Name: Przygotowanie funkcjonalizowanych kulek SiO2 z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kulek SiO₂ z poli(pentafluorofenylu) do immunoprecypitacji białek. Technika umożliwia immobilizację przeciwciał i skuteczne oczyszczanie antygenów docelowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Agencję Rozwoju Obronnego (Grant No. UD170039ID).

1. Przygotowanie homopolimeru poli(PFPA)
<ol>
	<li>Rekrystalizacja AIBN
	<ol>
		<li>Połączyć 5 g 2,2'-azobis(2-metylopropionitrylu) (AIBN) z 25 ml metanolu w zlewce o pojemności 250 ml. Zanurzyć zlewkę w kąpieli olejowej o temperaturze 60 °C, a następnie energicznie mieszać mieszaninę za pomocą mieszadła, aż do całkowitego rozpuszczenia AIBN.</li>
		<li>Przefiltrować ciepły roztwór przez bibułę filtracyjną (zatrzymanie cząstek 5-8 μm) i przechowywać filtrat w temperaturze 4 °C, aby umożliwić powolne tworzenie się kryształów.</li>
		<li>Zebrać zrekrystalizowany AIBN przez filtrację. Połączyć zebrany produkt z 25 ml świeżego metanolu i powtórzyć proces rekrystalizacji.</li>
		<li>Wysuszyć 2x zrekrystalizowany AIBN w piecu próżniowym w temperaturze pokojowej (RT) przez noc. Produkt przechowywać w ciemności w temperaturze < -10 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza ditiobenzoesanu benzylu25
	<ol>
		<li>Przygotować kolbę okrągłodenną o pojemności 500 ml z trzema szyjkami, wyposażoną w mieszadło magnetyczne, chłodnicę zwrotną, lejek do zakraplacza i gumową przegrodę. Podłączyć kolbę do przewodu gazowego azotu przez chłodnicę zwrotną i wypłukać powietrze z wnętrza azotem. Włóż termometr przez przegrodę. Dodać 41 ml (0,041 mola) 1 M roztworu bromku fenylomagnezu w tetrahydrofuranie (THF) przez strzykawkę przez tę samą przegrodę.</li>
		<li>Podgrzać roztwór bromku fenylomagnezu do temperatury 40 °C w kąpieli olejowej. Następnie powoli dodać 3,1 g (0,041 mola) dwusiarczku węgla przez lejek do zakraplania, utrzymując temperaturę roztworu na poziomie 40 °C.</li>
		<li>Dodać 7,1 g (0,042 mola) bromku benzylu do otrzymanej mieszaniny przez lejek do zakraplacza przez 15 minut. Zwiększyć temperaturę reakcji do 50 °C. Kontynuować mieszanie w tej temperaturze przez 45 minut.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną do rozdzielacza i rozcieńczyć 15 ml lodowatej wody. Wyekstrahować produkt, dodając 15 ml eteru dietylowego i usunąć dolną warstwę wody. Powtórz ekstrakcję eterem dietylowym jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Połączone fazy organiczne przemyć dużą ilością wody, następnie zalać solanką (roztwór 50% (w/v) NaCl w wodzie) i wysuszyć produkt na bezwodnym siarczanie magnezu.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik w próżni w temperaturze 35 °C za pomocą wyparki obrotowej.</li>
		<li>Oczyścić produkt metodą chromatografii kolumnowej przy użyciu 400 ml żelu krzemionkowego (wielkość porów 60 A, wielkość cząstek siatki 63-200) i eteru naftowego jako eluentu, otrzymując 5 g ditiobenzoesanu benzylu (BDB) w postaci czerwonego oleju. Czystość produktu potwierdzić za pomocą 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8,02-7,99 (2H, m), 7,55-7,50 (1H, m), 7,41-7,29 (7H, m), 4,60 (2H, s).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza poli(PFPA) metodą polimeryzacji RAFT9,26
	<ol>
		<li>Dostępny na rynku monomer PFPA zawiera niewielką ilość inhibitorów. Przed polimeryzacją należy usunąć inhibitory, przepuszczając monomer przez jednorazową strzykawkę wypełnioną zasadowym tlenkiem glinu.</li>
		<li>Dodać 0,4 mg (0,0024 mmol) rekrystalizowanego AIBN, 4,3 mg (0,018 mmol) BDB, 1012 mg (4,25 mmol) wolnego od inhibitorów PFPA i 0,7 ml bezwodnego anizolu do kolby Schlenka o pojemności 20 ml.</li>
		<li>Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka i odgazować mieszaninę w co najmniej trzech cyklach zamrażania, pompowania i rozmrażania. Krótko mówiąc, zamrozić mieszaninę reakcyjną w kąpieli ciekłego azotu. Zastosuj podciśnienie, aby usunąć gaz z przestrzeni nad głową. Uszczelnić kolbę, a następnie usunąć z dala od ciekłego azotu, aby umożliwić rozmrożenie zawartości w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieścić kolbę w łaźni olejowej o temperaturze 70 °C i reagować przez 4 godziny pod wpływem przedmuchiwaniaN2.</li>
