Name: Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę wykrywania apoptozy komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala analizować interakcje między limfocytami T CD8+ a komórkami nowotworowymi oraz oceniać mechanizmy immunosupresji wywołanej przez komórki szpikowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Wellcome Trust (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), UK) oraz MRC (MR/N022556/1 (JWP, TK), UK). NOC i DDS dziękują za wsparcie ze strony National Phenotypic Screening Centre, Phenomics Discovery Initiative i Cancer Research UK (NOC)

<ol><li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocytes%3A+all+roads+lead+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).</li>
<li>Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+targeting+CD8+T-cell+immunity+for+more+effective+cancer+immunotherapy.+Frontiers+in+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%229%22%5BJournal%5D)">Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology.</a> 9. , 14(2018).</li>
<li>Tanaka, A., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells in cancer immunotherapy.</a> Cell Research. 27, 109-118 (2017).</li>
<li>Fleming, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+myeloid-derived+suppressor+cells+to+bypass+tumor-induced+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression.</a> Frontiers in Immunology. 9, 398(2018).</li>
<li>Cassetta, L., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+targeting%3A+opening+new+possibilities+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy.</a> Immunology. 155, 285-293 (2018).</li>
<li>Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+fluorogenic+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates.</a> Methods. 31, 120-126 (2003).</li>
<li>Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometric+assays+for+monitoring+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity.</a> Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).</li>
<li>Azimi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+functional+assay+of+regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells.</a> Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).</li>
<li>Bruger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+the+immunosuppressive+activity+of+MDSC%3A+assays%2C+problems+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions.</a> Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).</li>
<li>Qian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+macrophage+population+mediates+metastatic+breast+cancer+cell+extravasation%2C+establishment+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth.</a> PLoS One. 4, e6562(2009).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+differentiate+to+immune+suppressive+precursors+of+metastasis-associated+macrophages+in+mouse+models+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 2004(2018).</li>
<li>Bronte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+myeloid-derived+suppressor+cell+nomenclature+and+characterization+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards.</a> Nature Communications. 7, 12150(2016).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL2-induced+chemokine+cascade+promotes+breast+cancer+metastasis+by+enhancing+retention+of+metastasis-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages.</a> Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).</li>
<li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22AnticancerResearch%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).</li>
<li>Choppa, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+the+detection+of+Mycoplasma+fermentans%2C+M.+hominisandM.+penetransin+cell+cultures+and+blood+samples+of+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome.</a> Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , Appendix 3:Appendix 3B (2001).</li>
<li>Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+colorimetric+cell+proliferation+assays+in+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells.</a> Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived-suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Cassetta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+and+human+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology.+899%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta opiera się na dwóch oddzielnych etapach wspólnej hodowli: kokulturze limfocytów T CD8 + z potencjalnymi komórkami supresorowymi oraz kokulturacji "wstępnie uwarunkowanych" limfocytów T CD8 + z docelowymi komórkami nowotworowymi (Figura 1). Pierwszy etap kohodowli jest dość podobny do tego w przypadku testów proliferacji limfocytów T CD8 + powszechnie stosowanych do określania wpływu komórek supresorowych na funkcję limfocytów T CD8 + . Jednak proliferacja limfocytów T nie zawsze koreluje z ich cytotoksycznością. Na przykład odkryliśmy, że kohodowla z M-MDSC lub MAM zwiększała, a nie zmniejszała proliferację limfocytów T CD8 + w obecności przeciwciał aktywujących CD3 / CD28 (rysunek uzupełniający 3), podczas gdy te wstępnie kondycjonowane limfocyty T CD8 + wykazywały zmniejszoną cytotoksyczność wobec docelowych komórek rakowych (Figura 4, Figura 5, Figura 6). Wyniki te podkreślają znaczenie oceny aktywności funkcjonalnej, której dowodem jest apoptoza docelowych komórek rakowych, oferowana przez ten test cytotoksyczności limfocytów T CD8 + .
W tym teście stwierdziliśmy, że limfocyty T CD8 + wymagają około 15 godzin kohodowli w celu wywołania maksymalnej apoptozy mysich komórek guza sutka E0771-LG (Figura 5). Opóźnienie to może być spowodowane opóźnieniem między początkowym kontaktem komórek efektorowych z celami a towarzyszącym tworzeniem synaps immunologicznych, a także czasem wymaganym do wywołania sygnałów apoptotycznych w celach, mierzonych aktywacją kaspazy-3 (film uzupełniający 1). Stwierdziliśmy również, że liczba apoptotycznych komórek nowotworowych osiągnęła plateau po 24 godzinach, co prawdopodobnie jest spowodowane eliminacją celów przez limfocyty T i / lub utratą sygnału fluorescencyjnego z martwych komórek. Ta zdolność do identyfikacji czasu szczytowej apoptozy jest jedną z głównych zalet tego testu, ponieważ określenie optymalnego punktu czasowego jest ważne dla odpowiednich porównań między różnymi warunkami. W naszym przypadku, na przykład, różnica w cytotoksyczności między kontrolnymi limfocytami T CD8 + a komórkami T CD8 + wykształconymi MDSC / MAM była znacznie większa po 15 - 18 godzinach w porównaniu do 72 godzin (ryc. 5), a zatem eksperyment końcowy z zastosowaniem 72-godzinnego okresu inkubacji przyniósłby mylące wyniki.
