Name: Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Poznaj nową platformę testową proteaz opartą na fluorescencyjnych białkach fuzyjnych i magnetycznych kulkach agarozowych. Metoda umożliwia badania kinetyczne enzymów, w tym HIV-1 proteazy, oraz wysokoprzepustowe przesiewanie inhibitorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez projekt GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT teaming", a także finansowana przez Program Doskonałości Instytucjonalnej Szkolnictwa Wyższego Ministerstwa Potencjału Ludzkiego na Węgrzech, w ramach programu tematycznego Biotechnologia Uniwersytetu w Debreczynie. Autorzy są wdzięczni członkom Laboratorium Biochemii Retrowirusowej za ich pomoc naukową podczas opracowywania testu, a także za cierpliwość podczas filmowania testu (szczególnie Norbertowi Kassayowi, Krisztinie Joóné Matúz i Vandzie Toldi, którzy pojawiają się w tle filmu). Autorzy pragną również złożyć specjalne podziękowania firmie Gedeon Richter Plc., a w szczególności dr Zoltánowi Urbányiemu za umożliwienie Beácie Bozóki pracy na Wydziale Biochemii i Biologii Molekularnej jako gościnnego badacza. Autorzy pragną również wyrazić swoje podziękowania dla Györgya Zsadányiego, Balázsa Tőgyi, Balázsa Pöstényiego i Zoltána Király'ego z Centrum Technicznego Multimediów i E-learningu Uniwersytetu w Debreczynie za profesjonalną pomoc w produkcji audio i wideo.

<ol><li>Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+Combinatorial+Assays+for+the+Determination+of+Protease+Activity+and+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Informatics%22%5BJournal%5D)">Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition.</a> Molecular Informatics. 24 (10), 1141-1148 (2005).</li>
<li>Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biotechnological+aspects+of+microbial+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (3), 597-635 (1998).</li>
<li>Zhang, G. Protease assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+G+%22The+Assay+Guidance+Manual%22">The Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda, MD. (2012).</li>
<li>Woelcke, J., Hassiepen, U. Fluorescence-based biochemical assay formats. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoelcke%2C+J+%22A+Practical+Guide+to+Assay+Development+and+High-Throughput+Screening+in+Drug+Discovery%22">A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery</a>. Chen, T. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2010).</li>
<li>Richardson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+and+use+of+optimized+protease+substrates+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (28), 2559-2581 (2002).</li>
<li>Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+mapping+protease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for mapping protease specificity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 46-51 (2007).</li>
<li>Schilling, O., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-derived%2C+database-searchable+peptide+libraries+for+identifying+protease+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites.</a> Nature Biotechnology. 26 (6), 685-694 (2008).</li>
<li>Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protease+activity+assay+using+heat-sensitive+Tus-GFP+fusion+protein+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates.</a> Analytical Biochemistry. 415 (2), 126-133 (2011).</li>
<li>Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP+based+assay+for+the+determination+of+hydrolytic+activity+and+substrate+specificity+of+subtilisins+under+washing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Catalysis+B%3A+Enzymatic%22%5BJournal%5D)">A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions.</a> Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).</li>
<li>Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+for+site-specific+proteases+using+bead-attached+GFP+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate.</a> Biotechniques. 31 (5), 1194-1198 (2001).</li>
<li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bioluminescence+resonance+energy+transfer-fluorescence+resonance+energy+transfer-based+ratiometric+protease+assays+with+fusion+proteins+of+firefly+luciferase+and+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 414 (2), 239-245 (2011).</li>
<li>Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fusion+protein+platform+for+quantitatively+measuring+activity+of+multiple+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases.</a> Microbial Cell Factories. 13 (1), 44(2014).</li>
<li>Fox, J. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maltose-binding+protein+as+a+solubility+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Maltose-binding protein as a solubility enhancer.</a> Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).</li>
<li>Bozóki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+fusion+protein-based%2C+fluorescent+protease+assay+for+high+throughput-compatible+substrate+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening.</a> Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).</li>
<li>Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+Ni-NTA+magnetic+bead-based+fluorescent+protease+assay+using+recombinant+fusion+protein+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates.</a> Data in Brief. 18, 203-208 (2018).</li>
<li>Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+characterization+of+maturation+time+of+fluorescent+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells.</a> Nature Methods. 15, 47-51 (2018).</li>
<li>Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variation+of+fluorescence+protein+maturation+times+in+closely+related+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains.</a> PLoS One. 8, e75991(2013).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na intensywne badania przemysłowe i akademickie enzymów proteolitycznych oraz ciągłe zapotrzebowanie na szybkie i niedrogie platformy do oznaczania proteaz kompatybilne z HTS, opracowaliśmy test proteazy fluorescencyjnej oparty na kulkach magnetycznych. Test opiera się na wykorzystaniu rekombinowanych białek fuzyjnych, które mogą być nową alternatywą dla szeroko stosowanych syntetycznych substratów peptydowych.
W opracowanym formacie testu substraty białek fuzyjnych są unieruchomione na powierzchniach magnetycznych kulek agarozy pokrytych chelatem Ni. Przyłączanie substratu jest zapewnione przez N-końcowy znacznik powinowactwa His6 białka fuzyjnego, który jest bezpośrednio połączony ze znacznikiem MBP w celu ułatwienia fałdowania i zwiększenia rozpuszczalności substratu13 w wodzie. Po MBP następują miejsca rozszczepienia TEV PR i proteaza będąca przedmiotem zainteresowania. Pierwsza z nich może służyć jako kontrolne miejsce rozszczepienia w teście, podczas gdy druga może być przetwarzana przez badaną proteazę. Miejsce łupliwości jest wymienne; krótka sekwencja dsDNA kodująca interesujące nas miejsce rozszczepienia może zostać wprowadzona do elastycznej "kasety klonującej" plazmidu ekspresyjnego przez ligację. Rekombinowane białka fuzyjne zawierają wysoce stabilny, monomeryczny znacznik białka fluorescencyjnego na C-końcu, który umożliwia wykrywanie punktu końcowego uwolnionych przez enzym, fluorescencyjnych produktów rozszczepienia C-końcowego uwalnianych po rozszczepieniu proteolitycznym (Figura 1A). Oczyszczone fluorescencyjne nienaruszone substraty rozpuszczone w różnych są również używane do kalibracji w celu oceny stężeń molowych substratów i produktów rozszczepienia. Ponadto, po fluorymetrii, składniki testu mogą być również analizowane za pomocą SDS-PAGE. Zarówno natywne (niedenaturowane), jak i denaturowane białka fluorescencyjne mogą być wizualizowane w żelu, odpowiednio bezpośrednio po elektroforezie lub po późniejszej renaturacji w żelu. Ta dodatkowa procedura - w połączeniu z konwencjonalnym barwieniem Coomassie Brilliant Blue - może być skutecznie stosowana do weryfikacji wyników testu (ryc. 1B).
