Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Protokół ten wykorzystuje wszystkie główne cechy AFM, niepodatne na inne techniki jednocząsteczkowe. Dzięki temu jesteśmy w stanie określić strukturę nukleosomu w skali nano. Co ważne, bezpośrednia wizualizacja nukleosomów została wykonana w warunkach fizjologicznych.

Korzystając z naszej techniki AFM, ujawniliśmy niedawno unikalne właściwości nukleosomu centromerowego, które mogą odgrywać rolę w funkcjonowaniu całego centromeru. Metoda, która zostanie pokazana, jest obecnie stosowana w naszym laboratorium do badania samoorganizacji białek związanych z tworzeniem agregatów amyloidowych. Te agregaty białkowe wywołują rozwój wyniszczających chorób, takich jak choroba Alzheimera i Parkinsona, by wymienić tylko kilka.

Proste metody przygotowania mają również zastosowanie do innych kompleksów białko-DNA, w tym dużych systemów, takich jak maszyneria replikacji DNA. Chociaż potrzebne są pewne modyfikacje. Aby scharakteryzować cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych, należy rozpocząć od oczyszczenia, złożenia i walidacji nukleosomów zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Następnie przygotuj powierzchnię miki do statycznego obrazowania AFM. Aby to zrobić, najpierw przygotuj pięćdziesięciomilimolowy roztwór podstawowy APS w wodzie dejonizowanej. Przechowywać jedną mililitrową porcję tego roztworu w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny.

Z roztworu podstawowego przygotować działający roztwór APS do modyfikacji miki, rozpuszczając 50 mikrolitrów 50-mikromolowego półproduktu APS w 15 mililitrach destylowanej wody dejonizowanej. Wymieszaj roztwór, a następnie napełnij nim kuwetę. Następnie wytnij jeden na trzy centymetrowe paski miki z wysokiej jakości arkuszy miki.

Sprawdź, czy element pasuje po umieszczeniu po przekątnej w kuwecie. Następnie rozłupuj warstwy miki, aż obie strony będą świeżo rozcięte, a kawałek będzie tak cienki, jak 0,1 milimetra. Natychmiast umieść kawałek miki w kuwecie wypełnionej APS i inkubuj mikę przez 30 minut.

Przenieś kawałek miki do kuwety wypełnionej destylowaną wodą dejonizowaną i moczyć go przez 30 sekund. Następnie użyj argonu, aby całkowicie wysuszyć obie strony paska miki APS. Nałóż dwustronną taśmę klejącą na kilka krążków magnetycznych i umieść je z boku.

Następnie przytnij podłoże z miki APS na jeden centymetr kwadratowy na jeden centymetr kwadratowy i przykryj je czystą szalką Petriego. Następnie przygotuj trzy rozcieńczenia połączonych nukleosomów za pomocą przefiltrowanego buforu o wielkości 0,22 mikrona zawierającego 10 milimolowych hepes i cztery milimolowe chlorki magnezu o pH 7,5. Aby ograniczyć utratę nukleosomów, przy niskim stężeniu końcowym, rozcieńczanie powinno być wykonywane pojedynczo, bezpośrednio przed osadzaniem na mice APS.

Umieść od pięciu do 10 mikrolitrów każdej próbki nukleosomu w środku kawałka miki APS i pozwól im inkubować przez dwie minuty. Następnie delikatnie przepłucz próbkę dwoma do trzech mililitrów destylowanej wody dejonizowanej, aby usunąć składniki buforu. I wysuszyć zdeponowaną próbkę pod lekkim strumieniem argonu.

Aby rozpocząć, zamontuj końcówkę na uchwycie końcówki zestawu AFM. Następnie zamontuj pierwszą próbkę na stoliku AFM, uważając, aby nie zetknąć się z powierzchnią próbki. Ustaw laser nad wspornikiem, aż jego suma osiągnie maksimum i dostosuj wartości odchylenia pionowego i bocznego do wartości bliskich zeru.

Następnie dostrój sondę AFM, aby znaleźć jej częstotliwość rezonansową, dostosuj amplitudę napędu i ustaw rozmiar obrazu na 100 na 100 nanometrów. Po skonfigurowaniu kliknij przycisk włączenia, aby rozpocząć podejście. Po zakończeniu podejścia stopniowo optymalizuj nastawę amplitudy, aż powierzchnia próbki będzie wyraźnie widoczna.

Następnie zwiększ rozmiar skanu do jednego mikrona na jeden mikron i rozdzielczość do 512 na 512 pikseli. Na koniec kliknij przycisk przechwytywania, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Użyj kleju do skanera prętów szklanych, aby przymocować szklany pręt do stolika skanera AFM.

Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 10 minut. W międzyczasie zrób okrągłe kawałki miki o grubości 0,1 milimetra i średnicy 1,5 milimetra, wykrawając je z większego arkusza miki. Użyj szybkiego kleju do prętów ze szkła mikowego AFM, aby przymocować ten kawałek miki do szklanego pręta na szybkoobrotowym AFM i pozostaw go nietkniętym przez co najmniej 10 minut, aż wyschnie.

