Przygotowanie funkcjonalizowanych kulek SiO2 z poli(pentafluorofenylu) do oczyszczania białek
19 listopada 2018
Przedstawiono protokół przygotowania szczepionych kulek krzemionkowych z poli(pentafluorofenylu akrylanu) (poli(PFPA)). Funkcjonalizowana powierzchnia poli(PFPA) jest następnie unieruchamiana przeciwciałami i z powodzeniem wykorzystywana do separacji białek poprzez immunoprecypitację.
Metoda ta może być stosowana do przygotowania powierzchni aktywowanych biomolekułami, które mają zastosowanie w takich dziedzinach jak dostarczanie leków, wykrywanie celów biologicznych i separacja biologiczna. Główną zaletą tej techniki jest to, że szczotki poli PFPA są wysoce reaktywne z aminami, a immobilizację przeciwciał uzyskuje się poprzez inkubację w roztworze buforowym przez kilka godzin. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku oczyszczania białek poprzez oczyszczanie immunologiczne, ponieważ unieruchomione przeciwciało może z powodzeniem wiązać się z docelowymi antygenami.
Chociaż metoda ta jest demonstrowana do mobilizacji przeciwciał i oczyszczania białek, może być również stosowana do innych systemów wymagających mobilizacji biomolekularnej. Aby potraktować kulki dwutlenku krzemu za pomocą APTES, najpierw uzyskaj cząsteczki dwutlenku krzemu w postaci wodnej zawiesiny o objętości 5%. Połącz 0,8 mililitra zawiesiny dwutlenku krzemu z 40 miligramami APTES i ośmioma mililitrami metanolu w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej wyposażonej w mieszadło.
Pozwól reakcji postępować w temperaturze pokojowej przez pięć godzin, energicznie mieszając. Po pięciu godzinach przenieś roztwór do stożkowej probówki. Aby wyizolować funkcjonalizowane kulki dwutlenku silikonu APTES, należy odwirować roztwór o stężeniu 10 000 G przez pięć minut.
Następnie usunąć supernatant. Teraz umyj koraliki, ponownie rozsączając je w trzech mililitrach świeżego metanolu. Potrząśnij probówką ręcznie w celu wymieszania, ale jeśli to konieczne, popraw dyspersję poprzez sonikację w łaźni wodnej przez kilka sekund.
Odwirować jak poprzednio i powtórzyć etap mycia jeszcze raz. Połącz kulki dwutlenku silikonu do mycia metanolem z trzema mililitrami dimetylosulfotlenku lub DMSO. Potrząśnij mieszaniną ręcznie lub, jeśli to konieczne, sonikuj przez kilka sekund, aż kulki zostaną całkowicie rozproszone w DMSO.
Po wcześniejszym odwirowaniu usunąć supernatant. Powtórz etap wirowania po raz ostatni, aby zapewnić pełną wymianę rozpuszczalnika z metanolu na DMSO. Aby przygotować roztwór poli PFPA, należy rozpuścić 20 miligramów poli PFPA w dwóch mililitrach DMSO w 20-mililitrowej fiolce scyntylacyjnej.
Aby przygotować roztwór PEG, rozpuść PEG funkcjonalizowany aminą w jednym mililitrze DMSO. Teraz przenieś roztwór PEG do roztworu poli PFPA. Reagować w temperaturze pokojowej przez godzinę, energicznie mieszając.
Przenieś jeden mililitr funkcjonalizowanych kulek dwutlenku krzemu APTES zawieszonych w DMSO do roztworu poli PFPA podstawionego PEG. Pozwól, aby szczepienie między kulkami dwutlenku krzemu funkcjonalizowanymi poli PFPA i APTES przebiegało w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, energicznie mieszając. Następnie wyizolować kulki przez odwirowanie w stężeniu 10 000 G przez pięć minut, po czym następuje usunięcie supernatantu.
Umyj kulki, dodając trzy mililitry DMSO i wymieszaj ręcznie lub z kilkusekundową sonikacją. Odwiruj kulki jak poprzednio. I usuń supernatant przed dwukrotnym powtórzeniem prania DMSO.
