Name: Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 28 s
Description: Poznaj metodę wirowania w gradiacji gęstości do separacji nasienia o zróżnicowanej jakości. Technika ta pozwala uzyskać trzy warstwy plemników o różnej jakości i ma zastosowanie w badaniach nad płodnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Georgii.
1. Przemywanie przy użyciu tradycyjnego wirowania
<ol>
	<li>Przygotować roztwór buforu fosforanowego (PBS). Do 800 mL wody destylowanej (dH2O) dodać 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 oraz 0,24 g KH2PO4 . Dostosować pH do wartości 7,4 za pomocą 0,1 N HCl i uzupełnić objętość roztworu do 1 L wodą dH2O.</li>
	<li>Przygotować bufor do badania ruchliwości. Do 800 mL dH2O dodać 6,5 g NaCl, 4,5 g glukozy, 0,444 g CaCl2 oraz 11,5 g kwasu N-tris-[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowego (TES). Dostosować pH do wartości 7,4 za pomocą 1 M NaOH i uzupełnić objętość roztworu do 1 L wodą dH2O.</li>
	<li>Do polipropylenowej probówki do mikrocentryfugi pipetować 0,5 mL nasienia. Dodać 1,0 mL PBS i delikatnie wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie odlać nadsącz. Osad plemników zawiesić ponownie w PBS do objętości 1,5 mL.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 10 min w RT. Osad plemników zawiesić ponownie w buforze do badania ruchliwości do objętości 0,5 mL.</li>
</ol>
2. Wykonywanie techniki PDGC
UWAGA: Cały proces PDGC należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Przygotować w dwóch osobnych probówkach po 3,0 ml roztworów Percoll o gęstości 1,08 g/ml oraz 1,07 g/ml.
	<ol>
		<li>Do czystej probówki dodać 1,712 ml oryginalnego Percoll o gęstości 1,13 g/ml do 0,3 ml 1,5 M roztworu NaCl. Dodać 0,988 ml dH2O2i wymieszać poprzez delikatne odwracanie naczynia, aby przygotować 3,0 ml roztworu o gęstości 1,08 g/ml.</li>
		<li>Do czystej probówki dodać 1,482 ml oryginalnego Percollu o gęstości 1,13 g/ml do 0,3 ml roztworu NaCl 1,5 M. Dodać 1,218 ml dH2O2i wymieszać poprzez delikatne odwracanie naczynia, aby otrzymać 3,0 ml roztworu o gęstości 1,07 g/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W czystej probówce rozcieńczyć 1,0 ml próbki nasienia w stosunku 1:2, dodając 2,0 ml PBS. Delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie.</li>
	<li>Do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml pipetuj 3,0 ml roztworu o gęstości 1,07 g/ml. Następnie ostrożnie pipetuj 3,0 ml roztworu o gęstości 1,08 g/ml pod warstwę roztworu o gęstości 1,07 g/ml. Należy dopilnować, aby obie warstwy nie wymieszały się. Zastosowanie długiej (9 cali) pipety Pasteura może ułatwić wykonanie tego kroku.</li>
	<li>Napiperuj 3,0 ml rozcieńczonej próbki nasienia na powierzchnię PDG. Aby zapobiec wymieszaniu się próbki nasienia z PDG, delikatnie przechyl probówkę stożkową zawierającą PDG pod kątem 45° pod kątem. Pipetować próbkę wzdłuż ścianki probówki, pozwalając jej spłynąć po ściance na PDG.</li>
	<li>Przygotuj pustą probówkę o masie odpowiadającej masie gradientu gęstości (PDG) z nałożoną próbką. Odwiruj obie probówki z prędkością 1500 x g przez 20 min. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zaburzyć gradientu nieciągłego podczas przenoszenia probówek z blatu na wagę, a następnie do wirówki. 
	UWAGA: Nie należy używać hamulca po zakończeniu wirowania.</li>
	<li>Zaobserwuj wyniki. Upewnij się, że w probówce powstały trzy wyraźne warstwy nasienia, zgodnie z obrazem w Rycina 1.</li>
	<li>Odssać odseparowane warstwy nasienia za pomocą pipety. Najpierw zebrać górną warstwę nasienia, następnie warstwę środkową, a na koniec twardy osad na dnie probówki. Przenieść każdą z nich do czystej i sterylnej probówki polipropylenowejprobówka do mikrocentryfugi</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą próbkę do objętości 1,5 ml za pomocą PBS. Wirować z prędkością 1500 x g przez 10 min.</li>
	<li>Odlać nadsącz. Resuspender pellet plemników w buforze do badania ruchliwości, delikatnie pipetując. 
	UWAGA: W zależności od potrzeb badacza można zastosować alternatywne gęstości. Ilości użytych składników należy wyznaczyć za pomocą następującego równania, gdzie v0 is objętość użytego roztworu gęstości zapasu, v to pożądana objętość końcowa roztworu, p to pożądana gęstość końcowa roztworu i p0 gęstość roztworu gęstościowego zapasu wynosi: 
