Name: Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj technikę izolacji pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych z mysiego modelu zakażenia dróg moczowych. Metoda umożliwia badanie patogenezy UTI bez zanieczyszczenia bakteriami zewnątrzkomórkowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Research Foundation, Kancelarię Premiera, Singapur, w ramach programu stypendiów badawczych NRF (NRF award no. NRF-RF2010-10); Krajowa Rada ds. Badań Medycznych przy Ministerstwie Zdrowia Singapuru (NMRC/CIRG/1358/2013); oraz Instytut Genomu w Singapurze (GIS)/Agencja ds. Nauki, Technologii i Badań (A*STAR).

Wszystkie opisane tutaj metody dotyczące obchodzenia się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Instytutu Genomu w Singapurze oraz Centrum Zasobów Biologicznych Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań w Singapurze.
1. Zakażenie myszą
<ol>
	<li>Przygotowanie kapilar szklanych
	<ol>
		<li>Zapal źródło otwartego ognia (palnik Bunsena lub palnik alkoholowy).</li>
		<li>Przytrzymaj szklaną kapilarnę obiema rękami, mocno ściskając oba końce, a następnie równomiernie podgrzej środek rurki, aż szklanka zmięknie. Delikatnie obracaj kapilatę do przodu iz powrotem wzdłuż jej osi, aby pomóc w równomiernym podgrzaniu szkła.</li>
		<li>Zdejmij szklaną kapilarnę ze źródła ciepła i natychmiast rozsuń ręce, utrzymując chwyt na obu końcach rurki. Idealna końcowa długość naciągniętej kapilary jest o 3-5 cm dłuższa niż kapilary nienaciągniętej, aby zapewnić odpowiednią średnicę wewnętrzną do izolacji pojedynczych komórek nabłonka pęcherza moczowego. 
		ostrożność: Rurka nadal pozostaje bardzo gorąca przez pewien czas, więc odłóż kapilę na bok na powierzchni bezpiecznej dla ciepła na kilka minut, aby ostygła przed przejściem do następnego kroku.</li>
		<li>Sprawdź, czy środek szklanej kapilary stał się węższy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i czy wnętrze rurki jest nadal puste (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Do izolacji IBC można stosować średnicę otworu 200-400 μm.</li>
		<li>Podnieś jedną ręką jeden koniec naciągniętej kapilary. Drugą ręką przytrzymaj parę kleszczy i użyj ich, aby podnieść wyciągniętą szklaną kapilarnę w najwęższym miejscu. Upewnij się, że kleszcze są dzierżone z wystarczającą siłą, aby mocno chwycić kapilatę bez jej zgniatania.</li>
		<li>Użyj szybkiego ruchu skręcającego ręką trzymającą kleszcze, aby zatrzasnąć naciągniętą kapilę w najwęższym miejscu, aby utworzyć kapilarnę do mikropipetowania jamy ustnej. 
		nuta: Dopuszczalne jest również używanie palców zamiast kleszczy, o ile stosowana jest odpowiednia ochrona przed odłamkami szkła.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.2-1.1.6 co najmniej 4 razy częściej, aby wytworzyć wystarczającą ilość zapasowych kapilar do mikropipetowania i zapewnić zakres średnic do izolacji IBC. Jeśli przewiduje się więcej niż jedną grupę infekcji, należy przygotować 5 dodatkowych kapilar do mikropipetowania dla każdej dodatkowej grupy zakażenia. 
		ostrożność: Nie zapomnij wyłączyć otwartego ognia.</li>
		<li>Umieść wyciągnięte naczynia włosowate na szalce Petriego o średnicy 100 mm i wystawiaj naczynie na działanie promieniowania UV przez 30 minut w celu wysterylizowania naczyń włosowatych.</li>
		<li>Po sterylizacji UV załóż pokrywkę na szalkę Petriego i przechowuj szalkę Petriego z naczyniami włosowatymi w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie cewników przed zakażeniem
	<ol>
		<li>Przygotuj cewniki moczowe na zakażenie zgodnie z opisem w Hung et al.8 i Conover et al.26 co najmniej jeden dzień przed zakażeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie fluorescencyjnej uropatogennej kultury E. coli
	<ol>
		<li>Hoduj wybrany uropatogenny szczep bakteryjny z ekspresją fluoroforu zgodnie z ustalonymi protokołami. 
		nuta: Wybór szczepu i fluoroforu w dużej mierze zależy od mikroskopu i szczepów dostępnych w poszczególnych laboratoriach. W tym przykładzie używamy szczepu pochodzącego z UTI89, który jest izolatem klinicznym pierwotnie pochodzącym od pacjenta z nawracającym zapaleniem pęcherza moczowego. Ten szczep, SLC-638, przenosi plazmid (pSLC-77), który wyraża zarówno oporność na vsfGFP-9, jak i kanamycynę18. SLC-638 jest uprawiany w bulionie LB w temperaturze 37 °C uzupełnionym 50 μg/ml kanamycyny.</li>
		<li>Szczep smugowy SLC-638 na płytce z agarem Luria Bertani (LB) uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Obejrzyj płytkę pod mikroskopem preparacyjnym, aby potwierdzić ekspresję markerów fluorescencyjnych przed wyborem kolonii.</li>
		<li>Za pomocą pętli inokulacji bakteryjnej przenieś wybraną kolonię do stożkowej kolby o pojemności 125 ml z 10 ml bulionu LB uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować kolbę statycznie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Subhodowlę bakterii z tej kolby poprzez pobranie 10 μl kultury z kolby i rozcieńczenie jej w 10 ml bulionu LB uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyny w świeżej kolbie o pojemności 125 ml (rozcieńczenie 1:1000). Inkubować drugą kolbę statycznie w temperaturze 37 °C przez kolejne 24 godziny.</li>
		<li>Wirować kulturę bakteryjną przez 5 minut w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w zimnym PBS przy OD600 0,5,5, 
		nuta: Chociaż może się to różnić w zależności od kultury, zazwyczaj 1 ml kultury statycznej daje około 4-5 ml OD600 = 0,5 kultury bakteryjnej. Całkowitą objętość inokulum bakteryjnego potrzebnego dla każdego szczepu można obliczyć w następujący sposób: 50 μl jest wymagane dla każdej myszy i 50 μl jest potrzebne do wypełnienia główki igły. Zaleca się dodanie dodatkowych 10-20% (minimum 50 μl) inokulum w celu uwzględnienia martwej objętości w strzykawce.</li>
		<li>Użyj pozostałej mieszaniny bakteryjnej, aby określić miano infekcji zgodnie z opisem w Hung et al.8. 
		nuta: Ten etap można opóźnić o kilka godzin poprzez przechowywanie mieszaniny bakteryjnej w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mysi model zakażenia dróg moczowych
	<ol>
		<li>Zakażenie myszy zgodnie z opisem Hung et al.8, z jedną grupą eksperymentalną dla każdego szczepu fluorescencyjnego E. coli hodowanego w sekcji 1.3. 
		nuta: Zobacz także Conover et al.26 dla pomocy wizualnej.</li>
		<li>Zwróć uwagę na czas inokulacji bakteryjnej myszy lub klatki.</li>
		<li>Powtórz infekcje dla całej grupy eksperymentalnej. 
		nuta: Cewnik infekcyjny może być ponownie użyty u wszystkich myszy w tej samej grupie.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.4.1-1.4.3 dla każdej planowanej grupy doświadczalnej, upewniając się, że dla każdej grupy przygotowany jest świeży cewnik i nowy żel smarujący. 
		nuta: W przypadku eksperymentów z dużą liczbą zwierząt najlepiej jest podzielić zwierzęta na grupy po pięć sztuk i rozłożyć infekcje tak, aby każda grupa była zarażona w odstępie około 30 minut do 1 godziny. Zapewni to wystarczająco dużo czasu na wykonanie kolejnych kroków (sekcje 2 i 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie komórek nabłonka pęcherza moczowego w celu uzyskania zawiesiny komórek
<ol>
	<li>Zbieranie i odwracanie pęcherzy mysich
	<ol>
		<li>Przygotuj trzy stożkowe probówki o pojemności 50 ml wypełnione 45 ml 70% etanolu do sterylizacji sprzętu chirurgicznego.</li>
		<li>W dwóch probówkach przygotowanych w kroku 2.1.1 umieść nożyczki i parę kleszczy każda. Umieść dwie pary kleszczy (najlepiej jedną węższą i z zaokrągloną końcówką, do odwrócenia pęcherza) do trzeciej rurki. 
		nuta: Narzędzia w pierwszej rurce będą używane w obszarze zewnętrznym, narzędzia w drugiej będą używane do pobierania pęcherza, a dwie pary kleszczy w ostatniej rurce będą używane do inwersji pęcherza.</li>
		<li>Po 6 godzinach od zakażenia należy poddać zakażone myszy eutanazji zgodnie z ustalonymi przez instytucję protokołami IACUC. 
		nuta: Nasz protokół IACUC wzywa do eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy wykonywanej w czasie, gdy mysz jest pod narkozą (izofluran).</li>
		<li>Połóż zwierzęta płasko na plecach i użyj butelki z rozpylaczem wypełnionej 70% etanolem, aby wysterylizować ich okolice brzucha.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek chirurgicznych z pierwszej rurki (przygotowanej w kroku 2.1.2) wykonaj małe poprzeczne nacięcie na skórze około 1 cm powyżej ujścia cewki moczowej. Rozszerz nacięcie po przekątnej w kierunku górnych kończyn myszy, tworząc nacięcie w kształcie litery V wzdłuż całego przedniego odcinka myszy, które odsłania zawartość otrzewnej. Upewnij się, że podczas tego procesu nożyczki nie przecinają jelit myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B).</li>
