Name: Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę wysokorozdzielczej mikroskopii sił atomowej do badania struktury i dynamiki nukleosomów z CENP-A na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika umożliwia ilościową analizę zjawisk chromatynowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wkład autora: YLL i MSD zaprojektowały projekt; Nukleosomy złożone z MSD. MSD i ZS przeprowadziły eksperymenty AFM i analizy danych. Wszyscy autorzy napisali i zredagowali rękopis.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany powyżej protokół jest dość prosty i zapewnia wysoce powtarzalne wyniki, choć można podkreślić kilka istotnych kwestii. Funkcjonalizowany APS-mica jest kluczowym substratem dla uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Jedną z ważnych cech tego podłoża jest wysoka stabilność APS-miki, która pozwala na wcześniejsze przygotowanie podłoża do obrazowania, które może być użyte co najmniej dwa tygodnie po przygotowaniu. 59,61 Powierzchnia może jednak zosta...

W komórkach eukariotycznych DNA jest bardzo skondensowane i zorganizowane w chromosomy. 1 Pierwszym poziomem organizacji DNA w chromosomie jest zespół nukleosomów, w którym 147 pz DNA jest ciasno owinięte wokół rdzenia oktamera histonowego. 2,3 Cząstki nukleosomów gromadzą się na długiej cząsteczce DNA, tworząc matrycę chromatyny, która jest następnie organizowana, aż do powstania bardzo zwartej jednostki chromosomowej. 4 Demontaż chromatyny zapewnia dostęp do wolnego DNA wymaganego przez krytyczne procesy komórkowe, takie jak transkrypcja genów i replikacja genomu, co sugeruje, że chromatyna jest bardzo dynamicznym systemem. 5,6,7 Zrozumienie dynamicznych właściwości DNA na różnych poziomach chromatyny jest niezwykle ważne dla wyjaśnienia procesów genetycznych na poziomie molekularnym, gdzie błędy mogą prowadzić do śmierci komórki lub rozwoju chorób, takich jak rak. 8 Bardzo ważną właściwością chromatyny jest dynamika nukleosomów. 9,10,11,12 Wysoka stabilność tych cząstek pozwoliła na scharakteryzowanie struktury za pomocą technik krystalograficznych. 2 To, czego brakuje w tych badaniach, to dynamiczne szczegóły nukleosomów, takie jak mechanizm odwijania DNA z rdzenia histonu; którego dynamiczny szlak jest wymagany do procesów transkrypcji i replikacji. 7,9,13,14,15,16 Ponadto wykazano, że specjalne białka zwane czynnikami przebudowy ułatwiają rozkład cząstek nukleosomalnych17; Jednak wewnętrzna dynamika nukleosomów jest krytycznym czynnikiem w tym procesie, który przyczynia się do całego procesu demontażu. 14,16,18,19
Techniki jednocząsteczkowe, takie jak fluorescencja pojedynczej cząsteczki19,20,21, pułapkowanie optyczne (pęseta)13,18,22,23 oraz AFM10,14,15,16,24,25,26 odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu dynamiki nukleosomów. Wśród tych metod AFM korzysta z kilku unikalnych i atrakcyjnych funkcji. AFM pozwala na wizualizację i charakterystykę poszczególnych nukleosomów, a także dłuższych tablic27. Na podstawie obrazów AFM można zmierzyć ważne cechy struktury nukleosomów, takie jak długość DNA owiniętego wokół rdzenia histonu 10,14,26,28; Parametr, który ma kluczowe znaczenie dla charakterystyki dynamiki rozpakowywania nukleosomów. Wcześniejsze badania AFM wykazały, że nukleosomy są układami wysoce dynamicznymi, a DNA może spontanicznie odwijać się z rdzenia histonu14. Spontaniczne rozpakowywanie DNA z nukleosomów było bezpośrednio wizualizowane przez AFM działający w trybie poklatkowym, gdy obrazowanie odbywa się w roztworach wodnych 14,26,29.
Pojawienie się szybkiego oprzyrządowania AFM (HS-AFM) umożliwiło wizualizację procesu rozpakowywania nukleosomów w milisekundowej skali czasowej 14,15,24. Ostatnie badania HS-AFM 16,30 badań nukleosomów specyficznych dla centromerów ujawniły kilka nowych cech nukleosomów w porównaniu z typem kanonicznym. Nukleosomy centromerowe składają się z centromeru, niewielkiej części chromosomu krytycznie ważnej dla segregacji chromosomów31. W przeciwieństwie do nukleosomów kanonicznych w chromatynie masowej, rdzeń histonowy nukleosomów centromerowych zawiera histon CENP-A zamiast histonu H332,33. W wyniku tego podstawienia histonów owijanie DNA w nukleosomach centromerów wynosi ~120 pz zamiast ~147 pz dla nukleosomów kanonicznych; Różnica, która może prowadzić do odmiennych morfologii macierzy centromerów i nukleosomów kanonicznych34, co sugeruje, że chromatyna centromerowa ulega większej dynamice w porównaniu z chromatyną masową. Nowa dynamika wykazywana przez centromery nukleosomów w HS-AFM16,30 badania ilustrują wyjątkową okazję, jaką daje ta technika pojedynczej cząsteczki, do bezpośredniej wizualizacji strukturalnych i dynamicznych właściwości nukleosomów. Przykłady tych cech zostaną pokrótce omówione i zilustrowane na końcu artykułu. Postęp ten został osiągnięty dzięki opracowaniu nowych protokołów obrazowania AFM nukleosomów, a także modyfikacjom istniejących metod. Celem opisanego tutaj protokołu jest udostępnienie tych ekscytujących postępów w badaniach pojedynczych cząsteczek nukleosomów AFM każdemu, kto chciałby wykorzystać te techniki w swoich badaniach nad chromatyną. Wiele z opisanych technik ma zastosowanie do problemów wykraczających poza badanie nukleosomów i może być wykorzystywanych do badań innych systemów białkowych i DNA. Kilka przykładów takich zastosowań można znaleźć w publikacjach35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49 i perspektywy badań AFM różnych systemów biomolekularnych są podane w recenzjach29,50,51,53,54.