	<img alt="Równanie do obliczania prędkości, zawierające parametry p i p₀, w kontekście formuły naukowej." src="/files/ftp_upload/58833/58833eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	Do przygotowania roztworów gęstościowych zawsze należy używać 0,3 ml 1,5 M NaCl, aby dopasować stężenie NaCl do stężenia soli fizjologicznej.</li>
</ol>
3. Określanie jakości plemników
<ol>
	<li>Oblicz stężenie plemników zgodnie z wcześniejszym opisem22.</li>
	<li>Przeprowadź barwienie witalne eozyną i nigrozyną zgodnie z wcześniejszym opisem12, z następującymi modyfikacjami:
	<ol>
		<li>Przygotuj 100 µL roztworu plemników o stężeniu 1 x 108 cells/mL.</li>
		<li>Pipetuj 50 µL roztworu plemników do polipropylenowej probówki do mikrocentryfugi zawierającej równą objętość barwnika eozyna-nigrozyna. Inkubuj mieszaninę przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nanieś kroplę 20 µL zabarwionej próbki plemników na jeden koniec szkiełka przedmiotowego i rozmaż równomiernie w sposób podobny do wykonywania rozmazów krwi. Osusz rozmazane szkiełka na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3-5 min.</li>
		<li>Obserwuj rozmaz pod mikroskopem. Policz liczbę żywych plemników (niezabarwione) i martwych plemników (zabarwione na różowo), a następnie oblicz procent żywych plemników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź test Accudenz, uprzednio zwalidowany dla plemników kurzych, aby obiektywnie ocenić ruchliwość plemników8, z następującymi modyfikacjami:
	<ol>
		<li>Pipetuj 1,0 mL 6% roztworu testowego do kuwet polistyrenowych, jak pokazano na Rysunku 2. Inkubuj w temperaturze 41 °C. 
		UWAGA: Temperaturę 41 °C zastosowano, aby odpowiadała ona temperaturze wewnętrznej kury. Temperatura inkubacji powinna być zgodna z temperaturą dróg rodnych samicy badanego gatunku.</li>
		<li>Na podgrzany roztwór testowy nanieś 100 µL próbki nasienia o stężeniu 5 x 108 cells/mL.</li>
		<li>Umieść kuwetę zawierającą nałożoną próbkę plemników w spektrofotometrze. Zapisz wartość absorbancji przy 550 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź test penetracji IPVL zgodnie z wcześniejszym opisem11, z następującymi modyfikacjami:
	<ol>
		<li>Wytnij fragment (0,5 cm x 0,5 cm) regionu IPVL poza tarczką zarodkową.</li>
		<li>Dostosuj stężenie plemników do 4 x 106 cells/mL</li>
		<li>Inkubuj plemniki w buforze do badania ruchliwości z IPVL w małej szklanej fiolce przez 15 min w temperaturze 37 °C, jak pokazano na Rysunku 3.</li>
		<li>Zanurz fragment IPVL w 3% NaCl, aby zatrzymać interakcję między IPVL a plemnikami.</li>
		<li>Zamocuj fragment IPVL na szkiełku przedmiotowym i barw odczynnikiem Schiffa przez 10 min po utrwaleniu w 10% formalinie przez 20 s.</li>
		<li>Obserwuj IPVL pod mikroskopem w celu zidentyfikowania otworów po udanej penetracji plemników i policz liczbę wszystkich widocznych otworów na 0,25 mm2 przy powiększeniu 40X.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Spargo, S. C., Hope, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+nomenclature+of+the+zona+pellucida+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Evolution and nomenclature of the zona pellucida gene family.</a> Biology Reproduction. 68, 358-362 (2003).</li>
<li>Okamura, F., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passage+of+spermatozoa+through+the+vitelline+membrane+in+the+domestic+fowl%2C+Gallus+gallus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The passage of spermatozoa through the vitelline membrane in the domestic fowl, Gallus gallus.</a> Cell and Tissue Research. 188 (3), 497-508 (1978).</li>
<li>Henkel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+function+and+assisted+reproduction+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm function and assisted reproduction technology.</a> Reproductive Medicine and Biology. 4, 7-30 (2005).</li>
<li>Reddy, R. P. Artificial Insemination of broilers: Economic and management implications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReddy%2C+RP+%22Proceedings+of+1st+International+Symposium+on+Artificial+Insemination+of+Poultry.+Poultry+Science+Association%22">Proceedings of 1st International Symposium on Artificial Insemination of Poultry. Poultry Science Association</a>. Bakst, M. R., Wishart, G. J. , Savoy, Il. 73-89 (1995).</li>
<li>Howarth, B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Examination+for+Sperm+Capacitation+in+the+Fowl%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">An Examination for Sperm Capacitation in the Fowl.</a> Biology of Reproduction. 3, 338-341 (1971).</li>