Następnie odetnij warstwy z miki za pomocą taśmy samoprzylepnej, aż na taśmie pojawi się dobrze rozcięta warstwa. Następnie rozcieńczyć jeden mikrolitr 50-milimolowego materiału APS w 99 mikrolitrach destylowanej wody dejonizowanej, aby uzyskać 500-mikromolowy roztwór APS. Umieść 2,5 mikrolitra roztworu na świeżo rozciętej powierzchni miki i pozwól powierzchni funkcjonalizować się przez 30 minut.

Po inkubacji kilkakrotnie przepłukać mikę destylowaną wodą dejonizowaną, stosując płukanie w trzech mikrolitrach. Po każdym płukaniu całkowicie usuń wodę, umieszczając chusteczkę z włókniny na krawędzi miki. Po ostatnim płukaniu umieść trzy mikrolitry destylowanej wody dejonizowanej na powierzchni i pozostaw na co najmniej pięć minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane APS.

Następnie umieść sondę w uchwycie AFM o dużej prędkości i umieść uchwyt na stoliku AFM końcówką skierowaną do góry. Opłucz uchwyt za pomocą 100 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej, a następnie wykonaj dwa płukania po 100 mikrolitrów filtrowanego buforu do obrazowania nukleosomów o grubości 0,22 mikrona. Po zakończeniu płukania napełnij komorę 100 mikrolitrami buforu do obrazowania nukleosomów, zanurzając końcówkę.

Dostosuj pozycję wspornika, aż zostanie uderzony laserem. Następnie przepłucz mikę APS pięciokrotnie przefiltrowanym buforem do obrazowania nukleosomów, używając czterech mikrolitrów na płukanie. Rozcieńczyć jeden mikrolitr materiału montażowego nukleosomów w 250 mikrolitrach przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, aby uzyskać końcowe stężenie nukleosomów wynoszące jeden nanomolowiec.

Umieść 2,5 mikrolitra tego rozcieńczenia na powierzchni i pozostaw na dwie minuty. Spłucz powierzchnię dwukrotnie czterema mikrolitrami buforu do obrazowania nukleosomów, aby uniknąć nadmiernego zatłoczenia. Po ostatnim płukaniu pozostaw powierzchnię pokrytą buforem obrazowania.

Umieść skaner i próbkę na uchwycie końcówki tak, aby próbka była skierowana stroną zadrukowaną do dołu. Aby rozpocząć podejście, należy użyć funkcji automatycznego podejścia z amplitudą wartości zadanej zbliżoną do amplitudy drgań swobodnych. Dostosuj nastawę, aż powierzchnia będzie dobrze śledzona.

Następnie ustaw obszar obrazu około 150 na 150 nanometrów na 200 na 200 nanometrów z szybkością pozyskiwania danych około 300 milisekund na klatkę obrazowania. Jako kontrolę składania i osadzania, mononukleosomy H3 przygotowano i zobrazowano za pomocą statycznego AFM. To zdjęcie przedstawia populację nukleosomów taką, jaka istniała na chwilę przed depozycją, potwierdzając, że nucelosomy zostały pomyślnie złożone.

Po sukcesie montażu kontrolnego H3, zaprezentowane metody zostały następnie zastosowane do badania nukleosomów CENP-A. Statyczne obrazowanie AFM tej próbki wykazało, że jej montaż zakończył się sukcesem. Na podstawie statycznych obrazów AFM można było scharakteryzować wysokość i liczbę zwojów mononukleosomów.

Zarówno kąt między wolnymi ramionami DNA, jak i długość wolnych ramion DNA są wykorzystywane do określenia liczby zwojów DNA w poszczególnych nukleosomach. W przeciwieństwie do tego, obrazowanie AFM nukleosomów w czasie może być wykorzystane do wizualizacji ogólnego spontanicznego rozpakowywania nukleosomów. Wraz ze spadkiem liczby zwojów nukleosomu obserwuje się również odpowiedni spadek objętości rdzenia nukleosomu.

Oprócz zwykłego obrazowania poklatkowego, AFM poklatkowy o dużej prędkości może być używany do badania bardziej skomplikowanej dynamiki nukleosomów, która jest pomijana przy użyciu standardowego obrazowania poklatkowego. Zdolność tej techniki do uchwycenia dynamiki w długim okresie czasu była niezbędna do wizualizacji dalekiej translokacji rdzenia nukleosomu CENP-A, która została uchwycona w ciągu 1200 klatek. Technika ta miała również kluczowe znaczenie w uchwyceniu rzadkiego transferu rdzenia nukleosomu CENP-A z jednego substratu DNA do drugiego.

Szybkie tempo przechwytywania obrazu umożliwiło wizualizację tego dynamicznego zdarzenia, ponieważ zajęło tylko kilka klatek. W szeroko pojętej dziedzinie chromatyny pojawia się szereg ważnych pytań związanych z rolą histonów liger i powiększeniem histonów w dynamice chromatyny. Na wszystkie te pytania można odpowiedzieć za pomocą naszej techniki.