Procedura testowa składa się z prostych, łatwych do wykonania kroków w formacie o małej objętości, który może być w pełni dostosowany do środowiska automatycznego o wysokiej przepustowości. Jednak niezależnie od wykonywania testu ręcznie lub za pomocą systemu automatyzacji, następujące części testu są uważane za kluczowe i wymagają szczególnej uwagi podczas wykonywania procedury. i) Jednorodność roztworu kulki magnetycznej. W całym teście należy stosować jednorodny roztwór kulki magnetycznej, zarówno na etapie oczyszczania, jak i mycia. W szczególności wiarygodność testów proteazy w dużym stopniu zależy od prawidłowego porcjowania roztworów podstawowych kulek magnetycznych przyczepionych do substratu (SAMB). W celu zwiększenia skuteczności zawiesiny i dyspersji zaleca się ustawienie stężenia kulek w zakresie od 2% do 10% (v/v). Podczas przygotowywania próbki stosowanie uzupełnionych niejonowym detergentem (takich jak Triton X-100 lub Tween 20) do 2% może również zmniejszyć przyczepność kulek magnetycznych do powierzchni z tworzywa sztucznego. Przylegania kulek do ścianek fiolek z próbkami można uniknąć, jeżeli zawiesiny kulek są ostrożnie nakładane na dno fiolek, a nie na ścianki probówek z próbkami. Jednorodność kulek magnetycznych podczas reakcji enzymatycznej ma również kluczowe znaczenie i może być zapewniona przez ciągłe wytrząsanie próbek z prędkością 600 obr./min podczas inkubacji. Koraliki są odpowiednio rozproszone w zaokrąglonych lub płaskodennych wyrobach z tworzywa sztucznego, przy czym nie zaleca się stosowania fiolek z dnem w kształcie litery V. Nieoptymalny wynik spowodowany niewłaściwą homogenizacją ściegu przedstawiono na rysunku 4B. ii) Zakończenie próbek reakcyjnych.  Kolejną zaletą tej metody jest to, że reakcję enzymatyczną można zakończyć bez użycia obróbki denaturacji cieplnej lub jakichkolwiek potencjalnie zakłócających czynników chemicznych15. Zakończenie można przeprowadzić po prostu poprzez oddzielenie kulek magnetycznych od mieszaniny reakcyjnej za pomocą konwencjonalnego koncentratora cząstek magnetycznych. Podczas gdy usunięty bufor reakcyjny zawiera aktywny enzym i wygenerowane C-końcowe fluorescencyjne produkty rozszczepienia, nierozdrobnione substraty pozostają przyłączone do kulek. Ze względu na obecność aktywnego enzymu w buforze reakcyjnym, procedura rozdzielania musi być przeprowadzana ostrożnie, aby zapewnić wiarygodne wykrywanie punktu końcowego. Przed umieszczeniem fiolek z próbkami w koncentratorze zaleca się zastosowanie wirowania z krótkim wirowaniem. Po umieszczeniu probówek w koncentratorze należy zapewnić co najmniej 15 s na zebranie kulek, które mają zostać zebrane. Niewielki ruch separatora w przód i w tył może ułatwić zbieranie kulek. Należy wziąć pod uwagę, że podczas ręcznie wykonywanej separacji zakończenie zwykle zajmuje więcej czasu niż rozpoczęcie reakcji. W związku z tym zaleca się zarejestrowane opóźnienie około 2 minut między inicjacjami, jeżeli ten sam czas inkubacji musi być zastosowany do wszystkich próbek.
Zasada opisanego testu proteolitycznego jest stosunkowo prosta; Uniwersalność systemu gwarantuje jednak elastyczna i stabilna struktura podłoża. Indywidualna optymalizacja testu może być ograniczona jedynie zgodnością kulek powinowactwa z zastosowanymi warunkami, odczynnikami i dodatkami. Zgodnie z protokołem producenta stwierdziliśmy również, że powinowactwo wiązania substratów z powierzchniami kulek Ni-NTA znacznie słabnie przy pH ≤ 6,515. W związku z tym zaleca się stosowanie próbek zerowej próby substratu równolegle do próbek reakcyjnych, a podczas oceny wyników należy wziąć pod uwagę szybkość spontanicznej dysocjacji substratu.
W tych przypadkach, gdy nie można przeprowadzić testów na bazie kulek magnetycznych ze względu na użycie składników niezgodnych z kulkami lub niskie pH, można również zastosować trawienie w roztworze oczyszczonych substratów rekombinowanych. W takich przypadkach mieszaniny reakcyjne można analizować za pomocą elektroforezy, a białka można uwidocznić w żelu w oparciu o opisany protokół. Aby zbadać aktywność proteolityczną, trawienie w roztworze i wykrywanie białek w żelu mogą być również alternatywnymi narzędziami fluorymetrii. Nowością zaprojektowanego systemu substratów jest zastosowanie etapu renaturacji w żelu po denaturacji SDS-PAGE. Podczas gdy natywne (niedenaturowane) białka fluorescencyjne zachowują swoją fluorescencję podczas elektroforezy, właściwość fluorescencyjna zostaje zniesiona po denaturacji (ryc. 7B). Jednak fluorescencję zdenaturowanych białek można częściowo odzyskać poprzez usunięcie SDS z żelu. W ten sposób rozdzielenie składników reakcji w warunkach denaturacji umożliwia nie tylko identyfikację na podstawie fluorescencji, ale także na podstawie masy cząsteczkowej. Kolejną zaletą detekcji fluorescencyjnej w żelu w porównaniu z analizą żelu barwionego Coomassie jest to, że (natywne lub zrenaturyzowane) białka fluorescencyjne można łatwo zidentyfikować w żelu na podstawie ich fluorescencji (patrz ryc. 7). Może to być istotne, jeśli reakcje rozszczepienia przeprowadza się w próbkach zawierających zanieczyszczenia niefluorescencyjne lub białka bardzo przypominające swoje masy cząsteczkowe.
Testy proteazy z wykorzystaniem podobnie zaprojektowanych substratów zostały już opublikowane wcześniej 8,9,10 i chociaż miejsce rozszczepienia będące przedmiotem zainteresowania w tych przypadkach również znajdowało się między znacznikiem powinowactwa a białkiem fluorescencyjnym, przedstawiony tutaj system testów nie tylko powtarza opisane pomysły, ale łączy różne zalety poprzednich platform, a także uzupełnia je o dalsze ulepszenia: i) wykorzystanie partnera do fuzji MBP, ii) obecność kontrolnego miejsca rozszczepienia TEV PR, iii) zastosowanie nowo opracowanych monomerycznych FP oraz iv) zastosowanie unikalnej procedury kalibracji substratu. Sam test został specjalnie zaprojektowany, aby był przydatny do badań specyficzności enzymatycznej i kinetycznych w bezpieczny, efektywny czasowo i kosztowo sposób, bez konieczności stosowania drogiego oprzyrządowania. Metoda ma być odpowiednim i niedrogim narzędziem zarówno do celów badań przemysłowych, jak i akademickich. Ze względu na elastyczność "kasety klonującej" plazmidu ekspresyjnego, system może być odpowiedni do szybkiego i niedrogiego generowania bibliotek substratów rekombinowanych. Opisany tutaj test jest wykonalnym narzędziem do realizacji badań specyficzności substratu, mutagenezy enzymów i hamowania, a także stanowi alternatywne narzędzie do przeprowadzania kinetyki enzymów. Platforma testowa (od rozerwania komórek bakteryjnych do określenia parametrów kinetycznych) może zostać dostosowana do środowiska opartego na HTS i automatyzacji, a potencjalnie może być stosowana w przemysłowych badaniach przesiewowych inhibitorów proteazy i/lub opracowywaniu leków przeciwwirusowych. Ponadto adaptacja testu do proteolizy konkurencyjnej jest również w przyszłym zakresie naszego laboratorium. W takim konkurencyjnym teście dwa różne substraty - każdy zawierający inne miejsce rozszczepienia połączone z innym C-końcowym znacznikiem fluorescencyjnym - są przeznaczone do jednoczesnego użycia w tej samej reakcji rozszczepienia w celu zbadania preferencji badanego enzymu dla danych sekwencji docelowych. Co więcej, zastosowanie 96-dołkowej formy testu dostosowanej do płytki (ryc. 8) jest również optymalizowane pod kątem badań przesiewowych mutacji przy użyciu szeregu substratów ze zmodyfikowanymi sekwencjami miejsc cięcia w przypadku proteaz cysteinowych.

