Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy
20 stycznia 2019
Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii naczyń mózgowych w odniesieniu do regulacji przepływu krwi w mózgu podczas starzenia się i rozwoju chorób przewlekłych. Podstawową zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony śródbłonka tętnic mózgowych w jego naturalnej postaci w warunkach fizjologicznych. Aby wyizolować mózg myszy, pod mikroskopem usuń skórę i włosy nad czaszką.
I usuń nadmiar krwi za pomocą zimnego bezwapniowego PSS. Następnie wykonaj nacięcie, używając tylko końcówek standardowych nożyczek preparacyjnych. Zaczynając od kości potylicznej i rozciągając się w górę przez kość nosową czaszki.
Następnie ostrożnie otwórz czaszkę wzdłuż nacięcia, używając kleszczy z grubą końcówką i oddziel tkankę łączną, aby odsłonić mózg. Delikatnie umyj izolowany mózg zimnym bezwapniowym PSS w zlewce, aby usunąć krew. Umieść mózg brzuszną stroną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny w celu izolacji tętnic mózgowych.
Aby wyizolować tętnice mózgowe, zabezpiecz izolowany mózg w zimnym roztworze preparacyjnym, wkładając przez niego dwa kołki ze stali nierdzewnej do powłoki polimerowo-krzemowej nasączonej węglem drzewnym na dnie szklanej szalki Petriego. Następnie chirurgicznie odizoluj tylne tętnice mózgowe na około 0,3 do 0,5 centymetra odcinków od tylnych tętnic komunikacyjnych i podstawnych. Użyj kołków ze stali nierdzewnej, aby zabezpieczyć obie izolowane tylne tętnice mózgowe w roztworze preparacyjnym na szalce Petriego.
Następnie dokładnie oczyść izolowane tylne tętnice mózgowe, usuwając tkankę łączną za pomocą zaostrzonych kleszczyków z cienką końcówką. Pokrój nienaruszone tętnice na segmenty o długości od jednego do dwóch milimetrów w celu trawienia enzymatycznego. W tej procedurze należy przygotować aparat do rozcierania za pomocą mikroskopu, kamery i aluminiowego stolika z komorą i mikromanipulatorami.
Zabezpieczyć mikrostrzykawkę ze sterownikiem pompy przylegającym do stolika i próbki. Następnie całkowicie napełnij pipetę do miareczkowania olejem mineralnym i zabezpiecz ją nad tłokiem mikrostrzykawki. Następnie za pomocą mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy należy pobrać do pipety około 130 nanolitrów roztworu dysocjacyjnego, upewniając się przy tym braku pęcherzyków powietrza.
Następnie umieść nienaruszone odcinki tętnic w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego o wymaganych stężeniach enzymów w 10-mililitrowej szklanej probówce. Inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut w celu częściowego trawienia. Po roztrawieniu zastąp roztwór enzymu pięcioma mililitrami świeżego roztworu dysocjacyjnego.
Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś jeden segment do komory zawierającej roztwór dysocjacyjny w temperaturze pokojowej. Następnie umieść pipetę w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieść ją blisko jednego końca strawionego naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od dwóch do pięciu nanolitrów na sekundę na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.
Podczas oglądania w powiększeniu od 100 do 200 razy, wycofaj się i wysuń segment tętniczy, aby zdysocjować komórki mięśni gładkich, jednocześnie wytwarzając rurkę śródbłonka. W razie potrzeby ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby oddzielić zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę od rurki śródbłonka. Upewnij się, że wszystkie komórki mięśni gładkich są zdysocjowane i że tylko komórki śródbłonka pozostają jako nienaruszona rurka.
Za pomocą mikromanipulatorów przymocuj każdy koniec rurki śródbłonka do szkiełka pokrywowego komory superfuzyjnej za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego. Wypłukać zdysocjowaną przydankę i komórki mięśni gładkich z komory. I zastąp roztwór dysocjacyjny dwoma molowymi więcej chlorku wapnia PSS.
Przenieś mobilną platformę z zabezpieczoną rurką śródbłonka na mikroskop superfuzji i stanowisko eksperymentalne. Następnie użyj sześciu czystych 50-mililitrowych zbiorników do ciągłego dostarczania PSS i odpowiednich roztworów leków podczas eksperymentu. Użyj wbudowanego zaworu sterującego przepływem, aby ręcznie ustawić natężenie przepływu tak stałe, jak przepływ laminera, jednocześnie dopasowując przepływ zasilania do ssania próżniowego.