		<li>Przełącz się na drugi zestaw narzędzi (przygotowany w kroku 2.1.2). Używając ostrzy nożyczek lub trzonków kleszczy, delikatnie dociśnij poduszeczki tłuszczowe w pobliżu miednicy myszy. 
		nuta: Ten krok powoduje, że pęcherz wystaje na zewnątrz i zapewnia widoczność podczas zbioru.</li>
		<li>Chwyć odsłonięty pęcherz na wierzchołku za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Trzymając mocno wierzchołek pęcherza za pomocą kleszczy, odetnij i uwolnij pęcherz od reszty zwierzęcia (odcinając cewkę moczową i moczowody) za pomocą nożyczek chirurgicznych. Nie zwalniaj jeszcze kleszczyków przytrzymujących pęcherz.</li>
		<li>Przechodząc z nożyczek na węższe zaokrąglone kleszcze z trzeciej stożkowej rurki (z kroku 2.1.2), włóż końcówkę jednego trzonka zaokrąglonych kleszczyków do otworu pęcherza, w którym został właśnie przecięty w poprzednim kroku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D). Po bezpiecznym włożeniu końcówki zaokrąglonych kleszczyków do otworu pęcherza, zwolnij parę kleszczy chwytających wierzchołek pęcherza i włóż ją z powrotem do drugiej stożkowej rurki.</li>
		<li>Używając drugiej pary kleszczyków z trzeciej rurki, delikatnie obróć pęcherz "na lewą stronę", najpierw odciągając zewnętrzny koniec ust pęcherza moczowego od zaokrąglonych kleszczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D, strzałka 1) i prowadząc go wokół i nad drugą końcówką zaokrąglonych kleszczy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D, strzałka 2). 
		nuta: Czynność tę można porównać do zdejmowania skarpety z jednej stopy i naciągania jej na drugą.
		<ol>
			<li>Podczas procesu inwersji utrzymuj pierwszą zaokrągloną parę kleszczy prawie całkowicie zamkniętą. Zapewnia to wystarczającą swobodę ruchów, aby oderwać pęcherz od pierwszego trzonu zaokrąglonych kleszczy, ale także zbliża drugi trzon zaokrąglonych kleszczyków do pierwszego i umożliwia łatwe przenoszenie pęcherza. Końcowym wynikiem tego kroku jest to, że pęcherz powinien być odwrócony i znaleźć się na końcu drugiego trzonu pierwszej pary kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
			<li>Używając drugiej pary kleszczyków, delikatnie oderwij odwrócony pęcherz od końcówki kleszczyków do 1 ml zimnego PBS. 
			UWAGA: (Opcjonalnie) Jest to odpowiedni moment na zrobienie zdjęć całego odwróconego, zainfekowanego pęcherza moczowego, aby zaobserwować ogólną częstotliwość i rozmieszczenie IBC, jeśli takie występują.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.10 dla każdego pęcherza moczowego w grupie doświadczalnej (maksymalnie do pięciu zwierząt).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skrobanie komórek nabłonka pęcherza moczowego
	<ol>
		<li>Za pomocą dwóch czystych par kleszczyków delikatnie zeskrob zewnętrzną stronę odwróconego pęcherza moczowego (który jest wewnętrzną warstwą komórek nabłonka). Otaczający PBS powinien wydawać się bardziej mętny, gdy skrobanie postępuje, a komórki nabłonkowe są uwalniane do roztworu PBS.</li>
		<li>(Opcjonalnie) Potwierdź wzrokowo, że skrobanie pęcherza moczowego uwolniło komórki do roztworu za pomocą mikroskopu preparacyjnego. <silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B). Gołym okiem PBS powinien wydawać się mętny, a zeskrobane pojedyncze komórki nabłonka pęcherza moczowego można zobaczyć w 10-krotnym powiększeniu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 2.2.1-2.2.2 dla każdego pobranego pęcherza moczowego od kroku 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC): Pipetowanie doustne IBC
UWAGA: Wszystkie metody opisane w tej sekcji zostały poddane ocenie ryzyka instytucjonalnego. Pipetowanie doustne wiąże się z nieodłącznym ryzykiem połknięcia przenoszonego roztworu. Ryzyko to jest w dużej mierze złagodzone przez objętości nanolitrów, które są wykorzystywane w tym protokole, i zalecamy, aby wszyscy użytkownicy protokołu zwracali uwagę na uwagi dotyczące środków ostrożności i praktyki wymienione tutaj i w dyskusji.
<ol>
	<li>Po zeskrobaniu komórek do PBS należy zainstalować aparat do mikropipetowania w jamie ustnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).
	<ol>
		<li>Włóż grubszy koniec wyciągniętej szklanej kapilary (niewyciągnięty koniec) do gumowej zatyczki (biały koniec) rurki aspiratora.</li>
		<li>Włóż wąską końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml do drugiego otwartego (czerwonego) końca probówki aspiratora, upewniając się, że jest dobrze dopasowana.</li>
		<li>Włóż wąską końcówkę pipety zasysającej o pojemności 2 ml do otwartego, szerszego końca końcówki pipety o pojemności 1 ml, ponownie upewniając się, że jest dobrze dopasowana. 
		nuta: Uzyskana w ten sposób konfiguracja pozwala badaczowi na wprowadzenie pipety do ust z szerszego, otwartego końca pipety zasysającej, aby wytworzyć delikatną siłę ssącą z wąskiego końca rurki kapilarnej na drugim końcu aparatu.</li>
		<li>Zbadać końcowy aparat do mikropipetowania jamy ustnej przy użyciu płytki Petriego o średnicy 100 mm zawierającej świeżą wodę dejonizowaną. Lekkie ssanie otwartego końca pipety zasysającej (podobne do popijania napoju przez słomkę) powinno zwiększyć poziom płynu w kapilarze, ale nie spowodować przelania się wody dejonizowanej do rurki aspiratora. Jedną ręką steruj rurką kapilarną, a drugą ręką reguluj położenie szalki Petriego. 
		nuta: Siła ssania wymagana do pipetowania doustnego pojedynczego IBC będzie różna w zależności od badaczy. Zaleca się jednak, aby każdy badacz próbujący tej techniki zaczął od słabego ssania i powoli je zwiększał, jeśli żadna ciecz nie przepływa w górę naczynia włosowatego. Nie ma potrzeby stosowania siły większej niż ssanie słomki do picia. Jeżeli wydaje się, że kapilara nie zbiera cieczy podczas badania w kroku 3.1.4, możliwe jest, że kapilara lub rurka zasysająca są niedrożne i wymagają wymiany. Ponadto zaleca się, aby wszyscy nowi badacze najpierw przećwiczyli kontrolowanie ssania w aparacie do pipetowania w jamie ustnej za pomocą wysterylizowanej wody. Dodatkowo należy zauważyć, że kontrola objętości pobieranej przez aparat do pipetowania doustnego odbywa się za pomocą języka badacza. Język może precyzyjnie regulować siłę zasysania, a także działać jako zatrzymanie awaryjne.</li>
		<li>Po pomyślnym pobraniu płynu należy sprawdzić jego zdolność do wydalenia go z kapilary poprzez delikatne dmuchnięcie w otwarty koniec pipety zasysającej. Upewnij się, że w procesie usuwania cieczy nie powstają pęcherzyki powietrza, aby zapobiec zanieczyszczeniu IBC w kroku 3.5. 
		nuta: Podobnie jak w przypadku ssania, siła nadciśnienia wywieranego przez badacza w celu wyrzucenia IBC do probówki wirówkowej będzie różna u poszczególnych badaczy. Zaleca się, aby badacze, którzy nie mają doświadczenia w tym protokole, przećwiczyli krok 3.1 na kilka dni przed właściwą infekcją. Jedną z sugestii dotyczących ćwiczenia mikropipetowania jamy ustnej jest ćwiczenie przenoszenia małych objętości wysterylizowanej wody zmieszanej z kilkoma kroplami barwnika spożywczego (dla widoczności) za pomocą aparatu do mikropipetowania jamy ustnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zeskrobaną zawiesinę komórek pod mikroskopem preparacyjnym i zidentyfikuj IBC jako duże agregaty fluorescencyjne (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B). Idealny zakres powiększenia to 20-40x. Zanurz cienki koniec szklanej kapilary w świeżej probówce PBS na 1 s, aby zmniejszyć wchłanianie niepożądanej objętości przez działanie kapilarne.</li>
	<li>Patrząc przez mikroskop, zidentyfikuj interesujący Cię IBC i powoli zbliżaj otwarty koniec rurki kapilarnej w kierunku IBC. Użyj cienkiego końca szklanej kapilary, aby usunąć dodatkowe komórki w pobliżu każdego IBC, aby zapobiec zachłyśnięciu dwóch lub więcej komórek lub rozbić większe agregaty komórek.</li>
	<li>Patrząc przez mikroskop, przyłóż bardzo małą siłę ssącą do drugiego końca (pipety zasysającej) aparatu do mikropipetowania jamy ustnej, aby wprowadzić IBC do szklanej kapilary.</li>
	<li>Po podniesieniu IBC przenieś kapilarnę do pustej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i zastosuj lekkie nadciśnienie, aby usunąć kroplę i IBC do probówki wirówkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3-3.6 na tylu IBC, ile jest potrzebnych z bieżącego pęcherza, zanim przejdziesz do następnego pęcherza. Często zmieniaj pipety aspiracyjne i naczynia włosowate, aby zapobiec gromadzeniu się śliny. 
