Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych dotyczące roli dorosłych komórek macierzystych w regulacji zachowania komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na ocenę interakcji komórek nowotworowych i komórek macierzystych in vitro bez użycia organizmów żywych. Technika ta ma potencjał w zakresie przerzutów nowotworowych, ponieważ modeluje promowanie roli dorosłych komórek macierzystych w przerzutach raka do tkanek twardych, takich jak kości.

Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez Huseyin Apdik, doktora habilitowanego w moim laboratorium. Zacznij od użycia sterylnych kleszczy ekstrakcyjnych, aby usunąć tkankę miazgi ze środka zębów mądrości uzyskanych od młodych dorosłych w wieku od 17 do 20 lat. Umieść tkankę w zimnym, kompletnym DMEM w 10-centymetrowych naczyniach do hodowli tkankowych i użyj skalpela, aby zmielić próbki na dwu- lub trzymilimetrowe fragmenty.

Przenieść kawałki z każdej płytki do pojedynczych dołków sześciodołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych i przykryć tkanki w każdym dołku 200 mikrolitrami kompletnego DMEM. Pozwól tkankom przyczepić się do dna studzienki podczas co najmniej dwugodzinnej inkubacji w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Pod koniec inkubacji nakarm tkanki od dwóch do 2,5 mililitra świeżej, kompletnej pożywki i hoduj komórki przez dodatkowe osiem do dziewięciu dni.

Gdy kultura osiągnie 80% konfluacji, umyj każdą studzienkę dwoma mililitrami PBS, a następnie odłącz komórki dwoma mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po dwóch minutach zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch mililitrów kompletnego DMEM na studzienkę i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie ponownie zawieś granulki w 15 mililitrach świeżej, kompletnej pożywki na dwa dołki komórek i przenieś komórki do kolb T75 w celu ich późniejszej hodowli.

Po co najmniej ośmiu pasażach zwizualizuj komórki za pomocą mikroskopii świetlnej. Komórki macierzyste miazgi zębowej powinny być przyczepione do szalek hodowlanych i powinny wykazywać morfologię komórek wrzecionowatą. W celu analizy markerów powierzchniowych, po wykazaniu trypsynizacji, utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej w 1,5-mililitrowych probówkach, a następnie trzy płukania w 500 mikrolitrach PBS na pranie.

Po ostatnim płukaniu oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami w 100 mikrolitrach PBS na probówkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć komórki trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i oznaczyć komórki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w 100 mikrolitrach PBS na probówkę przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj próbki trzykrotnie w PBS i przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami.

W celu różnicowania komórek macierzystych miazgi zębowej, wysiewa się od jednej razy 10 do czterech komórek do pojedynczych studzienek 24-dołkowych płytek w 500 mikrolitrach kompletnego DMEM na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę w każdym dołku odpowiednią pożywką różnicującą i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze, odświeżając pożywkę dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie. Rozróżnienie można potwierdzić za pomocą barwienia na niebiesko von Kossa i Alciana zgodnie ze standardowymi protokołami.

Po dwóch do czterech pasażach zbierz kondycjonowane supernatanty z hodowanych komórek macierzystych miazgi zębowej, gdy kultury osiągną 80% zbieżności. Następnie odwiruj zebrane podłoże, aby usunąć wszelkie odpady tkankowe i resztki komórek, a następnie przechowuj pożywkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia. W przypadku leczenia komórek rakowych należy wysiać od jednego razy 10 do pięciu komórek nowotworowych do pojedynczych dołków 12-dołkowej płytki do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Następnego ranka użyj sterylnej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów, aby spowodować zadrapanie w każdym dołku i natychmiast zastąp supernatant w każdej studzience świeżą pożywką zawierającą różne stężenia kondycjonowanej pożywki. Następnie natychmiast obserwuj rysy pod odwróconym mikroskopem i uzyskuj obrazy uszkodzonych kultur w regularnych odstępach czasu. Na koniec analizy zmierz zamknięcie rysy w czasie w ImageJ.