Dostarczyć PSS do komory w celu przefuzji rurki śródbłonka przez co najmniej pięć minut przed zarejestrowaniem danych tła i załadowaniem barwnika. Aby zmierzyć potencjał błony jednocześnie ze stężeniem wapnia w wewnątrzkomórkowych stanach, wyciągnij ostrą elektrodę i wypełnij ją dwoma molowymi roztworami chlorku potasu, aby zarejestrować z komórek obciążonych barwnikiem fura-2. Aby zbadać sprzężenie wewnątrzkomórkowe poprzez transfer barwnika, należy wypełnić mikroelektrodę 0,1% jodkiem propydyny rozpuszczonym w dwóch molowych chlorkach potasu.
Następnie umieść elektrodę na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie na pipetę przymocowaną do stopnia głowicy elektrometru zabezpieczonego mikromanipulatorem. Użyj mikromanipulatora, aby na krótko umieścić końcówkę elektrody w przepływającym PSS w komorze, patrząc przez czterokrotny obiektyw. Następnie ustaw spoczynkowy potencjał membrany na zero, zgodnie z potencjałem kąpieli z uziemieniem.
W razie potrzeby użyj dźwiękowych monitorów linii bazowej połączonych z elektrometrami, aby skojarzyć wysokość dźwięku z potencjalnymi nagraniami. Następnie zwiększ powiększenie do 400 razy za pomocą 40-krotnego obiektywu i umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką rurki śródbłonka. Dostosuj okno fotometryczne za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby ustawić ostrość na około 50 do 80 komórkach śródbłonka.
Następnie delikatnie umieść elektrodę w jednej z komórek rurki śródbłonka za pomocą mikromanipulatora i odczekaj co najmniej dwie minuty, aż spoczynkowy potencjał błony się ustabilizuje. Gdy spoczynkowy potencjał błonowy ustabilizuje się na oczekiwanej wartości, włącz rurkę fotopowielacza na granicy fluorescencji przy braku światła i rozpocznij pozyskiwanie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia poprzez wzbudzanie Fura-2 na przemian przy 340 i 380 nanometrach, zbierając emisję fluorescencji na 510 nanometrach. Po ustaleniu jednoczesnych pomiarów potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, przed zastosowaniem leków należy odczekać około pięciu minut na superfuzję rurki śródbłonka z PSS przy stałym natężeniu przepływu laminarnego.
Lek przygotowany w PSS należy nanieść do komory przefuzyjnej ze stałym natężeniem przepływu. Podczas leczenia farmakologicznego należy jednocześnie zmierzyć potencjał błonowy w proporcjach F340/F380. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij elektrodę z ogniwa.
Następnie zatrzymaj odpowiednie zapisy potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i zapisz pliki do analizy danych. Jest to obraz kontrastu różnicowego z interferencją mysi w śródbłonku tętnicy mózgowej, dostosowany do eksperymentu w oknie fotometrycznym przy użyciu 40-krotnego obiektywu. Ostra elektroda jest umieszczana w ogniwie, jak pokazano na górze obrazu.
Poniżej znajdują się przykłady surowych śladów do jednoczesnego pomiaru stosunku F340/F380 i potencjału błony w odpowiedzi na 100 mikromolowe ATP. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące sygnalizacji mikrodomenowej śródbłonka wapnia i reaktywnych form tlenu, na przykład. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta będzie nadal torować drogę dla badań w dziedzinie fizjologii komórkowej w celu zbadania funkcji naczyń krwionośnych i starzenia się krwi i krążenia limfatycznego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie szczegółowo opisuje protokoły izolacji nienaruszonych cewek śródbłonkowych mózgu oraz pomiaru stężenia wapnia i potencjału błonowego śródbłonka podczas hiperpolaryzacji pochodzenia śródbłonkowego. Możliwość farmakologicznego manipulowania sygnałami wapniowymi i elektrycznymi pozwala na lepsze zrozumienie fizjologii naczyń mózgowych, szczególnie w kontekście regulacji przepływu krwi w mózgu.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Fizjologia naczyń mózgowych
- Regulacja mózgowego przepływu krwi
- Sygnalizacja komórek śródbłonka
Wprowadzenie
- Niniejsze badanie koncentruje się na wzajemnych zależnościach między śródbłonkowym sygnałowaniem wapniowym a potencjałem błonowym.
- Zrozumienie tych mechanizmów jest kluczowe dla rozwiązywania problemów związanych ze starzeniem się organizmu i chorobami przewlekłymi.
- Opracowane metody umożliwiają obserwację w warunkach fizjologicznych.
Zastosowane metody
- Izolacja tętnic mózgowych i przygotowanie rurek śródbłonkowych
- Model mysi do eksperymentów in vivo
- Symultaniczny pomiar wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i potencjału błonowego
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja rurek śródbłonkowych z zachowaniem ich funkcji.
