Name: Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym śródbłonku tętnic mózgowych myszy. Technika umożliwia badanie sygnalizacji komórkowej w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Charlesowi Hewittowi za doskonałą pomoc techniczną przy tworzeniu sprzętu i materiałów potrzebnych do obecnych protokołów. Dziękujemy doktorom Seanowi M. Wilsonowi i Christopherowi G. Wilsonowi z Centrum Biologii Perinatalnej LLU za dostarczenie nam dodatkowego mikroskopu odwróconego i elektrometru. Badania te zostały wsparte przez grant National Institutes of Health R00-AG047198 (EJB) oraz fundusze na rozpoczęcie nowego wydziału Loma Linda University School of Medicine. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+networks+in+the+control+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ion channel networks in the control of cerebral blood flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).</li>
<li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+the+vascular+endothelium+in+functional+neurovascular+coupling+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787(2014).</li>
<li>Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+propagated+vascular+responses+evoked+by+focal+synaptic+activity+in+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).</li>
<li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+microcirculation%3A+role+of+conducted+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).</li>
<li>Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDH%3A+endothelium-dependent+hyperpolarization+and+microvascular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling.</a> Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).</li>
<li>Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+dynamics+of+isolated+cerebral+and+skeletal+muscle+endothelial+tubes%3A+Differential+roles+of+G-protein-coupled+receptors+and+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391(2018).</li>
<li>Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+intermediate+conductance+KCa+channels+in+cerebral+EDHF-mediated+dilations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).</li>
<li>Behringer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+signaling+in+arterial+endothelial+tubes%3A+New+insights+into+cellular+physiology+and+cardiovascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function.</a> Microcirculation. 24 (3), (2017).</li>
<li>Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).</li>
<li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).</li>
<li>Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effects+on+morphological+integrity+and+Ca2%2B+signaling+in+freshly+isolated+murine+feed+artery+endothelial+cell+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).</li>
<li>Socha, M. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+microvascular+endothelial+tubes+from+mouse+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).</li>
<li>Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+inhibits+agonist-mediated+Ca2%2B+responses+and+activation+of+IKCa+channels+in+mouse+resistance+artery+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2018).</li>
<li>Norton, C. E., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+hyperpolarizes+mouse+pulmonary+artery+endothelial+tubes+through+KATP+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+governs+calcium+influx+into+microvascular+endothelium%3A+integral+role+for+muscarinic+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation.</a> The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).</li>
<li>Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Aging+on+Calcium+Signaling+and+Membrane+Potential+in+Endothelium+of+Resistance+Arteries%3A+A+Role+for+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria.</a> The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).</li>
<li>Behringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+electrical+dynamics+in+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium.</a> The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).</li>
<li>Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+shear+stress+regulates+endothelial+cell-directed+migration%2C+polarity%2C+and+morphology+in+confluent+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiolog%22%5BJournal%5D)">Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).</li>
<li>Sandow, S. L., Grayson, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+of+isolation+and+culture%3A+intact+vascular+endothelium+and+BKCa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).</li>
<li>Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+is+associated+with+changes+to+the+biomechanical+properties+of+the+posterior+cerebral+artery+and+parenchymal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).</li>
<li>Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+endothelial+transient+receptor+potential+C3+channel+is+required+for+small+conductance+calcium-activated+potassium+channel+activation+and+sustained+endothelial+hyperpolarization+and+vasodilation+of+cerebral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).</li>
<li>Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TRPV4+channels+mediate+dilation+of+cerebral+arteries%3A+impairment+and+recovery+in+cerebrovascular+pathologies+related+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer's disease.</a> British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).</li>
<li>Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intercellular+Ca2%2B+signaling+in+endothelial+cell+tubes+of+mouse+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries.</a> Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W świetle ostatnich osiągnięć 6,15,16,17 demonstrujemy teraz metodę izolowania śródbłonka tętnic mózgowych myszy w ramach przygotowań do jednoczesnego pomiaru [Ca2 + ]i i Vm leżącego u podstaw EDH konsekwentnie przez ~ 2 godziny w temperaturze 37 °C. Chociaż jest to technicznie trudne, możemy również zmierzyć sprzężenie komórka-komórka (patrz odniesienie<sup cla...