Umyj koraliki jeszcze dwukrotnie trzema mililitrami potrójnie destylowanej wody. Następnie wymieszaj ręcznie lub z kilkusekundową sonikacją. Odwirować kulki jak poprzednio i usunąć supernatant.
Na koniec wysusz koraliki w temperaturze 40 stopni Celsjusza w piekarniku próżniowym przez noc. Dodaj pięć miligramów kulek dwutlenku krzemu szczepionego poli PFPA do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Umyj kulki, dodając 800 mikrolitrów PBS i dobrze wymieszaj, wirując.
Odwirować kulki w temperaturze pokojowej 10 000 G przez jedną minutę. Usuń supernatant i powtórz etap mycia trzy razy. Teraz dodaj 350 mikrolitrów świeżego PBS, 50 mikrolitrów 0,1% PBST i 6,67 mikrogramów przeciwciała.
Inkubować około 20 godzin na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj kulki i odwiruj w temperaturze 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę. Następnie usuń supernatant i ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do lizy.
Delikatnie zawiesić kulki, pipetując pięć razy w górę i w dół. Powtórz ten krok prania trzy razy. Po ostatnim przemyciu należy usunąć jak najwięcej supernatantu.
Przygotować komórki i bufor do lizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy z 400 mikrolitrami buforu do lizy. Sonikuj komórki za pomocą ultrasonografu.
Po sonikacji krótko zawirować. Następnie odwirować lizat w temperaturze 20 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.
Aby przeprowadzić immunoprecypitację, należy przenieść 300 mikrolitrów lizatu komórkowego do wcześniej przygotowanych kulek dwutlenku krzemu immobilizowanych przeciwciałami z poli PFPA. Zachowaj 30 mikrolitrów lizatu komórkowego jako próbkę wejściową w nowej probówce do mikrowirówki. Inkubuj mieszaninę kulek lizatu przez trzy godziny na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po inkubacji odwirować mieszaninę w temperaturze 400 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę. Usuń supernatant i ostrożnie dodaj 400 mikrolitrów buforu do mycia. Delikatnie zawiesić kulki, pipetując w górę i w dół około pięć razy.
Po trzech płukaniach usunąć jak najwięcej supernatantu. Dodaj 30 mikrolitrów barwnika ładującego 2x SDS do kulek i do próbki wejściowej. Następnie podgrzewaj je przez 10 minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza.
Po podgrzaniu przeanalizuj próbkę za pomocą western blotting lub przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Funkcjonalizowane kulki krzemionki są badane za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów lub XPS w celu określenia składu powierzchni. Reprezentatywne dane XPS są pokazane tutaj.
Po leczeniu APTES wykrywany jest pik azotu 1s związany ze strefą grupy aminowej APTES. Po poddaniu działaniu poli PFPA wykrywany jest pik fluoru 1s związany z jednostkami PFP na polimerze. Przeprowadza się aktywację kinazy białkowej RNA lub wzbogacenie PKR poprzez immunoprecypitację, a próbka białka jest analizowana za pomocą western blot.
Zgodnie z oczekiwaniami, kulki unieruchomione bez przeciwciał lub z nieswoistą mieszanką przeciwciał nie wykazują powrotu do PKR. Koraliki inkubowane z anty-PKR mogą z powodzeniem wzbogacać PKR, na co wskazuje obecność pasma PKR i brak pasma GAPDH. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że podczas porównywania systemów, eksperymenty z IP, jak również późniejsza analiza western blot, powinny być wykonywane jednocześnie.
Po opracowaniu technika ta może być stosowana do unieruchamiania różnych substratów biomolekularnych lub materiałowych. Co więcej, ta metoda ma dodatkową zaletę polegającą na dostosowaniu właściwości powierzchni Tylko do potrzeb każdej aplikacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół przygotowania kulek krzemianowych z wtórnie spreparowanym poli(pentafluorofenyloakrylanem) (poli(PFPA)), które są funkcjonalizowane przeciwciałami do separacji białek poprzez immunoprecypitację.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria biocząsteczk
- Oczyszczanie białek
- Techniki immunoprecypitacji
Tło
- Szczotki z poli(PFPA) są bardzo reaktywne wobec amin.