		<li>Aby zakończyć reakcję, należy wyjąć kolbę z kąpieli olejowej i wystawić zawartość reakcji na działanie powietrza.</li>
		<li>Wytrącić polimer w zimnym metanolu, a następnie wysuszyć odzyskany polimer w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C przez noc.</li>
		<li>Aby zmierzyć masę cząsteczkową polimeru, należy użyć chromatografii żelowej (GPC). Użyć THF jako fazy ruchomej w temperaturze 35 °C przy natężeniu przepływu 1 ml/min i skonstruować krzywą kalibracyjną przy użyciu wzorców polistyrenu monodyspersyjnego. Aby uzyskać pomiar GPC, rozpuść polimer w THF (1-2 mg/ml) i przefiltruj przez jednorazowy filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE) 0,2 μm. Wstrzyknąć 100 μl próbki do przyrządu GPC. Przelicz zmierzony czas retencji próbki na masę cząsteczkową za pomocą krzywej kalibracyjnej polistyrenu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie poli(PFPA) funkcjonalizowanych kulek SiO2
<ol>
	<li>Obróbka kulek SiO2 za pomocą APTMS
	<ol>
		<li>Cząsteczki SiO2 są dostępne w postaci 5% (w/v) zawiesiny wodnej. Połączyć 0,8 ml zawiesiny SiO2 z 40 mg APTMS i 8 ml metanolu w 20 ml fiolce scyntylacyjnej wyposażonej w mieszadło.</li>
		<li>Pozostawić reakcję w temperaturze pokojowej przez 5 godzin, energicznie mieszając.</li>
		<li>Przenieś roztwór do stożkowej rurki. Aby wyizolować kulki SiO2 funkcjonalizowane przez APTMS, należy odwirować roztwór o sile 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Umyj kulki, ponownie dyspergując je w 3 ml świeżego metanolu. Potrząśnij probówką ręcznie w celu wymieszania, ale jeśli to konieczne, popraw dyspersję poprzez sonikację w łaźni wodnej przez kilka sekund. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i powtórzyć etap mycia jeszcze raz.</li>
		<li>Połącz płukane metanolem kulki SiO2 z 3 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Potrząśnij mieszaniną ręcznie lub, jeśli to konieczne, sonikuj przez kilka sekund, aż kulki zostaną całkowicie rozproszone w DMSO. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórz ten krok, aby zapewnić pełną wymianę rozpuszczalnika z metanolu na DMSO. 
		UWAGA: Końcowa zawiesina zawiera funkcjonalizowane przez APTMS kulki SiO2 rozproszone w 4 ml DMSO.</li>
		<li>Aby sprawdzić rozkład wielkości cząstek, wykonaj analizę DLS. Pobrać jedną kroplę zawiesiny przygotowanej w kroku 2.1.4 i umieścić w jednorazowej kuwecie UV. Rozcieńczyć próbkę, napełniając kuwetę świeżym DMSO, aż będzie wypełniona w 2/3. Włóż próbkę do uchwytu komórki, aby rozpocząć akwizycję danych. Do pomiaru wielkości cząstek należy użyć następujących parametrów konfiguracji: Temperatura: 25 °C; Czas równowagi: 120 s; Czas trwania pomiaru: Automatyczny.</li>
		<li>Aby sprawdzić skład powierzchni, należy przeprowadzić analizę XPS. Wysuszyć małą próbkę z zawiesiny przygotowanej w kroku 2.1.4 w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C przez noc. Pobrać wysuszony polimer i równomiernie zapakować w uchwyt na próbkę o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm. Załaduj próbkę do komory wysokiej próżni (10-8 torów) i rozpocznij akwizycję danych. Dla konkretnego użytego instrumentu XPS, wygeneruj fotoelektrony za pomocą monochromatycznego promieniowania rentgenowskiego Al Kα działającego przy napięciu 15 kV i 6,7 mA i zbieraj je przy użyciu powiększenia w trybie hybrydowym za pomocą analizatora przy energii przejścia 50 eV dla widm o wysokiej rozdzielczości i energii przejścia 100 eV dla badań pierwiastków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczepienie poli(PFPA) do kulek SiO2 funkcjonalizowanych APTMS
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór poli(PFPA) rozpuszczając 20 mg poli(PFPA) w 2 ml DMSO w 20 ml fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. 