Przepływ krwi w mózgu jest regulowany przez koordynację rozszerzenia naczyń krwionośnych między tętnicami mózgowymi i tętniczkami w sieciach naczyniowych1. Komórki śródbłonka wyściełające tętnice oporowe mózgu powodują zmiany średnicy naczyń krwionośnych w zależności od potrzeb, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne neuronów1,2,3. W szczególności, podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka (powszechnie znanej jako EDH), wewnątrzkomórkowy Ca2+ ([Ca2+]i) i sygnalizacja elektryczna w komórkach śródbłonka koordynują rozszerzenie naczyń krwionośnych między komórkami śródbłonka i otaczającymi je komórkami mięśni gładkich poprzez połączenia szczelinowe w celu relaksacji tętnic4. Fizjologiczna inicjacja EDH sekwencyjnie pociąga za sobą stymulację receptorów sprzężonych zG q (GPCR), wzrost [Ca2+]i oraz aktywację śródbłonkowych kanałów K+ aktywowanych przez małe i pośrednie Ca2+ (SKCa/IKCa) w celu hiperpolaryzacji potencjału błony śródbłonkowej mózgu (V m) 5,6,7. Tak więc bliski związek śródbłonka [Ca2 + ]i i Vm jest integralną częścią regulacji przepływu krwi i jest niezbędny do funkcjonowania układu krążenia i naczyń mózgowych6,8. W szerszej literaturze liczne badania wykazały związek dysfunkcji śródbłonka naczyń krwionośnych z rozwojem chorób przewlekłych (np. nadciśnienie, cukrzyca, niewydolność serca, choroba wieńcowa, przewlekła niewydolność nerek, choroba tętnic obwodowych)9,10, wskazując na znaczenie badania funkcji śródbłonka w stanach fizjologicznych i patologicznych.
Śródbłonek naczyniowy jest integralną częścią produkcji hiperpolaryzacji, rozszerzenia naczyń krwionośnych i perfuzji tkanek, dlatego kluczowe jest zbadanie jego natywnych właściwości komórkowych. Jako ogólny model badawczy, przygotowanie modelu śródbłonka tętniczego myszy zostało już wcześniej opublikowane dla mięśni szkieletowych11,12, gut13, lung14, a ostatnio dla brain6. Opublikowano badania jednoczesnych pomiarów [Ca2+]i i Vm dla śródbłonka tętnic mięśni szkieletowych15,16, a także śródbłonka naczynia limfatycznego17. Oprócz badań podstawowych wykorzystujących podejście rurki śródbłonkowej, można zapoznać się z kompleksowym przeglądem jego zalet i wad8 w celu ustalenia, czy to narzędzie eksperymentalne jest odpowiednie dla konkretnego badania. Krótko mówiąc, zaletą jest to, że kluczowe fizjologiczne składniki funkcji komórek śródbłonka są zachowane (np. napływ Ca2+ i uwalnianie wewnątrzkomórkowe, hiperpolaryzacja Vm do potencjału Nernst dla K+ poprzez aktywacjęSK Ca / IKCa i śródbłonkowe sprzężenie międzykomórkowe poprzez Połączenia szczelinowe) bez czynników zakłócających, takich jak wejście nerwów okołonaczyniowych, funkcja kanału bramkowanego napięciem mięśni gładkich i kurczliwość, krążenie krwi i wpływy hormonalne8. W przeciwieństwie do tego, powszechnie stosowane metody hodowli komórkowych wprowadzają znaczące zmiany w morfologii18 i ekspresji kanału jonowego19 w sposób, który może znacznie zaciemnić porównania z obserwacjami fizjologicznymi ustalonymi ex vivo lub in vivo. Ograniczenia obejmują brak integracji z innymi istotnymi składnikami regulującymi przepływ krwi, takimi jak mięśnie gładkie i ograniczona elastyczność w harmonogramie eksperymentalnym, ponieważ model ten jest optymalnie testowany w ciągu 4 godzin od odizolowania nienaruszonego segmentu naczyniowego od zwierzęcia.