<table><tbody><tr><td>Plazmid pGEM3Z-601</td><td>Addgene, Cambridge, MA</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td>IDT, Coralville, IA</td><td>Zamówienie niestandardowe</td> <td>(FP) 5'- CAGTGAATTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq</td></tr> <tr><td>polimeraza</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>EP0701</td><td>Numer katalogowy dla 200 jednostek</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy&nbsp;</td><td>28104</td><td>Numer katalogowy dla 50 sztuk</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>10708976001</td><td>Numer katalogowy dla 250 g</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>15576028</td><td>Numer katalogowy dla 500 g</td></tr><tr><td>(CENP-A/H4)2, rekombinowany ludzki</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>16-0010</td><td>Numer katalogowy dla 50 ug</td></tr><tr><td>H2A/H2B, rekombinowany ludzki</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>15-0311</td><td>Numer katalogowy dla 50 ug</td></tr><tr><td>H3 Octamer, rekombinowany ludzki</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>16-0001</td><td>Numer katalogowy dla 50 ug</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dializa Zestaw urządzenia do dializy, 10K MWCO, 0,1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>69574</td><td>Numer katalogowy dla 10 urządzeń</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9888-500G</td><td>Numer katalogowy dla 500 mg</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5&nbsp; Filtry odśrodkowe ml&nbsp;</td><td>Millipore-sigma, Burlington, MO</td><td>UFC501008</td><td>Numer katalogowy dla 8 urządzeń</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>258148-25ML</td><td>Numer katalogowy dla 25 mL</td></tr><tr><td></td><td>Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T0377-25G</td><td>Numer katalogowy dla 25 g</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>11667289001</td><td>Numer katalogowy dla 1 kg</td></tr><tr><td>Nadsiarczanu amonu (AmmPS)&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610700</td><td>Numer katalogowy 10 g</td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu/bis, 37.5:1</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610158</td><td>Numer katalogowy dla 500 mL</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610800</td><td>Numer katalogowy dla 5 mL</td></tr><tr><td>4x Laemmli bufor do próbek białka SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610747</td><td>Numer katalogowy dla 10 ml</td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M6250-10ML</td><td>Numer katalogowy dla 10 ml</td></tr><tr><td>wiekuLinijka Prestained Protein Ladder&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>26616</td><td>Numer katalogowy dla 500 uL</td></tr><tr><td>Bio-Safe&trade; Coomassie Stain</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610786</td><td>Numer katalogowy dla</td></tr><tr><td>1 L chusteczek z włókniny do pomieszczeń czystych: TX604 TechniCloth&nbsp;</td><td>TexWipe, Kernersvile, NC</td><td>TX604</td><td></td></tr><tr><td>Moskiewski blok Mika</td><td>AshevilleMica, Newport News, VA</td><td>Grade-1</td><td></td></tr><tr><td>Aminopropylosilaren (APS)</td><td>Zsyntetyzowany zgodnie z opisem w 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>H4034-25G</td><td>Numer katalogowy dla taśmy klejącej 25 g</td></tr><tr><td></td><td>Scotch-3M, St. Paul, MN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda TESPA-V2 afm (do obrazowania statycznego)</td><td>Sondy AFM Bruker, Camarillo, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda MSNL-10 afm (do standardowego obrazowania poklatkowego)</td><td>Sondy AFM Bruker, Camarillo, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td><td>Toagosei America, West Jefferson, OH</td><td>AA480</td><td>Numer katalogowy rurki 2 g</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M8266-100G</td><td>Numer katalogowy dla 100 g</td></tr><tr><td>Filtr Millex-GP, 0,22&nbsp; &mikro; m</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>SLGP05010</td><td>Numer katalogowy dla 10 urządzeń</td></tr><tr><td>BL-AC10DS-A2 sonda afm (do HS-AFM)</td><td>Olympus, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound FG-3020C-20&nbsp;</td><td>FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Związek FS-1010S135-0.5&nbsp;</td><td>FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy mikroskop sił atomowych</td><td>Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szybki poklatkowy mikroskop sił atomowych</td><td>Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Uniwersytet Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatyna, która jest długim łańcuchem podjednostek nukleosomów, jest dynamicznym systemem, który pozwala na tak krytyczne procesy jak replikacja DNA i transkrypcja w komórkach eukariotycznych. Dynamika nukleosomów zapewnia dostęp do DNA przez maszynerię replikacji i transkrypcji oraz krytycznie przyczynia się do mechanizmów molekularnych leżących u podstaw funkcji chromatyny. Badania pojedynczych cząsteczek, takie jak obrazowanie za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), znacząco przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia roli struktury i dynamiki nukleosomów. Obecny protokół opisuje etapy umożliwiające technikom obrazowania AFM o wysokiej rozdzielczości badanie strukturalnych i dynamicznych właściwości nukleosomów. Protokół ilustrują dane AFM uzyskane dla nukleosomów centromerowych, w których histon H3 jest zastąpiony swoim odpowiednikiem białkiem centromerowym A (CENP-A). Protokół rozpoczyna się od złożenia mononukleosomów przy użyciu metody ciągłego rozcieńczania. Przygotowanie substratu miki funkcjonalizowanego aminopropylositranem (APS-mika), który jest używany do obrazowania nukleosomów, ma kluczowe znaczenie dla wizualizacji AFM opisanych nukleosomów i zapewniona jest procedura przygotowania substratu. Nukleosomy osadzone na powierzchni APS-mica są najpierw obrazowane za pomocą statycznego AFM, który rejestruje migawkę populacji nukleosomów. Na podstawie analiz tych obrazów można zmierzyć takie parametry, jak rozmiar DNA owiniętego wokół nukleosomów, a proces ten jest również szczegółowo opisany. Procedura obrazowania poklatkowego AFM w cieczy jest opisana dla szybkiego AFM poklatkowego, który może uchwycić kilka klatek dynamiki nukleosomów na sekundę. Na koniec opisano i zilustrowano analizę dynamiki nukleosomów umożliwiającą ilościową charakterystykę procesów dynamicznych.