	ostrożność: Podczas pracy z zakaźnymi (lub klinicznymi) szczepami bakterii należy stale monitorować poziom roztworu w naczyniach włosowatych. Nie pozwól, aby poziom pipetowanej cieczy przelał się z krawędzi kapilary do rurki aspiratora. W takim przypadku natychmiast przełącz się na inną rurkę aspiratora i wyrzuć poprzednią konfigurację.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.2-3.6 na wszystkich pobranych pęcherzach lub do momentu, gdy zostanie pobrana wystarczająca liczba próbek biologicznych dla grupy doświadczalnej.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Powtarzaj kroki 3.6 i 3.7, aż wszystkie grupy eksperymentalne (lub myszy) zostaną poddane eutanazji i z każdej grupy zostanie pobrana wystarczająca ilość próbek biologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+Tract+Infections%3A+Current+and+Emerging+Management+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies.</a> Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).</li>
<li>Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infections%3A+epidemiology%2C+mechanisms+of+infection+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options.</a> Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).</li>
<li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurring+urinary+tract+infection%3A+incidence+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors.</a> American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).</li>
<li>Foxman, B., Barlow, R., D'Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+tract+infection%3A+self-reported+incidence+and+associated+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs.</a> Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).</li>
<li>Zowawi, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+threat+of+multidrug-resistant+Gram-negative+bacteria+in+urology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology.</a> Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).</li>
<li>Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+physiology+to+pharmacy%3A+developments+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+urinary+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Urology+Reports%22%5BJournal%5D)">From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections.</a> Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).</li>
<li>Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waging+war+against+uropathogenic+Escherichia+coli%3A+winning+back+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract.</a> Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).</li>
<li>Hung, C. -S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).</li>
<li>Cusumano, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prevention+of+urinary+tract+infection+with+orally+active+FimH+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors.</a> Science Translational Medicine. , (2011).</li>
<li>Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Immunization+with+Iron+Receptor+Antigens+Protects+against+Urinary+Tract+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection.</a> PLoS Pathogens. , (2009).</li>
<li>Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+uropathogenic+Escherichia+coli+persistence+and+eradication+from+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).</li>
<li>Hunstad, D. A., Justice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+lifestyles+and+immune+evasion+strategies+of+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli.</a> Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).</li>
<li>Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+human+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection.</a> PLoS Medicine. , (2007).</li>
<li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+bacterial+communities+in+a+child+with+Escherichia+coli+recurrent+urinary+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections.</a> Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).</li>
<li>Robino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+bacteria+in+the+pathogenesis+of+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).</li>
<li>Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+and+niche+distribution+of+uropathogenic+Escherichia+coli+during+acute+and+chronic+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection.</a> Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).</li>
<li>Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+morphological+parameters+of+the+human+urinary+bladder+%28malignant+and+normal%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal).</a> International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).</li>
<li>Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Intracellular+Bacterial+Communities+during+Experimental+Urinary+Tract+Infection+Reveals+an+Abundant+and+Viable+Bacterial+Reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
<li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+and+stochastic+allele+specific+gene+expression+in+single+mouse+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres.</a> PLoS One. , (2011).</li>
<li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mouse+endoderm+is+patterned+by+soluble+factors+from+adjacent+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers.</a> Development. 127, 1563-1572 (2000).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+DNA+methylome+landscapes+of+mammalian+cells+with+single-cell+reduced-representation+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing.</a> Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+clonally+derived+chicken+embryonic+fibroblast+cell+line+%28CSC%29+with+high+transfection+efficiency+and+ability+as+a+feeder+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).</li>
<li>Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporation+of+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporation of Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).</li>
<li>Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Characterization+of+UTI+and+CAUTI+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), 52892(2015).</li>
<li>Justice, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+developmental+pathways+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+urinary+tract+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).</li>
<li>Mulvey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+Evasion+of+Host+Defenses+by+Type+1-Piliated+Uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli.</a> Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).</li>
<li>Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mutagenesis+of+the+fimS+promoter+regulatory+switch+reveals+novel+regulation+of+type+1+pili+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).</li>
<li>Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+regulation+of+the+fim+switch+controlling+type+1+fimbrial+phase+variation+in+Escherichia+coli+K-12%3A+effects+of+temperature+and+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media.</a> Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).</li>
<li>Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgens+Enhance+Male+Urinary+Tract+Infection+Severity+in+a+New+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).</li>
<li>Garofalo, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+from+Urine+of+Female+Patients+with+Urinary+Tract+Infections+Is+Competent+for+Intracellular+Bacterial+Community+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation.</a> Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).</li>
<li>Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+cultures+support+intracellular+bacterial+community+formation+by+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).</li>
<li>Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+P-fimbrial+phase+variation+frequencies+in+Escherichia+coli+CFT073%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073.</a> Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).</li>
