Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fizjologii plemników, takie jak chemiczne determinaty jakości nasienia. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do oddzielania dużych ilości próbek według jakości, a także zdolność adaptacji w porównaniu z alternatywnymi metodami. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w różnice w jakości nasienia, można ją również zastosować do innych próbek, takich jak mieszane typy komórek lub składniki subkomórkowe o różnej gęstości.

Na początek przygotuj dwa 3-mililitrowe rozcieńczenia Percollu w dwóch oddzielnych probówkach. W czystej probówce rozcieńczyć 1 mililitr próbki nasienia 2 mililitrami PBS. Delikatnie wymieszaj roztwór.

Dodaj 3 mililitry roztworu Percoll o niższej gęstości do sterylnej stożkowej probówki. Następnie ostrożnie odpipetuj 3 mililitry roztworu Percoll o większej gęstości poniżej roztworu Percollu o niższej gęstości. Przechylając stożkową rurkę pod kątem 45 stopni, odpipetuj 3 mililitry rozcieńczonej próbki nasienia na wierzch gradientu gęstości Percoll.

Po przygotowaniu ślepej probówki odwirować obie probówki o sile 1500 G przez 20 minut. Upewnij się, że po odwirowaniu w wannie utworzyły się trzy wyraźne warstwy nasienia. Za pomocą pipety zbierz trzy warstwy nasienia, zaczynając od górnej warstwy, następnie środkowej, a kończąc na twardym granulie na dnie probówki.

Przenieś każdą z warstw do sterylnej mikroprobówki wirówkowej. Rozcieńczyć każdą z próbek nasienia 1,5 mililitra PBS i odwirować próbki w temperaturze 1500 G przez dziesięć minut. Na koniec odlać supernatant i rozpuścić granulki za pomocą buforu do pomiaru ruchliwości.

W tym protokole zastosowano technikę wirowania w gradiencie gęstości Percoll (PDGC) do rozdzielenia próbki nasienia na trzy odrębne warstwy. Plemniki rozdzielają się na warstwę wysokiej jakości poniżej roztworu o wyższej gęstości, warstwę średniej jakości między roztworami o wyższej i niższej gęstości oraz warstwę niskiej jakości powyżej roztworu o niższej gęstości. O tych różnicach w jakości nasienia świadczą różnice w żywotności, ruchliwości i penetracji.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że próbki muszą być doprowadzone do temperatury pokojowej. Sukces PDGC zależy od starannego przygotowania gradientu, a także starannego zebrania izolowanych warstw. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę do naszych badań w dziedzinie perdiomiki plemników w celu zbadania biologicznych markerów płodności u gatunków ptaków.