Mononukleosomy zostały najpierw przygotowane do eksperymentów z obrazowania AFM przy użyciu metody składania przez rozcieńczanie ciągłe (Rysunek 1). Przygotowane nukleosomy sprawdzono następnie za pomocą nieciągłej elektroforezy SDS-PAGE (Rysunek 2). Następnie powierzchnię miki funkcjonalizowano APS-em, który wiąże nukleosomy na powierzchni, zapewniając jednocześnie gładkie tło dla obrazowania o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 3). ...

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Protokół ten wykorzystuje wszystkie główne cechy AFM, niepodatne na inne techniki jednocząsteczkowe. Dzięki temu jesteśmy w stanie określić strukturę nukleosomu w skali nano. Co ważne, bezpośrednia wizualizacja nukleosomów została wykonana w warunkach fizjologicznych.Korzystając z naszej techniki AFM, ujawniliśmy niedawno unikalne właściwości nukleosomu centromerowego, które mogą odgrywać rolę w funkcjonowaniu całego centromeru. Metoda, która zostanie pokazana, jest obecnie stosowana w naszym laboratorium do badania samoorganizacji białek związanych z tworzeniem agregatów amyloidowych. Te agregaty białkowe wywołują rozwój wyniszczających chorób, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, by wymienić tylko kilka.Proste metody przygotowania mają również zastosowanie do innych kompleksów białko-DNA, w tym dużych systemów, takich jak maszyneria replikacji DNA. Chociaż potrzebne są pewne modyfikacje. Aby scharakteryzować cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych, należy rozpocząć od oczyszczenia, złożenia i walidacji nukleosomów zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.Następnie przygotuj powierzchnię miki do statycznego obrazowania AFM. Aby to zrobić, najpierw przygotuj pięćdziesięciomilimolowy roztwór podstawowy APS w wodzie dejonizowanej. Przechowywać jedną mililitrową porcję tego roztworu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.Z roztworu podstawowego przygotować działający roztwór APS do modyfikacji miki, rozpuszczając 50 mikrolitrów 50-mikromolowego półproduktu APS w 15 mililitrach destylowanej wody dejonizowanej. Wymieszaj roztwór, a następnie napełnij nim kuwetę. Następnie wytnij jeden na trzy centymetrowe paski miki z wysokiej jakości arkuszy miki.Sprawdź, czy element pasuje po umieszczeniu po przekątnej w kuwecie. Następnie rozłupuj warstwy miki, aż obie strony będą świeżo rozcięte, a kawałek będzie tak cienki, jak 0,1 milimetra. Natychmiast umieść kawałek miki w kuwecie wypełnionej APS i inkubuj mikę przez 30 minut.Przenieś kawałek miki do kuwety wypełnionej destylowaną wodą dejonizowaną i moczyć go przez 30 sekund. Następnie użyj argonu, aby całkowicie wysuszyć obie strony paska miki APS. Nałóż dwustronną taśmę klejącą na kilka krążków magnetycznych i umieść je z boku.Następnie przytnij podłoże z miki APS na jeden centymetr kwadratowy na jeden centymetr kwadratowy i przykryj je czystą szalką Petriego. Następnie przygotuj trzy rozcieńczenia połączonych nukleosomów za pomocą przefiltrowanego buforu o wielkości 0,22 mikrona zawierającego 10 milimolowych