<li>Jost, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+growth+of+the+mouse+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Postnatal growth of the mouse bladder.</a> Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany przez nas protokół pozwala na odizolowanie pojedynczych IBC od mysiego modelu ZUM. Protokół ten izoluje IBC zawierające żywotne bakterie wewnątrzkomórkowe, które można zweryfikować poprzez hodowlę pod kątem CFU. Protokół skutkuje powstawaniem bakterii wewnątrzkomórkowych z IBC z niewielkim zanieczyszczeniem bakteriami zewnątrzkomórkowymi, co pozwala na dalszą charakterystykę zarówno bakterii, jak i komórki gospodarza z IBC (ryc. 4C). Wykazaliśmy również, że bakterie z pojedynczego IBC mogą być wykorzystywane w dalszych zastosowaniach, takich jak qPCR (Rysunek 4C), co sugeruje, że nasza technika może być wykorzystana do przetwarzania IBC do innych analiz in vitro. Łącząc bakterie zebrane z zaledwie 5 IBC, dodatkowo demonstrujemy naszą zdolność do przeprowadzania analizy qRT-PCR na trzech genach bakteryjnych, co sugeruje, że dobrej jakości RNA można zebrać z bakterii w naszych izolowanych IBC (Rysunek 4D). Łącznie, dane, które pokazaliśmy, wskazują, że przeprowadzenie analizy RNA całego genomu (takiej jak sekwencjonowanie RNA) na pojedynczych IBC może być możliwe przy użyciu tej techniki izolacji.
W tym protokole skupiliśmy się na 6-godzinnym punkcie czasowym, ponieważ jest to moment, w którym liczby IBC osiągają szczyt w pęcherzach czarnych 6 myszy zakażonych UTI8927. Ponadto zastosowaliśmy również statyczny system hodowli bakteryjnej w celu zwiększenia poziomu ekspresji pilusa typu 1 w UTI89. Ekspresja pilusa typu 1 ma kluczowe znaczenie dla E. coli do przyczepiania się i infekowania komórek nabłonka pęcherza moczowego28. Jednak ta ekspresja jest ściśle regulowana29 i wiadomo, że sygnały środowiskowe ją zmieniają30. W celu utrzymania spójnego fenotypu infekcji i wystarczającej liczby IBC, zalecamy stosowanie statycznej hodowli bakteryjnej trwającej 2 x 24 godziny (nieznacznie zmodyfikowanej w stosunku do Hung i wsp.8) oraz 6-godzinnego punktu czasowego infekcji podczas pracy z wcześniej testowanymi szczepami E. coli, takimi jak NU14 i UTI8928,29. Możliwe jest jednak, że zmienne te będą musiały zostać dostosowane w innych szczepach ZUM lub w innych szczepach myszy, aby uzyskać idealną liczbę IBC z każdej infekcji.
Podczas gdy protokół z Hung i wsp.8 wykorzystuje tylko samice myszy, inne ustalone protokoły ustalania infekcji dróg moczowych u samców myszy zostały zgłoszone31. W tym modelu zapalenie pęcherza moczowego u samców myszy również przebiegało szlakiem IBC. Ponieważ pęcherze moczowe samców i samic myszy są podobnej wielkości, przewidujemy, że nasz protokół izolacji IBC może być również stosowany u zakażonych samców myszy.
Stosunkowo prosta technologia zastosowana w tym protokole zapewnia również, że można go wdrożyć w większości laboratoriów. Jednym z kluczowych kroków związanych z tym protokołem jest wyciąganie szklanych naczyń włosowatych w celu wytworzenia mikronaczyń włosowatych w celu wyboru typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Ten etap pozwala na elastyczność w zakresie średnic tworzonych mikrokapilarek, a tym samym metodę można rozszerzyć na wiele różnych typów komórek docelowych. Jednak ze względu na nieodłączną zmienność w tworzeniu tych naczyń włosowatych, należy zadbać o to, aby ostateczna średnica mieściła się w użytecznym zakresie. Jeśli naczynia włosowate są zbyt wąskie, nie są w stanie podnieść interesującej ich komórki, ale jeśli są zbyt szerokie, można wybrać wiele komórek za jednym razem. Co więcej, użycie otwartego ognia podczas procesu wyciągania naczyń włosowatych niesie ze sobą nieodłączne ryzyko poparzenia i pożaru, dlatego badacz próbujący stworzyć mikrokapilary powinien zadbać o to, aby do takich zdarzeń nie dopuścić. Aby zmniejszyć zmienność, a także ryzyko otwartego ognia związane z wytwarzaniem tych kapilarek, badacz może skorzystać z tradycyjnej maszyny do wyciągania mikropipet, takiej jak te używane do eksperymentów elektrofizjologicznych (np. PC-100, grupa Narishige). Ponieważ maszyny te wykorzystują platformy grawitacyjne lub robotyczne do wyciągania naczyń włosowatych, można je dostosować do potrzeb modelu infekcji. Jednak szeroka gama dostępnych maszyn do wyciągania mikropipet oznacza, że indywidualny badacz będzie musiał przejść przez kilka prób i błędów, aby określić odpowiednią końcową średnicę kapilary do użycia z tym protokołem.
Prezentowany protokół wykorzystuje bakterie wykazujące ekspresję znacznika fluorescencyjnego do wizualnej identyfikacji IBC. W związku z tym technika ta jest ograniczona przez zdolność naukowców do genetycznej modyfikacji organizmu zakaźnego. Specjalnie dla UPEC, szczepy tworzące IBC, takie jak CFT073 i NU14, zostały z powodzeniem przekształcone w plazmidy eksprymujące GFP 32,33,34; W związku z tym powinny one nadawać się do stosowania w tym samym protokole. Na podstawie powierzchni pęcherza moczowego myszy (70 mm2)35, długości poszczególnych komórek nabłonka (50-120 μm)17 oraz częstości występowania IBC w pojedynczym pęcherzu moczowym16, konserwatywne oszacowanie częstości występowania IBC wynosi około 1 na 1000 komórek (lub 0,1%). Szacunki te pokazują użyteczność naszego protokołu izolacji komórek w celu zwalczania rzadkich zdarzeń. Precyzja selekcji komórek za pomocą naszego protokołu i szeroki zakres średnic naczyń włosowatych, które można pociągnąć, sugerują, że protokół ten może być stosowany do izolowania bakterii wewnątrzkomórkowych od innych modeli infekcji in vivo i in vitro. Rzeczywiście, z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę do wyizolowania zakażonych hodowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego (dane nie pokazane).
Jednym z trudniejszych technicznie kroków w protokole jest odwrócenie pęcherza moczowego w celu odsłonięcia komórek nabłonka do zeskrobania. Odkryliśmy, że możliwe jest również wykonanie nacięcia na pęcherzu, aby rozłożyć go do skrobania. Należy jednak zachować należytą ostrożność w celu zmniejszenia uszkodzenia komórek nabłonka pęcherza moczowego podczas procesu jego rozcinania; Idealnie byłoby, gdyby do rozchylenia pęcherza zastosowano pojedyncze cięcie. Dodatkowo cięcie powinno być wykonane w zimnym PBS, aby zapobiec przypadkowej utracie komórek lub tkanki pęcherza moczowego podczas procesu.
Pipetowanie doustne IBC w tym protokole zapewnia większą kontrolę nad procesem selekcji komórek, a także ogranicza końcową objętość roztworu przenoszonego wraz z celą. Precyzyjna kontrola i duża separacja roztworu od ust badaczy również maksymalizuje bezpieczeństwo badacza, ponieważ przenoszone objętości mieszczą się w zakresie od nanolitrów do mikrolitrów. W przeciwieństwie do tego, nasze doświadczenie z nowoczesnymi mikropipetami jest takie, że mają one tendencję do przenoszenia większej ilości otaczającej cieczy i komórek za pomocą IBC, co potencjalnie prowadzi do zanieczyszczenia zewnątrzkomórkowymi bakteriami luminalnymi. Nasze odkrycie, że pipetowanie doustne zapewnia wyższą wydajność w porównaniu z innymi metodami izolacji pojedynczych komórek, zostało również zgłoszone przez inne laboratoria 22,23,24. Oprócz izolacji pojedynczych komórek, pipetowanie doustne było nawet stosowane w elektroporacji pojedynczych komórek dla neuronów25, co dodatkowo pokazuje użyteczność i drobiazgową kontrolę, jaką wyszkolony badacz może osiągnąć dzięki tej technice. Jednak bezpieczeństwo ma pierwszorzędne znaczenie i sugerujemy potencjalne dodatkowe środki, które można podjąć w zależności od stosowanych patogenów: (i) rozszerzenie bufora powietrza między badaczem a materiałem biologicznym, na przykład poprzez użycie pipety zasysającej o większej objętości (np. 5 ml) lub (ii) dodanie fizycznego filtra, takiego jak wata, do pipety zasysającej, aby działał jako dodatkowa bariera.
W przypadkach, w których ocena ryzyka prowadzi do wniosku, że pipetowanie doustne jest nadal zbyt ryzykowne, dostępne na rynku zestawy robotyczne (takie jak te używane do nanoiniekcji) można połączyć z innymi sekcjami naszej techniki, aby zapewnić bezpieczniejszą metodę izolowania zakażonych komórek z mieszanych populacji. Należy zauważyć, że nasze doświadczenia z użyciem mikromanipulatora robotycznego wykazały zmniejszenie wskaźnika izolacji IBC w porównaniu z pipetowaniem doustnym, ponieważ duża wewnątrzeksperymentalna różnica w wielkości komórek nabłonka pęcherza moczowego utrudnia użytkownikowi ramienia robotycznego określenie siły wymaganej do podniesienia pojedynczych IBC. Niemniej jednak pozostaje to realną, choć bardziej kosztowną opcją dla osób pracujących z wysoce zakaźnymi czynnikami chorobotwórczymi.