		UWAGA: W tym badaniu stosuje się poli(PFPA) o stosunkowo niskiej masie cząsteczkowej (20 kg/mol). Tak więc, pomimo wysokiego stężenia polimeru (10 mg/ml), nie obserwuje się dowodów na sieciowanie polimerów. Jeśli używany jest polimer o wyższej masie cząsteczkowej, może być konieczne dostosowanie stężenia roztworu polimeru, aby uniknąć możliwego sieciowania.</li>
		<li>Dodać 1 ml funkcjonalizowanych APTMS kulek SiO2 zawieszonych w DMSO (z kroku 2.1.4) do roztworu poli(PFPA). Reagować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, energicznie mieszając.</li>
		<li>Wyizolować poli(PFPA) szczepione kulki SiO2 przez odwirowanie w stężeniu 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Umyj kulki, dodając 3 ml DMSO i wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórzyć mycie kulek SiO2 szczepionych poli(PFPA) dwukrotnie DMSO.</li>
		<li>Umyj koraliki jeszcze dwa razy wodą potrójnie destylowaną (TDW). Na tym etapie połącz kulki z 3 ml TDW, a następnie wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>Aby sprawdzić rozkład wielkości cząstek, wykonaj DLS zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.1.5. Aby sprawdzić skład chemiczny powierzchni, wykonaj XPS zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.1.6.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie kulek SiO2 szczepionych poli(PFPA) podstawionym PEG
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór poli(PFPA), należy rozpuścić 20 mg poli(PFPA) w 2 ml DMSO w 20 ml fiolki scyntylacyjnej.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór PEG, rozpuść PEG funkcjonalizowany aminami w 1 ml DMSO. Dokładna ilość użytego PEG zależy od pożądanego stopnia podstawienia PFP, określonego za pomocą równania pokazanego poniżej: 
	Ilość aminokwasów PEG (g/g-poli(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % PEG-Sub) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA)) 
	gdzie N_poly(PFPA) = poli(PFPA) stopień polimeryzacji 
	% PEG-Sub = procent podstawienia PEG 
	MW_PEG = masa cząsteczkowa amino-PEG 
	MW_ poli(PFPA) = masa cząsteczkowa poli(PFPA)</li>
	<li>Przenieść roztwór PEG do roztworu poli(PFPA). Reagować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, energicznie mieszając.</li>
	<li>Aby przygotować funkcjonalizowane przez APTMS kulki SiO2 zawieszone w DMSO, wykonaj te same czynności, które pokazano w kroku 2.1. Przenieść 1 ml zawiesiny kulek do roztworu poli(PFPA) podstawionego PEG przygotowanego w kroku 3.3. Pozwól, aby szczepienie między kulkami SiO2 funkcjonalizowanymi poli(PFPA) i APTMS przebiegało w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z energicznym mieszaniem.</li>
	<li>Wyizolować kulki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Umyj kulki, dodając 3 ml DMSO i wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Powtórz pranie DMSO dwukrotnie.</li>
	<li>Umyj koraliki jeszcze dwa razy za pomocą TDW. Na tym etapie połącz kulki z 3 ml TDW, a następnie wymieszaj, potrząsając ręką lub przez kilka sekund sonikacji. Odwirować kulki o masie 10 000 x g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Kulki suszyć przez noc w temperaturze 40 °C w piekarniku próżniowym.</li>
</ol>
4. Immobilizacja przeciwciał na poli(PFPA) szczepionych kulkach SiO2
UWAGA: Ta sama procedura jest stosowana niezależnie od procentowego podstawienia PEG na poli(PFPA). Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), rozpuszczając tabletkę PBS w TDW. Przygotować 0,1% (v/v) buforowaną solą fizjologiczną z fosforanem Tween-20 (PBST), dodając 1/1000 Tween-20 do PBS.
<ol>
	<li>Dodać 5 mg kulek SiO2 szczepionych poli(PFPA) do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umyj kulki, dodając 800 μl PBS i dobrze wymieszaj, wirując. Odwirować kulki o sile 10 000 x g w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Usunąć supernatant i powtórzyć etap mycia trzy razy.</li>
	<li>Dodać 350 μl świeżego PBS, 50 μl 0,1% (v/v) PBST i 6,67 μg przeciwciała. Inkubować ~20 h na rotatorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj kulki, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Odwirować kulki w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do lizy. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół przez pięć razy. 