- Unieruchomienie przeciwciał osiąga się poprzez inkubację w buforowym roztworze.
- Ta metoda ma zastosowania w dostarczaniu leków i wykrywaniu biologicznych celów.
- Kuleczki krzemionkowe są traktowane APTES w celu modyfikacji powierzchni.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia aktywowanych biocząsteczek powierzchni.
- Poprawa procesów oczyszczania białek.
- Wykazanie wszechstronności techniki w różnych zastosowaniach biocząsteczkowych.
Stosowane metody
- Przygotowanie 5% wagowo-objętościowej zawiesiny wodnej cząstek dwutlenku krzemu.
- Połączenie zawiesiny dwutlenku krzemu z APTES i metanolu.
- Inkubacja mieszaniny w celu ułatwienia modyfikacji powierzchni.
- Unieruchomienie przeciwciał na potrzeby późniejszej immunoprecypitacji.
Główne wyniki
- Skuteczna unieruchomienie przeciwciał na funkcjonalizowanych powierzchniach poli(PFPA).
- Skuteczne wiązanie unieruchomionych przeciwciał z antygenami docelowymi.
- Wykazanie przydatności metody do oczyszczania białek.
- Możliwość zastosowania w innych systemach wymagających unieruchomienia biocząsteczek.
Wnioski
- Graftowane kuleczki krzemianowe poli(PFPA) zapewniają solidną platformę do separacji białek.
- Ta technika może być przystosowana do różnych zastosowań biocząsteczkowych.
- Dalsze badania tej metody mogą poprawić systemy dostarczania leków i wykrywania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables the preparation of reactive silica bead surfaces for antibody immobilization, supporting downstream protein purification workflows. The poly(PFPA) grafting strategy provides a tunable platform for biomolecule capture, enhancing target enrichment while minimizing non-specific interactions. Such surfaces improve the reliability and scalability of immunoprecipitation-based assays in early-stage target validation and biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific antigen enrichment using immobilized antibodies.
- Operational Value: Supports functional target validation by reducing background noise in protein interaction studies.
- Predictive Value: Increases confidence in target engagement data through reproducible immunoprecipitation outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized antibody-coated beads suitable for quantitative pull-down assays.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch consistency via XPS and DLS monitoring of surface functionalization.
- Assay Readiness: Facilitates screening workflows by enabling rapid, reversible biomolecule capture under physiological conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical biomarker analysis through consistent IP efficiency.
- Disease-Relevant System: Demonstrated utility in enriching PKR, a kinase involved in stress response pathways relevant to oncology and neurodegeneration.
- Risk Mitigation: Reduces false positives in target de-risking by minimizing non-specific protein binding.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling antigen capture for mechanistic studies and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via specific antigen enrichment from complex lysates.
- Screening: Enables assay standardization through quantifiable antibody immobilization and antigen recovery.
- Analytics: Generates measurable outputs (e.g., Western blot signal) for comparing binding conditions and antibody performance.
- Translational Research: Connects early target validation to preclinical continuity through reproducible IP efficiency.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable surface chemistry platform adaptable to multiple antibody targets and purification scales.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through specific antigen enrichment and low background.
- Operational Value: Delivers reproducible surface functionalization verifiable by XPS and particle sizing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing predictive confidence in target-disease relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reliable immunoprecipitation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and biomolecular immobilization techniques.
- Needs access to XPS, DLS, centrifugation, and Western blotting infrastructure.
- Demands standardization across teams for consistent APTMS and poly(PFPA) grafting efficiency.
- Requires adaptation testing when applying to non-antibody biomolecules or alternative bead substrates.
- Limited by the need for amine-containing ligands for PFP exchange, restricting direct use with non-aminoisurface chemistries.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
Preparation of Poly(PFPA) Functionalized SiO2 Beads
2:31
Preparation of SiO2 Beads Grafted with PEG-Substituted Poly(PFPA)
4:06
Antibody Immobilization on Poly(PFPA) Grafted SiO2 Beads
5:20
Cell Lysis and Immunoprecipitation
7:00
Results: Analysis of Poly (pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification
8:09
Conclusion