Opierając się na poprzednim protokole wideo autorstwa Sochy i Segala12 i najnowszych eksperymentalnych odkryciach w klasie interim<sup="xref">6,15,16, niniejszym demonstrujemy izolację świeżego śródbłonka z tylnych tętnic mózgowych i jednoczesne pomiary śródbłonka [Ca2+]i i Vm przy użyciu odpowiednio fotometrii Fura-2 i wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod. Dodatkowo eksperyment ten polega na ciągłym przetopianiu roztworów soli i środków farmakologicznych w warunkach fizjologicznych (pH 7,4, 37 °C). Wybraliśmy tylną tętnicę mózgową, ponieważ daje ona izolowany śródbłonek o integralności strukturalnej (komórki sprzężone połączeniami szczelinowymi) i wystarczających wymiarach (szerokość ≥50 μm, długość ≥300 μm) podatnych na sygnalizację wewnątrz- i międzykomórkową wzdłuż i między komórkami śródbłonka. Ponadto badania nad tylną tętnicą mózgową gryzoni są szeroko reprezentowane w literaturze i obejmują badanie podstawowych mechanizmów sygnalizacji śródbłonka, rozwoju/starzenia się naczyń krwionośnych i patologii20,21,22. Oczekuje się, że to eksperymentalne zastosowanie przyniesie wysokoprzepustową analizę funkcji (i dysfunkcji) śródbłonka mózgu, a tym samym pozwoli na znaczne postępy w zrozumieniu regulacji przepływu krwi w okresie starzenia się i rozwoju chorób neurodegeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>A466250</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza (Mieszanka typu H)</td><td>Sigma</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>Ditioerytrytol</td><td>Sigma</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Elastaza</td><td>Sigma</td><td>E7885</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Fura-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>F14185</td><td></td></tr><tr><td>Recyrkulacyjny agregat chłodniczy (Isotemp 500LCU)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13874647</td><td></td></tr><tr><td>Superfuzja z pleksiglasu izba&nbsp;</td><td>Warner Instruments, Camden, CT, USA</td><td>RC-27</td><td></td></tr><tr><td>Szklane szkiełko nakrywkowe (2.4&nbsp; &czasy; &nbsp; 5.0&nbsp; cm)</td> <td>Platforma ThermoFisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>z anodyzowanego aluminium (średnica: 7,8&nbsp; cm)&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>PM6 lub PH6</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowa scena aluminiowa&nbsp;</td><td>Siskiyou, Grants Pass, OR, USA</td><td>8090P</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>&nbsp; </td> Mikroskopy stereoskopowe MX10<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Zeiss, NY, USA</td><td>Stemi 2000 & 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowe źródła światła</td><td>&nbsp; Schott, Moguncja, Niemcy & KL200, Zeiss</td><td>Fostec 8375</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon</td><td>Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td>Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy z kontrastem fazowym&nbsp;</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>&nbsp;( Ph1 DL; 10X & 20X)</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy fluorescencyjne&nbsp;</td><td>Nikon Instruments Inc</td><td>20X (S-Fluor) i 40X (Plan Fluor)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon</td><td>Instruments Inc Eclipse</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik pompy mikrostrzykawkowej (Micro4)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td> Stół do izolacji drgań <td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Produkcja</td><td>techniczna, Peabody, MA, USA&</td><td>nbsp; Wzmacniacze Micro-g</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA</td><td>Axoclamp 2B & Stopnie czołowe Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>HS-2A i HS-9A</td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcyjny&nbsp;</td><td>EZ Digital, Seul, Korea Południowa</td><td>FG-8002</td><td></td></tr><tr><td>System pozyskiwania danych</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA</td><td>Digidata 1550A</td><td></td></tr><tr><td>Dźwiękowe monitory bazowe</td><td>Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA&</td><td>nbsp; Cyfrowy oscyloskop z pamięcią BM-A-TM</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix, Beaverton, Oregon, Stany Zjednoczone&</td><td>nbsp; TDS 2024B</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs systemu fluorescencji, lampa ARC + zasilacz, Hyperswitch,</td><td>urządzenia