	UWAGA: Bufor do lizy używany do płukania kulek powinien być taki sam, jak używany podczas lizy komórek i IP, z wyjątkiem tego, że dodanie ditiotreitolu i inhibitora proteazy jest opcjonalne (patrz krok 5).</li>
	<li>Powtórz ten krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu usuń supernatant w jak największym stopniu.</li>
</ol>
5. Liza komórek i immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do lizy i buforu do przemywania
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,5% (v/v) NP-40, 10% (v/v) glicerol, 1 mM ditiotreitol (DTT) i koktajl inhibitorów proteazy).</li>
		<li>Przygotować bufor do przemywania (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,1 % (v/v) NP-40 i 10% (v/v) glicerolu).</li>
		<li>Przechowywać roztwory buforowe w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Zasiaj komórki (komórki HeLa) na jeden lub dwa dni przed eksperymentem IP i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zebrać około 1,4 x 107 komórek za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy ciśnieniu 380 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 1 ml zimnego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 s. Usunąć dokładnie supernatant. Granulki komórkowe mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C po usunięciu supernatantu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lizatów komórkowych
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 400 μl buforu do lizy. Sonikować komórki za pomocą ultradźwięków.</li>
		<li>Po sonikacji należy krótko zmieszać i odwirować lizat w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja
	<ol>
		<li>Przenieść 300 μl lizatu komórkowego do wcześniej przygotowanych inkubowanych kulek SiO2 szczepionych poli(PFPA) przeciwciałami. Zachować 30 μl lizatu komórkowego jako próbkę wejściową w nowej probówce do mikrowirówki. Przechowywać wsadową próbkę w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Całkowita ilość białka w lizacie komórkowym powinna wynosić około 4 mg.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę lizatu i kulek przez 3 godziny na rotatorze w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę w temperaturze 400 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Usunąć supernatant i ostrożnie dodać 400 μl buforu do przemywania wody. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół około pięć razy.</li>
		<li>Powtórz ten krok prania trzy razy. Po ostatnim umyciu usuń supernatant w jak największym stopniu.</li>
		<li>Przygotuj 2x dodecylosiarczanu sodu (SDS) barwnik ładujący (25% (v/v) glicerolu, 0,1% (w/v) błękitu bromofenolowego (BPB), 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% (w/v) SDS i 2,75 mM 2-merkaptoetanolu). Przechowywać 2x barwnik ładujący SDS w temperaturze -20 °C. Dodać 30 μl barwnika ładującego 2x SDS do kulek i przechowywanej próbki wejściowej i podgrzewać je przez 10 minut w temperaturze 95 °C.</li>
		<li>Po podgrzaniu przeanalizować próbkę za pomocą Western blotting27 lub przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li>
<li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+%27chemical+nose%27+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li>
<li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li>
<li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li>
<li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Ester+Containing+Polymers%3A+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pola.26200">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li>
<li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+universal+method+toward+light-responsive+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li>
<li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/pj20166">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li>
<li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li>
<li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+defined+adjustment+of+surface+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li>
<li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/jm/b913753j">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li>
<li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014305705000649">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li>
<li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores%3A+a+method+toward+molecular+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li>
<li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1381514813002514">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li>
<li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li>
<li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+grafting+of+poly%28pentafluorophenyl+acrylate%29+onto+oxides%3A+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li>
<li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine-Reactive+Poly%28pentafluorophenyl+acrylate%29+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li>
<li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li>
<li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li>
<li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li>
<li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+biomimetic+materials%3A+nonfouling+poly+%28carboxybetaine%29+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHS-ester+functionalized+poly%28PEGMA%29+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+%283D%29+substrates+for+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li>
<li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma020882h">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li>
<li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma900945s">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma202700y">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Syntezę kulek SiO2 szczepionych poli(PFPA) zilustrowano na rysunku 1. Dzięki zastosowaniu APTMS jako cząsteczki łącznikowej, szczotki poli(PFPA) kowalencyjnie szczepione na substracie SiO2 można przygotować w prostym dwuetapowym procesie. Chociaż niektóre jednostki PFP są poświęcane do reakcji z APTMS, oczekuje się, że duża liczba jednostek PFP pozostanie dostępna do późniejszej reakcji z amino-PEG lub przeciwciałami. Wiadomo, że grupy PFP tworzą powierzchnie o niskiej ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58843/preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads">Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification</a>.&#160; Throughout the article, the term &#34;3-aminopropyltriethoxysilane&#34; has been replaced with &#34;3-aminopropyltrimethoxysilane&#34;, and &#34;APTES&#34; with &#34;APTMS&#34;.

Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Reaktywne szczotki polimerowe cieszą się dużym zainteresowaniem w ostatnich latach. Mogą być używane do immobilizacji funkcjonalnych cząsteczek na materiałach organicznych lub nieorganicznych w celu tworzenia aktywowanych powierzchni z zastosowaniami w obszarach takich jak wykrywanie i separacja1,2,3,4,5. Spośród zgłoszonych polimerów reaktywnych, te zawierające jednostki estru pentafluorofenylu są szczególnie przydatne ze względu na ich wysoką reaktywność z aminami i odporność na hydrolizę6. Jednym z takich polimerów jest poli(PFPA) i może być łatwo funkcjonalizowany po polimeryzacji cząsteczkami zawierającymi pierwszorzędowe lub drugorzędowe aminy7,8,9,10. W jednym z przykładów pędzle poli(PFPA) przereagowały z amino-spiropyranami, aby stworzyć powierzchnie reagujące na światło7.