<li>Menkveld, R., Holleboom, C. A. G., Rhemrev, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+significance+of+sperm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Measurement and significance of sperm morphology.</a> Asian Journal of Andrology. 13, 59-68 (2011).</li>
<li>Kumaresan, A., Johannisson, A., Al-Essawe, E. M., Morrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+viability%2C+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+fragmentation+index+combined+can+discriminate+between+above-+and+below-average+fertility+bulls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Sperm viability, reactive oxygen species, and DNA fragmentation index combined can discriminate between above- and below-average fertility bulls.</a> Journal of Dairy Science. 100, 5824-5836 (2017).</li>
<li>Froman, D. P., McLean, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+measurement+of+sperm+motility+based+upon+sperm+penetration+of+Accudenz%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz.</a> Poultry Science. 75, 776-784 (1996).</li>
<li>Zaneveld, L. J., De Jonge, C. J., Anderson, R. A., Mack, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+capacitation+and+the+acrosome+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human sperm capacitation and the acrosome reaction.</a> Human Reproduction. 6 (9), 1265-1274 (1991).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosome+reaction+of+fowl+sperm%3A+Evidence+for+shedding+of+acrosomal+cap+in+intact+form+to+release+acrosomal+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Acrosome reaction of fowl sperm: Evidence for shedding of acrosomal cap in intact form to release acrosomal enzyme.</a> Poultry Science. 92 (3), 798-803 (2013).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+motility%2C+acrosomal+proteolytic+activity%2C+and+penetrability+of+the+inner+perivitelline+layer+of+fowl+sperm%2C+during+their+passage+through+the+male+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in motility, acrosomal proteolytic activity, and penetrability of the inner perivitelline layer of fowl sperm, during their passage through the male genital tract.</a> Theriogenology. 76 (6), 1100-1109 (2011).</li>
<li>Chalah, T., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+assessment+of+fowl+sperm+viability+by+eosin-nigrosin+and+dual+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Comparison of assessment of fowl sperm viability by eosin-nigrosin and dual fluorescence.</a> Theriogenology. 50 (3), 487-493 (1998).</li>
<li>Aitken, R. J., West, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+relationship+between+reactive+oxygen+species+production+and+leukocyte+infiltration+in+fractions+of+human+semen+separated+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the relationship between reactive oxygen species production and leukocyte infiltration in fractions of human semen separated on Percoll gradients.</a> International Journal of Andrology. 13, 433-451 (1990).</li>
<li>Mortimer, D., Mortimer, S. T. Density Gradient Separation of Sperm for Artificial Insemination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMortimer%2C+D+%22Spermatogenesis.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%22">Spermatogenesis. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols</a>. Carrell, D., Aston, K. , Humana Press. Totowa, NJ, USA. 927(2013).</li>
<li>Qingling, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+semen+by+density+gradient+centrifugation+selects+spermatozoa+with+longer+telomeres+for+assisted+reproduction+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Processing of semen by density gradient centrifugation selects spermatozoa with longer telomeres for assisted reproduction techniques.</a> Reproductive BioMedicine Online. 31, 44-50 (2015).</li>
<li>Moohan, J. M., Lindsay, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatozoa+selected+by+a+discontinuous+Percoll+density+gradient+exhibit+better+motion+characteristics%2C+more+hyperactivation%2C+and+longer+survival+than+direct+swim-up%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up.</a> Fertility and Sterility. 64 (1), 160-165 (1995).</li>