Aby ocenić migrację komórek macierzystych miazgi zęba, najpierw wysiew trzy razy 10 do czterech komórek macierzystych miazgi zęba na indywidualne 24-dołkowe wkładki płytki z porami 0,4 mikrona w 250 mikrolitrach DMEM i inkubuj wkładki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie wysiewaj pięć razy 10 czterech komórek nowotworowych do pojedynczych dołków 24-dołkowej płytki w 500 mikrolitrach DMEM do nocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka podrap komórki nowotworowe, jak pokazano.

Zastąp supernatanty 500 mikrolitrami świeżego DMEM i umieść jedną wkładkę z nasionami komórek macierzystych miazgi zęba w każdym dobrze karmionym świeżym podłożem. Następnie natychmiast obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem i obrazuj komórki w regularnych odstępach czasu, aby ocenić migrację komórek macierzystych miazgi zęba. Aby ocenić bezpośrednie interakcje komórek macierzystych miazgi zęba z komórkami rakowymi, trypsynizuj każdą znakowaną kulturę, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek i zebrać zdysocjowane komórki przez odwirowanie.

Zawiesić osady w odrębnych roztworach barwnika łącznikowego komórek przygotowanych w buforze rozcieńczalnika C, dostarczonym zgodnie z instrukcjami producenta, i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zakończyć reakcję barwienia za pomocą 100 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej i zebrać komórki przez odwirowanie. Następnie odwirować komórki z kompletną pożywką wzrostową przed posiewem pięć razy 10 do czterech komórek macierzystych miazgi zębowej i komórek nowotworowych na studzience na płytce sześciodołkowej w stosunku jeden do jednego na dwa mililitry kompletnej pożywki.

Zebrać komórki po 24 lub 48 godzinach inkubacji przez odwirowanie, a następnie przemycie w PBS. Następnie ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach aktywowanego fluorescencją bufora do sortowania komórek w pięciomililitrowych probówkach do cytometrii przepływowej z okrągłym dnem i wiruj, aby rozproszyć dowolne agregaty komórkowe przed analizą komórek zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. Komórki macierzyste miazgi zębowej wykazują morfologię komórek podobną do fibroblastów po posiewie i wyrażają antygeny powierzchniowe mezenchymalnych komórek macierzystych, ale nie markery komórek krwiotwórczych.

Zmiany na poziomie morfologicznym i molekularnym związane z różnicowaniem kostnym, chrzęstnym i adipogennym obserwuje się również w hodowlach komórek macierzystych miazgi zęba po odpowiednim zastosowaniu koktajlu różnicującego. Traktowanie kultur komórek nowotworowych uszkodzonych przez zadrapanie za pomocą 10 i 20% stężeń kondycjonowanej pożywki znacznie zwiększa zamknięcie zadrapań w porównaniu z hodowlami komórek nowotworowych traktowanych pożywką kontrolną. Cząsteczki wydzielane z kokultur wstawek komórek macierzystych miazgi zęba również zwiększały zamykanie zadrapań w uszkodzonych komórkach nowotworowych w porównaniu z kokulturami komórek kontrolnych.

Analiza mikroskopowa interakcji między łodygą miazgi zęba a komórką nowotworową w hodowli komórkowej in vitro ujawnia tworzenie dobrze zorganizowanej struktury, w której komórki nowotworowe szybko namnażają się po 48 godzinach. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu dwóch próbek tkanek w zimnym podłożu i natychmiastowym transporcie próbek do laboratorium, aby zminimalizować śmierć komórki. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się komórkami macierzystymi w badaniu interakcji między dorosłymi komórkami macierzystymi a ludźmi.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak śledzenie komórek immunologicznych dla znakowanych różnicowo komórek komórek macierzystych i typów raka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie o to, w jaki sposób dorosłe komórki macierzyste oddziałują z komórkami rakowymi i kontrolują przerzuty raka. Nie zapominaj, że praca z próbkami ludzkimi może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak analiza próbek pacjenta pod kątem chorób zakaźnych i uzyskanie pisemnej zgody pacjenta.