Metoda ta umożliwia również wizualizację interakcji między efektorem a komórką docelową w czasie rzeczywistym, co dostarczyłoby lepszego wglądu w mechanizm leżący u podstaw ograniczonej cytotoksyczności limfocytów T CD8 + wstępnie inkubowanych z komórkami supresorowymi. Na przykład zaobserwowaliśmy, że limfocyty T CD8 + wstępnie inkubowane z M-MDSC lub MAM napotkały i wchodziły w interakcje z docelowymi komórkami nowotworowymi, ale nie zawsze indukowały apoptozę (film uzupełniający 4, film uzupełniający 5, film uzupełniający 6). Chociaż nie określiliśmy ilościowo tego zdarzenia, wykonalne i interesujące byłoby ilościowe określenie i porównanie proporcji spotkań i czasu ich interakcji w korelacji z indukcją apoptozy. Kolejną ważną zaletą jest to, że metoda ta wymaga niewielkiej liczby komórek (np. 1 x 103 komórek docelowych i 4 x 103 komórek efektorowych na studzienkę). W rzeczywistości protokół ten można w razie potrzeby poddać dalszej miniaturyzacji dla formatu płytki 384-dołkowej. Dlatego test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i eksperymentów, w których liczba komórek jest ograniczona, takich jak testy in vitro z wykorzystaniem cennych komórek pochodzących z próbek in vivo lub ex vivo.
Z drugiej strony, ograniczeniem obecnego testu jest obecność znacznej liczby martwych komórek efektorowych w niektórych warunkach. W celu zwiększenia dokładności odróżniania apoptozy docelowych komórek nowotworowych od apoptozy efektorowych limfocytów T CD8 + , jądra komórek docelowych są znakowane, a do analizy danych w tym teście stosuje się ograniczenie wielkości jąder (które wyklucza komórki efektorowe) (ryc. 2). Istnieją jednak przypadki, w których nakładanie się agregatów (zielonych) apoptotycznych limfocytów T CD8 + na nieapoptotyczne docelowe komórki rakowe, co może zakłócić wyniki. Ograniczenie to można złagodzić, stosując kolumnę do usuwania martwych komórek na komórkach efektorowych przed wspólną hodowlą z docelowymi komórkami nowotworowymi, zakładając, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek efektorowych. W przypadku bardziej złożonych systemów mikroskopowych możliwe jest również zmniejszenie fałszywie dodatniego sygnału poprzez znakowanie efektorowych limfocytów T CD8 + fluoroforem innym od jąder komórek docelowych i substratu kaspazy fluorogennej-3.
Do tej pory protokół ten był wykorzystywany do badania niespecyficznej aktywacji antygenu limfocytów T CD8 + . Chociaż MDSC i TAM w mikrośrodowisku guza hamują funkcje limfocytów T poprzez niespecyficzne mechanizmy antygenu, MDSC w obwodowych tkankach limfatycznych hamują odpowiedzi limfocytów T w sposób specyficzny dla antygenu18. Aby zbadać funkcje immunosupresyjne takich typów komórek, powszechnie stosuje się test proliferacji in vitro z wykorzystaniem limfocytów T CD8 + od myszy transgenicznych OT-1. W tym teście limfocyty T OT-1 (receptor limfocytów T swoisty dla ekspresji albuminy jaja kurzego (OVA)) są hodowane wspólnie z supresorowymi MDSC w obecności peptydów OVA, co ma zastosowanie do pierwszej hodowli w naszym teście cytotoksyczności (tj. aktywacja limfocytów T w obecności lub braku supresorów). Możliwe jest również manipulowanie docelowymi komórkami rakowymi w celu ekspresji OVA, która może indukować zabijanie komórek rakowych specyficznych dla antygenu przez limfocyty T OT-1. W związku z tym test umożliwi również zbadanie supresji aktywacji limfocytów T specyficznej dla antygenu za pośrednictwem MAM/MDSC. Możliwe jest również zastosowanie testu do badania komórek ludzkich, ponieważ przeciwciała aktywacyjne przeciwko ludzkim CD3 i CD28 są dostępne na rynku, a także ustanowiono protokół izolacji ludzkich TAM od próbek klinicznych19.
Podsumowując, test ten jest dość wszechstronny i może być stosowany do badania cytotoksyczności innych typów komórek odpornościowych. Obecnie w naszych laboratoriach jest on rozszerzany o badanie cytotoksyczności komórek zależnej od antygenu w różnych warunkach, a także jest opracowywany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wiadomo, że limfocyty T CD8+ mogą eliminować komórki nowotworowe, gdy wykorzystują pełną swoją cytotoksyczność. Po aktywacji receptora limfocytów T (TCR) limfocyty T CD8 + namnażają się i różnicują w cytotoksyczne komórki efektorowe. Rozszerzone i aktywowane limfocyty T CD8 + wydzielają cytotoksyczne granulki, w tym perforynę i granzymy, które są przenoszone do komórek docelowych i inicjują różne szlaki lityczne, takie jak apoptoza za pośrednictwem kaspazy-31. Limfocyty T CD8 + mogą również indukować apoptozę komórek nowotworowych poprzez aktywację receptorów na komórkach docelowych, takich jak receptory czynnika martwicy nowotworu α (TNF-α), ligand sygnałowy pierwszej apoptozy (FasL) lub ligand indukujący apoptozę związany z TNF (TRAIL). Ponadto aktywowane limfocyty T CD8 + wydzielają interferon-γ (IFN-γ), który może hamować proliferację komórek nowotworowych i zwiększać wrażliwość komórek nowotworowych na limfocyty T CD8 + poprzez regulację w górę receptora FasL1. Biorąc pod uwagę potencjał zdolności do zabijania guza T CD8 +, ustalono kilka strategii zwiększających ich cytotoksyczność (np. inhibitory punktów kontrolnych, szczepienie raka i adoptywny transfer limfocytów T eksprymujących chimeryczny receptor antygenowy (CAR), które wykazały znaczące efekty terapeutyczne na niektóre typy raka2. Jednak coraz więcej dowodów sugeruje, że komórki odpornościowe naciekające nowotwór, takie jak limfocyty T regulatorowe, komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM), mogą hamować funkcje limfocytów T CD8 + i ograniczać skuteczność immunoterapii3,4,5. Aby ulepszyć takie immunoterapie, ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki immunosupresorowe ograniczają cytotoksyczność limfocytów T CD8 +. Identyfikacja mechanizmów supresji limfocytów T CD8 +, a także celów lekologicznych w celu jej przezwyciężenia, będzie wymagała opracowania i wykorzystania testów in vitro.