<li>Paulson, J. D., Polakoski, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass+wool+column+procedure+for+removing+extraneous+material+from+human+ejaculate%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">A glass wool column procedure for removing extraneous material from human ejaculate.</a> Fertility and Sterility. 28, 178-181 (1977).</li>
<li>Ahammad, M. U., Chiaki, N., Tatemoto, H., Kawamoto, Y., Nakada, T. Utilization of the swim-up migration sedimentation technique to separate viable and progressively motile fowl spermatozoa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhammad%2C+MU+%22World%27s+Poultry+Science+Association+Proceedings%22">World's Poultry Science Association Proceedings</a>. , Cambridge University Press. (2010).</li>
<li>Lucena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+motile+sperm+using+the+migration-sedimentation+technique+in+an+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recovery of motile sperm using the migration-sedimentation technique in an in vitro fertilization-embryo transfer programme.</a> Human Reproduction. 4 (2), 163-165 (1989).</li>
<li>Henkel, R. Sperm Processing for IVF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHenkel%2C+R+%22Clinical+Embryology%3A+A+Practical+Guide%22">Clinical Embryology: A Practical Guide</a>. , Springer Science and Business Media. New York, USA. (2013).</li>
<li>Sherman, J., Paulson, D., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glass+wool+filtration+on+ultrastructure+of+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Effect of glass wool filtration on ultrastructure of human spermatozoa.</a> Fertility and Sterility. 36, 643-647 (1981).</li>
<li>Freund, M., Carol, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+haemocytometer+counts+of+sperm+concentration+in+human+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Factors affecting haemocytometer counts of sperm concentration in human semen.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 8, 149-155 (1964).</li>
<li>Bakst, M. R., Wishart, G. J., Brillard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviducal+sperm+selection%2C+transport+and+storage+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science+Review%22%5BJournal%5D)">Oviducal sperm selection, transport and storage in poultry.</a> Poultry Science Review. 5, 117-143 (1994).</li>
<li>Ahammad, M. U., Okamoto, S., Kawamoto, Y., Nakada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+regular+fluid+secretion+from+the+uterus+of+laying+hens+on+the+longevity+and+fertilization+ability+of+fowl+sperm+in+the+oviduct%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">The effects of regular fluid secretion from the uterus of laying hens on the longevity and fertilization ability of fowl sperm in the oviduct.</a> Poultry Science Journal. 1 (1), 13-22 (2013).</li>
<li>Ahammad, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+changes+in+the+survivability+and+fertility+of+fowl+sperm+during+their+passage+through+the+male+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Reproduction+Science%22%5BJournal%5D)">Maturational changes in the survivability and fertility of fowl sperm during their passage through the male reproductive tract.</a> Animal Reproduction Science. 128 (1-4), 129-136 (2011).</li>
<li>Choi, K. H., Emery, D. A., Straub, D. E., Lee, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percoll+process+can+improve+semen+quality+and+fertility+in+turkey+breeders%5BTitle%5D)+AND+%22Asian-Australasian+Journal+of+Animal+Sciences%22%5BJournal%5D)">Percoll process can improve semen quality and fertility in turkey breeders.</a> Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 12 (5), 702-707 (1999).</li>
<li>Chen, M. J., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+two+density+gradient+preparations+for+sperm+separation+for+medically+assisted+conception%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of two density gradient preparations for sperm separation for medically assisted conception.</a> Human Reproduction. 14 (3), 759-764 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Płodność nie tylko decyduje o opłacalności produkcji zwierzęcej, ale także działa jako środek naturalnej selekcji gatunków do istnienia. Ostateczną funkcją plemnika jest zapłodnienie komórki jajowej. Janowód samicy wybiera tylko te plemniki, które są najbardziej przystosowane, aby zapewnić zapłodnienie komórki jajowej 23,24. Badania in vitro wykazały również ścisłą korelację między jakościowymi cechami plemników a sukcesem zapłodnienia<...