Przygotowanie poly(PFPA) i jego zastosowania zostały opisane w wielu poprzednich publikacjach6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17. W szczególności Theato i współpracownicy opisali syntezę pędzli poli(PFPA) zarówno metodą "szczepienia", jak i "szczepienia z"7,8,10,11,12. W podejściu "szczepienie do" zsyntetyzowano hybrydowy polimer poli(metylosilseskwioksan)-poli(akrylan pentafluorofenylu) (poli(MSSQ-PFPA)) hybrydowy polimer8,10,11,12. Składnik poli(MSSQ) był w stanie wytworzyć silną przyczepność do wielu różnych powierzchni organicznych i nieorganicznych, umożliwiając w ten sposób składnikowi poli(PFPA) utworzenie warstwy pędzla na powierzchni powlekanego materiału. W podejściu "szczepienie z" zastosowano inicjowaną powierzchniowo polimeryzację odwracalnego dodawania i przenoszenia łańcucha fragmentacji (SI-RAFT) do przygotowania szczotek poli(PFPA)7. W tym przypadku czynnik przenoszący łańcuch unieruchomiony powierzchniowo (SI-CTA) został najpierw kowalencyjnie przyłączony do podłoża w reakcji krzemionka-silan. Unieruchomiony SI-CTA uczestniczył następnie w polimeryzacji monomerów PFPA metodą SI-RAFT, generując gęsto upakowane szczotki poli(PFPA) o stabilnym wiązaniu kowalencyjnym z podłożem.
Wykorzystując szczotki poli(PFPA) zsyntetyzowane metodą polimeryzacji SI-RAFT, niedawno zademonstrowaliśmy immobilizację przeciwciał na cząstkach krzemionki szczepionej poli(PFPA) i ich późniejsze zastosowanie w oczyszczaniu białek18. Stwierdzono, że zastosowanie szczotek poli(PFPA) do immobilizacji przeciwciał rozwiązuje szereg problemów związanych z obecną separacją białek za pomocą IP. Konwencjonalne IP opiera się na wykorzystaniu białka A/G jako łącznika do immobilizacji przeciwciał19,20,21. Ponieważ zastosowanie białka A/G pozwala na przyłączanie przeciwciał o określonej orientacji, osiąga się wysoką skuteczność odzyskiwania docelowego antygenu. Jednak stosowanie białka A/G cierpi z powodu niespecyficznej interakcji białkowej, a także utraty przeciwciał podczas odzyskiwania białek, co przyczynia się do wysokiego poziomu szumu tła. Aby rozwiązać te niedociągnięcia, zbadano bezpośrednie sieciowanie przeciwciał do stałego nośnika22,23,24. Skuteczność takich technik jest zazwyczaj niska ze względu na losową orientację usieciowanych przeciwciał. W przypadku substratu szczepionego poli(PFPA) immobilizacja przeciwciał jest trwała, osiągana poprzez reakcję wymiany między jednostkami PFP i funkcjami aminowymi na przeciwciałach. Chociaż orientacja przeciwciał jest nadal losowa, system korzysta z wielu reaktywnych miejsc PFP, które można kontrolować za pomocą stopnia polimeryzacji. Ponadto wykazaliśmy, że poprzez częściowe zastąpienie jednostek PFP amino-PEG, hydrofilowość powierzchni może być dostrojona, co jeszcze bardziej poprawia wydajność odzyskiwania białek w systemie18. Ogólnie rzecz biorąc, wykazano, że szczepione cząstki krzemionki poli(PFPA) są skuteczną alternatywą dla tradycyjnego IP z rozsądną wydajnością, a także znacznie czystszym tłem.
W tym wpisie opisujemy alternatywną metodę przygotowania poli(PFPA) szczepionej powierzchni do immobilizacji przeciwciał i aplikacji IP. W prostym dwuetapowym procesie, jak pokazano na Rysunek 1, cząsteczka łącznika APTMS jest najpierw osadzana na powierzchni krzemionki, a następnie polimer poli(PFPA) jest kowalencyjnie przyłączany do cząsteczki łącznika poprzez reakcję między jednostkami PFP na polimerze a funkcjami aminowymi na APTMS. Ta metoda przygotowania pozwala na trwałe sieciowanie poli(PFPA) z powierzchnią podłoża, ale pozwala uniknąć wielu komplikacji związanych z syntezą SI-CTA i polimeryzacją SI-RAFT szczotek poli(PFPA). Częściowe zastąpienie jednostek PFP amino-PEG może być nadal wykonane, co pozwala na precyzyjne dostrojenie właściwości powierzchni szczotek polimerowych. Pokazujemy, że tak przygotowane szczepione kulki krzemionki z poli(PFPA) można unieruchomić przeciwciałami i wykorzystać do wzbogacania białek za pomocą IP. Szczegółowa procedura przygotowania kulek, immobilizacja przeciwciał i testowanie IP są udokumentowane w tym artykule, dla czytelników zainteresowanych poszukiwaniem alternatywy dla konwencjonalnego IP opartego na białku A / G.