Enzymy proteolityczne należą do najintensywniej badanych grup enzymów ze względu na ich znaczenie w szlakach metabolicznych oraz w zastosowaniach przemysłowych. Ich kluczowa rola w chorobach wirusowych, regulacji krzepliwości krwi, nowotworach oraz chorobach sercowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych sprawia, że proteazy są ważnymi celami w dziedzinie odkrywania leków. W związku z tym szczegółowa charakterystyka specyficzności substratowej i profilowania inhibitora proteazy (PR) będącej przedmiotem zainteresowania jest kluczowa i jest korzystnie przeprowadzana za pomocą szybkich, opłacalnych i solidnych testów biochemicznych1,2,3.
Obecnie zdecydowana większość testów proteaz in vitro stosowanych w dziedzinie odkrywania leków do profilowania związków to platformy jednorodne, oparte na peptydach fluorescencyjnych i kompatybilne z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi (HTS)4. Co więcej, znakowane peptydy nadają się nie tylko do badań przesiewowych w bibliotekach, ale także oferują doskonałe narzędzia do określania parametrów kinetycznych enzymów na wybranych substratach. W innych przypadkach, gdy etykietowanie substratu nie jest możliwe, testy oparte na separacji mogą stanowić możliwe rozwiązanie do oceny właściwości kinetycznych reakcji proteolitycznych3.
Generalnie, testy proteazy in vitro opierają się na użyciu dwóch rodzajów substratów: krótkich peptydów lub całych białek. W tych przypadkach, w których rozszczepienie krótkich sekwencji peptydowych wystarczająco odzwierciedla właściwości rozszczepienia, stosuje się następujące standardowe podejścia: (i) badanie standardowych substratów białkowych, takich jak utleniony łańcuch B insuliny, (ii) testowanie dostępnych na rynku substratów innych proteaz, (iii) badanie przesiewowe syntetycznych i znakowanych fluorescencyjnie bibliotek peptydów stworzonych przez chemię kombinatoryczną, lub (iv) stosowanie metod genetycznych, Na przykład biologiczne technologie wyświetlania5,6. Oprócz konwencjonalnej klasyfikacji, dostępne są również inne nowatorskie platformy do generowania substratów (np. tworzenie bibliotek peptydów pochodzących z proteomu7 lub specjalne podtypy metod genetycznych, takie jak rekombinowane substraty oparte na białkach fuzyjnych8,9,10,11,12).
Wszystkie wyżej wymienione typy substratów i testy mają swoje zalety i ograniczenia, a rozwój formatów testów łączących i/lub ulepszających zalety znanych platform jest nadal pożądany. Tutaj opisujemy protokół testu proteazy fluorescencyjnej opartego na separacji, który wykorzystuje rekombinowane substraty. Te białka fuzyjne składają się ze znaczników His6 i MBP połączonych z kontrolnym miejscem cięcia TEV PR, po którym następuje sekwencja substratu, która jest bezpośrednio połączona z C-końcowym białkiem fluorescencyjnym (FP) (Figura 1A). Klonowanie sekwencji DNA kodującej interesujące miejsce rozszczepienia do "kasety klonowania" można przeprowadzić za pomocą pojedynczej reakcji ligacji do plazmidu ekspresyjnego, który został wcześniej zlinearyzowany przez endonukleazy restrykcyjne.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Zasada testu proteazy fluorescencyjnej. (A) Przedstawiono schematyczne przedstawienie substratu fluorescencyjnego i jego rozszczepienia przez proteazę ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Strzałka wskazuje pozycję rozszczepienia w sekwencji miejsca rozszczepienia matrycy/kapsydu proteazy HIV-1 (VSQNY*PIVQ). (B) Substraty fluorescencyjne mogą być używane do analizy reakcji enzymatycznych za pomocą testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA, a także za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, jak pokazano na schemacie przepływu pracy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Chociaż testy proteolityczne wykorzystujące podobne rekombinowane substraty białkowe - zawierające znacznik powinowactwa, proteolityczne miejsce cięcia i białko fluorescencyjne - zostały już opisane8,9,10, przedstawiony tutaj system ma na celu integrację i ulepszenie zalet tych metod. Istotną różnicą jest to, że substraty białek fuzyjnych w tej platformie testowej są wyposażone w MBP w celu zwiększenia rozpuszczalności białek13 i zawierają kontrolne miejsce rozszczepienia dla PR TEV. Ponadto substraty zawierają białka fluorescencyjne nowej generacji, które są wysoce stabilne i mają formę monomeryczną, aby zapobiec agregacji substratów. Oprócz wcześniej opublikowanego zastosowania form fuzji mTurquoise2 i mApple14, tutaj pokazujemy również wyniki uzyskane przy użyciu rekombinowanego substratu zawierającego monomeryczny znacznik fluorescencyjny wzmocnionego żółtego białka fluorescencyjnego (mEYFP). W niniejszym artykule wykazujemy kompatybilność systemu z innymi białkami fluorescencyjnymi i przedstawiamy pewne ogólne typy wyników, które można uzyskać za pomocą testu proteazy.
Rekombinowane białka fuzyjne są wyrażane w komórkach E. coli BL21(DE3) i są używane jako substraty do testu w formie magnetycznej agarozy pokrytej kwasem niklowo-nitrylotrioctowym (Ni-NTA). Produkty rozszczepienia C-końcowego są uwalniane z powierzchni koralików do supernatantu po rozszczepieniu przez proteazę będącą przedmiotem zainteresowania. Po oddzieleniu supernatantu (zawierającego enzym i produkty rozszczepienia) od kulek magnetycznych, można zmierzyć fluorescencję w celu określenia właściwości enzymu w zakresie rozszczepienia. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, w przedstawionym tutaj systemie ilości substratu i produktów rozszczepienia C-końcowego są jednoznacznie określane ilościowo w oparciu o szczegółową procedurę kalibracji substratu. System testowy może być wspierany przez analizę próbek testowych za pomocą SDS-PAGE; Późniejsza wizualizacja fluorescencyjna w żelu może być zastosowana natychmiast po elektroforezie lub po renaturacji w żelu odpowiednio niedenaturowanych i zdenaturowanych składników fluorescencyjnych<klasa sup="xref">14.</klasa>
Elastyczność i struktura 'kasety do klonowania' pozwala na szybkie i ekonomiczne wprowadzanie do konstrukcji szerokiej gamy sekwencji, a tym samym sprzyja generowaniu bibliotek substratów. Ponieważ wszystkie etapy testu są kompatybilne z automatyzacją i HTS, system może być szczególnie atrakcyjny, na przykład do pomiarów swoistości proteazy i badań mutagenezy, lub może być również skutecznie wykorzystywany do przemysłowych badań przesiewowych inhibitorów proteazy i/lub opracowywania leków przeciwwirusowych.
Parametry kinetyczne enzymu (kcat, Km) mogą być określone za pomocą opracowanego testu opartego na separacji; dlatego może być odpowiednie do wykonywania indywidualnych pomiarów kinetycznych enzymów, takich jak badania przebiegu czasowego, zależne od substratu i hamowania. Dowodzi to, że rekombinowane substraty białek fuzyjnych stanowią dobrą alternatywę dla często stosowanych syntetycznych substratów oligopeptydowych, a ze względu na ich duże podobieństwo do substratów polibiałkowych, dokładniej reprezentują naturalnie występujące interakcje enzym-substrat.

<table><tbody><tr><td>Rurki 10K Amicon</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>40% Akrylamid/Bis roztwór 37,5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>SERVA</td><td>11404.04</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Imager System dokumentacji żelu HP</td><td>BiałkoSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Beckman Coulter Allegra X-22 Beckman</td><td>Coulter</td><td>392185</td><td></td></tr><tr><td>Czarne płytki półpowierzchniowe</td><td>Greiner bio-One</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bufor CutSmart (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Do linearyzacji plazmidu (krok 1.1.1)</td></tr><tr><td>Nadajnik Dark Reader</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-45M</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2&nbsp; cząstka magnetyczna&nbsp; koncentrator</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3) kompetentne komórki&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merc-Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp; Panie przewodniczący, panie i panowie!</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td></td><td></td>798681</tr><tr><td>Gel Loading Dye, fioletowy (6X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>356350</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Szybki mini zestaw plazmidowy</td><td>GeneAid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Jouan CR 412</td><td>Rotator</td> Labinco <td>LD-76</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &nbsp;</td><td>Labinco</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) rosół</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>MERCK eurolab kąpiel ultradźwiękowa</td><td>MERCK</td><td>USR54H</td><td></td></tr><tr><td>Millifuge Eppendorf wirówka</td><td>Millipore</td><td>CT10</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Komórka do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna NheI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131L</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan niklu(II) (NiSO4)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td></td><td></td>656895</tr><tr><td>Magnetyczne koraliki agarozowe Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>36113</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Biosan</td><td>OS-20</td><td></td></tr><tr><td>PacI endonukleaza restrykcyjna</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>PageBlue Roztwór do barwienia białek&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>24620</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Lobind do białek&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka Snijders Press-to-Mix&nbsp;</td><td>Gemini</td><td>34524</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>Thermo Fischer</td><td>Scientific S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>Promega</td><td>M180A Wytrząsarka</td><td></td></tr><tr><td>termiczna</td><td>Biosan</td><td>TS-100</td><td>z blokiem akcesoriów SC-24</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Stany Zjednoczone)&nbsp;</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>WALLAC VICTOR2 1420 licznik multilabel</td><td>Wallac Oy, Turku, Finlandia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteazy są intensywnie badanymi enzymami ze względu na ich zasadnicze role w kilku szlakach biologicznych organizmów żywych oraz w patogenezie; dlatego są ważnymi celami leków. Opracowaliśmy platformę testową opartą na kulkach magnetyczno-agarozowych do badania aktywności proteolitycznej, która opiera się na wykorzystaniu rekombinowanych substratów białek fuzyjnych. W celu zademonstrowania zastosowania tego systemu testowego przedstawiono protokół na przykładzie proteazy ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1). Wprowadzona platforma testowa może być skutecznie wykorzystana w biochemicznej charakterystyce proteaz, w tym w pomiarach aktywności enzymatycznej w badaniach mutagenezy, kinetycznych, inhibicji lub swoistości, a także może być odpowiednia do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substratów lub może być dostosowana do innych enzymów proteolitycznych.
W tym systemie testowym, zastosowane substraty zawierają N-końcową heksahistydynę (His6) i znaczniki białka wiążącego maltozę (MBP), miejsca cięcia dla wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) i proteaz HIV-1 oraz C-końcowe białko fluorescencyjne. Substraty mogą być efektywnie wytwarzane w komórkach Escherichia coli i łatwo oczyszczane za pomocą kulek pokrytych chelaletem niklu (Ni). Podczas testu rozszczepienie proteolityczne substratów przyczepionych do kulek prowadzi do uwolnienia fluorescencyjnych fragmentów rozszczepienia, które można zmierzyć za pomocą fluorymetrii. Dodatkowo reakcje rozszczepienia można analizować za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylusiarczanu sodu (SDS-PAGE). Opisano również protokół renaturacji składników testu w żelu, ponieważ częściowa renaturyzacja białek fluorescencyjnych umożliwia ich detekcję na podstawie masy cząsteczkowej i fluorescencji.

Rysunek 1A pokazuje schematyczną strukturę reprezentatywnego rekombinowanego substratu białkowego, który może być przetwarzany przez HIV-1 PR w określonej sekwencji miejsca cięcia. <silna klasa="xfig">Rysunek 1B przedstawia produkcję substratów i ich możliwe zastosowania w testach proteazowych, w tym teście opartym na kulkach magnetycznych Ni-NTA i/lub PAGE.</silna>
Aby uzyskać wiarygodne dane za pomocą fluorymetrii, wymagana jest procedura kalibracji w celu określenia ilości substratów fluorescencyjnych i produktów rozszczepienia. W tym celu należy zmierzyć wartości intensywności fluorescencji różnych substratów w różnych warunkach buforowych i skorelować je z ich stężeniami w badanym zakresie stężeń (<klasa silna="xfig">Rysunek 3). Wartości nachylenia krzywych kalibracyjnych można zastosować do określenia ilości substratów i produktów rozszczepienia w próbkach testowych. Nachylenia krzywych kalibracyjnych są niezależne od sekwencji miejsc rozszczepienia wprowadzonych do substratów (Tabela 11) i mogą być potencjalnie wykorzystane do serii substratów połączonych z tym samym typem białka fluorescencyjnego. Wykresy powiększenia są pokazane dla wszystkich regresji liniowych, aby powiększyć również dolne zakresy stężeń (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Należy pamiętać, że kalibracja musi być wykonywana ostrożnie, ponieważ do wiarygodnej kalibracji wymagany jest odpowiedni rozkład punktów danych. Z tego powodu do przygotowania próbek do kalibracji stosuje się dwukrotne rozcieńczenie seryjne, ponieważ wartość R2 wskazuje na dobrą korelację między stężeniem białka fluorescencyjnego a fluorescencją tylko wtedy, gdy wykorzystano wystarczającą liczbę punktów danych, aby pokryć cały zakres stężeń. Ponadto błędy eksperymentalne mogą mieć duży wpływ na dokładność kalibracji; W związku z tym konieczna może być również graficzna ocena linii regresji.</silna></klasa>
Za pomocą testu proteazy można wykonać różne pomiary enzymatyczne, w tym badanie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji (Rysunek 4A). Dzięki regresji nieliniowej dane można wykorzystać do określenia parametrów kinetycznych enzymu (np. vmax i Km). Niewystarczająca zawiesina i dyspersja kulek oraz niewłaściwe zakończenie reakcji mogą powodować nieoptymalne wyniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B), które nie są odpowiednie do obliczania wiarygodnych wartości kinetycznych enzymów.</silna>
Zależność powstawania produktu od czasu można określić za pomocą testu (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A) (np. podczas optymalizacji parametrów reakcji rozszczepienia). Aktywność enzymu w obecności inhibitora może być również badana (<silna klasa="xfig">Rysunek 5B) w celu określenia stężenia aktywnego enzymu i stałej hamującej. Stosując tę samą metodologię, za pomocą testu można również badać działanie innych inhibitorów.</silna></silna>
Test proteazy jest również przydatny podczas badania wpływu pH na aktywność enzymów. <silna klasa="xfig">Rysunek 6A przedstawia zależność aktywności enzymu od pH na przykładzie TEV PR, który ma szeroki optymalny zakres pH (pH 6-9). Jeżeli badana jest zależność aktywności enzymu od pH (lub jeżeli konieczne jest zmierzenie enzymów o optymalnym pH kwaśnym), należy wziąć pod uwagę, że powinowactwo wiązania substratów rekombinowanych z kulkami może być ograniczone przy pH lekko kwaśnym. Podwyższona dysocjacja substratów od kulek (<klasa silna="xfig">Rysunek 6B) może spowodować zniekształcenie wyników testu. W celu uwzględnienia spontanicznej dysocjacji substratu od kulek, wartości zmierzone dla próbek reakcyjnych muszą zostać skorygowane przez wartości próbek B.</klasa></silna>
Rysunek 7 pokazuje, że niedenaturowane białka fluorescencyjne można rozróżnić w żelu na podstawie ich kolorów, korzystając z transilluminacji światłem niebieskim (Rysunek 7A). Jeśli konieczne jest określenie masy cząsteczkowej substratów/fragmentów rozszczepienia, warunki denaturacji można również zastosować do przygotowania próbki, ponieważ białka fluorescencyjne mogą być częściowo renaturyzowane w żelu i mogą być wykryte przez oświetlenie UV (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B) lub przez barwienie Coomassie (<silna klasa="xfig"> Rysunek 7C). Jeśli próbki R są analizowane, widoczne są tylko produkty rozszczepienia C-końcowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C), podczas gdy N-końcowe fragmenty rozszczepienia i nienaruszone substraty pozostają przyczepione do kulek. Czasami białka mogą być częściowo denaturowane pomimo stosowania warunków niedenaturujących (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C), a podczas gdy białka niedenaturowane są bardziej obfite, formy denaturowane są również wykrywalne w próbce. Zjawisko to nie ma wpływu na wykrywanie rozszczepienia proteolitycznego, ale musi być brane pod uwagę w przypadku densytometrii ilościowej próbek niedenaturowanych.</silna></silna></silna></silna>
Chociaż szczegółowy opis jest pokazany tylko dla testu opartego na probówce 2 mL, test można dostosować do 96-dołkowego systemu opartego na płytkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 8), który został już pomyślnie przetestowany w naszym laboratorium (nie pokazano). Format 96-dołkowy dostosowany do płytek jest w pełni kompatybilny z analizami fluorymetrycznymi i elektroforetycznymi, a uzyskane dane mogą być również oceniane w oparciu o metody opisane w tym artykule.</silna>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 3: Krzywe kalibracyjne. Reprezentatywne krzywe kalibracji substratu pokazano na przykładzie dwóch rekombinowanych substratów połączonych z różnymi C-końcowymi znacznikami fluorescencyjnymi: (A i B) His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 oraz (C i D) His6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP. Pokazano również powiększone rysunki reprezentujące regresję liniową punktów danych w zakresie stężeń substratu 0-0,005 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> 
Rysunek 4: Wyznaczanie parametrów kinetycznych enzymu. Pomiary kinetyczne zależne od substratu wykonano za pomocą HIV-1 PR (przy końcowym stężeniu czynnym 41,2 nM). Początkowe wartości prędkości zestawiono ze stężeniem substratu i przeprowadzono analizę regresji nieliniowej Michaelisa-Mentena. Słupki błędów reprezentują SD (n = 2). (A) Reprezentatywny optymalny wynik przedstawiono na przykładzie substratu białka fuzyjnego His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mApple. (B) Reprezentatywny wynik nieoptymalny przedstawiono również dla substratu His 6-MBP-KARVL*AEAM-mTurquoise2, gdzie ustawienie właściwych stężeń substratu było problematyczne ze względu na niewystarczającą homogenizację roztworu podstawowego SAMB, podczas gdy stosunkowo wysokie błędy były spowodowane niewłaściwym zakończeniem reakcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 5: Badanie przebiegu czasowego i hamowania. (A)Jego rekombinowany substrat białka fuzyjnego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP (o końcowym stężeniu 0,00326 mM) został rozszczepiony przez HIV-1 PR (przy końcowym stężeniu aktywnym 41,2 nM), a uwolnienie fluorescencyjnych fragmentów proteolitycznych PIVQ-mEYFP zostało zmierzone w celu przeprowadzenia analizy przebiegu w czasie. Pomiary przeprowadzono w pięciu różnych punktach czasowych. Słupki błędów reprezentują SD (n = 2). (B) Jego 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mEYFP zastosowano jako substrat (w stężeniu 0,0015 mM) w celu określenia hamującego wpływu amprenawiru na aktywność HIV-1 PR (przy całkowitym stężeniu 163,8 nM). Na podstawie danych można było ocenić połowę maksymalnego stężenia hamującego (IC50), a także stężenie aktywnego enzymu (końcowe stężenie aktywne 41,2 nM) zastosowanego PR HIV-1 na podstawie krzywej hamowania. Słupki błędów reprezentują SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> 
Rysunek 6: Badanie zależności aktywności enzymu i spontanicznej dysocjacji substratu od pH. (A) Substrat His 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 (w 0,033 mM) został użyty do pomiaru aktywności enzymatycznej TEV PR (przy końcowym całkowitym stężeniu 91,42 nM) w buforze rozszczepiającym ustawionym na inne pH, w zakresie 6,5-8,5. Słupki błędów reprezentują SD (n = 2). Wykreślone dane zostały opublikowane wcześniej14. (B) Na podstawie względnych wartości intensywności fluorescencji ślepych próbek substratu, spontaniczną dysocjację substratu He 6-MBP-VSQNY*PIVQ-mTurquoise2 (0,033 mM) od kulek magnetycznych badano przy użyciu buforu rozszczepialnego o innym pH, w zakresie 6,0-8,5. Wykreślone dane zostały opublikowane wcześniej14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> 
Rysunek 7: Wykrywanie białek w żelu różnymi metodami. (A) Nietryskane i trawione przez HIV-1 PR substraty białkowe po przygotowaniu próbki bez denaturacji były wizualizowane przez transillumination światłem niebieskim po SDS-PAGE. Reakcję rozszczepienia przeprowadzono przez trawienie w roztworze. (B) Bezpośrednio po PAGE tylko niezdenaturowane białka można było wykryć w żelu za pomocą oświetlenia UV, podczas gdy po usunięciu SDS wcześniej zdenaturowane białka fluorescencyjne uległy częściowej reanaturyzacji i były wykrywalne. Próbki przygotowano z supernatantów testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA. (C) Barwienie Coomassie może być również stosowane do wykrywania białek po renaturacji w żelu. SDS - obecny w żelu - może powodować częściową denaturację białka natywnego, ale w próbkach natywnych formy niedenaturowane są bardziej obfite. Próbki przygotowano z supernatantów testu opartego na kulkach magnetycznych Ni-NTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> 
<silna klasa="xfig">Rysunek 8: 96-dołkowa adaptacja platformy testowej oparta na płytkach. (A) Test można przeprowadzić nie tylko w probówkach 2 ml, ale także w dołkach płytki 96-dołkowej. Tutaj pokazujemy schematyczną reprezentację zastosowania testu do badania specyficzności fikcyjnej proteazy przy użyciu serii substratów fluorescencyjnych, które mogą zawierać sekwencje miejsc cięcia typu dzikiego (wt) lub zmutowane (mut-1 do mut-4). Do obchodzenia się z kulkami magnetycznymi w eksperymentach ma być użyty 96-dołkowy koncentrator cząstek magnetycznych (MPC). Wszystkie wskazane objętości są związane z jedną studnią. Aby porównać wydajność rozszczepiania różnych substratów, konwersję substratu można ocenić na podstawie procentu wartości RFU skorygowanych o ślepą próbę substratu próbek reakcyjnych, biorąc pod uwagę wartości RFU skorygowane o substrat ślepą próbę powiązanych próbek kontrolnych substratu wynoszące 100. (B) Po fluorymetrii oddzielone supernatanty próbek testowych mogą być również analizowane za pomocą PAGE, a składniki białek fluorescencyjnych mogą być analizowane bezpośrednio lub po renaturacji w żelu w przypadku przygotowania próbki niedenaturującej i denaturującej. Na każdym rysunku przedstawiono również trzy różne typy próbek testowych: C = kontrola substratu, B = ślepa próba substratu i R = reakcja. Próbki kontrolne substratu znajdują się w buforze elucyjnym, podczas gdy ślepa próba substratu i próbki reakcyjne znajdują się w buforze rozszczepialnym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a></silna>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>bufor</td>
			<td>Białko fluorescencyjne</td>
			<td>CV% nachyleń (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elucji</td>
			<td rowspan="2">mTurkusowy2</td>
			<td>Klasa 6.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łupliwość</td>
			<td>Klasa 9.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elucji</td>
			<td rowspan="2">mJabłko</td>
			<td>Godzina 10,92</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łupliwość</td>
			<td>Godzina 12.68</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 11: Wartości współczynnika wariancji (CV%) nachyleń krzywych kalibracji podłoża. Aby sprawdzić, czy fluorescencja rekombinowanych substratów białkowych jest zależna od wstawionego miejsca rozszczepienia, kalibracje przeprowadzono za pomocą serii substratów połączonych mApple i mTurquoise2 (sześć wariantów dla każdego, zawierających różne sekwencje miejsca cięcia proteazy HIV-1), zarówno w elucyjnych, jak i rozszczepiających. Stwierdziliśmy, że wartości CV% nachyleń są niższe niż 15% we wszystkich przypadkach, co oznacza, że pojedyncza kalibracja podłoża może być wykorzystana do oceny różnych pomiarów wykonanych przez warianty podłoża zawierające ten sam znacznik fluorescencyjny.

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Proteazy są jedną z najlepiej zbadanych grup podpór biomolekularnych w badaniach akademickich i przemysłowych. Ich potężna rola w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych sprawia, że są one również ważnym celem w dziedzinie odkrywania leków. Jeśli chodzi o ich intensywne badania, istnieje duże i ciągłe zapotrzebowanie na rozwój oszczędzających czas i koszty, wysokoprzepustowych, kompatybilnych z badaniami przesiewowymi platform do oznaczania proteaz fluorescencyjnych.W tym miejscu chcielibyśmy przedstawić protokół stosowania opartej na separacji, wysokoprzepustowej, kompatybilnej z badaniami przesiewowymi platformy do badań fluorescencyjnych przy użyciu rekombinowanych substratów proteazy fuzyjnej mTurquoise2 i mApple. Dodatkowo chcielibyśmy zademonstrować metodę renaturacji substratów i fragmentów rozszczepienia w żelu próbek testowych po denaturacji SDS-PAGE. Wszystkie eksperymenty prowadzone są na przykładzie proteazy wirusa HIV-1.Plazmid ekspresyjny przenosi sekwencję kodującą znacznika powinowactwa hexa histadiny i białka fuzyjnego wiążącego maltozę, a następnie kontrolne miejsce cięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu, kasetę klonującą i C-końcowe białko fluorescencyjne. Linearyzuj plazmid ekspresji za pomocą endonukleaz restrykcyjnych PacI i NheI. Wykonaj wyżarzanie starterów oligonukleotydowych Escherichia coli zoptymalizowanych do przodu i do tyłu, które kodują interesującą sekwencję substratu i flankują kohezyjne końce PacI i NheI.Przeprowadzić wprowadzanie wyżarzonych starterów do zlinearyzowanego plazmidu ekspresyjnego przez ligację. W celu ekspresji białek przekształć kompetentne komórki BL21(DE3) za pomocą mieszaniny ligacyjnej. Białka fluorescencyjne znajdą się w tej samej otwartej ramce odczytu z N-końcowymi znacznikami fuzyjnymi dopiero po udanej ligacji.Kilka dni po transformacji, kolonie zawierające plazmid ekspresyjny kodujący wstawione miejsce rozszczepienia będące przedmiotem zainteresowania będą wykazywać widoczną fluorescencję z użyciem lub nawet bez użycia niebieskiego transiluminatora Dark Reader. Dodać 10 mikrolitrów glicerolu w komórkach BL21 (DE3) przenoszących plazmid ekspresyjny kodujący sekwencję miejsca rozszczepienia będącą przedmiotem zainteresowania do pięciu mililitrów pożywki LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni przez 15 godzin, ciągle wstrząsając.Przenieś pięć mililitrów kultury bakteryjnej do 50 mililitrów świeżej pożywki LB zawierającej 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Hoduj komórki pod kątem 37 stopni do absorbancji od 0,6 do 0,8 przy długościach fal 600 nanometrów. W tym momencie indukuj ekspresję białka przez dodanie IPTG.Następnie inkubuj kulturę przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni, ciągle wstrząsając. Po inkubacji przenieś 25 mililitrów kultury do czystych 50-mililitrowych probówek wirówkowych i zbierz komórki przez odwirowanie. Wyrzucić supernatant i przechowywać granulki komórek bakteryjnych w temperaturze minus 70 stopni przez co najmniej godzinę.Granulki komórkowe zawierające pomyślnie eksprymowane białka fluorescencyjne wykazują wyraźną fluorescencję z użyciem lub nawet bez użycia niebieskiego transiluminatora Dark Reader. Umieść zamrożone granulki komórkowe na lodzie i pozwól im się rozmrozić przez 15 minut. Dodaj dwa mililitry buforu do lizy do osadu i zawieś komórki.Następnie dodać inhibitor proteazy, uwolnić zawiesinę za pomocą lizozymu i DNazy, zawiesić komórki i inkubować zawiesinę na lodzie przez 15 minut. Przenieś dwa razy jednomililitrowe zawiesiny do 1,5-mililitrowych probówek wirówek i poddawaj zawiesiny sonikacji przez trzy minuty w rundach po 10 sekund sonikacji i pięciosekundowej przerwie. Odwirować probówki o masie 10 000 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Oczyszczone lizaty komórek bakteryjnych zawierające interesujący nas substrat fluorescencyjny wykazują widoczną fluorescencję z użyciem lub nawet bez użycia niebieskiego transiluminatora Dark Reader. Procedura opracowanego testu proteazy rozpoczyna się od przygotowania próbek testowych. Po pierwsze, rekombinowane substraty są inkubowane z kulkami magnetycznymi o powinowactwie, a następnie powstają kulki magnetyczne przyczepione do substratu, w skrócie SAMB.SAMB są kilkakrotnie myte, a na koniec przygotowuje się roztwór podstawowy SAMB, przez podanienie którego tworzone są próbki testowe. Reakcje są inicjowane przez dodanie roztworu proteazy. Po rozszczepieniu przez proteazę fragmenty proteolityczne są uwalniane do supernatantu.Reakcja kończy się oddzieleniem kulek magnetycznych od buforu reakcyjnego, który zawiera fluorescencyjne produkty rozszczepienia i enzym. Supernatanty nanosze nakłada się na studzienki płytki mikromiareczkowej, a fluorescencję określa się za pomocą fluorymetrii. Krzywe kalibracyjne są generowane przy użyciu oczyszczonych substratów fluorescencyjnych rozpuszczonych w każdym buforze testowym.Stężenie C-końcowych fluorescencyjnych produktów rozszczepienia, a także stężenie zastosowanego substratu w próbkach testowych określa się na podstawie nachylenia krzywych kalibracyjnych. Umieść probówkę zawierającą nowe lub pochodzące z recyklingu magnetyczne kulki agarozy niklowo-NPA w magnetycznym koncentratorze cząstek. Koraliki mogą przyklejać się do ściany i/lub do pokrywy probówki do mikrowirówki.Dlatego obróć koncentrator do góry nogami we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że wszystkie koraliki zostały zebrane. Usunąć supernatant i wyrzucić go. Dodaj 1,8 mililitra buforu do lizy do kulek i wyjmij zamknięte probówki z koncentratora.Zawieś koraliki w tubie, potrząsając i/lub obracając rurkę do góry nogami, aż kulki będą całkowicie jednorodne. Umieść probówki z powrotem w koncentratorze i odwróć je do góry nogami we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że wszystkie koraliki zostały zebrane. Otworzyć probówkę i wyrzucić supernatant.Dodać oczyszczony bakteryjny sterylny lizat zawierający interesujący nas substrat i wyjąć zamkniętą probówkę z koncentratora. Odwróć rurki do góry nogami, aż kulki będą całkowicie jednorodne i obracaj rurki za pomocą rotatora, powoli, w temperaturze pokojowej przez 30 minut. SAMB wykazują widoczną fluorescencję z użyciem lub nawet bez użycia niebieskiego transiluminatora Dark Reader.Umyj SAMB trzykrotnie za pomocą 1,8 mililitra 1%Tween 20, buforem do prania i buforem do łupania. Dodaj bufor łupliwości do umytych SAMB, aby utworzyć roztwór podstawowy SAMB. W przypadku stosowania dwumililitrowych probówek wirówkowych o niskiej wiązalności białka objętość zastosowanego buforu rozszczepiającego wynosi do 1,9 mililitra.Po dodaniu buforu nie należy potrząsać ani odwracać rurki do góry nogami. Zamknij rurkę i wyjmij ją z koncentratora. Przygotować dwumililitrowe probówki wirówkowe do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania białka do próbek testowych.Zawiesić roztwór podstawowy SAMB do momentu, aż stanie się całkowicie jednorodny i zmierzyć ilość substratu do analizy w reakcjach, natychmiast przenosząc roztwór podstawowy SAMB do fiolek z próbkami. Zaleca się, aby objętość roztworu podstawowego SAMB, który ma być przeniesiony, wynosiła od 25 do 300 mikrolitrów, ale należy ją ustawić zgodnie z indywidualnym projektem doświadczalnym. Umieścić probówki z próbkami zawierające podane zawiesiny SAMB w koncentratorze.Ostrożnie usunąć supernatant z SAMB i wyrzucić go. Wyjąć probówki z koncentratora i ostrożnie dodać bufor reakcyjny do SAMB. Objętość dodanego buforu reakcyjnego należy obliczyć zgodnie z indywidualnym projektem doświadczalnym, ale zaleca się ustawienie końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej między 50 a 150 mikrolitrów, jeśli stosuje się probówki dwumililitrowe.Zamknij pokrywy probówek. Teraz próbki są gotowe do zainicjowania. Dodać roztwór enzymu do próbek reakcyjnych.Ostrożnie wymieszaj kulki, delikatnie przesuwając probówki i natychmiast umieść je w już trzęsącym się termoshakerze. W przypadku próbek zerowych substratu i próbek kontrolnych substratu należy dodać odpowiednio bufor rozszczepialny i bufor elucyjny. Trzydzieści sekund przed zakończeniem inkubacji wyjąć próbkę z termowytrząsarki i niezwłocznie ją odkręcić.Umieść probówkę na koncentratorze i odstaw probówkę na 15 sekund. Zbieranie SAMB może być ułatwione poprzez lekkie przesuwanie koncentratora do przodu i do tyłu. Otworzyć pokrywkę i ostrożnie przenieść supernatant do płytki lub nowej probówki.Nie dotykaj zagęszczonych kulek końcówką pipety. Pobrany supernatant z próbek kontrolnych substratu oraz próbek reakcyjnych o wysokim stopniu rozszczepienia może wykazywać widoczną fluorescencję z użyciem lub nawet bez użycia transiluminatora Dark Reader blue. Przenieść dwa razy po 30 mikrolitrów oddzielonych supernatantów próbki na czarną mikropłytkę o połowie powierzchni.Zmierz fluorescencję za pomocą fluorymetru przy użyciu odpowiednich filtrów zgodnie z zastosowanym białkiem fluorescencyjnym. W celu oczyszczenia substratów fluorescencyjnych należy przygotować ten sam roztwór, jak opisano wcześniej, i odrzucić supernatant. Dodać od 400 do 600 mikrolitrów buforu elucyjnego do SAMB i powoli obracać probówki za pomocą rotatora w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Przenieść eluat do nowych probówek wirówkowych o niskim poziomie wiązania białek. Pokazuje wyraźnie widoczną fluorescencję z użyciem lub bez użycia niebieskiego transiluminatora Dark Reader. Po oczyszczeniu, wymianie buforu i pomiarze zawartości białka, przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenie w co najmniej ośmiu etapach, zarówno z roztworów substratu rozpuszczonych w buforze elucji, jak i rozszczepienia-buforu, używając odpowiednio buforu elucji lub rozszczepienia do rozcieńczenia.Przenieść 30 mikrolitrów każdego punktu rozcieńczenia na czarną mikropłytkę o połowie powierzchni. Zmierzyć fluorescencję za pomocą fluorymetru, stosując te same ustawienia, które zostały zastosowane przy pomiarze supernatantów próbki testowej. Jako przykład do przetwarzania danych, pomiary kinetyczne proteazy HIV-1 zależne od substratu przeprowadzono na formie rekombinowanego substratu skondensowanego mTurquoise2 kodującego miejsce cięcia między macierzą a białkami kapsydu w naturalnym prekursorze białka gapiowego.Wykreślić skorygowane względne wartości intensywności fluorescencji w stosunku do stężenia molowego oczyszczonych substratów, rozpuścić bufor łupliwy lub elucyjny i przeprowadzić regresję liniową. Obliczyć stężenie molowe C-końcowych produktów rozszczepienia w próbkach reakcyjnych, wykorzystując nachylenie krzywej kalibracyjnej opartej na rozszczepieniu i buforze. Należy również obliczyć stężenie zastosowanego substratu w próbkach reakcyjnych na podstawie stężenia molowego eluowanego substratu w próbkach kontrolnych substratu, korzystając z nachylenia krzywej kalibracyjnej opartej na buforze elucji.Początkowe wartości prędkości obliczono na podstawie ilości fragmentów rozszczepienia C-końcowego, a następnie zestawiono je ze stężeniem zastosowanego substratu. Parametry kinetyczne wyznaczono również za pomocą analizy regresji nieliniowej Michaelisa-Mentena. Po wykonaniu testu magnetycznego na bazie kulek niklowo-NTA, supernatanty testowe można również analizować za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.Jednak oprócz analizy próbek testowych możliwa jest również analiza oczyszczonych substratów fluorescencyjnych i/lub fragmentów rozszczepienia po mineralizacji w roztworze. Do mineralizacji w roztworze, oczyszczone substraty fluorescencyjne do trawienia rozpuścić w buforze rozszczepiającym do 1,5 mililitrowych probówek mikrowirówek i dodać roztwór enzymu do próbek. Inkubować próbki zgodnie z planem doświadczalnym i zakończyć reakcje zgodnie z procedurą przygotowania próbki do PAGE.W przypadku przygotowania próbki nieskażonej należy zmieszać próbki przeznaczone do analizy z niedenaturującym buforem ładującym próbkę niezawierającym środków redukujących. W przypadku przygotowania próbki denaturowanej należy zmieszać próbki przeznaczone do analizy z buforem ładującym denaturację próbki i poddać próbki obróbce cieplnej w temperaturze 95 stopni przez 10 minut. Próbki niedenaturowane i denaturowane należy umieścić w studzienkach żelu poliakryloamidowego SDS i przeprowadzić elektroforezę.Wyjmij kasetę z żelem z modułu roboczego. Niezdenaturowane próbki są już widoczne w żelu nawet gołym okiem lub za pomocą niebieskiego transiluminatora Dark Reader. W celu wykrycia składników fluorescencyjnych zdenaturowanych próbek na transiluminatorze, należy przeprowadzić renaturację w żelu, wypłukując SDS z żelu.Do żelu dodaj 100 mililitrów wody destylowanej i płucz go co najmniej przez 30 minut. Wizualizację białek fluorescencyjnych poprzez umieszczenie niezabarwionego żelu na niebieskim transiluminatorze Dark Reader. Rekombinowane fluorescencyjne białka fuzyjne zostały zaprojektowane tak, aby można je było wykorzystać jako substraty w testach proteolitycznych.Po rozszczepieniu przez proteazę w określonym miejscu rozszczepienia, C-końcowy fluorescencyjny fragment rozszczepienia jest uwalniany i można wykryć jego fluorescencję. Ich zastosowanie w teście opartym na kulkach magnetycznych niklu-NTA oraz detekcja fluorescencyjna za pomocą analizy PAGE zostały zoptymalizowane przy użyciu proteazy HIV-1. Jednak opracowana platforma testowa może być odpowiednia również dla innych proteaz.Krzywe kalibracyjne oczyszczonych substratów rozpuszczonych w buforze rozszczepialnym lub elucyjnym zilustrowano na przykładach zarówno skondensowanej formy rekombinowanego substratu mTurquoise2, jak i mEYFP, kodującej stronę rozszczepienia między matrycą a białkami kapsydu naturalnego białka bezechowego HIV. Test magnetyczny oparty na kulkach niklowo-NTA jest użytecznym narzędziem do badania wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji, a tym samym umożliwia również określenie parametrów kinetycznych enzymu, takich jak Vmax i Km. Wykres A przedstawia optymalny wynik uzyskany po pomyślnie przeprowadzonej analizie aktywności zależnej od substratu na substracie skonfundowanym przez mApple.Natomiast wykres B przedstawia wynik nieoptymalny, w którym niewystarczająca homogenizacja roztworu podstawowego SAMB powoduje problemy z ustaleniem prawidłowych stężeń substratu, podczas gdy niewłaściwe zakończenie próbek reakcji skutkuje stosunkowo dużymi błędami. Test stanowi również odpowiednie narzędzie do przeprowadzania badań przebiegu w czasie i hamowania. Wykres A przedstawia zależność w czasie proteolitycznego rozszczepienia proteazy HIV-1 od substratu skondensowanego z mEYFP, podczas gdy wykres B przedstawia hamujący wpływ amprenawiru na reakcję rozszczepienia.Na podstawie danych uzyskanych w badaniu hamującym można określić zarówno stężenie aktywnego enzymu, jak i stałą hamującą. Test można również zoptymalizować w celu zbadania zależności aktywności enzymu od pH, ponieważ jest on przedstawiony na wykresie A na przykładzie proteazy wirusa wytrawiania tytoniu. Wykres B wskazuje na ograniczenie testu przez pH i pokazuje, że obojętne lub lekko zasadowe pH jest w pełni zgodne z pomiarami, podczas gdy kwaśne pH ułatwia spontaniczną dysocjację substratów od powierzchni kulek magnetycznych.Prezentowany rysunek przedstawia oczyszczone, nienaruszone substraty fluorescencyjne, fluorescencyjne fragmenty rozszczepienia C-końcowego, powstałe w wyniku trawienia w roztworze przez proteazę HIV-1. Składniki fluorescencyjne można wykryć w żelu poliakrylamidowym zawierającym kartę charakterystyki poprzez transoświetlenie światłem niebieskim zaraz po elektroforezie, jeśli podczas przygotowania próbki zastosowano warunki niedenaturujące. Różne białka fluorescencyjne można rozróżnić na podstawie ich koloru.Po teście opartym na kulkach magnetycznych, niedenaturowane białka fluorescencyjne w supernatantach próbki można również wykryć w żelu za pomocą oświetlenia UV. W przeciwieństwie do tego, jeśli podczas przygotowywania próbki stosowane są warunki denaturacji, zdenaturowane białka nie mogą być wykryte w żelu bezpośrednio po SDS PAGE. Jednak zdenaturowane białka fluorescencyjne mogą zostać częściowo zrenaturyzowane przez usunięcie SDS z żelu i stać się wykrywalne.W związku z tym po STRONIE SDS następuje procedura renaturacji w żelu. Zdolność renaturyzacji białek fluorescencyjnych umożliwia ich identyfikację nie tylko na podstawie ich fluorescencji, ale także na podstawie ich masy cząsteczkowej. W tym miejscu zademonstrowaliśmy protokół korzystania z naszej niedawno opracowanej platformy do oznaczania proteaz fluorescencyjnych na bazie kulek magnetycznych.Zastosowanie tego systemu zademonstrowaliśmy na przykładzie badań kinetycznych enzymów na proteazie HIV-1. Użyliśmy form rekombinowanego substratu do oznaczania mTurkusowego i mApple, który zawierał sekwencję miejsca rozszczepienia proteazy. Oprócz analizy fluorymetrycznej, próbki testowe były następnie analizowane również przez SDS PAGE.Wykazaliśmy, że denaturowane białka fluorescencyjne mogą być częściowo reanaturyzowane w żelu po SDS PAGE, który zapewnia zarówno fluorescencyjną, jak i molekularną identyfikację substratu i fragmentów proteolitycznych.

use-recombinant-fusion-proteins-fluorescent-protease-assay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Opisano nową metodę badania kinetyki enzymatycznej, wykorzystującą ilościową analizę sygnałów FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Wyznaczono wartości KM oraz kcat dla hydrolizy domeny katalitycznej SENP1 (proteazy 1 specyficznej dla SUMO/Sentryny) w odniesieniu do pre-SUMO1 (małego modyfikatora podobnego do ubikwityny). Ogólne zasady tego ilościowego badania kinetyki proteaz w oparciu o technikę FRET mogą zostać zastosowane do innych proteaz.

Ilościowa analiza FRET (Förster Resonance Energy Transfer) w celu oznaczenia kinetyki proteazy SENP1

W tym filmie wykonujemy zymografię, technikę elektroforetyczną, aby przeanalizować aktywność proteolityczną w próbkach biologicznych.

Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Interakcje białko-białko są kluczowe dla systemów biologicznych, a badania kinetyki wiązania dostarczają wglądu w dynamikę i funkcję kompleksów białkowych. Opisujemy metodę, która określa ilościowo parametry kinetyczne kompleksu białkowego za pomocą rezonansu fluorescencyjnego, transferu energii i techniki zatrzymanego przepływu.

Wykorzystanie transferu energii rezonansu fluorescencyjnego in vitro do badania dynamiki kompleksów białkowych w milisekundowej skali czasowej

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

Poznaj nową platformę testową proteaz opartą na fluorescencyjnych białkach fuzyjnych i magnetycznych kulkach agarozowych. Metoda umożliwia badania kinetyczne enzymów, w tym HIV-1 proteazy, oraz wysokoprzepustowe przesiewanie inhibitorów.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Przeglądaj więcej filmów