U kręgowców męskie gamety poddawane są intensywnemu naciskowi selekcyjnemu; dlatego sprawność reprodukcyjna samca jest kluczowa dla osiągnięcia udanego zapłodnienia. Samce każdego gatunku kręgowców muszą być zdolne do wytwarzania plemników w dużych ilościach i o wystarczającej jakości, aby zaspokoić potrzeby zapłodnienia. Plemniki, posiadające zarówno główkę plemnika, jak i wić, są najbardziej spolaryzowanymi komórkami w organizmie. Są również bardzo niejednorodne pod względem jakości plemników (żywych i martwych, morfologicznie normalnych i nieprawidłowych oraz nieruchomych, mało ruchliwych i wysoko ruchliwych), co ujawnia się w dużym zróżnicowaniu wydajności rozrodczej samców. Im większy udział plemników wysokiej jakości, tym mniejsza liczba kryć wymaganych do pomyślnego zapłodnienia komórki jajowej. Jednak, aby osiągnąć płodność, morfologicznie normalne plemniki polegają na siłach napędowych generowanych przez ich wici, aby dotrzeć do miejsca zapłodnienia, a także przeniknąć do osłonki przejrzystej1 (ZP; w przypadku ssaków) lub wewnętrznej warstwy periviteliny2 (IPVL; w przypadku ptaków i) komórki jajowej po naturalnym kryciu lub sztucznym zapłodnieniu (AI). Określenie jakości nasienia jest niezbędne do wykorzystania w technologiach wspomaganego rozrodu3 (ART) i selekcji samców hodowlanych do wykorzystania w programach AI4. Z drugiej strony, sukces ART zależy wyłącznie od dokładnej oceny jakości nasienia. Opracowano szereg testów laboratoryjnych w celu określenia cech funkcjonalnych plemników. Najważniejszymi parametrami są: morfologia plemników, żywotność, ruchliwość, pojemność (plemniki ptaków nie wymagają kapacytacji5), reakcja akrosomyczna (AR; egzocytoza i uwalnianie enzymu proteolitycznego z akrosomu główki plemnika), penetracja plemników ZP lub IPVL oraz zapłodnienie6,7,8,9,10,11. Same pomiary płodności nie zapewniają dokładnej oceny zdolności zapłodnienia populacji plemników11. Pomiary kilku zdarzeń prowadzących do zapłodnienia komórki jajowej pozwalają na odpowiednie odwzorowanie wydajności poszczególnych spermatocytów7.
Metodologia opracowana do pomiaru funkcji plemników jest przede wszystkim specyficzna dla gatunku. Na przykład w przypadku plemników ptaków żywotność, ruchliwość i penetracja IPVL są najczęstszymi parametrami używanymi do oceny jakości nasienia8,11,12. Liczba żywych plemników w ejakulacie odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu plemników, ponieważ obecność dużej liczby martwych plemników w nasieniu wpływa na jakość plemników. Zwiększa to produkcję reaktywnych form tlenu w nasieniu i powoduje uszkodzenia oksydacyjne żywych plemników13. Wiadomo, że ruchliwość plemników, czyli zdolność plemników ptasich do poruszania się wiciowego przed oporem w temperaturze ciała, odgrywa bezpośrednią rolę w doprowadzeniu do zapłodnienia8. Powszechnie wiadomo, że mobilność jest dodatnio skorelowana z płodnością i dlatego jest głównym wyznacznikiem płodności8. Jednak ruchomy plemnik musi mieć również zdolność do poddania się AR i penetracji IPVL11. Testy penetracji IPVL uwzględniają każdy plemnik, który uczestniczy w procesie zapłodnienia11.