<table><tbody><tr><td>2,2-Azobisisobutyronitryl, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>1102-4405</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol metylowy do HPLC, 99,9%</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>d62</td><td></td></tr><tr><td>Bromek fenylomagnezu, roztwór 1,0&nbsp; M w THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Dwusiarczek węgla bezwodny, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335266</td><td></td></tr><tr><td>Bromek benzylu, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td></td></tr><tr><td>Eter naftowy, 90%</td><td>Samchun Chemicals</td><td>P0220</td><td></td></tr><tr><td>Eter etylowy, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>4025-4404</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu bezwodny, proszek,&nbsp; 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>5514-4405</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan pentafonenylu</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-264001</td><td>zawiera inhibitor</td></tr><tr><td>Tlenek glinu, aktywowany, zasadowy, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Daejung Chemicals</td><td>7548-4400</td><td></td></tr><tr><td>Anizol bezwodny, 99,7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>Nanocząstki krzemionki</td><td>Microparticles GmbH</td><td>SiO2-R-0,7</td><td>5% w/v zawiesina wodna</td></tr><tr><td>3-aminopropylotrimetoksysilan, >96,0%</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T1255</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek do HPLC, &ge; 99,7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>Aminozakończony eter metylowy poli(glikolu etylenowego)</td><td>Źródło</td><td>polimeru P16082-EGOCH3NH2</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami</td><td>Takara</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Calbiochem</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM9640G</tr><tr><td>NP-40</td><td>VWR</td><td>E109-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Biosesang</td><td>D1037</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Merck</td><td>535140-1MLCN</td><td></td></tr><tr><td>Bromo fenol niebieski</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 6,8)</td><td>Bioroztwór</td><td>BT033</td><td></td></tr><tr><td>Bioroztwór dodecylosiarczanu sodu</td><td></td><td>BS003</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>przeciwciał PKR</td><td>12297S Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td></td></tr><tr>Normalna <td>technologia sygnalizacji komórek</td><td>IgG królika</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>Korea Cell Line Bank</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WUC-D10H</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy</td><td>wirówka BMBio</td><td>BR2006A</td><td></td></tr><tr><td>I</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka II</td><td>LABOGENE</td><td>1736R</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR</td><td>ROTATOR/AG</td><td></td></tr><tr><td>Piec próżniowy</td><td>DAIHAN Naukowa</td><td>termostabilna chromatografia żelowa OV-30</td><td></td></tr><tr><td>(THF)</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 Spektrometr</td> fotoelektronów rentgenowskich Infinity II <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo VG Scientific</td><td>Sigma Probe</td><td></td></tr><tr><td>Dynamiczne rozpraszanie światła</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN 3690</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie funkcjonalizowanych kulek sio2 z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Pokazujemy prostą metodę przygotowania poli(akrylanu pentafluorofenylu) (poli(PFPA)) szczepionych kulek krzemionkowych do immobilizacji przeciwciał i późniejszej aplikacji immunoprecypitacji (IP). Powierzchnia szczepiona z poli(PFPA) jest przygotowywana w prostym, dwuetapowym procesie. W pierwszym etapie 3-aminopropylotrimetoksysilan (APTMS) osadza się jako cząsteczkę łącznikową na powierzchni krzemionki. W drugim etapie homopolimer poli(PFPA), syntetyzowany przez polimeryzację odwracalnego dodawania i przenoszenia łańcucha fragmentacji (RAFT), jest szczepiony do cząsteczki łącznika w wyniku reakcji wymiany między jednostkami pentafluorofenylu (PFP) na polimerze i grupami aminowymi na APTMS. Osadzanie się APTMS i poli(PFPA) na cząstkach krzemionki jest potwierdzane za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS), a także monitorowane przez zmianę wielkości cząstek mierzoną za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). W celu poprawy hydrofilowości powierzchniowej kulek przeprowadza się również częściowe podstawienie poli(PFPA) poli(glikolem etylenowo-glikolowym) (amino-PEG) funkcjonalizowanym aminami. Podstawione przez PEG kulki krzemionki z poli(PFPA) są następnie unieruchamiane przeciwciałami do aplikacji IP. W celu demonstracji stosuje się przeciwciało przeciwko kinazie białkowej aktywowanej RNA (PKR), a wydajność IP określa się za pomocą Western blot. Wyniki analizy pokazują, że kulki unieruchomione przeciwciałem mogą być rzeczywiście wykorzystane do wzbogacenia PKR, podczas gdy nieswoiste interakcje białkowe są minimalne.

