Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości
29 listopada 2018
W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii plemników, takie jak chemiczne determinaty jakości nasienia. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do oddzielania dużych ilości próbek według jakości, a także zdolność adaptacji w porównaniu z alternatywnymi metodami. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w różnice w jakości nasienia, można ją również zastosować do innych próbek, takich jak mieszane typy komórek lub składniki subkomórkowe o różnej gęstości.
Na początek przygotuj dwa 3-mililitrowe rozcieńczenia Percollu w dwóch oddzielnych probówkach. W czystej probówce rozcieńczyć 1 mililitr próbki nasienia 2 mililitrami PBS. Delikatnie wymieszaj roztwór.
Dodaj 3 mililitry roztworu Percoll o niższej gęstości do sterylnej stożkowej probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj 3 mililitry roztworu Percoll o większej gęstości poniżej roztworu Percollu o niższej gęstości. Przechylając stożkową rurkę pod kątem 45 stopni, odpipetuj 3 mililitry rozcieńczonej próbki nasienia na wierzch gradientu gęstości Percoll.
Po przygotowaniu ślepej probówki odwirować obie probówki o sile 1500 G przez 20 minut. Upewnij się, że po odwirowaniu w wannie utworzyły się trzy wyraźne warstwy nasienia. Za pomocą pipety zbierz trzy warstwy nasienia, zaczynając od górnej warstwy, następnie środkowej, a kończąc na twardym granulie na dnie probówki.
Przenieś każdą z warstw do sterylnej mikroprobówki wirówkowej. Rozcieńczyć każdą z próbek nasienia 1,5 mililitra PBS i odwirować próbki w temperaturze 1500 G przez dziesięć minut. Na koniec odlać supernatant i rozpuścić granulki za pomocą buforu do pomiaru ruchliwości.
W tym protokole zastosowano technikę wirowania w gradiencie gęstości Percoll (PDGC) do rozdzielenia próbki nasienia na trzy odrębne warstwy. Plemniki rozdzielają się na warstwę wysokiej jakości poniżej roztworu o wyższej gęstości, warstwę średniej jakości między roztworami o wyższej i niższej gęstości oraz warstwę niskiej jakości powyżej roztworu o niższej gęstości. O tych różnicach w jakości nasienia świadczą różnice w żywotności, ruchliwości i penetracji.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że próbki muszą być doprowadzone do temperatury pokojowej. Sukces PDGC zależy od starannego przygotowania gradientu, a także starannego zebrania izolowanych warstw. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę do naszych badań w dziedzinie perdiomiki plemników w celu zbadania biologicznych markerów płodności u gatunków ptaków.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje zastosowanie wirowania w gradiencie gęstości (DGC) w badaniach nad fizjologią plemników, koncentrując się w szczególności na zdolności tej techniki do separacji plemników pod kątem ich jakości. Metoda DGC pozwala na uzyskanie wiedzy na temat różnic w jakości plemników i może być również adaptowana do innych próbek biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Fizjologia plemników
- Badania nad biomarkerami płodności
- Techniki separacji gradientem gęstości
Wprowadzenie
- DGC pomaga odpowiedzieć na pytania dotyczące chemicznych czynników determinujących jakość plemników.
- Technika ta skutecznie rozdziela próbki ze względu na ich jakość.
- Można ją zastosować do różnych próbek biologicznych poza plemnikami.
Zastosowane metody
- Wirowanie w gradiencie gęstości (DGC)
- Przygotowanie roztworów gradientu gęstości Percoll
- Wirowanie i pobieranie poszczególnych warstw próbki
Główne wyniki
- Uzyskano trzy odrębne warstwy jakości plemników: wysokiej, średniej i niskiej jakości.
- Zaobserwowano różnice w żywotności, ruchliwości i zdolności do penetracji plemników.
- Technika ta umożliwia skuteczną separację do dalszych analiz biologicznych.
Wnioski
- Badanie ilustruje skuteczność DGC w różnicowaniu jakości plemników.
- Implikacje dla dalszych badań w zakresie fizjologii plemników i płodności.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wirowanie w gradiencie gęstości umożliwia powtarzalną izolację subpopulacji plemników ze względu na ich jakość, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad biologią rozrodu. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w odkrywaniu biomarkerów płodności oraz zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej. Metoda ta zapewnia skalowalny, standaryzowany schemat postępowania w celu oceny żywotności, ruchliwości i zdolności penetracyjnej plemników w systemach istotnych w kontekście chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolowanie populacji plemników o zróżnicowanym potencjale zapłodnienia.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki powtarzalnej separacji frakcji plemników o wysokiej, średniej i niskiej jakości.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie jakości plemników z wynikami dotyczącymi żywotności, ruchliwości i zdolności do penetracji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do późniejszej standaryzacji testów i ilościowego pomiaru funkcji plemników.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i skalowalność przygotowania próbek plemników do przesiewania związków lub oceny biomarkerów.
- Wartość translacyjna: Umożliwia rzetelną ocenę związków poprzez zapewnienie spójnych, stratyfikowanych jakościowo populacji plemników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez charakterystykę plemników o zdefiniowanym potencjale płodności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki zestandaryzowanym protokołom izolacji.
- Łagodzenie ryzyka: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając ilościowych danych na temat gradientów jakości plemników.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego przed etapami identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie frakcji plemników w celu wyjaśnienia funkcjonalnych czynników płodności.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne populacje plemników z mierzalnymi gradientami jakości do screeningu związków.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (żywotność, ruchliwość, zdolność penetracji), umożliwiając porównania statystyczne pomiędzy różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez stratyfikację plemników zgodną z biomarkerami.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako reużywalna platforma do oceny jakości plemników w wielu badaniach i systemach modelowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w fizjologii plemników.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów izolacji plemników.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne w programach związanych z płodnością.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o stratyfikację jakości plemników i potencjał płodności.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu gradientów gęstości oraz w technikach manipulacji plemnikami.
- Zależy od dostępu do wirówek umożliwiających precyzyjną kontrolę siły odśrodkowej (G) i temperatury.
- Wymaga standaryzacji składu gradientu oraz protokołów pobierania warstw pomiędzy zespołami badawczymi.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania techniki przy zastosowaniu jej do próbek nieptasich lub mieszanych typów komórek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują stabilność gradientu oraz integralność warstw podczas pobierania próbek, zgodnie z treścią materiałów źródłowych.