hepes i cztery milimolowe chlorki magnezu o pH 7,5. Aby ograniczyć utratę nukleosomów, przy niskim stężeniu końcowym, rozcieńczanie powinno być wykonywane pojedynczo, bezpośrednio przed osadzaniem na mice APS.Umieść od pięciu do 10 mikrolitrów każdej próbki nukleosomu w środku kawałka miki APS i pozwól im inkubować przez dwie minuty. Następnie delikatnie przepłucz próbkę dwoma do trzech mililitrów destylowanej wody dejonizowanej, aby usunąć składniki buforu. I wysuszyć zdeponowaną próbkę pod lekkim strumieniem argonu.Aby rozpocząć, zamontuj końcówkę na uchwycie końcówki zestawu AFM. Następnie zamontuj pierwszą próbkę na stoliku AFM, uważając, aby nie zetknąć się z powierzchnią próbki. Ustaw laser nad wspornikiem, aż jego suma osiągnie maksimum i dostosuj wartości odchylenia pionowego i bocznego do wartości bliskich zeru.Następnie dostrój sondę AFM, aby znaleźć jej częstotliwość rezonansową, dostosuj amplitudę napędu i ustaw rozmiar obrazu na 100 na 100 nanometrów. Po skonfigurowaniu kliknij przycisk włączenia, aby rozpocząć podejście. Po zakończeniu podejścia stopniowo optymalizuj nastawę amplitudy, aż powierzchnia próbki będzie wyraźnie widoczna.Następnie zwiększ rozmiar skanu do jednego mikrona na jeden mikron i rozdzielczość do 512 na 512 pikseli. Na koniec kliknij przycisk przechwytywania, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Użyj kleju do skanera prętów szklanych, aby przymocować szklany pręt do stolika skanera AFM.Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 10 minut. W międzyczasie zrób okrągłe kawałki miki o grubości 0,1 milimetra i średnicy 1,5 milimetra, wykrawając je z większego arkusza miki. Użyj szybkiego kleju do prętów ze szkła mikowego AFM, aby przymocować ten kawałek miki do szklanego pręta na szybkoobrotowym AFM i pozostaw go nietkniętym przez co najmniej 10 minut, aż wyschnie.Następnie odetnij warstwy z miki za pomocą taśmy samoprzylepnej, aż na taśmie pojawi się dobrze rozcięta warstwa. Następnie rozcieńczyć jeden mikrolitr 50-milimolowego materiału APS w 99 mikrolitrach destylowanej wody dejonizowanej, aby uzyskać 500-mikromolowy roztwór APS. Umieść 2,5 mikrolitra roztworu na świeżo rozciętej powierzchni miki i pozwól powierzchni funkcjonalizować się przez 30 minut.Po inkubacji kilkakrotnie przepłukać mikę destylowaną wodą dejonizowaną, stosując płukanie w trzech mikrolitrach. Po każdym płukaniu całkowicie usuń wodę, umieszczając chusteczkę z włókniny na krawędzi miki. Po ostatnim płukaniu umieść trzy mikrolitry destylowanej wody dejonizowanej na powierzchni i pozostaw na co najmniej pięć minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane APS.Następnie umieść sondę w uchwycie AFM o dużej prędkości i umieść uchwyt na stoliku AFM końcówką skierowaną do góry. Opłucz uchwyt za pomocą 100 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej, a następnie wykonaj dwa płukania po 100 mikrolitrów filtrowanego buforu do obrazowania nukleosomów o grubości 0,22 mikrona. Po zakończeniu płukania napełnij komorę 100 mikrolitrami buforu do obrazowania nukleosomów, zanurzając