Złotym standardem metody pomiaru cytotoksyczności limfocytów T CD8+ jest test uwalniania chromu, w którym określa się uwalnianie radioaktywnej sondy (51Cr) z komórek docelowych, które są lizowane przez limfocyty T CD8+6. Jednak test ten ma kilka wad, w tym stosunkowo niską czułość, wysokie tło, niezdolność do wykrycia wczesnych zdarzeń apoptozy, problemy z niebezpieczną utylizacją oraz ograniczoną kompatybilność z automatyczną obsługą i wykrywaniem cieczy w celu obsługi aplikacji o wyższej przepustowości. Inną popularną metodą są analizy cytometrii przepływowej, w których apoptoza docelowych komórek nowotworowych jest wykrywana przez wiązanie aneksyny V7. W tym teście możliwe jest wykrycie innych parametrów, takich jak śmierć komórki docelowej za pomocą jodku propidyny (PI) lub 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD) oraz aktywacja komórek efektorowych wskazywana przez ekspresję CD107a lub CD69, oprócz apoptozy w komórkach docelowych7. Jednak ten test wymaga dużej liczby komórek supresorowych w porównaniu z testem uwalniania chromu. Wymaga to również oderwania i dezagregacji przylegających komórek docelowych, co może zniekształcić wyniki. Rzeczywiście, test uwalniania chromu lub test cytometrii przepływowej nie są powszechnie stosowane do badania wpływu komórek supresorowych na funkcje komórek T. Zamiast tego pomiar proliferacji limfocytów T wskazywany przez rozcieńczenie barwnika fluorescencyjnego (np. CFSE) wstępnie załadowanego do limfocytów T jest często stosowany do oceny hamowania funkcji limfocytów T CD8 + przez komórki supresorowe. Wykrywanie produkcji IFN-γ z hodowanych limfocytów T to kolejna standardowa metoda oceny wpływu komórek supresorowych na aktywację limfocytów T8,9. Jednak wyniki tych testów niekoniecznie korelują ze zdolnością komórek docelowych do zabijania limfocytów T CD8 +.
Prezentujemy tutaj alternatywny test funkcjonalny do oceny wpływu komórek supresorowych, szczególnie makrofagów w guzach przerzutowych, na cytotoksyczność limfocytów T CD8+. Metoda ta określa cytotoksyczność limfocytów T CD8 +, wstępnie wyhodowanych z komórkami supresorowymi lub bez nich w obecności przeciwciał aktywujących anty-CD3 / CD28, poprzez wykrywanie apoptozy komórek nowotworowych, wskazywanej przez fluorescencję z fluorogennego substratu kaspazy-3 < klasa sup = "xref">6 przy użyciu automatycznej mikroskopii poklatkowej (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 1). Ten protokół ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami; Wymaga tylko niewielkiej liczby komórek, umożliwia wykrywanie przylegającej śmierci komórek nowotworowych z wysoką czułością, może obrazować interakcję efektor-cel w czasie rzeczywistym i jest podatny na wysokoprzepustowe badania przesiewowe.
W tym protokole, makrofagi związane z przerzutami (MAM) i ich progenitorowe monocytowe MDSC (M-MDSC) wyizolowane z guzów przerzutowych u myszy są używane jako komórki supresorowe. W mysich modelach przerzutowego raka piersi wyraźna populacja makrofagów charakteryzujących sięwysokimpoziomem Ly6G-CD11b F4/80i niskimpoziomem Ly6Cgromadzącym się w płucach zawierających przerzutowe guzy. Ta populacja makrofagów jest rzadko spotykana w normalnych płucach i dlatego nazywana jest makrofagami związanymi z przerzutami (MAM)10. W tych modelach mysich inna populacja komórek szpikowych, zdefiniowana jakowysokiLy6G-CD11bF4/80 wysokipoziom Ly6C, również gromadzi się głównie w przerzutowym płucu, gdzie powoduje powstawanie MAMs11. Opierając się na ich charakterystyce, komórki progenitorowe CD11bo wysokiejzawartości Ly6Ci MAM mogą reprezentować M-MDSCs12.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Freiner Bio-One</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>2-merkapteetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>5mL Plystyrena Probówka z okrągłym dnem</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej (okrągła Na dole )</td> <td>Costar</td><td>3799</td><td>Kokultura limfocytów T CD8 + z posortowanymi komórkami szpikowymi</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa (płaskie dno)</td> <td>Nunc</td><td>165305</td><td>Kokultura limfocytów T CD8 + z komórkami docelowymi do testu cytotoksyczności</td></tr><tr><td>AF647 Przeciwciało anty-mysie F4 / 80</td><td>BIO-RAD</td><td>MCA497A647</td><td>Klon: CIA3-1, Lot #: 1707, 2 &mu; Komórki L/1x10^6</td></tr><tr><td>AlexaFluor700 przeciwciało anty-mysie CD8</td><td>Biolegend</td><td>100730</td><td>Klon: 53-6,7, Partia#: B205738, 0,5 &mu; Komórki L / 1x10^6</td></tr><tr><td>anty-mysie przeciwciało CD28</td><td>Biolegend</td><td>102111</td><td>Aktywacja izolowanych limfocytów T CD8 +, Klon: 37.51, Lot #: B256340</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie CD3e</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td>Aktywacja izolowanych limfocytów T CD8 +, Klon: 145-2C11, Lot #: B233720</td></tr><tr><td>APC anty-mysie przeciwciało CD3</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td>Klon: 17A2, Partia#: B198730, 0,5 &mu; L/1x10^6 komórek</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anty-mysie przeciwciało Ly6C</td><td>Biolegend</td><td>128026</td><td>klon: HK1.4, Parti#: B248351, 1 &mu; L/1x10^6 komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albmin</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (100&mu; m Nylon)</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Aby rozbić sitko do komórek śledziony</td></tr><tr><td>(40&mu; m Nylon)</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td>Do filtrowania trawienia płuc</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek T EasySep CD8 + StemCell</td><td>Technologies</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało przeciw myszom CD4</td><td>Biolegend</td><td>100406</td><td>Klon: GK1.5, Parti#: B179194, 0,5 &mu; Komórki L/1x10^6</td></tr><tr><td>Geltrex Gotowy do użycia</td><td>Gibco</td><td>A1596-01</td><td>Powlekanie 96-dołkowych płytek do oznaczania cytotoksyczności</td></tr><tr><td>Odczynnik IncuCyte NucLight Red Lentivirus</td><td>Essen BioScience</td><td>4476</td><td>Cząsteczki wirusa Lenti kodujące mKate2</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>Detector (mikroskop fluorescencyjny)</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM 2018A</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>L-Glutamina (100X)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji płuc</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-927</td><td>Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z płuca nośnego</td></tr><tr><td>nowotworu Zestaw do wykrywania MycoAlert Mycoplasma</td><td>Lonza</td><td>LT07-318</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwas endogenny (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucView488</td><td>Biotium</td><td>10403</td><td>Fluoregeniczny substrat kaspazy-3</td></tr><tr><td>PE anty-mysie przeciwciało Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>Klon: 1A8, Partia #: B258704, 0,5 &mu; L/1x10^6 komórek</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anty-mysie przeciwciało CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Klon: M1/70, Parti#: B249268, 0,5 &mu; L/1x10^6 komórek</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Penicylina Streptomycyna do pierwotnej hodowli komórek</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anty-mysie przeciwciało CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>Klon: 30-F11, Parti#: B249564, 0.5 &mu; L/1x10^6 komórek</td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadimetryny)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC (10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td>Aktywacja izolowanych limfocytów T CD8 +</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TruStain fcX (anty-mysz CD16/32) Przeciwciało Biolegend</td><td></td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&nbsp;: Obiektyw Nikon 10X (rozdzielczość 1,22 i mikro; m) &nbsp;: Wzbudzenie kanału zielonego: 440 - 480 nm &nbsp;: Emisja kanału zielonego: 504 - 544 nm &nbsp;: Wzbudzenie kanału czerwonego: 565-605 nm &nbsp;: Emisja kanału czerwonego: 625 - 705 nm</td></tr></tbody></table>

wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty t cd8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Zwiększenie zdolności limfocytów T CD8+ do zabijania nowotworów w nowotworach, wraz z ich efektywną infiltracją guza, jest kluczowym elementem udanych immunoterapii. Kilka badań wykazało, że komórki szpikowe naciekające nowotwór (np. komórki supresorowe pochodzenia szpikowego (MDSC) i makrofagi związane z nowotworem (TAM)) hamują cytotoksyczność limfocytów T CD8 + w mikrośrodowisku guza, a celowanie w te regulatorowe komórki mieloidalne może poprawić immunoterapię. Tutaj przedstawiamy system testów in vitro do oceny immunosupresyjnego wpływu monocytowych MDSC i TAM na zdolność limfocytów T CD8 + do zabijania nowotworów. W tym celu najpierw wyhodowaliśmy naiwne limfocyty T CD8 + śledziony z przeciwciałami aktywującymi anty-CD3 / CD28 w obecności lub bez komórek supresorowych, a następnie współhodowaliśmy wstępnie aktywowane limfocyty T z docelowymi komórkami rakowymi w obecności fluorogennego substratu kaspazy-3. Fluorescencja z substratu w komórkach nowotworowych została wykryta za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym jako wskaźnik apoptozy komórek nowotworowych wywołanej limfocytami T. W tym teście możemy z powodzeniem wykryć wzrost apoptozy komórek nowotworowych przez limfocyty T CD8 + i jej supresję przez wstępną hodowlę za pomocą TAM lub MDSC. Ten funkcjonalny test jest przydatny do badania mechanizmów supresji limfocytów T CD8 + przez regulatorowe komórki szpikowe i identyfikacji celów lekowych w celu przezwyciężenia go poprzez wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Metoda ta opiera się na prostej kokulturze docelowych komórek nowotworowych z efektorowymi limfocytami T CD8+, które były uprawiane wcześniej, z komórkami supresorowymi lub bez nich, w obecności aktywujących przeciwciał anty-CD3/CD28. Metoda ta wykrywa indukowaną przez limfocyty T CD8+ apoptozę komórek nowotworowych w czasie po kokulturze, co umożliwia ocenę wpływu komórek supresorowych na cytotoksyczność limfocytów T CD8+.
Zazwyczaj komórki nowotworowe wykazują zwiększoną zieloną fluorescencję w jądrach po aktywacji nuklearnie targetowanego biosensora kaspazy, gdy komórki te wchodzą w kontakt z limfocytami T CD8+ uprzednio aktywowanymi przeciwciałami w obecności braku komórek supresorowych (Rysunek 3; Film dodatkowy 1). Zielona fluorescencja substratu kaspazy była wykrywalna przez co najmniej 15 h po zainicjowaniu apoptozy. Z czasem zaobserwowano również pewną spontaniczną apoptozę efektorowych limfocytów T CD8+, nawet jeśli komórki te były hodowane w izolacji (Rysunek 4; Film dodatkowy 2). Jednakże jądra limfocytów T CD8+ są mniejsze niż jądra komórek nowotworowych, zatem apoptotyczne komórki „efektorowe” mogą zostać wykluczone z obliczeń apoptotycznych komórek „docelowych” za pomocą metody analizy obrazu z ograniczeniem wielkości (Rysunek 2 oraz Rysunek 4). Chociaż niektóre docelowe komórki nowotworowe wykazują niewielki, zaokrąglony kształt bez zielonej fluorescencji, nie wpływa to na analizę, ponieważ komórki te przechodzą mitozę, a nie apoptozę (Film dodatkowy 3), i tym samym są wykluczane z obliczeń apoptotycznych komórek „docelowych” za pomocą maski nakładania czerwieni i zieleni (Rysunek dodatkowy 2). Spontaniczna apoptoza docelowych komórek nowotworowych jest sporadycznie spotykana nawet w hodowli pojedynczej (Film dodatkowy 3). Niemniej jednak współhodowla docelowych komórek nowotworowych z uprzednio aktywowanymi limfocytami T CD8+ zwiększyła apoptozę komórek nowotworowych powyżej poziomu apoptozy spontanicznej w monokulturze komórek nowotworowych (Rysunek 4). Zazwyczaj, przy zastosowaniu optymalnego stosunku docelowych komórek nowotworowych do komórek efektorowych, można zaobserwować szczyt w liczbie apoptotycznych docelowych komórek nowotworowych (Rysunek 5A). Szczyt ten jest bardziej wyraźny, gdy dane są przedstawione jako frakcja apoptotyczna populacji komórek docelowych (Rysunek 5B). W tym eksperymencie bazowa apoptoza docelowych komórek nowotworowych osiągnęła szczyt po 24 h (przy frakcji apoptotycznej = 0,08), natomiast apoptoza indukowana przez limfocyty T CD8+ osiągnęła poziom maksymalny po 17 h (przy frakcji apoptotycznej = 0,6).
Stwierdziliśmy ponadto, że CD8+ Komórki T preinkubowane z MAM lub M-MDSC mogły nawiązać kontakt z docelowymi komórkami nowotworowymi, jednak kontakt ten wydawał się prowadzić do rzadszych przypadków apoptozy komórek nowotworowych w porównaniu do komórek CD8.+ limfocyty T preaktywowane bez komórek supresorowych (Rysunek 3 i Rycina 4; Film uzupełniający 4 i Film uzupełniający 5). Chociaż CD8+ Limfocyty T preinkubowane z komórkami mieloidalnymi sporadycznie indukowały apoptozę komórek nowotworowych; zaobserwowano również proliferację docelowych komórek nowotworowych, które nie zostały stymulowane do przejścia w apoptozę w czasie trwania eksperymentu (Dodatkowy film 6). Zgodnie z tymi wynikami, maksymalna frakcja apoptotycznych komórek nowotworowych hodowanych z CD8+ Liczba komórek T preinkubowanych z komórkami mieloidalnymi (frakcja apoptotyczna = 0,38 po 23 h dla MDSC-E i 0,25 po 20 h dla MAM-E) była znacznie niższa niż w przypadku komórek nowotworowych hodowanych z komórkami CD8+ Limfocyty T, które nie zostały poddane preinkubacji z komórkami supresorowymi (Rysunek 6).
<img alt="Schemat aktywacji limfocytów T CD8+ i ich interakcji z komórkami nowotworowymi; detekcja apoptozy za pomocą kaspazy-3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający procedurę eksperymentalną. Naïwne limfocyty CD8 śledzionowe+ Limfocyty T hoduje się z przeciwciałami aktywującymi anty-CD3/CD28 w obecności lub pod nieobecność makrofagów związanych z przerzutami (MAMs) lub monocytarnych supresyjnych komórek pochodzenia szpikowego (M-MDSCs). Po 4 dniach pływające komórki CD8+ Limfocyty T są zbierane i hodowane wspólnie z docelowymi komórkami nowotworowymi w obecności fluorogennego substratu dla kaspazy-3. Apoptotyczne komórki nowotworowe są wykrywane za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii obrazowania w czasie rzeczywistym. Przedstawione obrazy zostały pozyskane przy użyciu platformy do obrazowania żywych komórek (patrz Tabela materiałów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna; detekcja apoptozy; kanały czerwony i zielony; obraz złożony; analiza nakładania się kanałów R/G." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Identyfikacja apoptotycznych komórek docelowych odróżnionych od apoptotycznych komórek efektorowych. Górny rząd: Pozyskiwanie obrazów w kanale czerwonym umożliwia identyfikację jąder komórek docelowych za pomocą maski detekcji celu (różowa maska analizy). Środkowy rząd: Obrazy pozyskane w kanale zielonym wskazują apoptotyczne komórki efektorowe i docelowe. Maska apoptozy z ograniczeniem wielkości (turkusowa maska analizy; większa niż 80 µm2) pozwala na wykluczenie pojedynczych apoptotycznych komórek efektorowych z analizy. Dolny rząd: obrazy złożone, w których kanały czerwony i zielony zostały nałożone na obraz w kontraście fazowym (po lewej) lub na maskę nakładania się kolorów czerwonego i zielonego (po prawej). Identyfikacja kolokającej się, ograniczonej wielkościowo fluorescencji zielonej z fluorescencją czerwoną (żółta maska analizy) umożliwia dokładniejsze wykrywanie jąder apoptotycznych komórek docelowych (żółta grot arrowhead) poprzez wykluczenie agregatów apoptotycznych komórek efektorowych (białe groty arrowhead). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Time-lapse interakcji komórkowych, proces apoptozy efektorów, obrazy mikroskopowe, interwały 12–30 h." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Interakcja między CD8+ Limfocyty T i komórki nowotworowe. Klatki z reprezentatywnych filmów time-lapse komórek docelowych E071-LG_NLR (T) w ko-kulturze z efektorowymi komórkami CD8+ Limfocyty T (E) w stosunku efektor/cel 4:1. MDSC-E i MAM-E oznaczają odpowiednio komórki efektorowe inkubowane wcześniej z M-MDSCs i MAMs. Przedstawiono obrazy złożone (obejmujące obrazy z kontrastu fazowego oraz kanałów czerwonego i zielonego). Groty strzałek śledzą te same komórki w różnych polach i punktach czasowych. Żółte groty strzałek: cel, który wiąże się z efektorami i ulega apoptozie; białe groty strzałek: cel, który wiąże się z efektorami, ale nie ulega apoptozie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej; kanał czerwony, faza kompozytowa; oddziaływanie komórki efektorowej z komórką docelową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wykrywanie apoptotycznych komórek nowotworowych. Reprezentatywne pola wycięte z filmów time-lapse wykonanych 18 h po rozpoczęciu obrazowania. Przedstawiono obrazy kompozytowe (lewo; kontrast fazowy, kanał czerwony i zielony) oraz obrazy z kanału czerwonego bez (środek) lub z (prawo) maską nakładania kanałów czerwonego i zielonego (kolor żółty). Żółte kropki w prawej kolumnie reprezentują apoptotyczne komórki nowotworowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres apoptozy komórek nowotworowych, stosunek efektorów do celu, analiza czasu inkubacji, wykres danych apoptozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: CD8+ Apoptoza komórek nowotworowych indukowana przez limfocyty T. (A) Liczba apoptotycznych komórek nowotworowych hodowanych z efektorem C8+ Limfocyty T przy różnych stosunkach liczby komórek efektorowych do docelowych (E:T). (B) Odsetek komórek apoptotycznych w populacji komórek docelowych. Dane przedstawiono jako średnie ± SD. Przedstawiono również średnią powierzchnię pod krzywą (AUC). Test nieparzysty t-test z poprawką Welcha został użyty do analizy AUC. *P&lt;0,001 w porównaniu do E:T=0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Liczba apoptotycznych komórek nowotworowych w czasie, analiza graficzna efektów inkubacji, badanie porównawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Wpływ mielocytów naciekających guz na cytotoksyczność CD8+ Limfocyty T. (A) Liczba apoptotycznych komórek nowotworowych (cel: T) hodowanych z C8+ Limfocyty T (efektorowe: E) w stosunku E:T wynoszącym 4:1. CD8+ Limfocyty T poddano uprawie wstępnej w obecności (niebieskie koło) lub w nieobecności (czarne koło) monocytarnych mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC-E: niebieskie koło) lub makrofagów związanych z przerzutami (MAM-E: czerwone koło). Dane przedstawiono jako średnie ± SD.B) Odsetek komórek apoptotycznych w populacji komórek docelowych. Dane przedstawiono jako średnie ± SD. Przedstawiono również średnią wartość AUC. Testy niepowiązane t-test z poprawką Welcha został użyty do analizy AUC. *P&lt;0,001 w porównaniu do samej grupy T, #P&lt;0,001 w porównaniu do E+T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Rycina uzupełniająca 1. Strategia bramkowania w celu wyizolowania komórek supresorowych z przerzutów w płucach. (A) Reprezentatywne wykresy kropkowe izolacji monocytarnych mieloidalnych komórek supresorowych (M-MDSCs) i makrofagów związanych z przerzutami (MAMs). Próg poziomu Ly6C służący do rozróżnienia MAMs (Ly6Cniski) oraz M-MDSCs (Ly6Cwysoki) opiera się na makrofagach pęcherzykowych rezydujących (RMAC). (B) Czystość wyizolowanych M-MDSC (CD45+Ly6G-CD1b+Ly6Cwysoki) oraz MAMs (CD45+Ly6G-CD1b+Ly6Cniski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2. Reprezentatywne obrazy komórek docelowych w fazie mitozy. Klatki z reprezentatywnych filmów time-lapse monokultury komórek docelowych E071-LG_NLR. Góra: obrazy złożone, obejmujące obrazy z kontrastu fazowego oraz kanałów czerwonego i zielonego. Dół: obrazy złożone (kanały czerwony i zielony) z maską nakładania kolorów czerwonego i zielonego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">Prosimy o kliknięcie tutaj w celu pobrania tego pliku.</a>
Rycina uzupełniająca 3. Wpływ naciekających nowotwór komórek mieloidalnych na proliferację komórek CD8+ Limfocyty T. (A) Reprezentatywne histogramy obrazujące rozcieńczenie znakowania fluorescencyjnego CFSE w komórkach CD8+ limfocyty T. Naiwne limfocyty CD8+ śledzionowe+ Limfocyty T wyizolowano zgodnie z opisem w Protokołach-3 i znakowano za pomocą 5 µM CFSE w stężeniu 37 °C przez 15 min. Znakowane limfocyty T hodowano w obecności IL-2 i aktywujących przeciwciał anty-CD3/CD28, z komórkami mieloidalnymi lub bez nich, zgodnie z opisem w protokole 4. Po 4 dniach zieloną fluorescencję w limfocytach T wykryto za pomocą cytometru przepływowego. (B) Indeks podziału dla CD8+ Liczbę limfocytów T obliczono zgodnie z wcześniejszym opisem17Dane przedstawiono jako średnie ± SEM. *P&lt;0,01 w porównaniu z grupą kontrolną, #P&lt;0,05 w porównaniu z przeciwciałem αCD3/CD28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy film 1. Film do rysunków 3 i 4; E+T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy film 2. Film do rysunków 3 i 4; Efektor (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy film 3. Film do rysunków 3 i 4; Cel (T). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film uzupełniający 4. Film do Ryciny 3 i 4; MDSC-E +T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film uzupełniający 5. Film do rycin 3 i 4; MAM-E +T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film uzupełniający 6. Film do rycin 3 i 4; MAM-E +T (proliferacja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Nasz protokół ocenia wpływ komórek supresorowych pochodzących z mieloidu i makrofagów związanych z nowotworem w apoptozie komórek nowotworowych wywołanej limfocytami T. Równolegle z badaniem mechanizmów leżących u podstaw potencjalnych interwencji terapeutycznych. Protokół ten bezpośrednio ocenia apoptozę komórek nowotworowych indukowaną przez limfocyty T z wysoką czułością i umożliwia analizę podłużną oraz obrazowanie interakcji międzykomórkowych.Skuteczność inhibitora punktu kontrolnego najlepiej sprawdzają komórki szpikowe naciekające nowotwór w niektórych typach nowotworów. Technika ta może doprowadzić do zidentyfikowania nowych terapii tych nowotworów. Metoda ta może nie tylko przyczynić się do postępu w badaniach nad immunologią nowotworów, ale potencjalnie może również dostarczyć informacji na temat niedoboru odporności i chorób autoimmunologicznych.W celu aktywacji i ekspansji izolowanych przez śledzionę limfocytów T CD8-dodatnich, najpierw porcjuj jeden razy 10 do piątych CD8-dodatnich limfocytów T w 50 mikrolitrach E-DMEM do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki U-dna. Następnie dodaj jeden razy 10 do piątych komórek supresorowych w 50 mikrolitrach E-DMEM lub 50 mikrolitrach samego E-DMEM do każdej studzienki limfocytów T. Następnie dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanej pożywki aktywacyjnej i 50 mikrolitrów E-DMEM, z lub bez odczynników testowych, do odpowiednich studzienek.I umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla o wilgotności 95% na cztery dni. Aby skonfigurować wstępnie aktywowaną kohodowlę komórek docelowych komórek T CD8-dodatnich, najpierw dodaj 30 mikrolitrów rozpuszczalnej macierzy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu w 1 do 100 do 100 do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki o płaskim dnie, odpowiedniej do mikroskopii. Potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić matrycę, a następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej godzinę.Podczas gdy płytka się równoważy, przygotuj komórki docelowe. Odessać pożywkę, przemyć PBS i dodać jeden mililitr 05% trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Dodaj dziewięć mililitrów DMEM uzupełnionego płodową surowicą bydlęcą przez delikatne pipetowanie i przenieś zdysocjowane komórki do probówek.Po odwirowaniu komórek ponownie zawiesić paletę w 500 mikrolitrach E-DMEM. Przefiltruj zawieszone komórki przez sitko i policz żywe komórki. Następnie dostosuj gęstość do czterech razy 10 do czwartej komórki docelowej na mililitr w świeżym E-DMEM na lodzie.Następnie kilkakrotnie odpipetuj wstępnie aktywowane limfocyty T CD8-dodatnie, aby ponownie zawiesić komórki w zawiesinie pojedynczej komórki i przenieś pływające limfocyty T do jednej 1,5-mililitrowej probówki na warunek. Zbierz wszelkie pozostałe komórki z 200 mikrolitrami PBS na studzienkę, przenieś popłuczyny do odpowiednich 1,5-mililitrowych probówek i odwiruj. Odessać pożywkę i dodać jeden mililitr E-DMEM do każdej probówki w celu odwirowania.Po odwirowaniu ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach świeżego E-DMEM na probówkę. Po zliczeniu dostosuj komórki w każdej probówce do gęstości 1,6 razy 10 do piątych wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8-dodatnich na mililitr pożywki i umieść komórki na lodzie. Gdy komórki są gotowe, odessać matrycę błony podstawnej z każdej studzienki 96-dołkowej płytki mikroskopowej i dodać 50 mikrolitrów komórek docelowych do poszczególnych dołków w wewnętrznych 60 dołkach płytki z mieszaniem.Dodać 25 mikrolitrów E-DMEM uzupełnionych czterokrotnie 10 do trzecich jednostek na mililitr IL2 i 10-mikromolowego substratu kaspazy fluorogenicznej-3 do odpowiednich studzienek. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8-dodatnich do odpowiednich studzienek. I na koniec dodaj E-DMEM do odpowiednich studzienek, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 mikrolitrów.Dodaj 200 mikrolitrów PBS lub sterylnej wody do wszystkich pustych studzienek. Potrząśnij talerzem i pozostaw talerz na płaskiej powierzchni na 10 minut. Aby zobrazować komórki, ustaw mikroskop tak, aby rejestrował obrazy w kontraście fazowym.A także kanały fluorescencyjne odpowiednie dla białka fluorescencyjnego o ograniczonym jądrze oraz fluorogennych fluoroforów substratu kaspazy-3 użytych w eksperymencie. Następnie uchwyć obrazy każdej studzienki eksperymentalnej w kontraście fazowym i dwóch kanałach fluorescencyjnych co jedną do trzech godzin przez co najmniej 72 godziny. Aby przeanalizować przechwycone obrazy, otwórz obraz z dołka kontrolnego zawierającego tylko komórki docelowe i pożywkę bez substratu kaspazy-3 w kanale fluorescencyjnym używanym do sygnału substratu.Obserwuj, czy jądra nie emitują niewłaściwego sygnału fluorescencyjnego. Jeśli sygnał substratu jest widoczny w jądrach, użyj rozmieszania spektralnego, aby zwiększyć procent sygnału substratu usuniętego z sygnału jądra, aż sygnał substratu zniknie. Następnie należy obejrzeć studzienkę kontrolną zawierającą tylko jądra nieznakowanych komórek efektorowych w pożywce bez substratu kaspazy-3 w dwóch kanałach fluorescencyjnych indywidualnie.Obserwuj, czy sygnał jest emitowany przez jądra. Jeśli w poszczególnych kanałach nie jest widoczny żaden sygnał, nie jest konieczne rozmieszanie widma. Aby rozdzielić obiekty fluorescencyjne w obu kanałach fluorescencyjnych, należy użyć metody odejmowania tła fluorescencji z odpowiednimi parametrami dla próbki i odpowiednimi parametrami dla podziału krawędzi.Wykorzystaj obrazy monokultury komórek docelowych do ustalenia parametrów fluorescencji jądrowej komórki docelowej. Wykorzystaj obrazy monokultury komórek efektorowych do ustalenia parametrów apoptotycznej fluorescencji jądrowej indukowanej substratem. Wykorzystaj obrazy kohodowli, aby zweryfikować lub udoskonalić parametry apoptotycznej fluorescencji jądrowej indukowanej substratem w komórkach docelowych.Aby określić minimalny rozmiar jąder docelowych, należy użyć obrazów w kanale sygnałowym jąder z dołków zawierających tylko komórki docelowe z substratem kaspazy. Aby określić średnią wielkość apoptotycznych jąder efektorowych, należy użyć obrazów w kanale sygnałowym substratu ze studzienek zawierających tylko komórki efektorowe z substratem kaspazy. Aby policzyć liczbę jąder komórek docelowych fluorescencji, należy skonfigurować procedurę analizy z zastosowaniem odpowiedniego ograniczenia minimalnej wielkości.Korzystając z obrazów monokultury komórek efektorowych, skonfiguruj drugą procedurę analizy, aby policzyć liczbę jąder apoptotycznych, które są większe niż średni rozmiar apoptotycznych jąder efektorowych. Następnie skonfiguruj trzecią procedurę analizy, aby policzyć liczbę apoptotycznych komórek docelowych, zliczając liczbę jąder, w których sygnał jądra i sygnał substratu o ograniczonej wielkości znacznie się kolokalizują. Zazwyczaj komórki rakowe zwiększają sygnał fluorescencyjny w swoich jądrach po aktywacji biosensora kaspazy ukierunkowanego na jądro, gdy komórki wchodzą w kontakt z limfocytami T CD8-dodatnimi wstępnie aktywowanymi przez przeciwciała przy braku komórek supresorowych.Rozmiary jąder limfocytów T CD8-dodatnich są mniejsze niż w komórkach rakowych. W ten sposób apoptotyczne komórki efektorowe można wykluczyć z apoptotycznej liczby komórek docelowych za pomocą metody analizy obrazu z ograniczeniem rozmiaru. Chociaż niektóre docelowe komórki rakowe wykazują mały zaokrąglony kształt bez fluorescencji substratu, nie ma to wpływu na analizę.Ponieważ komórki te przechodzą mitozę, a nie apoptozę, a zatem są wykluczone z apoptotycznej liczby komórek docelowych przez maskę nakładania się sygnału substratu jądrowego. Jednoczesna hodowla docelowych komórek nowotworowych z wstępnie aktywowanymi limfocytami T CD8-dodatnimi zwiększa apoptozę komórek nowotworowych powyżej poziomów spontanicznej apoptozy w monokulturach komórek rakowych. Ogólnie rzecz biorąc, przy zastosowaniu optymalnego stosunku docelowych komórek nowotworowych do komórek efektorowych można zaobserwować szczyt liczby apoptotycznych docelowych komórek rakowych.Ten pik staje się bardziej wyraźny, gdy dane są wyrażone jako frakcja apoptozy docelowej populacji komórek. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać przy próbie wdrożenia tego protokołu, jest ustawienie monokultur komórek docelowych i monokultur komórek efektorowych do wykorzystania w opracowywaniu masek analitycznych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat czasu trwania i częstotliwości interakcji między limfocytami T a komórkami nowotworowymi oraz warunków związanych z cytotoksycznością zależną od genów zarówno w komórkach ludzkich, jak i mysich.Obecnie rozwijamy ten test w wysokoprzepustowe badanie przesiewowe z wykorzystaniem komórek ludzkich do identyfikacji związków, które hamują immunosupresję za pośrednictwem komórek szpikowych, a tym samym zwiększają skuteczność inhibitora punktów kontrolnych.

real-time-detection-vitro-tumor-cell-apoptosis-induced-cd8-t-cells-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film prezentuje test apoptozy w komórkach nowotworowych indukowany przez wstępnie aktywowane efektorowe limfocyty T. Poprzez kokulturację tych komórek z komórkami rakowymi oznaczonymi jądrami fluorescencyjnymi, dodaje się substrat fluorogenny rozszczepialny przez kaspazę. Apoptotyczne komórki rakowe będą miały inny kolor w swoich jądrach, co prowadzi do podwójnej fluorescencji. Ta podwójna fluorescencja wskazuje na to, że komórki rakowe ulegają apoptozie.

Test in vitro do badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8 + wobec komórek rakowych

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ten protokół opisuje metodę szczegółowej oceny podzbiorów leukocytów w mikrośrodowisku guza w modelu guza myszy. Komórki czerniaka B16 z ekspresją chemeryny wszczepiono podskórnie myszom syngenicznym. Komórki z mikrośrodowiska guza zostały następnie wybarwione i przeanalizowane za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwoliło na szczegółowe analizy podzbiorów leukocytów.

Ocena podzbiorów leukocytów naciekających nowotwór w podskórnym modelu guza

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.

Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu guza do charakterystyki limfocytów naciekanych nowotworem w modelu guza myszy w intruzie naturalnym i pochodzącym z obwodu limfocytach. Specyficzne śledzenie napływu komórek odpornościowych pochodzących od biorcy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia dynamikę zmian fenotypowych i funkcjonalnych tych komórek podczas przeciwnowotworowych odpowiedzi immunologicznych.

Przeszczep guza w celu oceny dynamiki limfocytów T CD8 + naciekających nowotwór u myszy

Tutaj szczegółowo opisujemy prosty, szybki i niezawodny protokół wspomagany wieloparametryczną cytometrią przepływową i nowotworem na chipie, aby monitorować i charakteryzować etapy składające się na cykl rak-odporność. Rzeczywiście, dogłębne zrozumienie wzajemnych zależności między rakiem a komórkami odpornościowymi dostarcza kluczowych informacji, które pozwalają przechytrzyć nowotwory i kierować opieką kliniczną.

Systemy kohodowli in vitro w celu odtworzenia cyklu rak-odporność

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Poznaj metodę wykrywania apoptozy komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta pozwala analizować interakcje między limfocytami T CD8+ a komórkami nowotworowymi oraz oceniać mechanizmy immunosupresji wywołanej przez komórki szpikowe.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 ⁺ w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Przeglądaj więcej filmów