- Możliwość monitorowania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w warunkach fizjologicznych.
- Wgląd w odpowiedzi śródbłonka na działanie czynników farmakologicznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie demonstruje nową technikę badania funkcji śródbłonka w tętnicach mózgowych.
- Wyniki przyczyniają się do głębszego zrozumienia czynników wpływających na przepływ krwi w mózgu, istotnych w kontekście procesów starzenia i chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i potencjału błony w nienaruszonym śródbłonku mózgowym w warunkach fizjologicznych, zapewniając bezpośredni odczyt sygnałów hiperpolaryzacji pochodzenia śródbłonkowej (EDH). Poprzez rejestrację sprzężenia w czasie rzeczywistym między przepływami Ca2+ a regulacją napięcia naczyniowego, metoda ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w badaniach nad celami terapeutycznymi zaangażowanymi w kontrolę przepływu krwi mózgowej. Podejście to posiada wartość prognostyczną w ocenie dysfunkcji śródbłonka w modelach chorób neurodegeneracyjnych i naczyniowo-mózgowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje funkcjonalny związek między wewnątrzkomórkowym uwalnianiem Ca2+ a aktywacją kanałów K+ w ścieżkach sygnalizacyjnych śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Umożliwia walidację modulatorów farmakologicznych kanałów SKCa/IKCa w kontekście tkanki natywnej.
- Wartość naukowa: Wspiera testowanie hipotez dotyczących składników EDH jako mediatorów wazodylatacji niezależnej od tlenku azotu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, ratiometrycznych odczytów Ca2+ za pomocą Fura-2 oraz odczytów Vm za pomocą mikroelektrod do profilowania odpowiedzi na dawkę.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie śródbłonka poprzez trawienie enzymatyczne i triturację w celu uzyskania powtarzalnych rurek śródbłonka.
- Wartość naukowa: Pomiar przestrzennego rozprzestrzeniania się EDH poprzez połączenia szczelinowe na odległości do milimetra, co dostarcza danych do analiz sygnalizacji na poziomie sieci.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy dynamikę Ca2+ i Vm śródbłonka z regulacją przepływu krwi mózgowej w warunkach zdrowia i choroby.
- Wartość operacyjna: Utrzymuje integralność i funkcję śródbłonka podczas fizjologicznej superfuzyjnej perfuzji (pH 7.4, 37°C) podczas przedłużonych pomiarów.
- Wartość naukowa: Umożliwia przedkliniczną ocenę reaktywności naczyniowej w mysich modelach starzenia się i chorób przewlekłych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum badawcze, od walidacji celu po fenotypowanie przedkliniczne, oferując funkcjonalny odczyt sygnalizacji śródbłonka, który łączy mechanizmy molekularne z efektami fizjologicznymi.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących udziału kanałów K1+ aktywowanych przez Ca2+ w EDH i napięciu naczyniowym.
- Przesiewy: Dostarcza jednoczesne, w czasie rzeczywistym odczyty przepływu jonów i parametrów elektrycznych w celu profilowania działania związków w natywnym śródbłonku.
- Analityka: Dostarcza stosunek F340/F380 oraz trajektorie potencjału błonowego jako skorelowane punkty końcowe do analizy szlaków.
- Badania translacyjne: Łączy sygnalizację komórkową z wazodylatacją na poziomie tkankowym, wspierając ekstrapolację do regulacji przepływu krwi in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do funkcjonalnych przesiewów śródbłonka w różnych łożach naczyniowych i modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w EDH poprzez bezpośrednie powiązanie skoków Ca2+ z zjawiskami hiperpolaryzacji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej izolacji i superfuzji w kontrolowanych warunkach fizjologicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez potwierdzenie oddziaływania na cel w fizjologicznie istotnym systemie śródbłonkowym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowaną do ryzyka priorytetyzację związków celujących w kanały jonowe śródbłonka w oparciu o walidację funkcjonalną.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wiedza specjalistyczna w zakresie mikrodyssekcji, enzymatycznego przygotowania tkanek oraz rejestracji elektrofizjologicznej.
- Instrumentacja do elektrometrii z użyciem mikroelektrod ostrych, detekcji fluorescencji opartej na fotopowielaczach oraz mikrofluidycznej superfuzyjnej perfuzji.
- Standaryzacja przygotowania i montażu rurek śródbłonkowych pomiędzy różnymi operatorami i laboratoriami.
- Kwestie adaptacyjne dotyczące rurek śródbłonkowych pochodzących z różnych łożysk naczyniowych lub gatunków.
- Ograniczenia obejmują złożoność techniczną jednoczesnej konfiguracji mikroelektrod ostrych i fotometrii oraz wymóg izolacji świeżej tkanki.