końcówkę.Dostosuj pozycję wspornika, aż zostanie uderzony laserem. Następnie przepłucz mikę APS pięciokrotnie przefiltrowanym buforem do obrazowania nukleosomów, używając czterech mikrolitrów na płukanie. Rozcieńczyć jeden mikrolitr materiału montażowego nukleosomów w 250 mikrolitrach przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, aby uzyskać końcowe stężenie nukleosomów wynoszące jeden nanomolowiec.Umieść 2,5 mikrolitra tego rozcieńczenia na powierzchni i pozostaw na dwie minuty. Spłucz powierzchnię dwukrotnie czterema mikrolitrami buforu do obrazowania nukleosomów, aby uniknąć nadmiernego zatłoczenia. Po ostatnim płukaniu pozostaw powierzchnię pokrytą buforem obrazowania.Umieść skaner i próbkę na uchwycie końcówki tak, aby próbka była skierowana stroną zadrukowaną do dołu. Aby rozpocząć podejście, należy użyć funkcji automatycznego podejścia z amplitudą wartości zadanej zbliżoną do amplitudy drgań swobodnych. Dostosuj nastawę, aż powierzchnia będzie dobrze śledzona.Następnie ustaw obszar obrazu około 150 na 150 nanometrów na 200 na 200 nanometrów z szybkością pozyskiwania danych około 300 milisekund na klatkę obrazowania. Jako kontrolę składania i osadzania, mononukleosomy H3 przygotowano i zobrazowano za pomocą statycznego AFM. To zdjęcie przedstawia populację nukleosomów taką, jaka istniała na chwilę przed depozycją, potwierdzając, że nucelosomy zostały pomyślnie złożone.Po sukcesie montażu kontrolnego H3, zaprezentowane metody zostały następnie zastosowane do badania nukleosomów CENP-A. Statyczne obrazowanie AFM tej próbki wykazało, że jej montaż zakończył się sukcesem. Na podstawie statycznych obrazów AFM można było scharakteryzować wysokość i liczbę zwojów mononukleosomów.Zarówno kąt między wolnymi ramionami DNA, jak i długość wolnych ramion DNA są wykorzystywane do określenia liczby zwojów DNA w poszczególnych nukleosomach. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie AFM nukleosomów w czasie może być wykorzystane do wizualizacji ogólnego spontanicznego rozpakowywania nukleosomów. Wraz ze spadkiem liczby zwojów nukleosomu obserwuje się również odpowiedni spadek objętości rdzenia nukleosomu.Oprócz zwykłego obrazowania poklatkowego, AFM poklatkowy o dużej prędkości może być używany do badania bardziej skomplikowanej dynamiki nukleosomów, która jest pomijana przy użyciu standardowego obrazowania poklatkowego. Zdolność tej techniki do uchwycenia dynamiki w długim okresie czasu była niezbędna do wizualizacji dalekiej translokacji rdzenia nukleosomu CENP-A, która została uchwycona w ciągu 1200 klatek. Technika ta miała również kluczowe znaczenie w uchwyceniu rzadkiego transferu rdzenia nukleosomu CENP-A z jednego substratu DNA do drugiego.Szybkie tempo przechwytywania obrazu umożliwiło wizualizację tego dynamicznego zdarzenia, ponieważ zajęło tylko kilka klatek. W szeroko pojętej dziedzinie chromatyny pojawia się szereg ważnych pytań związanych z rolą histonów liger i powiększeniem histonów w dynamice chromatyny. Na wszystkie te pytania można odpowiedzieć za pomocą naszej techniki.

