Name: Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę nanoiniekcji do ustalania infekcji wirusowej u Drosophila melanogaster. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dawki wirusa i analizę interakcji gospodarz-wirus w badaniach nad chorobami zakaźnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować całemu laboratorium Pan w IPS. CAS. Dziękujemy dr Lanfeng Wang (IPS, CAS) za pomoc w eksperymentach oraz dr Gonalo Cordova Steger (Springer nature), dr Jessice VARGAS (IPS, Paryż) i dr Seng Zhu (IPS, Paryż) za komentarze. Prace te były wspierane przez granty z Programu Badań Priorytetowych Strategicznych Chińskiej Akademii Nauk dla L.P (XDA13010500) i H.T (XDB29030300), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin dla L.P (31870887 i 31570897) oraz J.Y (31670909). L.P jest członkiem CAS Youth Innovation Promotion Association (2012083).

UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentu, użyte linie komórkowe i muchy nie mogą być skażone innymi patogenami, szczególnie dla wirusów takich jak DCV, FHV, wirus Drosophila X (DXV) i wirus ptasiego zapalenia nerek (ANV). Idealnie byłoby, gdyby sekwencjonowanie RNA lub prostsza identyfikacja oparta na PCR były używane do wykrywania zanieczyszczenia10,45. Jeśli doszło do skażenia, linie komórkowe i muchy nie powinny być już używane, dopóki nie zostaną całkowicie odkażone46.
1. Przygotowanie do wirusa i muchy
<ol>
	<li>Rozprzestrzenianie się i zbieranie wirusów 
	UWAGA: Komórki Drosophila S2* są używane do propagacji i miareczkowania DCV. Linia komórkowa S2* pochodzi z pierwotnej hodowli zarodków D. melanogaster w późnym stadium rozwoju. Ta linia komórkowa została dobrze opisana wcześniej47.
	<ol>
		<li>Hodować komórki S2* w pożywce Drosophila firmy Schneider w temperaturze 25 °C bez dodatkowego CO2 , jako luźną, półprzylegającą monowarstwę w 10 cm naczyniu do hodowli komórkowej, w gęstości 1 x 107 żywotnych komórek/ml. Użyj kompletnej pożywki dla komórek S2*: Pożywki Drosophila firmy Schneider zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml Streptomycyny. 
		UWAGA: Zdrowe komórki powinny mieć okrągły kształt i jednorodną wielkość.</li>
		<li>Szybko rozmrozić materiał DCV od -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C. Natychmiast zainfekować komórki S2* DCV przy MOI = 0,01, bezpośrednio dodając 1 ml roztworu wirusa do szalek do hodowli komórkowych (obszar wzrostu: 55 cm2) z 10 ml kompletnej pożywki dla komórek S2*.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 25 °C przez 3 do 5 dni. Kiedy wirus jest gotowy do pobrania, morfologia komórek jest nieprawidłowa (kształt komórki wygląda na rozmyty), a pożywka hodowlana jest pełna czarnych cząstek wskazujących na szczątki komórkowe.</li>
		<li>Zebrać całą hodowlę komórkową do probówki o pojemności 15 ml, pipetując w górę i w dół, i zamrozić w temperaturze -80 °C (przez okres do roku). 
		UWAGA: DCV może być przechowywany przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C przy minimalnej utracie zakaźności, przez okres do jednego roku.</li>
		<li>Rozmrozić hodowlę komórkową w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C i stale wstrząsać, a następnie odwirować przy 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować. Podwielokrotność do 200 μl roztworu wirusa na probówkę. 
		UWAGA: Podwielokrotności wirusa mogą być przechowywane przez krótkie okresy do 3 dni w temperaturze 4 °C i do 1 roku w temperaturze -80 °C. Należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Zawsze lepiej jest użyć całej podwielokrotności na raz.</li>
		<li>Wybierz 5 losowych probówek zawierających wirusa, aby określić średnią dawkę infekcyjną kultury tkankowej wirusa (TCID50) za pomocą testu efektu cytopatycznego (CPE) (1 jednostka TCID50 = 0,7 jednostki tworzącej płytkę [PFU]). 