W zastosowaniu ART, ejakulat jest zwykle przetwarzany w celu maksymalizacji koncentracji plemników wysokiej jakości i zminimalizowania koncentracji plemników niskiej jakości. Po pobraniu nasienia można wzbogacić proporcję wysokiej jakości plemników za pomocą procedur separacji plemników powszechnie stosowanych zarówno w przemyśle, jak i praktykach badawczych. Wiele z tych procedur zostało opracowanych, wszystkie z odpowiednimi korzyściami i ograniczeniami, ale wszystkie wykorzystują niejednorodną naturę plemników do zbierania tylko plemników o wysokiej zdolności zapłodnienia. Procedury te obejmują metody migracji plemników, filtrację kolumnową adherencji i wirowanie w gradiacji gęstości (DGC)14,15,16,17,18,19,20. Wśród dostępnych technik stwierdzono, że DGC jest bardzo prosta, powtarzalna, opłacalna i skuteczna w izolowaniu maksymalnej ilości wysokiej jakości plemników do wykorzystania w ART w celu maksymalizacji szansy na zapłodnienie14,15. Ponadto DGC nie jest szkodliwy dla błony plemników. W przeciwieństwie do tego, metody migracji plemników zbierają tylko stopniowo ruchliwe plemniki18,19, ale ilość pobranych plemników jest bardzo niska, co czyni je nieefektywnymi w zbieraniu dużych ilości plemników18,20. Filtracja kolumny adhezyjnej jest bardzo skuteczna w filtrowaniu wysoce ruchliwych plemników z nasienia17; jednak ma tendencję do uszkadzania błon plemników<klasa sup = "xref" > 20,< klasa sup = "xref">21.
W technice DGC, najczęściej używanym substratem do generowania gradientu gęstości jest Percoll, który składa się z koloidalnych cząstek krzemionki pokrytych poliwinylopryrolidonem. Wirowanie w gradionym gradieniu gęstości Percoll (PDGC) może być ciągłe lub nieciągłe, ale nieciągły gradient jest najczęściej stosowany do wysokowydajnej izolacji wysoce ruchliwych plemników13,16,20. W nieciągłym gradiencie media o mniejszej gęstości unoszą się nad mediami o większej gęstości, tworząc gradient, który zwiększa gęstość od góry do dołu stożkowej rury. Tworzy to granice na styku między dwoma mediami o różnej gęstości. Skuteczność PDGC wynika z dwóch czynników: 1) zdolności napędowych poszczególnych plemników oraz 2) tendencji plemników o wysokiej integralności strukturalnej do zwiększania gęstości. Plemniki o większej ruchliwości są w stanie lepiej przechodzić z pożywki o mniejszej gęstości i przenikać do pożywki o większej gęstości. Plemniki o mniejszej ruchliwości są bardziej narażone na uwięzienie na granicy utworzonej przez granicę między pożywkami o różnej gęstości. Plemniki o wysokiej integralności strukturalnej i ruchliwości mają zwykle większą gęstość niż plemniki martwe, nieprawidłowe lub mało ruchliwe. Gdy w PDGC przyłożona jest siła odśrodkowa, ułatwia to przemieszczanie się plemników o różnej gęstości do odpowiedniego miejsca w gradiencie.
W praktyce, po wykonaniu PDGC, na dnie stożkowej rurki pobierana jest miękka osadka plemników o wysokim potencjale płodności, a reszta jest odrzucana. Jednak niewykorzystaną zaletą tej techniki jest jej zdolność do rozdzielania plemników na kilka grup w oparciu o różnice w jakości. Dla celów badawczych separacja plemników ze względu na stopień jakości z wykorzystaniem techniki PDGC pozwala na badanie jakości nasienia z uwzględnieniem różnic fizjologicznych, metabolomicznych i proteomicznych. W tym miejscu staramy się szczegółowo opisać, w jaki sposób można wykorzystać tę technikę do oddzielania plemników według jakości, a także wykazać te różnice w jakości, wykorzystując wcześniej ustalone barwienie niezbędne eozyny-nigrozyny dla żywotności, test Accudenz dla mobilności i test interakcji plemnik-IPVL dla przenikalności.