molekularne PMT, Sunnyvale, CA, USA</td> Regulator temperatury <td>systemów</td><td></td>IonOptix</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td>Nagrzewnica liniowa <td>Warner Instruments</td><td>TC-344B lub C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Sterownik zaworu <td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td></td></tr><tr><td>Liniowy zawór sterujący przepływem</td><td>Warner Instruments</td><td>&nbsp; Ściągacz elektroniczny FR-50</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td><td>P-97 lub P-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige, East Meadow, Nowy Jork, Stany Zjednoczone&</td><td>nbsp; MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Rurki ze szkła borokrzemianowego (trituracja)</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Rurki ze szkła borokrzemianowego (przypinanie)</td><td>Warner Instruments</td><td>G150T-6</td><td></td></tr><tr><td>Rurki ze szkła borokrzemianowego (ostre elektrody)</td><td>Warner Instruments</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy (0,22 i mikro; m)&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>722-2520</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego + oprzyrządowanie Charcoal Sylgard</td><td>Living Systems, St. Albans City, VT, USA</td><td>DD-90-S-BLK</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki w stylu Vannas (3 mm i 9.5&nbsp; mm)</td> <td>World Precision Instruments</td><td>555640S, 14364</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki 3 i 7 mm ostrza</td><td>Fine Science Tools (lub FST), Foster City, CA, USA</td><td>Moria MC52 & 15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Zaostrzone kleszcze z cienką końcówką&nbsp;</td><td>FST</td><td>Dumont #5 & Dumont #55</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Tętnice mózgowe i ich mikrokrążenie dostarczają tlen i składniki odżywcze do mózgu poprzez regulację przepływu krwi. Komórki śródbłonka wyściełają światło naczyń krwionośnych i nakazują zmiany średnicy naczyń krwionośnych w razie potrzeby, aby zaspokoić zapotrzebowanie metaboliczne neuronów. Pierwotne zależne od śródbłonka szlaki sygnałowe hiperpolaryzacji potencjału błonowego (Vm) i tlenku azotu zwykle działają równolegle, pośrednicząc w rozszerzeniu naczyń krwionośnych, a tym samym zwiększając przepływ krwi. Chociaż jest to integralna część koordynacji rozszerzenia naczyń krwionośnych na przestrzeni kilku milimetrów długości naczyń krwionośnych, składniki hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka (EDH) były historycznie trudne do zmierzenia. Te składniki EDH pociągają za sobą wewnątrzkomórkowe wzrosty Ca2 + [Ca2 +] i, a następnie aktywację kanałów K + aktywowanych przez Ca2+ o małej i pośredniej przewodnictwie (SKCa / IKCa).
Tutaj prezentujemy uproszczoną ilustrację izolacji świeżego śródbłonka z tętnic mózgowych myszy; jednoczesne pomiary śródbłonka [Ca2+]i i Vm przy użyciu odpowiednio fotometrii Fura-2 i wewnątrzkomórkowych ostrych elektrod; oraz ciągłe superfuzję roztworów soli i środków farmakologicznych w warunkach fizjologicznych (pH 7,4, 37 °C). Tylne tętnice mózgowe z koła Willisa są usuwane z tylnych tętnic komunikacyjnych i podstawnych. Trawienie enzymatyczne oczyszczonych tylnych odcinków tętnic mózgowych i późniejsze tarcie ułatwia usuwanie przydanek, nerwów okołonaczyniowych i komórek mięśni gładkich. Powstałe w ten sposób "rurki" śródbłonka tętnic tylnych mózgu są następnie zabezpieczane pod mikroskopem i badane za pomocą kamery, rurki fotopowielacza i jednego do dwóch elektrometrów podczas ciągłej superfuzji. Podsumowując, metoda ta może jednocześnie mierzyć zmiany w śródbłonku [Ca2 +] i Vm w dyskretnych lokalizacjach komórkowych, a także rozprzestrzeniać się EDH przez połączenia szczelinowe na milimetry wzdłuż nienaruszonego śródbłonka. Oczekuje się, że metoda ta pozwoli na wysokoprzepustową analizę funkcji śródbłonka mózgu leżących u podstaw mechanizmów regulacji przepływu krwi w zdrowym i chorym mózgu.

Schematyczna prezentacja opisanego powyżej protokołu przedstawiona jest na załączonych rycinach. Mózg wyizolowany od młodego samca myszy C57BL/6N (5 miesięcy) pokazano na Ryc. 1A. Tętnice mózgu tylne są ostrożnie izolowane z koła Willisa, oczyszczane z tkanki łącznej i cięte na segmenty (Ryc. 1B-D). Z częściowo trawionych segmentów tętnic uzyskuje się nienaruszoną rurkę śródbłonka i mocuje ją na szkiełku nakrywko...