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są jednymi z najczęstszych infekcji bakteryjnych. Szacuje się, że 40-50% kobiet doświadczy co najmniej jednej infekcji dróg moczowych (ZUM) w ciągu swojego życia1. Jednym z głównych czynników wywołujących ZUM jest uropatogenna E. coli (UPEC), która stanowi ponad 70% niepowikłanych ZUM2. Co więcej, około jedna czwarta osób z ZUM będzie miała nawracające infekcje, często spowodowane przez ten sam szczep, pomimo odpowiedniego leczenia antybiotykami3. Wysoka częstość występowania ZUM stanowi znaczne obciążenie dla systemów opieki zdrowotnej, kosztując ponad 2 miliardy dolarów rocznie w USA4. Co więcej, stosowanie antybiotyków w leczeniu ZUM prowadzi również do wzrostu wskaźników oporności na antybiotyki, co jest poważnym problemem zdrowia publicznego5.
Dlatego włożono wiele wysiłku w zrozumienie mechanizmów, za pomocą których UPEC infekuje drogi moczowe, a także jego zdolności do powodowania nawracających infekcji6,7,8. W szczególności mysi model infekcji został wykorzystany do zbadania cech bakterii i gospodarza, które przyczyniają się do UTI8. Ten mysi model ma tę zaletę, że można go zastosować do niezmodyfikowanych szczepów klinicznych wyizolowanych od ludzi. Model ten doprowadził również do odkrycia potencjalnie uleczalnych szlaków bakteryjnych ważnych dla rozwoju ZUM, takich jak pilus9 i systemy akwizycji żelaza10.
W porównaniu z tymi sukcesami w badaniu wczesnych zdarzeń w UTI, nadal brakuje wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw nawracających infekcji układu moczowego11. Jedna z hipotez głosi, że UPEC unika antybiotykoterapii i powoduje nawracające infekcje pęcherza moczowego poprzez tworzenie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC) w komórkach nabłonka pęcherza moczowego. IBC zostały zidentyfikowane zarówno w mysich modelach infekcji, jak i u pacjentów z ZUM12,13. Obecność IBC w próbkach moczu od pacjentów z ZUM u dzieci wiąże się z wyższymi wskaźnikami nawrotów14,15. Jednak izolowanie IBC i badanie bakterii w nich zawartych okazało się wyzwaniem technicznym ze względu na ich rzadkość; Szacuje się, że zakażony pęcherz moczowy myszy ma zazwyczaj tylko 10-100 IBCs16. Co więcej, komórki nabłonka pęcherza moczowego są stosunkowo duże (50-120 μm)17, co utrudnia zastosowanie sortowania komórek wspomaganego fluorescencją (FACS), biorąc pod uwagę, że typowe dysze FACS są zaprojektowane o średnicach 70 μm lub 100 μm. W związku z tym komórki tak duże jak komórki nabłonka pęcherza moczowego są często usuwane przez filtrację przed FACS, aby uniknąć zatkania płynów.
Nasze laboratorium niedawno opisało ogólną i ekonomiczną metodę izolowania rzadkich zakażonych komórek z mieszanin, takich jak zeskrobane komórki nabłonkowe pęcherza moczowego18. Aby skutecznie wyizolować IBC, zastosowaliśmy tradycyjne pipetowanie doustne. Mikropipetowanie jamy ustnej to technika, która od dawna jest stosowana do mikromanipulacji pojedynczymi komórkami i zarodkami w celu dalszej analizy19,20,21,22,23,24,25. Tradycyjne pipetowanie doustne dużych objętości płynów (w mililitrach) często było przyczyną wypadków związanych z laboratoriami, a technika ta słusznie była odrzucana przez większość społeczności badawczej poza tradycyjną embriologią i zastosowaniami pojedynczych komórek. Nasz protokół jest inspirowany jednokomórkowymi wersjami tej techniki19,20, które zmniejszają ryzyko, zapewniając duży bufor (>2 ml) powietrza między badaczem a próbką w porównaniu z objętością przenoszonej cieczy (<1 μL). Metoda ta wykorzystuje również precyzyjną kontrolę, jaką zapewnia mikropipetowanie w jamie ustnej, co przekłada się na niską końcową objętość przenoszonego roztworu w otoczeniu i wysoką czystość izolowanych komórek. Technika ta wykorzystuje niedrogie materiały (<50 USD), a zatem powinna być możliwa do wdrożenia we wszystkich laboratoriach.
Ten wizualny protokół opisuje naszą technikę izolacji IBC, stanowiąc punkt odniesienia dla innych badaczy próbujących powtórzyć tę technikę. Badacz będzie potrzebował dostępu do fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego (lub podobnego sprzętu), który może być używany do wizualizacji pojedynczych komórek nabłonka i bakterii fluorescencyjnych podczas obrazowania na żywo, z otwartym i dostępnym stolikiem do obrazowania do mikropipetowania (szczegóły dotyczące używanego mikroskopu znajdują się w Tabeli Materiałów, chociaż można również użyć innych równoważnych modeli instrumentów). Podczas gdy protokół ten będzie koncentrował się na IBC w mysim modelu ZUM, podobne metody powinny być stosowane do izolowania zakażonych komórek z zawiesin komórkowych w innych modelach infekcji.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówka</td><td></td><td></td> eppendorfa <td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>100% etanolu</td><td></td><td></td><td>Do palnika alkoholowego</td></tr><tr><td>15 ml rurka</td><td></td><td></td> stożkowa <td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka tuberkulinowa</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>3% agar</td><td></td><td></td> bakteryjny <td>Do statycznej hodowli bakteryjnej i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Kleszczyki anatomiczne Aesculap</td><td>Braun/Kruuse</td><td>BD222R</td><td>Do wstępnego wypreparowania myszy (skóra, powięź)</td></tr><tr><td>Palnik alkoholowy</td><td>Wheaton</td><td>237070</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta zasysająca</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td>357558</tr><tr><td>Rurka aspiratora</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Pętle</td><td></td><td></td> bakteryjne <td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Dowolna wirówka do probówek eppendorf 1,5 ml Kolby</td></tr><tr><td></td><td></td><td>stożkowe</td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Kamera cyfrowa do mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>DP71</td><td>Do przechwytywania obrazów i zbierania IBC. Wystarczy każdy inny mikroskop fluorescencyjny z kanałem GFP</td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Kimax</td><td>6148K07</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki STR SS 110MM</td><td>Braun</td><td>BC110R</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (Isothesia)</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Calbiochem</td><td>420311</td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru OD</td></tr><tr><td>bulion LB (Miller)</td> <td>Thermo/Gibco</td><td>10855021</td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Jednostka źródła światła do mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>LG-PS2</td><td>Do przechwytywania obrazów i zbierania IBC. Każdy inny mikroskop fluorescencyjny z kanałem GFP wystarczy</td></tr><tr><td>Smar&nbsp;</td><td>KY</td><td></td><td>: Każdy podobny komercyjny smar medyczny wystarczy</td></tr><tr><td>Mikroskop makrofluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Do przechwytywania obrazów i zbierania IBC. Wystarczy dowolny inny mikroskop fluorescencyjny z kanałem GFP Końcówki</td></tr><tr><td></td><td></td> do<td>mikropipet + mikropipet</td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td></td><td></td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Kontroler pipet + Pipety</td><td></td><td></td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa</td><td>BD Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Igła do precyzyjnego ślizgu 30 G</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>305107</td><td>Prawdopodobnie pod nowym numerem katalogowym (305106)</td></tr><tr><td>Kleszczyki do odłamków zakrzywione</td><td>Braun</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem (do etanolu)</td><td></td><td></td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Kuwety kwadratowe</td><td>Elkay</td><td>127-1010-400</td><td>Do statycznej hodowli bakterii i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa Sterilgard III Advance</td><td>Baker</td><td>SG403</td><td>Dowolna szafa bezpieczeństwa biologicznego z irydiatorem UV</td></tr><tr><td>Sterilin 90mm Standardowa szalka Petriego</td><td>Thermo</td><td>101VR20</td><td>Dowolna sterylna szalka Petriego</td></tr><tr><td>Stevens, Nożyczki naczyniowe i ścięgniste, zakrzywione, delikatne, 110 mm</td><td>Braun</td><td>OK366R</td><td>Zalecany do pobierania pęcherza</td></tr><tr><td>moczowego Nożyczki chirurgiczne STR S/B 105MM</td><td>Wirówka stołowa Braun</td><td>BC320R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Dowolna wirówka chłodnicza do stożkowego miernika</td></tr><tr><td>gęstości komórek WPA C08000</td> o pojemności 15 ml <td>Biowave (Biochrom)</td><td>80-3000-45</td><td>Do statycznej hodowli bakteryjnej i pomiaru średnicy zewnętrznej</td></tr></tbody></table>

izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

W tym artykule opisujemy procedurę używaną do izolowania indywidualnych wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych od myszy, która została eksperymentalnie zainfekowana w drogach moczowych. Protokół można ogólnie podzielić na trzy sekcje: infekcja, pobieranie komórek nabłonka pęcherza moczowego oraz mikropipetowanie jamy ustnej w celu wyizolowania poszczególnych zakażonych komórek nabłonka. Izolowana komórka nabłonkowa zawiera żywe komórki bakteryjne i jest prawie wolna od zanieczyszczających bakterii zewnątrzkomórkowych, co czyni ją idealną do dalszej analizy pojedynczych komórek. Czas od początku infekcji do uzyskania pojedynczej wewnątrzkomórkowej społeczności bakteryjnej wynosi około 8 godzin. Protokół ten jest niedrogi we wdrożeniu i wykorzystuje powszechnie dostępne materiały, a my przewidujemy, że może być również wykorzystany w innych modelach infekcji do izolowania pojedynczych zakażonych komórek z mieszanin komórkowych, nawet jeśli te zainfekowane komórki są rzadkie. Jednak ze względu na potencjalne ryzyko związane z mikropipetowaniem jamy ustnej, procedura ta nie jest zalecana w przypadku czynników wysoce zakaźnych.