<table><tbody><tr><td>Accudenz</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA</td><td>AN7050</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>P7828</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>3952016</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Nigrosin</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, USA</td><td>198285</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka ST 40R&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>DU 530 Spektrofotometr UV/Vis w dziedzinie nauk przyrodniczych</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Nie znaleziono katalogu</td></tr><tr><td>Olympus IX 71 Mikroskop z odwróconą fluorescencją i kontrastem fazowym</td><td>Olympus America Inc., PA, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Nie znaleziono katalogu</td></tr></tbody></table>

pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

Podczas rozmnażania płciowego, męska gameta lub plemnik łączy się z żeńską gametą, aby doprowadzić do zapłodnienia. Jednak duża liczba plemników ze zdolnością zapładniania jest wymagana do interakcji z żeńską gametą, aby zapewnić zapłodnienie. W związku z tym zdolność zapłodnienia poszczególnych plemników ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego rozrodu. Wirowanie w gradiencie gęstości jest stosowane od kilkudziesięciu lat jako powtarzalna, szybka, wydajna, skuteczna i niezwykle elastyczna metoda pobierania wyłącznie wysokiej jakości nasienia do wykorzystania w technologii wspomaganego rozrodu. Protokoły, które opisaliśmy w niniejszym dokumencie, koncentrują się na wykorzystaniu techniki nieciągłego wirowania w gradicynie gęstości Percoll (PDGC) w celu wyizolowania trzech odrębnych populacji plemników koguta pod względem ich jakości. Udało nam się pobrać nasienie o niskiej, średniej i wysokiej jakości. Opisujemy również powtarzalne protokoły, które polegają na określeniu potencjału płodności plemników poprzez ocenę ich żywotności, ruchliwości i przenikalności. Pobieranie nasienia według ich jakości przy użyciu techniki PDGC byłoby przydatne do dokładnego i dokładnego scharakteryzowania plemników o zróżnicowanym potencjale płodności.

Technika PDGC doprowadziła do wyraźnego rozdzielenia trzech warstw plemników w zależności od stopnia ich jakości we wszystkich parametrach. Plemniki dzielą się na warstwę wysokiej jakości poniżej roztworu o większej gęstości, warstwę średniej jakości pomiędzy roztworami o większej i mniejszej gęstości oraz warstwę niskiej jakości powyżej roztworu o mniejszej gęstości. Różnice w jakości te są potwierdzone wyraźnymi różnicami w żywotności (Rycina 4), ruchliwośc...

W tym artykule staramy się opisać wydajność techniki wirowania w gradiacji gęstości i jej zastosowanie w badaniach nad fizjologią plemników.

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii plemników, takie jak chemiczne determinaty jakości nasienia. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do oddzielania dużych ilości próbek według jakości, a także zdolność adaptacji w porównaniu z alternatywnymi metodami. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w różnice w jakości nasienia, można ją również zastosować do innych próbek, takich jak mieszane typy komórek lub składniki subkomórkowe o różnej gęstości.Na początek przygotuj dwa 3-mililitrowe rozcieńczenia Percollu w dwóch oddzielnych probówkach. W czystej probówce rozcieńczyć 1 mililitr próbki nasienia 2 mililitrami PBS. Delikatnie wymieszaj roztwór.Dodaj 3 mililitry roztworu Percoll o niższej gęstości do sterylnej stożkowej probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj 3 mililitry roztworu Percoll o większej gęstości poniżej roztworu Percollu o niższej gęstości. Przechylając stożkową rurkę pod kątem 45 stopni, odpipetuj 3 mililitry rozcieńczonej próbki nasienia na wierzch gradientu gęstości Percoll.Po przygotowaniu ślepej probówki odwirować obie probówki o sile 1500 G przez 20 minut. Upewnij się, że po odwirowaniu w wannie utworzyły się trzy wyraźne warstwy nasienia. Za pomocą pipety zbierz trzy warstwy nasienia, zaczynając od górnej warstwy, następnie środkowej, a kończąc na twardym granulie na dnie probówki.Przenieś każdą z warstw do sterylnej mikroprobówki wirówkowej. Rozcieńczyć każdą z próbek nasienia 1,5 mililitra PBS i odwirować próbki w temperaturze 1500 G przez dziesięć minut. Na koniec odlać supernatant i rozpuścić granulki za pomocą buforu do pomiaru ruchliwości.W tym protokole zastosowano technikę wirowania w gradiencie gęstości Percoll (PDGC) do rozdzielenia próbki nasienia na trzy odrębne warstwy. Plemniki rozdzielają się na warstwę wysokiej jakości poniżej roztworu o wyższej gęstości, warstwę średniej jakości między roztworami o wyższej i niższej gęstości oraz warstwę niskiej jakości powyżej roztworu o niższej gęstości. O tych różnicach w jakości nasienia świadczą różnice w żywotności, ruchliwości i penetracji.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że próbki muszą być doprowadzone do temperatury pokojowej. Sukces PDGC zależy od starannego przygotowania gradientu, a także starannego zebrania izolowanych warstw. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę do naszych badań w dziedzinie perdiomiki plemników w celu zbadania biologicznych markerów płodności u gatunków ptaków.

sperm-collection-differential-quality-using-density-gradient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wydajną metodę otrzymywania wysokiej czystości żywych frakcji meiotycznych z jądra myszy, która łączy udoskonalony protokół dysocjacji komórek z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS). Metoda ta wykorzystuje różnice w zawartości DNA oraz gęstości jąder poszczególnych frakcji meiotycznych.

Oczyszczanie komórek meiotycznych myszy metodą cytometrii przepływowej

Ten film opisuje technikę izolowania komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) od krwi obwodowej. Dzięki temu protokołowi wyizolujemy komórki PBL z próbki krwi ludzkiego pacjenta w celu późniejszego wydajnego generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.

Wirowanie w gradiencie gęstości: metoda izolowania komórek PBL z krwi obwodowej

Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.

Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT

Opisujemy strategię sortowania plemników myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Spermatydy są podzielone na cztery wysoce czyste populacje, w tym okrągłe (etapy spermiogenezy 1-9), wczesne wydłużające się (etapy spermiogenezy 10-12), późne wydłużające się (etapy spermiogenezy 13-14) i wydłużone spermioidy (etapy spermiogenezy 15-16). Barwienie DNA, wielkość i ziarnistość są wykorzystywane jako parametry selekcji.

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Pokazujemy użycie nieciągłych gradientów gęstości do rozdzielania populacji bakterii na podstawie produkcji kapsułek. Metoda ta służy do porównywania ilości kapsułek między kulturami, izolowania mutantów o określonym fenotypie kapsułki lub do identyfikacji regulatorów kapsułki. Opisano tutaj optymalizację i przebieg testu.

Oddzielanie bakterii według ilości kapsułek za pomocą nieciągłego gradientu gęstości

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Ten protokół opisuje metodę badania przesiewowego wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA poprzez wykorzystanie cech ruchliwości plemników i thigmotaxis. Metoda wykorzystuje poziomy tor pływacki w kształcie litery U, dzięki czemu wysokiej jakości plemniki docierają do przeciwnej strony przez kropelki buforowe, przy jednoczesnym wykluczeniu martwych plemników, szczątków komórek i zanieczyszczeń.

Technika pływania poziomego w kształcie litery U do przygotowywania wysokiej jakości plemników o niskim wskaźniku fragmentacji DNA

Elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym (DGGE)

Poznaj metodę wirowania w gradiacji gęstości do separacji nasienia o zróżnicowanej jakości. Technika ta pozwala uzyskać trzy warstwy plemników o różnej jakości i ma zastosowanie w badaniach nad płodnością.

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Przeglądaj więcej filmów