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii naczyń mózgowych w odniesieniu do regulacji przepływu krwi w mózgu podczas starzenia się i rozwoju chorób przewlekłych. Podstawową zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony śródbłonka tętnic mózgowych w jego naturalnej postaci w warunkach fizjologicznych. Aby wyizolować mózg myszy, pod mikroskopem usuń skórę i włosy nad czaszką.I usuń nadmiar krwi za pomocą zimnego bezwapniowego PSS. Następnie wykonaj nacięcie, używając tylko końcówek standardowych nożyczek preparacyjnych. Zaczynając od kości potylicznej i rozciągając się w górę przez kość nosową czaszki.Następnie ostrożnie otwórz czaszkę wzdłuż nacięcia, używając kleszczy z grubą końcówką i oddziel tkankę łączną, aby odsłonić mózg. Delikatnie umyj izolowany mózg zimnym bezwapniowym PSS w zlewce, aby usunąć krew. Umieść mózg brzuszną stroną do góry w komorze zawierającej zimny roztwór preparacyjny w celu izolacji tętnic mózgowych.Aby wyizolować tętnice mózgowe, zabezpiecz izolowany mózg w zimnym roztworze preparacyjnym, wkładając przez niego dwa kołki ze stali nierdzewnej do powłoki polimerowo-krzemowej nasączonej węglem drzewnym na dnie szklanej szalki Petriego. Następnie chirurgicznie odizoluj tylne tętnice mózgowe na około 0,3 do 0,5 centymetra odcinków od tylnych tętnic komunikacyjnych i podstawnych. Użyj kołków ze stali nierdzewnej, aby zabezpieczyć obie izolowane tylne tętnice mózgowe w roztworze preparacyjnym na szalce Petriego.Następnie dokładnie oczyść izolowane tylne tętnice mózgowe, usuwając tkankę łączną za pomocą zaostrzonych kleszczyków z cienką końcówką. Pokrój nienaruszone tętnice na segmenty o długości od jednego do dwóch milimetrów w celu trawienia enzymatycznego. W tej procedurze należy przygotować aparat do rozcierania za pomocą mikroskopu, kamery i aluminiowego stolika z komorą i mikromanipulatorami.Zabezpieczyć mikrostrzykawkę ze sterownikiem pompy przylegającym do stolika i próbki. Następnie całkowicie napełnij pipetę do miareczkowania olejem mineralnym i zabezpiecz ją nad tłokiem mikrostrzykawki. Następnie za pomocą mikrostrzykawki ze sterownikiem pompy należy pobrać do pipety około 130 nanolitrów roztworu dysocjacyjnego, upewniając się przy tym braku pęcherzyków powietrza.Następnie umieść nienaruszone odcinki tętnic w jednym mililitrze roztworu dysocjacyjnego o wymaganych stężeniach enzymów w 10-mililitrowej szklanej probówce. Inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez 10 do 12 minut w celu częściowego trawienia. Po roztrawieniu zastąp roztwór enzymu pięcioma mililitrami świeżego roztworu dysocjacyjnego.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś jeden segment do komory zawierającej roztwór dysocjacyjny w temperaturze pokojowej. Następnie umieść pipetę w roztworze dysocjacyjnym w komorze i umieść ją blisko jednego końca strawionego naczynia. Ustaw szybkość w zakresie od dwóch do pięciu nanolitrów na sekundę na sterowniku pompy, aby uzyskać delikatne rozcieranie.Podczas oglądania w powiększeniu od 100 do 200 razy, wycofaj się i wysuń segment tętniczy, aby zdysocjować komórki mięśni gładkich, jednocześnie wytwarzając rurkę śródbłonka. W razie potrzeby ostrożnie użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby oddzielić zdysocjowaną przydankę i wewnętrzną elastyczną blaszkę od rurki śródbłonka. Upewnij się, że wszystkie komórki mięśni gładkich są zdysocjowane i że tylko komórki śródbłonka pozostają jako nienaruszona rurka.Za pomocą mikromanipulatorów przymocuj każdy koniec rurki śródbłonka do szkiełka pokrywowego komory superfuzyjnej za pomocą pipet przypinających ze szkła borokrzemianowego. Wypłukać zdysocjowaną przydankę i komórki mięśni gładkich z komory. I zastąp roztwór dysocjacyjny dwoma molowymi więcej chlorku wapnia PSS.Przenieś mobilną platformę z zabezpieczoną rurką śródbłonka na mikroskop superfuzji i stanowisko eksperymentalne. Następnie użyj sześciu czystych 50-mililitrowych zbiorników do ciągłego dostarczania PSS i odpowiednich roztworów leków podczas eksperymentu. Użyj wbudowanego zaworu sterującego przepływem, aby ręcznie ustawić natężenie przepływu tak stałe, jak przepływ laminera, jednocześnie dopasowując przepływ zasilania do ssania próżniowego.Dostarczyć PSS do komory w celu przefuzji rurki śródbłonka przez co najmniej pięć minut przed zarejestrowaniem danych tła i załadowaniem barwnika. Aby zmierzyć potencjał błony jednocześnie ze stężeniem wapnia w wewnątrzkomórkowych stanach, wyciągnij ostrą elektrodę i wypełnij ją