		UWAGA: CPE odnosi się do zmian strukturalnych w komórkach gospodarza spowodowanych inwazją wirusa. Infekujący wirus powoduje lizę komórki gospodarza lub gdy komórka umiera bez lizy z powodu niezdolności do rozmnażania48.
		<ol>
			<li>W dniu 1 należy zebrać przygotowane komórki S2* za pomocą pipetowania. Policz numer komórki. Odwirować komórki przez 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki do gęstości 1 x 106 komórek/ml kompletnym podłożem dla komórek S2*, jak opisano w kroku 1.1.1.</li>
			<li>Wysiewaj 1 x 105 komórek S2 * (100 μL) na studzienkę do 96-dołkowej płytki o płaskim dnie (~ 30% konfluencji).</li>
			<li>Wykonaj seryjne 10-krotne rozcieńczenia materiału DCV za pomocą kompletnego podłoża dla ogniw S2*. Dodać 50 μl rozcieńczeń do studzienki. Dodać 50 μl pożywki hodowlanej bez wirusa do studzienki sklasyfikowanej jako studzienka kontroli ujemnej. 
			UWAGA: Dla każdej szybkości rozcieńczenia użyto 8 studzienek. Ponieważ typowa wydajność DCV wynosi około 108-10 9 PFU/ml, rozcieńczenie powinno obejmować co najmniej ~10-5-10-10.</li>
			<li>W 4 dniu obserwuj CPE za pomocą mikroskopu jasnego pola z obiektywem 20X lub 40X. Sklasyfikuj studzienkę, w której komórki wyglądają na rozmyte, a podłoże jest pełne fragmentów, jako "studnię dodatnią", a studzienkę, w której morfologia komórki jest normalna, jako "studnię ujemną".</li>
			<li>Oznacz dodatnie lub ujemne dołki CPE odpowiednio + lub –. Oblicz TCIDwirusa 50 metodą Reeda i Muencha49.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyrzuć wszystkie zanieczyszczone materiały i rękawice do miski odkażającej. Jeśli wirus nie może osiągnąć pożądanego TCID50, należy zagęścić 100 ml roztworu wirusa, odwirowując go przy 68 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W zależności od celu eksperymentu, do infekcji wirusowej można zastosować zakres dawek od 102 do 106 jednostek TCID50. Zazwyczaj używamy 3 x 106 jednostek TCID50.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml buforu Tris-HCl (10 mM, pH 7,2). Podaniec 20 μl roztworu wirusa na probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. Wybrać 5 losowych probówek, aby ponownie określić średni TCIDwirusa 50.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparat na muchy do infekcji 
	UWAGA: Symbiotyczne bakterie Wolbachia mogą tłumić wiele rodzajów infekcji wirusem RNA u owadów30,31,32,33,41. Dlatego tak ważne jest, aby oczyścić Wolbachię z much przed badaniem infekcji wirusem gospodarza in vivo33.
	<ol>
		<li>Przygotować pokarm na muchy zawierający tetracyklinę, dodając 400 μl 50 μg/ml tetracykliny (w 70% etanolu) do 4 g świeżej standardowej karmy na muchy z mąki kukurydzianej (1 l karmy zawiera 77,7 g mąki kukurydzianej, 32,19 g drożdży, 10,6 g agaru, 0,726 g CaCl2, 31,62 g sacharozy, 63,3 g glukozy, 2 g sorbinianu potasu i 15 ml 5% C8H8O3). Dokładnie wymieszaj i umieść żywność w temperaturze 4 °C na noc, aby odparować etanol. 
		UWAGA: Wysoka dawka etanolu może wpływać na płodność much, więc NIE pomijaj tego kroku.</li>
		<li>Podgrzej pokarm do temperatury pokojowej i umieść nowo zamknięte dorosłe muchy (20 samic i 10 samców) w fiolce. Rozmnażaj muchy w temperaturze 25 °C, wilgotności 60% w normalnym cyklu jasny/ciemny. 
		UWAGA: Zazwyczaj muchy potrzebują 3-4 dni, aby złożyć wystarczającą ilość jaj. Zbyt duża liczba jaj hamuje rozwój larw i zmniejsza wydajność tetracykliny.</li>
		<li>Zbierz nowo zamknięte dorosłe muchy (w ciągu 3 ~ 5 dni) pod lekkim przepływem CO2 i powtórz krok ~ 1.2.1-1.2.2. Zazwyczaj do całkowitego wyeliminowania Wolbachii potrzebne są co najmniej 3 pokolenia</li>.
		<li>Po 3 pokoleniach z leczeniem tetracykliną zbierz 5 much pod lekkim przepływem CO2 do testu infekcji Wolbachia. Miel muchy przez 1 minutę z 250 μl podwójnie destylowanej wody (ddH2O) i kilkoma sterylnymi kulkami ceramicznymi o średnicy 0,5 mm w probówce o pojemności 1,5 ml za pomocą homogenizatora. Dodać kolejne 250 μL 2x buforu A (0,2 M Tris-HCl, pH 9,0; 0,2 M EDTA; 2% SDS) do próbki i wirować. 
		UWAGA: Ponieważ SDS utrudnia ruch koralików, 1x bufor A nie może być bezpośrednio używany do mielenia much. Jeśli muchy mają czerwone oczy, usuń głowy przed zmieleniem, ponieważ może to wpłynąć na kolor produktu DNA.</li>
		<li>Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C (przechowywać przez okres do jednego roku). Szybko rozmrozić próbkę w temperaturze od -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C aż do rozpuszczenia. Próbki należy inkubować w temperaturze 70 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Dodać 190 μl 5 M KOAc, odwirować i inkubować na lodzie przez 15 minut lub dłużej.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, zebrać supernatant i przenieść je do nowych probówek.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.2.7, aby uzyskać DNA o lepszej jakości.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 750 μl izopropanolu i delikatnie odwrócić kilka razy ręcznie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Biała osadka genomowego DNA pozostanie na dnie probówki.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 70% etanolu do granulek, odwiruj przy 13 000 x g przez 5 minut i wyrzuć supernatant. Wysusz DNA na powietrzu, aż stanie się przezroczyste.</li>
		<li>Rozpuścić DNA w 100 μlddH2O, miareczkować stężenie DNA za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej UV-Vis i rozcieńczyć DNA do 100 ng/μl.</li>
		<li>Do reakcji PCR należy użyć 200 ng DNA (w systemie 20 μl, patrz tabela materiałów). Wykonać PCR według następującego programu: 95 °C przez 15 min; 36 cykli w temperaturze 95 °C przez 45 s, 50 °C przez 45 s i 72 °C przez 1 min; i końcowy etap przedłużania (72 °C przez 1 min) w termocyklerze. 
		UWAGA: W oparciu o rRNA Wolbachia 16S użyj następujących starterów: 5' TGAGGAAGATAATGACGG 3' (do przodu) i 5' CCTCTATCCTCTTTCAACC 3' (do tyłu). Dla wsp podstawkami były 5' CATTGGTGTTGGTGTGTGTGTGTGTGGTG 3' (do przodu) i 5' ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3' (do tyłu).</li>
		<li>Analizuj produkty PCR z 1% elektroforezą w żelu agarozowym. Wielkość produktu PCR Wolbachia 16S rRNA i wsp wynosi odpowiednio około 200 pz i 600 pz.</li>
		<li>Tylna mucha Wolbachia na standardowych muchach z mąki kukurydzianej. Zbieraj 3-5 dni, nowo zamknięte samce much na infekcję. 
		UWAGA: Leczenie tetracykliną może również wpływać na skład mikrobioty jelitowej, co z kolei wpływa na odpowiedź przeciwwirusową gospodarza. Zalecamy, aby wszystkie muchy otrzymywały te same zabiegi tetracyklinowe. Utrzymuj muchy wolne od Wolbachii w standardowych warunkach przez co najmniej 3 pokolenia, aby przywrócić mikrobiotę jelitową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genotypowanie pastrelu 
	UWAGA: Doniesiono, że obecność allelu S lub R genu pst w tle genetycznym wpływa na zakażenie DCV u Drosophila34,35. Konieczne jest sprawdzenie genotypu pst, szczególnie w przypadku zakażenia DCV. W pst jest kilka SNP, które mogą wpływać na infekcję wirusową, głównym SNP jest 512C/T. PCR z gradientem temperatury to szybka metoda identyfikacji genotypu pst.