probing-structure-dynamics-nucleosomes-using-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy statyczną mikroskopię sił atomowych, aby zobrazować złożone nukleosomy. Ta technika obrazowania o wysokiej rozdzielczości pozwala na badanie struktury nukleosomów.

Statyczna mikroskopia sił atomowych w celu wizualizacji i scharakteryzowania złożonych nukleosomów

W tym filmie demonstrujemy szybką mikroskopię sił atomowych w czasie poklatkowym, AFM, techniki obrazowania do badania dynamiki kompleksów nukleosomów. Gdy końcówka AFM skanuje powierzchnię nukleosomu, wykrywa zmiany wysokości nukleosomu i rejestruje rozwijanie się DNA w czasie.

Szybka poklatkowa mikroskopia sił atomowych w celu uchwycenia dynamiki nukleosomów

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Przedstawiono protokół do badania online relacji sekwencja-struktura-dynamika białek za pomocą Bio3D-web.

Badanie zależności między sekwencją, strukturą i dynamiką białek za pomocą Bio3D-web

Poznaj metodę wysokorozdzielczej mikroskopii sił atomowej do badania struktury i dynamiki nukleosomów z CENP-A na poziomie pojedynczych cząsteczek. Technika umożliwia ilościową analizę zjawisk chromatynowych.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów