Name: Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj metody izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z miazgi zęba i ich współhodowlę z komórkami raka prostaty. Technika ta umożliwia badanie interakcji in vitro bez użycia organizmów żywych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Uniwersytet Yeditepe. Wszystkie dane i rysunki użyte w tym artykule zostały wcześniej opublikowane34.

Po uzyskaniu zgody Instytucjonalnej Komisji Etycznej uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjentów.
1. Izolacja i hodowla komórek DPSC
<ol>
	<li>Zęby mądrości pobrane od młodych dorosłych w wieku od 17 do 20 lat przenieść w ciągu 8 h po ekstrakcji do probówek o pojemności 15 mL zawierających pełną pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) [pożywka DMEM o niskiej zawartości glukozy, uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% roztwór penicyliny/streptomycyny/amfoterycyny (PSA)]. Materiał tkankowy należy utrzymać w niskiej temperaturze (4 °C) podczas przenoszenia, aby uniknąć potencjalnej śmierci komórek.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety ekstrakcyjnej ostrożnie usunąć tkankę miazgi z centrum zęba, umieścić ją w zimnej, pełnej pożywce DMEM w 10 cm szalkach do hodowli tkankowej i posiekać skalpelem na małe fragmenty (2-3 mm). 
	UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne powinny być przeprowadzane w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ta nieenzymatyczna technika była stosowana wcześniej21,22,23.</li>
	<li>Małe fragmenty miazgi umieścić w 6-dołkowych płytkach przeznaczonych do hodowli tkankowej i dodać 200 µL pełnej pożywki DMEM, aby pokryć każdy fragment miazgi.</li>
	<li>Inkubować dołki z kulturą tkankową w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza (wilgotność 80%) z 5% CO2 przez 2 h, aby umożliwić przyleganie tkanek. 
	UWAGA: Krok ten można przedłużyć do 3-4 h, kontrolując odparowywanie pożywki.</li>
	<li>Do dołków dodać odpowiednią objętość (2-2,5 mL) pełnej pożywki DMEM i inkubować w 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza z 5% CO2, aby komórki mogły wyjść z tkanki. 
	UWAGA: Komórki stają się widoczne po około 4 dniach i osiągają konfluencję po 8-9 dniach.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, usunąć pożywkę z płytek 6-dołkowych, przemyć 2 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) i dodać 2 mL trypsyny. Inkubować przez 2 min w inkubatorze w 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza i 5% CO2. Następnie dodać 2 mL pełnej pożywki DMEM i inkubować przez 2 min w celu zahamowania działania trypsyny. Wirować komórki przy 300 x g przez 5 min w celu utworzenia osadu komórkowego.</li>
	<li>Przesiać komórki do kolb w pełnej pożywce DMEM i przechowywać do dalszych eksperymentów. Do kolb T-75 dodać 15 mL pełnej pożywki DMEM, przenieść komórki z dwóch dołków płytki 6-dołkowej do jednej kolby T-75 i inkubować w 37 °C w atmosferze nawilżonego powietrza i 5% CO2.</li>
</ol>
2. Charakterystyka DPSCs
<ol>
	<li>Przeprowadź analizy morfologiczne.
	<ol>
		<li>Wysiej komórki (krok 1.6) do pokrytych kolb do hodowli tkanek (lub płytek 6-dołkowych) w pełnej pożywce DMEM na co najmniej 8 pasaży, aby zaobserwować morfologię komórek.</li>
		<li>Zwizualizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego i zdefiniuj morfologię komórek przypominającą fibroblasty. Komórki powinny przytwierdzić się do naczyń hodowlanych i wykazywać wrzecionowatą morfologię. 
		UWAGA: Alternatywnie komórki można hodować jako pojedyncze komórki do 14 dni w płytkach wielodołkowych, aby zaobserwować zdolność do tworzenia kolonii, co jest specyficzną cechą fibroblastów i MSC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizy markerów powierzchniowych.
	<ol>
		<li>Trypsynizuj komórki z kroku 1.7. Usuń pożywkę z kolby do hodowli tkanek T-75, przemyj 2 mL PBS i dodaj 2 mL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze wilgotnego powietrza i 5% CO2. Następnie dodaj 2 mL pełnej pożywki DMEM, a następnie inkubuj przez 2 min, aby zahamować działanie trypsyny. Wirować komórki z prędkością 300 x g przez 5 min w celu utworzenia osadu komórkowego.</li>
		<li>Utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 20 min w temperaturze pokojowej w probówkach 1,5 mL, a następnie przemyj je 3 razy 500 µL PBS, aby usunąć paraformaldehyd.</li>
		<li>Inkubuj utrwalone komórki z przeciwciałami przeciwko CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 i CD73 przez 1 h w temperaturze 4 °C w 100 µL PBS. 
		UWAGA: Stosowane stężenie przeciwciał wynosi 0,5 µg/mL. CD34, CD14 i CD45 służą jako markery negatywne, natomiast CD29, CD90, CD105, CD166 i CD73 służą jako pozytywne markery powierzchniowe komórek dla MSC.</li>
		<li>Przemyj komórki 3 razy PBS i użyj odpowiednich przeciwciał wtórnych, takich jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), fykoerytryna (PE) itp. do znakowania. Inkubuj komórki z przeciwciałami wtórnymi rozcieńczonymi 1:500 w 100 µL PBS przez 30 min w temperaturze 4 °C i przemyj 3 razy PBS.</li>
		<li>Przechowuj próbki w ciemności do analizy cytometrycznej i wykryj barwienie pozytywne i negatywne za pomocą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Użyj niebarwionych komórek kontrolnych do ustawienia rozproszonego światła przedniego i bocznego (forward i side scatter). Ustaw bramkowanie (gating) populacji zabarwionych pozytywnie, wykluczając martwe komórki, debris i populację niebarwioną. Użyj dyszy 100 µm z ciśnieniem osłonki 45 psi i zbierz 10 000 zdarzeń, aby określić liczbę pozytywnych DPSC poprzez ustawienie kanałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź różnicowanie DPSC.
	<ol>
		<li>Wysiej 1 × 104 komórek na płytki 24-dołkowe w pełnej pożywce DMEM i inkubuj przez 24 h w temperaturze 37 °C w atmosferze wilgotnego powietrza z 5% CO2.</li>
		<li>Przygotuj pożywki do różnicowania, używając pełnej pożywki DMEM jako bazy. Przygotuj pożywkę osteogenną, mieszając 100 nM deksametazonu, 10 mM β-glicerylofosforanu i 0,2 mM kwasu askorbinowego. Przygotuj pożywkę chondrogenną, mieszając 1× insulin-transferrin-selenium (ITS-G), 100 nM deksametazonu, 100 ng/mL czynnika wzrostu TGF-beta (TGF-β), 14 μg/mL kwasu askorbinowego i 1 mg/mL albuminy surowicy wołowej (BSA). Przygotuj pożywkę adipogenną, mieszając 100 nM deksametazonu, 5 μg/mL insuliny, 0,5 mM 3-izobutyl-1-metylksantynę (IBMX) i 60 μM indometacynę. 
		UWAGA: Pożywki do różnicowania można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden tydzień.</li>
		<li>Zmień pożywkę wzrostową na pożywkę do różnicowania osteogennego, chondrogennego lub adipogennego i odświeżaj pożywkę dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie.</li>
		<li>Potwierdź różnicowanie za pomocą barwienia metodą von Kossa i błękitem Alciana, analizy aktywności enzymatycznej (aktywność fosfatazy zasadowej), immunocytochemii oraz ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej (qPCR) zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami21.
		<ol>
			<li>Wykonaj barwienia metodą von Kossa i błękitem Alciana na komórkach utrwalonych 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 10 min. Przemyj utrwalone komórki PBS i zabarw je przy użyciu zestawu von Kossa zgodnie z zaleceniami producenta, aby zaobserwować złogi wapnia.</li>
			<li>Przygotuj roztwór barwiący błękitem Alciana, rozpuszczając 1,00 g barwnika błękitu Alciana w 100 mL 3% (v/v) kwasu octowego do dalszego barwienia. Przemyj utrwalone komórki PBS i barw je przez 30 min roztworem błękitu Alciana. Zwizualizuj zabarwione próbki za pomocą mikroskopu świetlnego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki uwarunkowanej (CM)
<ol>
	<li>Wymień pożywkę komórek z kroku 1.7 na świeże, kompletne DMEM na 24 h przed pobraniem CM. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie pasaży 2-4.</li>
	<li>Pobierz pożywkę kondycjonowaną (CM) z hodowli DPSCs, gdy komórki osiągną 80% konfluencji. Wirowarkuj pobraną pożywkę przy 300 x g przez 5 min, aby usunąć resztki tkankowe i debris komórkowy. 
	UWAGA: Alternatywnie można użyć filtrów strzykawkowych 0,2 µm w celu usunięcia debris z pożywki kondycjonowanej.</li>
	<li>Zbierz nadsącz i przechowuj go w temperaturze -20 °C do dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Do długoterminowego przechowywania nadsącz należy trzymać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Traktowanie komórek nowotworowych CM
<ol>
	<li>Przeprowadź analizy żywotności komórek.
	<ol>
		<li>Wysiej komórki PC-3 (komórki raka prostaty człowieka) na płytki 96-dołkowe z gęstością 5 × 103 komórek/dołek w pełnej pożywce DMEM i inkubuj w komorze z nawilżoną atmosferą w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.</li>
		<li>Traktuj komórki 10, 20, 30, 40 i 50% CM (v/v) zmieszanych z pełną pożywką DMEM przez 24 h.</li>
		<li>Zmierz żywotność komórek, stosując test MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium) zgodnie z wcześniej opisaną metodą24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizy TUNEL (znakowanie końców nacięć dUTP przez terminalową deoksynukleotydylotransferazę).
	<ol>
		<li>Wysiej komórki PC-3 na 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z gęstością 2 × 105 komórek/dołek i inkubuj w komorze z nawilżoną atmosferą w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.</li>
		<li>Wymieszaj 20% CM (v/v) z pełną pożywką DMEM i dodaj do komórek na 24 h.</li>
		<li>Trypsynizuj komórki i zawieś w 50 μL mieszaniny reakcyjnej TUNEL (roztwór znakujący + roztwór enzymu, dostarczone w zestawie), a następnie inkubuj w 37 °C przez 60 min w nawilżonej atmosferze z 5% CO2. 
		UWAGA: W celu trypsynizacji usuń pożywkę z 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych, przemyj 1 mL PBS i dodaj 500 µL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze powietrznej z 5% CO2. Dodaj 1 mL pełnej pożywki DMEM, a następnie inkubuj przez 2 min, aby zahamować działanie trypsyny. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min w celu uzyskania osadu komórkowego.</li>
		<li>Przepłucz PBS i przeanalizuj komórki w PBS za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizy qPCR.
	<ol>
		<li>Wysiej komórki PC-3 na 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowej z gęstością 2 × 105 komórek/dołek i inkubuj w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.</li>
		<li>Wymieszaj 20% CM (v/v) z pełną pożywką DMEM i dodaj do komórek na 24 h.</li>
		<li>Trypsynizuj komórki i zbierz osad komórkowy do izolacji RNA i syntezy cDNA. 
		UWAGA: Usuń pożywkę z 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowej, przemyj 1 mL PBS i dodaj 500 µL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze powietrznej z 5% CO2. Dodaj 1 mL pełnej pożywki DMEM, a następnie inkubuj przez 2 min, aby zahamować działanie trypsyny. Odwiruj komórki przy 300 x g przez 5 min w celu uzyskania osadu komórkowego.</li>
		<li>Przeprowadź eksperymenty qPCR zgodnie z wcześniej opisanym protokołem25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizę migracji komórek nowotworowych.
	<ol>
		<li>Wysiej 1 × 105 komórek PC-3 na płytki 12-dołkowe i inkubuj w nawilżonym inkubatorze przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
		<li>Wykonaj zadrapanie (scratch) w warstwie komórek za pomocą sterylnego końcówki 200 μL i niezwłocznie wymień pożywkę na świeżą zawierającą różne stężenia CM [np. 10, 20, 30, 40 i 50% CM (v/v) zmieszanych z pełną pożywką DMEM].</li>
		<li>Obserwuj zadrapania pod mikroskopem odwróconym i wykonaj zdjęcia w różnych odstępach czasu (0 i 24 h).</li>
		<li>Zmierz stopień zamknięcia zadrapania za pomocą oprogramowania Image J, korzystając ze wzoru: 
		<img alt="Równanie zamknięcia zadrapania (%), wzór dla pomiaru testu gojenia ran; diagram matematyczny." src="/files/ftp_upload/58825/58825eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: Otwórz obraz zadrapania w oprogramowaniu Image J. Narysuj linię o tej samej długości co pasek skali istniejący na obrazie. Kliknij „analyze”, wybierz „set scale” i odczytaj odległość w pikselach jako powiększenie narysowanej linii. Wpisz wartość paska skali w polu znanej odległości (known distance), ustaw jednostkę (piksele, cm, itp.) i kliknij OK. Przejdź ponownie do sekcji „analyze” i kliknij „measurements”. Najpierw wyświetli się rozmiar paska skali w wybranej jednostce. Kliknij na jedną krawędź zadrapania i przeciągnij do drugiego końca zadrapania. Zapisz wartość dla każdego punktu czasowego (0 h i 24 h). Podstaw te wartości do powyższego wzoru i oblicz stopień zamknięcia zadrapania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Migracja komórek poprzez pośredni kontakt komórek nowotworowych i DPSCs
<ol>
	<li>Wysiać 3 × 104 DPSCs na wkładki do płytek 24-dołkowych z porami 0,4 μm i inkubować w wilgotnym inkubatorze przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wysiać komórki PC-3 na płytki 24-dołkowe z gęstością komórek 5 × 104 i inkubować w wilgotnym inkubatorze przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Wykonać zadrapanie w warstwie komórek PC-3 za pomocą sterylnego tipsa 200 μL, wymienić medium na świeże i umieścić wkładki z DPSCs na komórkach PC-3.</li>
	<li>Obserwować komórki pod mikroskopem odwróconym i wykonywać zdjęcia w różnych odstępach czasu (0 i 24 h) w celu analizy migracji komórek.</li>
</ol>
6. Test kokultury i analiza cytometrią przepływową
<ol>
	<li>Oznakuj komórki PC-3 oraz DPSCs, odpowiednio za pomocą fluorescencyjnych barwników do wiązania komórek PKH67 (zielony) i PKH26 (czerwony)26.</li>
	<li>Poddaj komórki PC-3 oraz DPSCs trypsynizacji. Usuń pożywkę z kolby do hodowli tkanek T-75, przemyj 2 mL PBS i dodaj 2 mL trypsyny. Inkubuj przez 2 min w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze z nawilżonym powietrzem i 5% CO2. Dodaj 2 mL pełnej pożywki DMEM, a następnie inkubuj przez 2 min w celu zahamowania działania trypsyny.</li>
	<li>Wiruj komórki z prędkością 300 x g przez 5 min, odlej nadosad i resuspenduj osad komórkowy w roztworze barwnika przygotowanym w buforze diluent-C dostarczonym w zestawie (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubuj komórki w roztworze barwnika przez 10 min i przerwij reakcję barwienia, dodając 100 µL FBS. Wiruj komórki z prędkością 300 x g przez 5 min, odlej nadosad i przemyj komórki pełną pożywką wzrostową przed rozpoczęciem kokultury.</li>
	<li>Wysiej oznakowane komórki (5 × 104/dołek) na płytki 6-dołkowe w stosunku 1:1 (DPSCs:PC3). Utrzymuj komórki w kokulturze w pełnej pożywce DMEM.</li>
	<li>Zbierz komórki po 24 h lub 48 h inkubacji poprzez wirowanie z prędkością 300 x g przez 5 min i przemycie PBS.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w 300 µL buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w 5 mL probówkach do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem. Wymieszaj na wortexie w celu rozbicia agregatów komórkowych bezpośrednio przed analizą próbek.</li>
	<li>Użyj dyszy 100 µm przy ciśnieniu osłonki 45 psi. 
	UWAGA: Bardzo wysoki przepływ może zmniejszyć czułość detekcji fluorescencji.</li>
	<li>Użyj niebarwionych komórek kontrolnych oraz komórek barwionych pojedynczym kolorem, aby dostosować odpowiednie napięcie laserów dla rozproszenia przedniego i bocznego (forward and side scatter) dla poszczególnych typów komórek oraz przeprowadzić kompensację, jak wspomniano wcześniej27. 
	UWAGA: Zastosuj bramkowanie (gating) dla żywych komórek, aby wykluczyć debris komórkowy, martwe komórki lub agregaty.</li>
	<li>Zbierz 10 000 zdarzeń (preferowane 100 000), aby określić procent dodatnich zielonych DPSCs oraz czerwonych komórek PC-3, ustawiając kanały FL-1 (zielony) i FL-2 (czerwony).</li>
</ol>

<ol><li>Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemirci%2C+S+%22Dental+Stem+Cells%22">Dental Stem Cells</a>. , Springer. 109-124 (2016).</li>
<li>Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+into+the+understanding+of+mesenchymal+stem+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking.</a> British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).</li>
<li>Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mesenchymal+stem+cells+in+cancer+progression+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+cancer+drug+targets%22%5BJournal%5D)">Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases.</a> Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors%3A+wounds+that+do+not+heal%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumors: wounds that do not heal.</a> New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).</li>
<li>Lu, Y. -r, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+inhibitory+effect+of+mesenchymal+stem+cells+on+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo.</a> Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).</li>
<li>Secchiero, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+display+anti-cancer+activity+in+SCID+mice+bearing+disseminated+non-Hodgkin%27s+lymphoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts.</a> PloS one. 5 (6), e11140(2010).</li>
<li>Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+cancer%3A+friends+or+enemies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies?</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).</li>
<li>Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Mesenchymal+Stem+Cells+%28MSCs%29+at+sites+of+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer.</a> Oncotarget. 4 (1), 106(2013).</li>
<li>Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+dissecting+a+discrepancy+in+the+literature%3A+do+mesenchymal+stem+cells+support+or+suppress+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth.</a> Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).</li>
<li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139(2007).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).</li>
<li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+%28DPSCs%29+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).</li>
<li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%3A+osteogenic+differentiation+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+new+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression.</a> Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).</li>
<li>Mori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+regulators+and+homeostatic+agents%22%5BJournal%5D)">Osteogenic properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).</li>
<li>Kerkis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+population+of+immature+dental+pulp+stem+cells+expressing+OCT-4+and+other+embryonic+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers.</a> Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).</li>
<li>Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells%3A+applications+in+future+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+stem+cells%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine.</a> World journal of stem cells. 7 (5), 839(2015).</li>
<li>Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+dental+pulp+stem+cell+secretome+for+Alzheimer%27s+disease+treatment%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+international%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study.</a> Stem cells international. 2016, (2016).</li>
<li>Gorin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+dental+pulp+stem+cells+with+fibroblast+growth+factor-2+increases+angiogenesis+of+implanted+tissue-engineered+constructs+through+hepatocyte+growth+factor+and+vascular+endothelial+growth+factor+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion.</a> Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).</li>
<li>Wakayama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+from+dental+pulp+stem+cells+show+multifaceted+benefits+for+treating+acute+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice.</a> Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).</li>
<li>Doğan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+stem+cells+is+promoted+by+amphiphilic+pluronic+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers.</a> International Journal of Nanomedicine. 7, 4849(2012).</li>
<li>Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boron+enhances+odontogenic+and+osteogenic+differentiation+of+human+tooth+germ+stem+cells+%28hTGSCs%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+trace+element+research%22%5BJournal%5D)">Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro.</a> Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).</li>
<li>Yalvac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+stem+cells+derived+from+human+third+molar+tooth+germs+of+young+adults%3A+implications+in+neo-vascularization%2C+osteo-%2C+adipo-and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+pharmacogenomics+journal%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis.</a> The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105(2010).</li>
<li>Doğan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+pentaborate+pentahydrate+and+pluronic+containing+hydrogel+increases+cutaneous+wound+healing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+trace+element+research%22%5BJournal%5D)">Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo.</a> Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).</li>
<li>Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+F68+on+cryopreservation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+tooth+germ%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+biochemistry+and+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ.</a> Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).</li>
<li>Rizvanov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+self-organization+of+human+mesenchymal+stem+cells+and+neuro-blastoma+SH-SY5Y+cells+under+co-culture+conditions%3A+A+novel+system+for+modeling+cancer+cell+micro-environment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).</li>
<li>Troiano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+cells+with+different+mitochondrial+membrane+potential+during+apoptosis+by+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry.</a> Nature protocols. 2 (11), 2719(2007).</li>
<li>Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+niche+models+and+contribution+by+mesenchymal+stroma%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells.</a> Molecular cancer. 16 (1), 28(2017).</li>
<li>Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cell%2Fmesenchymal+stem+cell+interaction+in+co-culture+and+its+implications+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBogdanowicz%2C+DR+%22Biomimetics+and+Stem+Cells%22">Biomimetics and Stem Cells</a>. , Springer. 29-36 (2013).</li>
<li>Plotnikov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+cross-talk+between+mesenchymal+stem+cells+and+cardiomyocytes+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+and+molecular%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture.</a> Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Brunetti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+TRAIL+by+osteoblastic+differentiated+dental+pulp+stem+cells+affects+myeloma+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+reports%22%5BJournal%5D)">High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability.</a> Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).</li>
<li>Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+%28DPSCs%29+increase+prostate+cancer+cell+proliferation+and+migration+under+in+vitro+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions.</a> Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udział MSCs w środowisku guza jest regulowany przez kilka interakcji, w tym wytwarzanie komórek hybrydowych poprzez fuzje komórek, entozę lub aktywność cytokin i chemokiny między komórkami macierzystymi a komórkami nowotworowymi28. Organizacja strukturalna, interakcje komórka-komórka i wydzielane czynniki determinują zachowanie komórek rakowych pod względem promocji guza, progresji i przerzutów do otaczającej tkanki. Odpowiednie systemy modelowe ex vivo do badania mechanizmów sto...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), posiadające zdolność różnicowania i przyczynianie się do regeneracji tkanek mezenchymalnych, takich jak kości, chrząstki, mięśnie, więzadła, ścięgna i tkanka tłuszczowa, zostały wyizolowane z prawie wszystkich tkanek w organizmie dorosłego człowieka1,2. Oprócz zapewnienia homeostazy tkanek poprzez wytwarzanie komórek rezydentnych w przypadku przewlekłego stanu zapalnego lub urazu, wytwarzają one niezbędne cytokiny i czynniki wzrostu, które koordynują angiogenezę, układ odpornościowy i przebudowę tkanek3. Interakcja MSCs z tkanką nowotworową nie jest dobrze poznana, ale coraz więcej dowodów sugeruje, że MSCs mogą sprzyjać inicjacji, progresji i przerzutom guza4.
Zdolność MSCs do miejsca zranionego lub przewlekle objętego stanem zapalnym czyni je cennym kandydatem do terapii opartych na komórkach macierzystych. Jednak tkanki nowotworowe, które "nigdy nie goją ran", uwalniają również cytokiny zapalne, cząsteczki proangiogenne i ważne czynniki wzrostu, które przyciągają MSCs do obszaru rakotwórczego5. Chociaż istnieje niewiele doniesień wskazujących na hamujący wpływ MSCs na wzrost nowotworów6,7, ich działanie sprzyjające progresji raka i przerzutom zostało szeroko opisane8. MSCs bezpośrednio lub pośrednio wpływają na kancerogenezę na różne sposoby, w tym hamują komórki odpornościowe, wydzielają czynniki wzrostu/cytokiny, które wspierają proliferację i migrację komórek rakowych, zwiększają aktywność angiogenną i regulują przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT)9,10. Środowisko nowotworowe składa się z kilku typów komórek, w tym fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i/lub miofibroblastów, komórek śródbłonka, adipocytów i komórek odpornościowych11. Spośród nich CAF są najliczniejszym typem komórek w obszarze guza, które wydzielają różne chemokiny sprzyjające wzrostowi raka i przerzutom8. Wykazano, że MSCs pochodzące ze szpiku kostnego mogą różnicować się w CAF w zrębie guza12.
Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC), scharakteryzowane przez Gronthosa i wsp. jako pierwsze MSC pochodzące z tkanek zęba.13 w 2000 roku, a następnie szeroko zbadany przez innych14,15, wyrażają markery pluripotencji, takie jak Oct4, Sox2 i Nanog16 i mogą różnicować się na różne linie komórek17. Analiza ekspresji genów i białek dowiodła, że DPSC wytwarzają porównywalne poziomy czynników wzrostu/cytokin z innymi MSC, takimi jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), angiogenina, czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2), interleukina-4 (IL-4), IL-6, IL-10 i czynnik komórek macierzystych (SCF), a także ligand kinazy tyrozynowej-3 podobny do FMS (Flt-3L), który może promować angiogenezę, modulować komórki odpornościowe oraz wspierać proliferację i migrację komórek rakowych18,19,20. Chociaż interakcje MSCs ze środowiskiem nowotworowym zostały dobrze udokumentowane w literaturze, związek między DPSC a komórkami nowotworowymi nie został jeszcze oceniony. W niniejszym badaniu ustaliliśmy strategie współhodowli i leczenia pożywki kondycjonującej dla linii komórkowej raka prostaty z dużymi przerzutami, PC-3 i DPSC, aby zaproponować potencjalne działanie mechanizmu stomatologicznego MSCs w progresji raka i przerzutach.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885084</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>Do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>Do mycia</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Składnik pożywki różnicującej</td></tr> <tr><td>i beta-glicerofosforan</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td>Składnik pożywki różnicującej osteogennej</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td>Składnik pożywki różnicującej osteo- i chondrogennej</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS &minus; G)</td> <td>Invitrogen</td><td>41400045</td><td>Składnik pożywki do różnicowania chondrogennego</td></tr><tr><td>TGF-&beta;</td><td>Sigma</td><td>SRP3171</td><td>Składnik pożywki do różnicowania chondrogennego</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Składnik pożywki do różnicowania adipogennego</td></tr><tr><td>Izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I7018</td><td>Składnik pożywki do różnicowania adipogennego</td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td>Składnik pożywki do różnicowania adipogennego</td></tr><tr><td>Odczynnik MTS</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Analizy żywotności komórek</td></tr><tr><td>Test TUNEL</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td>Analizy apoptotyczne</td></tr><tr><td>Wkładki do płytek 24-dołkowych</td><td>Corning</td><td>3396</td><td>Do testu migracji trans-well</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma PKH67GL</td><td></td><td>Do barwienia komórek z kohodowlą</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td>Do barwienia</td></tr> <tr><td>komórek z kohodowląParaformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>firmy Kossa Kit</td><td>BioOptica</td><td>04-170801.A</td><td>Do barwienia (różnicowania)</td></tr> <tr><td>komórekBłękit alciański</td><td>Sigma</td><td>A2899</td><td>Do barwienia komórek (różnicowania)</td></tr></tbody></table>

izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Rak jako wieloetapowy proces i skomplikowana choroba jest nie tylko regulowany przez proliferację i wzrost poszczególnych komórek, ale także kontrolowany przez środowisko guza i interakcje komórka-komórka. Identyfikacja interakcji między nowotworem a komórkami macierzystymi, w tym zmian w środowisku zewnątrzkomórkowym, interakcji fizycznych i wydzielanych czynników, może umożliwić odkrycie nowych opcji terapeutycznych. Łączymy znane techniki współhodowli, aby stworzyć modelowy system interakcji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i komórek nowotworowych. W obecnym badaniu interakcje komórek macierzystych miazgi zęba (DPSC) i komórek raka prostaty PC-3 badano za pomocą bezpośrednich i pośrednich technik wspólnej hodowli. Do badania aktywności parakrynnej wykorzystano pożywkę kondycyjną (CM) uzyskaną z DPSC i membran trans-well o wielkości porów 0,4 μm. Przeprowadzono wspólną hodowlę różnych typów komórek w celu zbadania bezpośredniej interakcji między komórkami. Wyniki wykazały, że CM zwiększa proliferację komórek i zmniejsza apoptozę w hodowlach komórek raka prostaty. Zarówno CM, jak i system trans-well zwiększyły zdolność migracji komórek PC-3. Komórki wybarwione różnymi barwnikami błonowymi zostały wysiane do tych samych naczyń hodowlanych, a DPSC uczestniczyły w samoorganizującej się strukturze z komórkami PC-3 w tych bezpośrednich warunkach wspólnej hodowli. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki wskazują, że techniki kohodowli mogą być przydatne w interakcjach między nowotworami a MSC jako system modelowy.

Rycina 1 przedstawia ogólne charakterystyki MSC dla DPSCs w warunkach hodowli. DPSCs wykazują fibroblastopodobną morfologię komórkową po wysianiu (Rycina 1B). Antygeny powierzchniowe MSC (CD29, CD73, CD90, CD105 i CD166) wykazują wysoką ekspresję, natomiast markery hematopoetyczne (CD34, CD45 i CD14) są ujemne (Rycina 1C). W hodowli DPSC po zastosowaniu koktajlu różnicującego obserwuje się zmiany na ...

Udostępniamy protokoły oceny mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych z miazgi zębowej i interakcji komórek raka prostaty w oparciu o bezpośrednie i pośrednie metody wspólnej hodowli. Membrany Condition Medium i trans-well są odpowiednie do analizy pośredniej aktywności parakrynnej. Wysiewanie różnie barwionych komórek razem jest odpowiednim modelem bezpośredniej interakcji komórka-komórka.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące roli dorosłych komórek macierzystych w regulacji zachowania komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na ocenę interakcji komórek nowotworowych i komórek macierzystych in vitro bez użycia organizmów żywych. Technika ta ma potencjał w zakresie przerzutów nowotworowych, ponieważ modeluje promowanie roli dorosłych komórek macierzystych w przerzutach raka do tkanek twardych, takich jak kości.Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Huseyin Apdik, doktora habilitowanego w moim laboratorium. Zacznij od użycia sterylnych kleszczy ekstrakcyjnych, aby usunąć tkankę miazgi ze środka zębów mądrości uzyskanych od młodych dorosłych w wieku od 17 do 20 lat. Umieść tkankę w zimnym, kompletnym DMEM w 10-centymetrowych naczyniach do hodowli tkankowych i użyj skalpela, aby zmielić próbki na dwu- lub trzymilimetrowe fragmenty.Przenieść kawałki z każdej płytki do pojedynczych dołków sześciodołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych i przykryć tkanki w każdym dołku 200 mikrolitrami kompletnego DMEM. Pozwól tkankom przyczepić się do dna studzienki podczas co najmniej dwugodzinnej inkubacji w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Pod koniec inkubacji nakarm tkanki od dwóch do 2,5 mililitra świeżej, kompletnej pożywki i hoduj komórki przez dodatkowe osiem do dziewięciu dni.Gdy kultura osiągnie 80% konfluacji, umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS, a następnie odłącz komórki dwoma mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch mililitrów kompletnego DMEM na studzienkę i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawieś granulki w 15 mililitrach świeżej, kompletnej pożywki na dwa dołki komórek i przenieś komórki do kolb T75 w celu ich późniejszej hodowli.Po co najmniej ośmiu pasażach zwizualizuj komórki za pomocą mikroskopii świetlnej. Komórki macierzyste miazgi zębowej powinny być przyczepione do szalek hodowlanych i powinny wykazywać morfologię komórek wrzecionowatą. W celu analizy markerów powierzchniowych, po wykazaniu trypsynizacji, utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej w 1,5-mililitrowych probówkach, a następnie trzy płukania w 500 mikrolitrach PBS na pranie.Po ostatnim płukaniu oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami w 100 mikrolitrach PBS na probówkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i oznaczyć komórki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w 100 mikrolitrach PBS na probówkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj próbki trzykrotnie w PBS i przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami.W celu różnicowania komórek macierzystych miazgi zębowej, wysiewa się od jednej razy 10 do czterech komórek do pojedynczych studzienek 24-dołkowych płytek w 500 mikrolitrach kompletnego DMEM na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę w każdym dołku odpowiednią pożywką różnicującą i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze, odświeżając pożywkę dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie. Rozróżnienie można potwierdzić za pomocą barwienia na niebiesko von Kossa i Alciana zgodnie ze standardowymi protokołami.Po dwóch do czterech pasażach zbierz kondycjonowane supernatanty z hodowanych komórek macierzystych miazgi zębowej, gdy kultury osiągną 80% zbieżności. Następnie odwiruj zebrane podłoże, aby usunąć wszelkie odpady tkankowe i resztki komórek, a następnie przechowuj pożywkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W przypadku leczenia komórek rakowych należy wysiać od jednego razy 10 do pięciu komórek nowotworowych do pojedynczych dołków 12-dołkowej płytki do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.Następnego ranka użyj sterylnej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, aby spowodować zadrapanie w każdym dołku i natychmiast zastąp supernatant w każdej studzience świeżą pożywką zawierającą różne stężenia kondycjonowanej pożywki. Następnie natychmiast obserwuj rysy pod odwróconym mikroskopem i uzyskuj obrazy uszkodzonych kultur w regularnych odstępach czasu. Na koniec analizy zmierz zamknięcie rysy w czasie w ImageJ.Aby ocenić migrację komórek macierzystych miazgi zęba, najpierw wysiew trzy razy 10 do czterech komórek macierzystych miazgi zęba na indywidualne 24-dołkowe wkładki płytki z porami 0,4 mikrona w 250 mikrolitrach DMEM i inkubuj wkładki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wysiewaj pięć razy 10 czterech komórek nowotworowych do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki w 500 mikrolitrach DMEM do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka podrap komórki nowotworowe, jak pokazano.Zastąp supernatanty 500 mikrolitrami świeżego DMEM i umieść jedną wkładkę z nasionami komórek macierzystych miazgi zęba w każdym dobrze karmionym świeżym podłożem. Następnie natychmiast obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem i obrazuj komórki w regularnych odstępach czasu, aby ocenić migrację komórek macierzystych miazgi zęba. Aby ocenić bezpośrednie interakcje komórek macierzystych miazgi zęba z komórkami rakowymi, trypsynizuj każdą znakowaną kulturę, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek i zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie.Zawiesić osady w odrębnych roztworach barwnika łącznikowego komórek przygotowanych w buforze rozcieńczalnika C, dostarczonym zgodnie z instrukcjami producenta, i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zakończyć reakcję barwienia za pomocą 100 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej i zebrać komórki przez odwirowanie. Następnie odwirować komórki z kompletną pożywką wzrostową przed posiewem pięć razy 10 do czterech komórek macierzystych miazgi zębowej i komórek nowotworowych na studzience na płytce sześciodołkowej w stosunku jeden do jednego na dwa mililitry kompletnej pożywki.Zebrać komórki po 24 lub 48 godzinach inkubacji przez odwirowanie, a następnie przemycie w PBS. Następnie ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach aktywowanego fluorescencją bufora do sortowania komórek w pięciomililitrowych probówkach do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem i wiruj, aby rozproszyć dowolne agregaty komórkowe przed analizą komórek zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. Komórki macierzyste miazgi zębowej wykazują morfologię komórek podobną do fibroblastów po posiewie i wyrażają antygeny powierzchniowe mezenchymalnych komórek macierzystych, ale nie markery komórek krwiotwórczych.Zmiany na poziomie morfologicznym i molekularnym związane z różnicowaniem kostnym, chrzęstnym i adipogennym obserwuje się również w hodowlach komórek macierzystych miazgi zęba po odpowiednim zastosowaniu koktajlu różnicującego. Traktowanie kultur komórek nowotworowych uszkodzonych przez zadrapanie za pomocą 10 i 20% stężeń kondycjonowanej pożywki znacznie zwiększa zamknięcie zadrapań w porównaniu z hodowlami komórek nowotworowych traktowanych pożywką kontrolną. Cząsteczki wydzielane z kokultur wstawek komórek macierzystych miazgi zęba również zwiększały zamykanie zadrapań w uszkodzonych komórkach nowotworowych w porównaniu z kokulturami komórek kontrolnych.Analiza mikroskopowa interakcji między łodygą miazgi zęba a komórką nowotworową w hodowli komórkowej in vitro ujawnia tworzenie dobrze zorganizowanej struktury, w której komórki nowotworowe szybko namnażają się po 48 godzinach. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu dwóch próbek tkanek w zimnym podłożu i natychmiastowym transporcie próbek do laboratorium, aby zminimalizować śmierć komórki. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komórkami macierzystymi w badaniu interakcji między dorosłymi komórkami macierzystymi a ludźmi.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie komórek immunologicznych dla znakowanych różnicowo komórek komórek macierzystych i typów raka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie o to, w jaki sposób dorosłe komórki macierzyste oddziałują z komórkami rakowymi i kontrolują przerzuty raka. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak analiza próbek pacjenta pod kątem chorób zakaźnych i uzyskanie pisemnej zgody pacjenta.

mesenchymal-stem-cell-isolation-from-pulp-tissue-co-culture-with

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ten film prezentuje technikę tworzenia wspólnej kultury neuronów trójdzielnych i pierwotnych komórek miazgi zębowej za pomocą filtra transwell. W tym fizycznie oddzielonym stanie komórki mezenchymalne uzyskane z tkanki miazgi zęba wydzielają parakrynne cząsteczki sygnałowe, które przechodzą przez pory, promując różnicowanie i migrację neuronów w kierunku komórek mezenchymalnych, tworząc system kohodowli.

Ustanowienie wspólnej hodowli komórek miazgi zębowej i neuronów trójdzielnych do komunikacji krzyżowej

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Właściwości immunomodulacyjne ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) wydają się coraz bardziej istotne dla zastosowań klinicznych. Korzystając z systemu kohodowli MSC i leukocytów krwi obwodowej wstępnie wybarwionych estrem sukcynimidylu barwnika fluorescencyjnego karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE), opisano ocenę in vitro immunomodulacji MSC na proliferację leukocytów efektorowych i określone subpopulacje.

Ocena właściwości immunomodulacyjnych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC)

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Poznaj metody izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z miazgi zęba i ich współhodowlę z komórkami raka prostaty. Technika ta umożliwia badanie interakcji in vitro bez użycia organizmów żywych.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Przeglądaj więcej filmów