Schemat przygotowania poli(PFPA) przyłączonych do SiO2 kulki, z lub bez modyfikacji PEG, przedstawiono na Rycina 1. Aby monitorować proces przyłączania APTMS i poli(PFPA), na powierzchni barek SiO₂2 kulki, functionalizowane APTMS SiO2 kulki oraz modyfikowane poli(PFPA) SiO₂2 kulki są charakteryzowane zarówno przy użyciu DLS (Rycina 2) oraz XPS (Rycina 3). S...

Przedstawiono protokół przygotowania szczepionych kulek krzemionkowych z poli(pentafluorofenylu akrylanu) (poli(PFPA)). Funkcjonalizowana powierzchnia poli(PFPA) jest następnie unieruchamiana przeciwciałami i z powodzeniem wykorzystywana do separacji białek poprzez immunoprecypitację.

Przygotowanie funkcjonalizowanych kulek SiO2 z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Metoda ta może być stosowana do przygotowania powierzchni aktywowanych biomolekułami, które mają zastosowanie w takich dziedzinach jak dostarczanie leków, wykrywanie celów biologicznych i separacja biologiczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że szczotki poli PFPA są wysoce reaktywne z aminami, a immobilizację przeciwciał uzyskuje się poprzez inkubację w roztworze buforowym przez kilka godzin. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku oczyszczania białek poprzez oczyszczanie immunologiczne, ponieważ unieruchomione przeciwciało może z powodzeniem wiązać się z docelowymi antygenami.Chociaż metoda ta jest demonstrowana do mobilizacji przeciwciał i oczyszczania białek, może być również stosowana do innych systemów wymagających mobilizacji biomolekularnej. Aby potraktować kulki dwutlenku krzemu za pomocą APTES, najpierw uzyskaj cząsteczki dwutlenku krzemu w postaci wodnej zawiesiny o objętości 5%. Połącz 0,8 mililitra zawiesiny dwutlenku krzemu z 40 miligramami APTES i ośmioma mililitrami metanolu w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej wyposażonej w mieszadło.Pozwól reakcji postępować w temperaturze pokojowej przez pięć godzin, energicznie mieszając. Po pięciu godzinach przenieś roztwór do stożkowej probówki. Aby wyizolować funkcjonalizowane kulki dwutlenku silikonu APTES, należy odwirować roztwór o stężeniu 10 000 G przez pięć minut.Następnie usunąć supernatant. Teraz umyj koraliki, ponownie rozsączając je w trzech mililitrach świeżego metanolu. Potrząśnij probówką ręcznie w celu wymieszania, ale jeśli to konieczne, popraw dyspersję poprzez sonikację w łaźni wodnej przez kilka sekund.Odwirować jak poprzednio i powtórzyć etap mycia jeszcze raz. Połącz kulki dwutlenku silikonu do mycia metanolem z trzema mililitrami dimetylosulfotlenku lub DMSO. Potrząśnij mieszaniną ręcznie lub, jeśli to konieczne, sonikuj przez kilka sekund, aż kulki zostaną całkowicie rozproszone w DMSO.Po wcześniejszym odwirowaniu usunąć supernatant. Powtórz etap wirowania po raz ostatni, aby zapewnić pełną wymianę rozpuszczalnika z metanolu na DMSO. Aby przygotować roztwór poli PFPA, należy rozpuścić 20 miligramów poli PFPA w dwóch mililitrach DMSO w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej.Aby przygotować roztwór PEG, rozpuść PEG funkcjonalizowany aminą w jednym mililitrze DMSO. Teraz przenieś roztwór PEG do roztworu poli PFPA. Reagować w temperaturze pokojowej przez godzinę, energicznie mieszając.Przenieś jeden mililitr funkcjonalizowanych kulek dwutlenku krzemu APTES zawieszonych w DMSO do roztworu poli PFPA podstawionego PEG. Pozwól, aby szczepienie między kulkami dwutlenku krzemu funkcjonalizowanymi poli PFPA i APTES przebiegało w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, energicznie mieszając. Następnie wyizolować kulki przez odwirowanie w stężeniu 10 000 G przez pięć minut, po czym następuje usunięcie supernatantu.Umyj kulki, dodając trzy mililitry DMSO i wymieszaj ręcznie lub z kilkusekundową sonikacją. Odwiruj kulki jak poprzednio. I usuń supernatant przed dwukrotnym powtórzeniem prania DMSO.Umyj koraliki jeszcze dwukrotnie trzema mililitrami potrójnie destylowanej wody. Następnie wymieszaj ręcznie lub z kilkusekundową sonikacją. Odwirować kulki jak poprzednio i usunąć supernatant.Na koniec wysusz koraliki w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piekarniku próżniowym przez noc. Dodaj pięć miligramów kulek dwutlenku krzemu szczepionego poli PFPA do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umyj kulki, dodając 800 mikrolitrów PBS i dobrze wymieszaj, wirując.Odwirować kulki w temperaturze pokojowej 