Poza potwierdzeniem (Rysunek 3D) obecności pojedynczego, wyizolowanego IBC w probówce zbiorczej za pomocą mikroskopu stereotypowego, czystość wyizolowanego IBC można potwierdzić również za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jak pokazano na Rysunku 4A, wyizolowane komórki powinny być barwione zarówno na E. coli, jak i uroplakinę, oraz posiadać oczekiwaną dla IBC wielkość (50-120 µm)17. Co więcej, barwienie na E. coli nie występuje w otaczającej cieczy. Na podstawie naszych danych ponad 90% komórek wyizolowanych tą techniką to IBC18. Po izolacji obecność i żywotność komórek bakteryjnych w pojedynczym IBC można potwierdzić poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) (Rysunek 4B) lub ilościową reakcję polimerazy łańcuchowej (qPCR) w celu oznaczenia ekwiwalentów genomowych (Rysunek 4C). Rysunek 4C wykazuje również, że niezakażone komórki nabłonkowe wyizolowane zgodnie z tym samym protokołem nie zawierają mierzalnych ilości bakterii. Na podstawie tych danych szacujemy, że zakres CFU w pojedynczym IBC w mysim modelu zakażenia dróg moczowych wynosi 102-103 . Jednym z głównych celów izolacji pojedynczych IBC jest przeprowadzenie analiz następczych, takich jak sekwencjonowanie RNA. Aby zweryfikować, czy nasza metoda izolacji pozwala na uzyskanie RNA z bakterii w IBC do analizy, przeprowadziliśmy ilościową reakcję polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) dla trzech genów (16S, cyoB i frdA) w zakresie pojedynczo wyizolowanych i połączonych IBC (Rysunek 4D). Wszystkie dane przedstawione na Rysunku 4 zostały opracowane za zgodą Duraiswamy i wsp.18. Schematyczny przegląd naszego protokołu izolacji IBC znajduje się na Rysunku 5, który został powielony z pracy Duraiswamy i wsp.18.
<img alt="Wyciąganie mikrowłókien: porównanie z linijką (A), widok mikroskopowy (B), badanie wydłużenia materiału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Kapilary wyciągane ręcznie zachowują wąskie otwory. (APróbki ręcznie wyciąganych kapilar przedstawiono na czarnym tle w celu zwiększenia kontrastu. Od dołu do góry pokazano: kapilarę niewyciąganą, kapilarę niewyciągniętą w wystarczającym stopniu, kapilarę, którą można wykorzystać do pobierania pojedynczych komórek nabłonka pęcherza, oraz kapilarę wyciągniętą zbyt cienko (co doprowadziło do jej rozdzielenia na dwa fragmenty). W celu określenia skali w dolnej części obrazu umieszczono linijkę o długości 15 cm. Szacowane miejsce odłamania użytecznej kapilary zaznaczono na rysunku czerwoną strzałką.BZdjęcie wykonane przy użyciu stereomikroskopu, potwierdzające pusty przekrój wewnętrzny wyciągniętej kapilary (na dole). Powyżej umieszczono kapilarę niewyciągniętą, aby zobrazować względną różnicę wielkości obu kapilar. Pasek skali = 4,0 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces sekcji myszy; narzędzia, organy; układ eksperymentalny, badanie biologiczne, analiza wizualna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Sekcja myszy w celu pobrania komórek nabłonka pęcherza moczowego. (A) Zdjęcie myszy z naniesionymi białymi liniami wskazującymi szacowaną lokalizację i kąt nacięć w celu odsłonięcia jamy otrzewnej oraz pęcherza moczowego myszy. (B) Obraz odsłoniętej jamy otrzewnej myszy po nacięciu. (C) Obraz odsłoniętego pęcherza moczowego (czerwona strzałka), wystającego pomiędzy poduszkami tłuszczowymi. (D) Obraz pęcherza mysiego z końcówką pęsety wprowadzoną do światła, ze strzałkami wskazującymi kierunki ruchu niezbędne do wywinięcia pęcherza. Pęcherz jest najpierw lekko wyciągany na zewnątrz, a następnie przesuwany wokół pierwszej ramion pęsety i z niej zdejmowany. Kierunki ruchu dla obu czynności są wskazane przez białe strzałki ponumerowane 1 i 2. (E) Obraz przedstawiający końcową pozycję odwróconego pęcherza wprowadzonego na drugie ramię kleszczy. Ramiona kleszczy są oznaczone na obu panelach D i E czerwonymi strzałkami oraz tekstem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek glonów, części mikropipety, analiza mikrostruktury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3Pozyskiwanie IBC z komórek pęcherza moczowego. (A) Zainfekowany i wywinięty pęcherz w zimnym roztworze PBS przed zeskrobaniem komórek. (B) Obraz przedstawiający zeskrobane komórki pęcherza moczowego obserwowane pod mikroskopem. IBC można zidentyfikować jako duże zielone fluorescencyjne agregaty na obu obrazach (patrz czerwone strzałki). (C) Zdjęcie kompletnego zestawu do mikropipetowania ustnego. Pipeta ssąca, końcówka pipety, rurka aspiratora i wyciągnięta kapilara są oznaczone ponumerowanymi strzałkami, zgodnie z opisem po prawej stronie. (D) Obraz pojedynczej wyizolowanej komórki IBC w probówce do zbierania o objętości 1,5 ml (obrysowana na czerwono). Paski skali (zgodnie z oznaczeniem) są przedstawione jako białe linie na panelach A, B i D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia konfokalna uroplakiny i E. coli w komórkach nabłonkowych; wykresy analizy CFU i qPCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4Odizolowane IBC są czyste i mogą być wykorzystane do dalszych analiz. Rysunek zmodyfikowany za zgodą Duraiswamy i wsp.18. (A) Obrazy dwóch wyizolowanych komórek GFP-dodatnich, które zostały zabarwione przeciwciałami anty-uroplakina oraz anty-E. coli przeciwciałami. Pierwsza komórka (IBC 1) posiada obrazy poszczególnych kanałów (przy małym powiększeniu) po lewej stronie, a po prawej stronie znajduje się obraz scalony przy dużym powiększeniu. Druga komórka (IBC 2) przedstawiona jest przy dużym powiększeniu w obrazie scalonym oraz w poszczególnych kanałach. Paski skali są oznaczone zgodnie z opisem. DNA wybarwiono 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) i przedstawiono w kanale niebieskim. Przeciwciała anty-E. coli barwi się przeciwciałem wtórnym sprzężonym z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), co reprezentowano w kanale zielonym. Przeciwciało anty-uroplakina jest barwione przeciwciałem wtórnym sprzężonym z izotiocyjanianem tetrametylorodaminy (TRITC), co reprezentowano w kanale czerwonym. (B) Bakteryjne JCF z wyizolowanych IBC. IBC poddano obróbce natychmiast lub inkubowano w 0,1% Triton-X przez 10 lub 30 min. Przedstawiono zbiorczą liczbę JCF dla poszczególnych IBC wyizolowanych z n = 3 oddzielnych eksperymentów. Granica wykrywalności = 0,7 log10 Jtk/IBC. Czerwone kropki naniesione na granicy wykrywalności oznaczają próbki, w których nie odzyskano kolonii. Wszystkie próbki zawierające IBC nie wykazują istotnych różnic (p &gt; 0,05, test Manna-Whitneya); niezinfekowane komórki nabłonka różnią się znacząco od danych z IBC (10 min) (p &lt; 0,01, test Manna-Whitneya). (C) ilościowe oznaczenie qPCR bakterii na poszczególnych IBC oraz niezakażonych komórkach nabłonkowych po 10-minutowej inkubacji w 0,1% Triton-X (*, p &lt; 0,01, test Mann-Whitney’a, n = 4). Granica wykrywalności = 1,18 log10 równoważniki genomów bakteryjnych/IBC. Czerwone kropki wskazują próbki, w których nie odzyskano kolonii podczas miareczkowania w panelu B. (D) Oznaczenie ilościowe 16S rRNA, cyoB, i frdA geny dla różnej liczby pojedynczo izolowanych i połączonych IBC (n = 1 eksperyment; każdy punkt wskazuje średnią z 3 powtórzeń technicznych). NC = ujemna kontrola bez DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat badania pęcherza moczowego przedstawiający inokulację, inwersję, skrobanie komórek i izolację pojedynczych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58829/58829fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5Schemat oraz powiązane z nim zdjęcia przedstawiające izolację IBC poprzez mikropipetowanie ustne z pęcherzy zakażonych myszy. Rysunek powielono z pracy Duraiswamy i wsp.18. (A) pobrany cały pęcherz moczowy; (B) wyewersowany cały pęcherz z widocznymi komórkami IBC wykazującymi ekspresję GFP; (C) zbliżenie krawędzi zeskrobanego pęcherza, ukazujące pojedyncze komórki IBC w zawiesinie w sąsiednim buforze; (D) pojedyncza wyizolowana komórka IBC przeniesiona pipetą do probówki. Czerwone strzałki w panelu B wskazują przykłady komórek IBC dodatnich pod kątem GFP na powierzchni luminalnej pęcherza moczowego. Czerwona przerywana linia w panelu C oznacza prawą krawędź wywiniętego pęcherza moczowego (oznaczonego jako „BL”); czerwone strzałki w panelu C wskazują prawdopodobnie pojedyncze komórki nabłonka dodatnie pod kątem GFP, które zostały zeskrobane z powierzchni pęcherza. Biała przerywana linia w panelu D wskazuje naniesioną za pomocą mikropipety kroplę o objętości poniżej mikrolitra zawierającą wyizolowaną komórkę IBC, wskazaną białą strzałką. Paski skali = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58829/58829fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne lub IBC zaobserwowano u myszy, które poddano eksperymentalnym infekcjom dróg moczowych lub ZUM. Zaobserwowano je również w osadach moczu pacjentów z ZUM. Technika, którą dzisiaj opisujemy, to sposób na izolację pojedynczych IPC od eksperymentalnie zakażonych myszy.Technika mikropipetowania jamy ustnej jest jedyną obecnie dostępną techniką izolowania bakterii wewnątrzkomórkowych z zakażonych pęcherzy myszy. Aby przygotować pipety ze szklanymi ustami, mocno ściśnij oba końce szklanej rurki kapilarnej i równomiernie obracaj środek rurki w przód iw tył wzdłuż jej osi nad otwartym źródłem płomienia. Gdy szkło stanie się miękkie, usuń kapilatę ze źródła ciepła i natychmiast rozsuń szklankę.Idealna końcowa długość naciągniętej kapilary jest od trzech do pięciu centymetrów dłuższa niż kapilary nienaciągnięta, aby zapewnić odpowiednią średnicę wewnętrzną do izolacji pojedynczych komórek nabłonka pęcherza moczowego. Gdy szklanka ostygnie, sprawdź, czy środek szklanej kapilary jest węższy i czy wnętrze rurki jest nadal puste. Podnosząc jedną ręką duży koniec naciągniętej kapilary, użyj kleszczyków, aby chwycić kapilarnę w najwęższym miejscu, upewniając się, że kleszcze są trzymane z wystarczającą siłą, aby mocno chwycić kapilatę bez jej zgniatania.Szybko przekręć kleszcze, aby zatrzasnąć naciągniętą kapilarnę w najwęższym miejscu. Następnie umieść kapilarnę wielkości mikropipety w jamie ustnej na 100-milimetrowej szalce Petriego i sterylizuj naczynie promieniami UV przez 30 minut. Aby pobrać pęcherz, umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wysterylizuj okolice brzucha 70% etanolem.Za pomocą kleszczy sterylizowanych etanolem i nożyczek chirurgicznych wykonaj początkowe jednocentymetrowe poprzeczne nacięcie skóry nad otworem cewki moczowej i rozszerz nacięcie po przekątnej w kierunku górnych kończyn myszy, aby utworzyć nacięcie w kształcie litery V wzdłuż całego przedniego odcinka myszy, które odsłania zawartość otrzewnej. Używając nowych wysterylizowanych narzędzi, delikatnie dociśnij poduszeczki tłuszczowe w pobliżu okolicy miednicy myszy, aby spowodować wysunięcie pęcherza i chwyć odsłonięty pęcherz na wierzchołku. Trzymając mocno pęcherz, przetnij moczowody i cewkę moczową, aby uwolnić pęcherz i włóż końcówkę jednego wałka zaokrąglonych kleszczy do otworu pęcherza, w którym właśnie został nacięty.Zwolnij kleszcze, chwytając wierzchołek i utrzymując zaokrąglone kleszcze prawie całkowicie zamknięte, użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie odciągnąć zewnętrzny koniec ust pęcherza moczowego od zaokrąglonych kleszczy i wokół i nad drugą końcówką zaokrąglonych kleszczy, aby obrócić pęcherz na lewą stronę. Następnie użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie nakłonić odwrócony pęcherz z końcówki kleszczy do jednego mililitra zimnego PBS. I delikatnie zeskrob wewnętrzną warstwę komórek nabłonka na zewnątrz odwróconego pęcherza za pomocą dwóch par czystych kleszczy.Gdy wszystkie komórki zostaną zeskrobane, włóż niewyciągnięty koniec ciągniętej szklanej kapilary do gumowej zatyczki rurki aspiratora i mocno dopasuj wąski koniec jednomililitrowej końcówki pipety do drugiego otwartego końca probówki. Ciasno dopasuj wąską końcówkę dwumililitrowej pipety zasysającej do otwartego, szerszego końca jednomililitrowej końcówki pipety i umieść zeskrobaną zawiesinę komórek pod mikroskopem preparacyjnym. Korzystając z powiększenia od 20 do 40x, zidentyfikuj IBC jako duże agregaty fluorescencyjne i zanurz cienki koniec szklanej kapilary w świeżej probówce PBS na jedną sekundę, aby zmniejszyć pobieranie niepożądanej objętości przez działanie kapilarne.Po zlokalizowaniu interesującego IBC powoli przysuń otwarty koniec rurki kapilarnej w kierunku IBC i przyłóż bardzo małą siłę ssącą do pipety zasysającej, aby wprowadzić IBC do szklanej kapilary. Następnie przenieś kapilę do pustej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i zastosuj lekkie nadciśnienie, aby usunąć kroplę i IBC do probówki. Oprócz potwierdzenia obecności pojedynczego izolowanego IBC w probówce zbiorczej za pomocą mikroskopu preparacyjnego, czystość wyizolowanego IBC można potwierdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej.Izolowane komórki powinny wybarwiać się zarówno na obecność E. coli, jak i uroprakiny i powinny mieć wielkość od 50 do 120 mikrometrów. Po wyizolowaniu obecność i żywotność komórek bakteryjnych w pojedynczym IBC można potwierdzić poprzez kwantyfikację jednostek tworzących kolonie lub ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w celu uzyskania odpowiedników genomowych. Warto zauważyć, że niezakażone komórki nabłonkowe wyizolowane tym samym protokołem nie wykazują ilościowych ilości bakterii.Co więcej, ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją potwierdza obecność genów bakteryjnych w szeregu indywidualnie izolowanych i połączonych IBC. Zawsze upewnij się, że mikropipeta do ust może łatwo pobierać i usuwać płyn. Nie wahaj się zmienić kapilary lub całego aparatu, jeśli mikropipeta do ust wydaje się niedrożna.Ta technika mikropipetowania jamy ustnej pozwala nam bezpośrednio i specyficznie badać populacje wewnątrzkomórkowe, które tworzą się podczas eksperymentalnego ZUM. Bez tej techniki te populacje wewnątrzkomórkowe byłyby skażone bakteriami zewnątrzkomórkowymi i przewyższałyby je liczebnie. Niektóre inne czynniki zakaźne mogą być łatwiej rozpylane lub przenoszone niż E. coli, których użyliśmy w tej aplikacji.W takich przypadkach uzasadnione mogą być pewne dodatkowe kontrole, takie jak dodanie filtra lub przedłużenie rurki, w zależności od używanego zastosowania. Pojemniki IBC wyizolowane przy użyciu tej techniki mikropipetowania jamy ustnej mogą być następnie wykorzystane w innych dalszych analizach pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie QRTPCR lub RNA.