dwoma molowymi roztworami chlorku potasu, aby zarejestrować z komórek obciążonych barwnikiem fura-2. Aby zbadać sprzężenie wewnątrzkomórkowe poprzez transfer barwnika, należy wypełnić mikroelektrodę 0,1% jodkiem propydyny rozpuszczonym w dwóch molowych chlorkach potasu.Następnie umieść elektrodę na srebrnym drucie pokrytym chlorkiem w uchwycie na pipetę przymocowaną do stopnia głowicy elektrometru zabezpieczonego mikromanipulatorem. Użyj mikromanipulatora, aby na krótko umieścić końcówkę elektrody w przepływającym PSS w komorze, patrząc przez czterokrotny obiektyw. Następnie ustaw spoczynkowy potencjał membrany na zero, zgodnie z potencjałem kąpieli z uziemieniem.W razie potrzeby użyj dźwiękowych monitorów linii bazowej połączonych z elektrometrami, aby skojarzyć wysokość dźwięku z potencjalnymi nagraniami. Następnie zwiększ powiększenie do 400 razy za pomocą 40-krotnego obiektywu i umieść końcówkę elektrody tuż nad komórką rurki śródbłonka. Dostosuj okno fotometryczne za pomocą oprogramowania fotometrycznego, aby ustawić ostrość na około 50 do 80 komórkach śródbłonka.Następnie delikatnie umieść elektrodę w jednej z komórek rurki śródbłonka za pomocą mikromanipulatora i odczekaj co najmniej dwie minuty, aż spoczynkowy potencjał błony się ustabilizuje. Gdy spoczynkowy potencjał błonowy ustabilizuje się na oczekiwanej wartości, włącz rurkę fotopowielacza na granicy fluorescencji przy braku światła i rozpocznij pozyskiwanie wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia poprzez wzbudzanie Fura-2 na przemian przy 340 i 380 nanometrach, zbierając emisję fluorescencji na 510 nanometrach. Po ustaleniu jednoczesnych pomiarów potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, przed zastosowaniem leków należy odczekać około pięciu minut na superfuzję rurki śródbłonka z PSS przy stałym natężeniu przepływu laminarnego.Lek przygotowany w PSS należy nanieść do komory przefuzyjnej ze stałym natężeniem przepływu. Podczas leczenia farmakologicznego należy jednocześnie zmierzyć potencjał błonowy w proporcjach F340/F380. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij elektrodę z ogniwa.Następnie zatrzymaj odpowiednie zapisy potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i zapisz pliki do analizy danych. Jest to obraz kontrastu różnicowego z interferencją mysi w śródbłonku tętnicy mózgowej, dostosowany do eksperymentu w oknie fotometrycznym przy użyciu 40-krotnego obiektywu. Ostra elektroda jest umieszczana w ogniwie, jak pokazano na górze obrazu.Poniżej znajdują się przykłady surowych śladów do jednoczesnego pomiaru stosunku F340/F380 i potencjału błony w odpowiedzi na 100 mikromolowe ATP. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące sygnalizacji mikrodomenowej śródbłonka wapnia i reaktywnych form tlenu, na przykład. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta będzie nadal torować drogę dla badań w dziedzinie fizjologii komórkowej w celu zbadania funkcji naczyń krwionośnych i starzenia się krwi i krążenia limfatycznego.

simultaneous-measurements-intracellular-calcium-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Wideo pokazuje jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i zmian potencjału błonowego w komórkach śródbłonka mysich odcinków tętnic mózgowych. Izolowany śródbłonek jest ładowany fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia i traktowany lekiem, który indukuje wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia, powodując zmianę potencjału błony. Fluorescencja wskaźnika umożliwia pomiar poziomu wapnia, a elektroda rejestrująca jest wprowadzana do ogniwa w celu pomiaru zmian potencjału błony.

Jednoczesny pomiar wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w śródbłonku mózgu myszy

Źródło: Hakim, M. A.  i inni., Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia analizę funkcjonalną śródbłonka tętniczki wyizolowanej z mózgu myszy. Przedstawiono w nim etapy pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia i potencjału błonowego, zarówno na początku badania, jak i w odpowiedzi na stymulację farmakologiczną.

Analiza dynamiki wapnia i zmian potencjału błonowego w śródbłonku tętniczym myszy

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Poznaj metodę jednoczesnego pomiaru wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym śródbłonku tętnic mózgowych myszy. Technika umożliwia badanie sygnalizacji komórkowej w warunkach fizjologicznych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Przeglądaj więcej filmów