10 000 G przez jedną minutę. Usuń supernatant i powtórz etap mycia trzy razy. Teraz dodaj 350 mikrolitrów świeżego PBS, 50 mikrolitrów 0,1% PBST i 6,67 mikrogramów przeciwciała.Inkubować około 20 godzin na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj kulki i odwiruj w temperaturze 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Następnie usuń supernatant i ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do lizy.Delikatnie zawiesić kulki, pipetując pięć razy w górę i w dół. Powtórz ten krok prania trzy razy. Po ostatnim przemyciu należy usunąć jak najwięcej supernatantu.Przygotować komórki i bufor do lizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy z 400 mikrolitrami buforu do lizy. Sonikuj komórki za pomocą ultrasonografu.Po sonikacji krótko zawirować. Następnie odwirować lizat w temperaturze 20 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Aby przeprowadzić immunoprecypitację, należy przenieść 300 mikrolitrów lizatu komórkowego do wcześniej przygotowanych kulek dwutlenku krzemu immobilizowanych przeciwciałami z poli PFPA. Zachowaj 30 mikrolitrów lizatu komórkowego jako próbkę wejściową w nowej probówce do mikrowirówki. Inkubuj mieszaninę kulek lizatu przez trzy godziny na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po inkubacji odwirować mieszaninę w temperaturze 400 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usuń supernatant i ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do mycia. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół około pięć razy.Po trzech płukaniach usunąć jak najwięcej supernatantu. Dodaj 30 mikrolitrów barwnika ładującego 2x SDS do kulek i do próbki wejściowej. Następnie podgrzewaj je przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Po podgrzaniu przeanalizuj próbkę za pomocą western blotting lub przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Funkcjonalizowane kulki krzemionki są badane za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów lub XPS w celu określenia składu powierzchni. Reprezentatywne dane XPS są pokazane tutaj.Po leczeniu APTES wykrywany jest pik azotu 1s związany ze strefą grupy aminowej APTES. Po poddaniu działaniu poli PFPA wykrywany jest pik fluoru 1s związany z jednostkami PFP na polimerze. Przeprowadza się aktywację kinazy białkowej RNA lub wzbogacenie PKR poprzez immunoprecypitację, a próbka białka jest analizowana za pomocą western blot.Zgodnie z oczekiwaniami, kulki unieruchomione bez przeciwciał lub z nieswoistą mieszanką przeciwciał nie wykazują powrotu do PKR. Koraliki inkubowane z anty-PKR mogą z powodzeniem wzbogacać PKR, na co wskazuje obecność pasma PKR i brak pasma GAPDH. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że podczas porównywania systemów, eksperymenty z IP, jak również późniejsza analiza western blot, powinny być wykonywane jednocześnie.Po opracowaniu technika ta może być stosowana do unieruchamiania różnych substratów biomolekularnych lub materiałowych. Co więcej, ta metoda ma dodatkową zaletę polegającą na dostosowaniu właściwości powierzchni Tylko do potrzeb każdej aplikacji.

preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

W tym filmie sondy siły biomembranowej (BFP) są używane do pomiaru sił między receptorami i ligandami. Technika ta może wykrywać interakcje poprzez monitorowanie ciśnienia potrzebnego do zerwania wiązań między pMHC sprzężonym na kulkach sondy a TCR na komórkach docelowych.

Sonda wymuszająca biomembranę do ilościowego określania interakcji receptor-ligand

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj prezentujemy protokół syntezy bioinspirowanych materiałów krzemionkowych i immobilizacji enzymów w nich. Krzemionka jest syntetyzowana przez połączenie krzemianu sodu i "dodatku" aminowego, które neutralizują się w kontrolowanym tempie. Właściwości i funkcję materiału można zmienić poprzez immobilizację enzymatyczną in situ lub postsyntetyczne elucję kwasową zamkniętych dodatków.

Otrzymywanie krzemionki funkcjonalnej metodą inspirowaną biologicznie

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Poznaj metodę przygotowania kulek SiO₂ z poli(pentafluorofenylu) do immunoprecypitacji białek. Technika umożliwia immobilizację przeciwciał i skuteczne oczyszczanie antygenów docelowych.

Przygotowanie funkcjonalizowanych kulek SiO₂ z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek

Przeglądaj więcej filmów