Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek
16 kwietnia 2019
Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.
Wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne lub IBC zaobserwowano u myszy, które poddano eksperymentalnym infekcjom dróg moczowych lub ZUM. Zaobserwowano je również w osadach moczu pacjentów z ZUM. Technika, którą dzisiaj opisujemy, to sposób na izolację pojedynczych IPC od eksperymentalnie zakażonych myszy.
Technika mikropipetowania jamy ustnej jest jedyną obecnie dostępną techniką izolowania bakterii wewnątrzkomórkowych z zakażonych pęcherzy myszy. Aby przygotować pipety ze szklanymi ustami, mocno ściśnij oba końce szklanej rurki kapilarnej i równomiernie obracaj środek rurki w przód iw tył wzdłuż jej osi nad otwartym źródłem płomienia. Gdy szkło stanie się miękkie, usuń kapilatę ze źródła ciepła i natychmiast rozsuń szklankę.
Idealna końcowa długość naciągniętej kapilary jest od trzech do pięciu centymetrów dłuższa niż kapilary nienaciągnięta, aby zapewnić odpowiednią średnicę wewnętrzną do izolacji pojedynczych komórek nabłonka pęcherza moczowego. Gdy szklanka ostygnie, sprawdź, czy środek szklanej kapilary jest węższy i czy wnętrze rurki jest nadal puste. Podnosząc jedną ręką duży koniec naciągniętej kapilary, użyj kleszczyków, aby chwycić kapilarnę w najwęższym miejscu, upewniając się, że kleszcze są trzymane z wystarczającą siłą, aby mocno chwycić kapilatę bez jej zgniatania.
Szybko przekręć kleszcze, aby zatrzasnąć naciągniętą kapilarnę w najwęższym miejscu. Następnie umieść kapilarnę wielkości mikropipety w jamie ustnej na 100-milimetrowej szalce Petriego i sterylizuj naczynie promieniami UV przez 30 minut. Aby pobrać pęcherz, umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wysterylizuj okolice brzucha 70% etanolem.
Za pomocą kleszczy sterylizowanych etanolem i nożyczek chirurgicznych wykonaj początkowe jednocentymetrowe poprzeczne nacięcie skóry nad otworem cewki moczowej i rozszerz nacięcie po przekątnej w kierunku górnych kończyn myszy, aby utworzyć nacięcie w kształcie litery V wzdłuż całego przedniego odcinka myszy, które odsłania zawartość otrzewnej. Używając nowych wysterylizowanych narzędzi, delikatnie dociśnij poduszeczki tłuszczowe w pobliżu okolicy miednicy myszy, aby spowodować wysunięcie pęcherza i chwyć odsłonięty pęcherz na wierzchołku. Trzymając mocno pęcherz, przetnij moczowody i cewkę moczową, aby uwolnić pęcherz i włóż końcówkę jednego wałka zaokrąglonych kleszczy do otworu pęcherza, w którym właśnie został nacięty.
Zwolnij kleszcze, chwytając wierzchołek i utrzymując zaokrąglone kleszcze prawie całkowicie zamknięte, użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie odciągnąć zewnętrzny koniec ust pęcherza moczowego od zaokrąglonych kleszczy i wokół i nad drugą końcówką zaokrąglonych kleszczy, aby obrócić pęcherz na lewą stronę. Następnie użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie nakłonić odwrócony pęcherz z końcówki kleszczy do jednego mililitra zimnego PBS. I delikatnie zeskrob wewnętrzną warstwę komórek nabłonka na zewnątrz odwróconego pęcherza za pomocą dwóch par czystych kleszczy.
Gdy wszystkie komórki zostaną zeskrobane, włóż niewyciągnięty koniec ciągniętej szklanej kapilary do gumowej zatyczki rurki aspiratora i mocno dopasuj wąski koniec jednomililitrowej końcówki pipety do drugiego otwartego końca probówki. Ciasno dopasuj wąską końcówkę dwumililitrowej pipety zasysającej do otwartego, szerszego końca jednomililitrowej końcówki pipety i umieść zeskrobaną zawiesinę komórek pod mikroskopem preparacyjnym. Korzystając z powiększenia od 20 do 40x, zidentyfikuj IBC jako duże agregaty fluorescencyjne i zanurz cienki koniec szklanej kapilary w świeżej probówce PBS na jedną sekundę, aby zmniejszyć pobieranie niepożądanej objętości przez działanie kapilarne.
Po zlokalizowaniu interesującego IBC powoli przysuń otwarty koniec rurki kapilarnej w kierunku IBC i przyłóż bardzo małą siłę ssącą do pipety zasysającej, aby wprowadzić IBC do szklanej kapilary. Następnie przenieś kapilę do pustej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i zastosuj lekkie nadciśnienie, aby usunąć kroplę i IBC do probówki. Oprócz potwierdzenia obecności pojedynczego izolowanego IBC w probówce zbiorczej za pomocą mikroskopu preparacyjnego, czystość wyizolowanego IBC można potwierdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Izolowane komórki powinny wybarwiać się zarówno na obecność E. coli, jak i uroprakiny i powinny mieć wielkość od 50 do 120 mikrometrów. Po wyizolowaniu obecność i żywotność komórek bakteryjnych w pojedynczym IBC można potwierdzić poprzez kwantyfikację jednostek tworzących kolonie lub ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w celu uzyskania odpowiedników genomowych. Warto zauważyć, że niezakażone komórki nabłonkowe wyizolowane tym samym protokołem nie wykazują ilościowych ilości bakterii.
Co więcej, ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją potwierdza obecność genów bakteryjnych w szeregu indywidualnie izolowanych i połączonych IBC. Zawsze upewnij się, że mikropipeta do ust może łatwo pobierać i usuwać płyn. Nie wahaj się zmienić kapilary lub całego aparatu, jeśli mikropipeta do ust wydaje się niedrożna.
Ta technika mikropipetowania jamy ustnej pozwala nam bezpośrednio i specyficznie badać populacje wewnątrzkomórkowe, które tworzą się podczas eksperymentalnego ZUM. Bez tej techniki te populacje wewnątrzkomórkowe byłyby skażone bakteriami zewnątrzkomórkowymi i przewyższałyby je liczebnie. Niektóre inne czynniki zakaźne mogą być łatwiej rozpylane lub przenoszone niż E. coli, których użyliśmy w tej aplikacji.
W takich przypadkach uzasadnione mogą być pewne dodatkowe kontrole, takie jak dodanie filtra lub przedłużenie rurki, w zależności od używanego zastosowania. Pojemniki IBC wyizolowane przy użyciu tej techniki mikropipetowania jamy ustnej mogą być następnie wykorzystane w innych dalszych analizach pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie QRTPCR lub RNA.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych, zakażonych komórek nabłonka pęcherza z mysiego modelu zakażenia dróg moczowych (UTI). Technika ta pozwala na badanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakterii (IBC) bez skażenia przez bakterie pozakomórkowe.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Choroby zakaźne
- Biologia komórki
Tło
- Wewnątrzkomórkowe społeczności bakterii (IBC) występują zarówno u myszy, jak i u ludzkich pacjentów z zakażeniami dróg moczowych.
- Technika mikropipetowania ustnego jest obecnie jedyną metodą izolowania IBC z zakażonych mysich pęcherzy.
- Zrozumienie IBC jest kluczowe dla badań nad patogenezą UTI.
- Izolacja IBC może ułatwić dalszą analizę, taką jak qPCR i sekwencjonowanie RNA.
Cel badania
- Izolacja pojedynczych IBC z mysich modeli UTI.
- Umożliwienie szczegółowego badania wewnątrzkomórkowych populacji powstałych podczas UTI.
- Zapewnienie niezawodnej metody badania infekcji bakteryjnych na poziomie pojedynczych komórek.
Stosowane metody
- Przygotowanie szklanych mikropipet ustnych do izolacji komórek.
- Chirurgiczne wyjęcie pęcherza z zakażonych myszy.
- Technika mikropipetowania do izolowania IBC z pęcherza.
- Potwierdzenie izolowanych IBC za pomocą mikroskopii i technik molekularnych.
Główne wyniki
- Udana izolacja IBC potwierdzona za pomocą mikroskopii.
- Izolowanie komórek dało pozytywny wynik na E. coli i uroplakinę.
- Analiza ilościowa potwierdziła obecność genów bakteryjnych w izolowanych IBC.
- Niezainfekowane komórki nie wykazały ilościowych bakterii, co potwierdza metodę izolacji.
Wnioski
- Technika mikropipetowania ustnego jest skuteczna w izolowaniu IBC.
- Ta metoda pozwala na badanie wewnątrzkomórkowych populacji bakterii bez skażenia.
- Dalsze zastosowania mogą obejmować różne analizy na poziomie pojedynczych komórek w celu zrozumienia patogenezy UTI.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating single intracellular bacterial communities (IBCs) from murine urinary tract infection models enables mechanistic de-risking of host-pathogen interactions at cellular resolution. This approach supports target validation by providing purified, viable infected epithelial cells for downstream single-cell analyses, reducing confounding signals from extracellular bacterial populations. The protocol’s reliance on widely available materials and short time-to-isolation (~8 hours) enhances feasibility for early discovery workflows focused on antimicrobial target identification and phenotypic screening in infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating viable IBCs containing intracellular E. coli for functional target assessment.
- Operational Value: Provides a contamination-minimized system for clarifying bacterial persistence mechanisms within host cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantifiable, single-cell resolution data on bacterial gene expression and viability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (IBC-containing epithelial cells) for standardized downstream assays such as qPCR or RNA sequencing.
- Operational Value: Ensures assay readiness through isolation of nearly contaminant-free single cells, improving reproducibility in infection model screening.
- Scalability: Enables platform reuse across infection models where rare infected cells require isolation from heterogeneous mixtures.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by isolating IBCs from a murine UTI model that mirrors human intracellular bacterial community formation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates biomarker alignment by enabling detection of bacterial genes (e.g., via qRT-PCR) in individually isolated IBCs.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by confirming absence of quantifiable bacteria in uninfected epithelial controls, validating isolation specificity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of intracellular survival pathways, progressing to lead identification through single-cell analysis of isolated IBCs, and supporting preclinical validation via gene expression and viability profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating IBCs for study of intracellular bacterial populations without extracellular contamination.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible single-cell outputs suitable for compound evaluation in infection models.
- Analytics: Generates quantitative measurements (e.g., genomic equivalents via qPCR, CFU counts) that allow comparison of bacterial load and viability across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant IBC isolation from a murine UTI model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare infected cells from mixtures, applicable beyond UTIs to other intracellular pathogen models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through a low-cost, widely accessible micropipetting technique.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of antimicrobial targets using physiologically relevant infection models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing single-cell resolution data on intracellular bacterial persistence and gene expression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical procedures, sterile tissue handling, and micropipette manipulation.
- Depends on glass capillary preparation, UV sterilization, and dissection microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for consistent IBC isolation and downstream molecular analysis (e.g., qPCR, RNA sequencing).
- Involves adaptation considerations when applying the technique to other infection models or cell types with varying fragility or size.
- Includes practical limitations such as the biohazard risk of mouth micropipetting, which precludes use with highly infectious agents.