isolation-single-intracellular-bacterial-communities-generated-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Yang, E. i inni. Izolacja pojedynczych społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych uzyskanych na podstawie modelu myszego zakażenia dróg moczowych do analizy pojedynczych komórek w dalszej fazie. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje ręczną izolację pojedynczych komórek nabłonkowych zawierających wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne z zakażonego pęcherza mysiego za pomocą mikropipetowania w jamie ustnej, umożliwiając dalszą analizę pojedynczych komórek populacji E. coli...

Izolacja komórek nabłonkowych pęcherza myszy zawierających wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne

Źródło: Conover, M. S. i in., Ustanowienie i charakterystyka ZUM i CAUTI w modelu myszy. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje wykrywanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBC) w tkance pęcherza myszy zakażonej Escherichia coli ekspresującą β-galaktozydazę. Po utrwaleniu tkanek, permeabilizacji i barwieniu X-gal, IBC pojawiają się jako niebieskie punkty pod mikroskopem rozcinającym, co potwierdza inwazję bakterii podczas infekcji dróg moczowych.

Wizualizacja społeczności bakteryjnych wewnątrzkomórkowych w zakażonym pęcherzu myszy

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Zdolność do modelowania infekcji dróg moczowych (ZUM) jest kluczowa, aby móc zrozumieć patogenezę bakterii i zapoczątkować rozwój nowych terapii. Celem tej pracy jest zademonstrowanie mysich modeli eksperymentalnego ZUM i ZUM związanego z cewnikiem, które podsumowują i przewidują wyniki obserwowane u ludzi.

Ustalenie i charakterystyka UTI i CAUTI w modelu mysim

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Przedstawiamy metodę analizy mikroprzepływowej poszczególnych linii komórek bakteryjnych na przykładzie Bacillus subtilis. Metoda ta przezwycięża niedociągnięcia tradycyjnych metod analitycznych w mikrobiologii, umożliwiając obserwację setek generacji komórek w ściśle kontrolowanych i jednolitych warunkach wzrostu.

Jednokomórkowa analiza mikroprzepływowa Bacillus subtilis

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Ten manuskrypt opisuje dopęcherzowe podawanie bakterii uropatogennych za pomocą operonu luksa w celu wywołania infekcji dróg moczowych u myszy i późniejszą podłużną analizę in vivo obciążenia bakteryjnego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Podłużna obserwacja zakażeń dróg moczowych i ich leczenie u myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Ten protokół szczegółowo opisuje model in vitro cewnikowanego układu moczowego, który może być wykorzystany do badania zarówno planktonowych, jak i związanych z biofilmem populacji komórek bakteryjnych w symulowanych infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Model ten może być dalej wykorzystywany do badania skuteczności produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu kontrolowanie infekcji dróg moczowych.

Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

Poznaj technikę izolacji pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych z mysiego modelu zakażenia dróg moczowych. Metoda umożliwia badanie patogenezy UTI bez zanieczyszczenia bakteriami zewnątrzkomórkowymi.

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek

Przeglądaj więcej filmów