	<ol>
		<li>Wyodrębnić genomowe DNA muchy, jak opisano powyżej (kroki 1.2.4 - 1.2.15).</li>
		<li>Użyj 100 ng DNA jako matrycy, startera 512C, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTC 3' (do przodu) i 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (do tyłu) do wykrycia allelu R, startera 512T, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTT 3' (do przodu) i 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (do tyłu), aby wykryć allel S.</li>
		<li>Ustaw gradienty Tm (temperatury topnienia) w następujący sposób: 54 °C, 54,7 °C, 55,5 °C, 58 °C, 59,7 °C, 62,2 °C, 63,7 °C i 64 °C (45 s w każdej temperaturze). 
		UWAGA: Zalecane jest 30 cykli reakcji łańcuchowej PCR (system 20 μL).</li>
		<li>Wizualizacja produktu PCR 100-pz za pomocą 2% elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Infekcja wirusowa u Drosophila
<ol>
	<li>Zakażone muchy za pomocą nanoiniekcji i wykonujące testy przeżycia.
	<ol>
		<li>Pociągnij kapilary, aby przygotować igły do wstrzykiwań, napełnij igłę do wstrzykiwań olejem i zmontuj wtryskiwacz zgodnie z wcześniejszym opisem50.</li>
		<li>Znieczulenie much na podkładce pod lekkim strumieniem CO2 . Zaszczepić muchy przez wstrzyknięcie do klatki piersiowej44 z 50,6 nL roztworu wirusa (100 PFU, rozcieńczony buforem Tris-HCl, pH 7,2). Wstrzyknąć co najmniej 3 fiolki z muchami (20 much na fiolkę). 
		UWAGA: Wstrzyknięcie jest czasochłonne (zwykle 100 much na godzinę), a replikacja DCV jest bardzo szybka, dlatego bardzo ważne jest, aby zapisać dokładny czas na probówce po zakończeniu każdej fiolki (20 much). Wstrzykiwanie tylko buforu jest ustawiane jako pozorowana kontrolka. Zazwyczaj preferowane są dorosłe samce, ponieważ wyniki są bardziej stabilne i powtarzalne niż w przypadku samic, ponieważ zmiany hormonalne podczas krycia i reprodukcji mogą wpływać na odczyt samic51.</li>
		<li>Hoduj wstrzyknięte muchy w temperaturze 25 °C, 60% wilgotności w normalnym cyklu światła/ciemności. Codziennie zaopatruj muchy w świeży pokarm i rejestruj liczbę martwych much.</li>
		<li>Wykonaj co najmniej 3 powtórzenia biologiczne i wykreśl krzywą przeżycia.</li>
		<li>W celu analizy statystycznej danych dotyczących przeżycia należy wygenerować krzywe przeżycia Kaplana-Meiera za pomocą oprogramowania statystycznego. Wykonaj test log-rank, aby obliczyć wartości P. W tabeli przetrwania wprowadź informacje dla każdego tematu. Następnie oprogramowanie oblicza procent przeżycia za każdym razem i kreśli wykres przeżycia Kaplana-Meiera. 
		UWAGA: NIE dodawać dodatkowych drożdży do fiolki. W porównaniu z próbnymi kontrolami, muchy zakażone DCV czasami mają wodobrzusze i są niezdarne, co czyni je podatnymi na lepkie drożdże. Lepiej jest zapisać więcej punktów czasowych we wstępnym eksperymencie, aby dowiedzieć się, w jakich ramach czasowych nastąpi masowa śmierć zarażonych much. Ogólnie rzecz biorąc, zainfekowane muchy rzadko umierają w ciągu pierwszych dwóch dni, nawet w przypadku zmutowanych linii Dcr-2. W przypadku muchy Wolbachia free w1118 (Bloomington 5905) zakażonej 100 PFU DCV, to okno czasowe wynosi około 3-5 dni po zakażeniu. Muszki owocówki, które umierają w ciągu 0,5 godziny po wstrzyknięciu, nie powinny być liczone jako śmiertelne, ponieważ mogą zostać zabite przez zranienie igłą, a nie przez infekcję wirusową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar obciążenia DCV za pomocą testu CPE 
	UWAGA: Miano wirusa mierzy się podobnie jak w przypadku miareczkowania zapasu wirusa (etap 1.1.6), ale wymaga dodatkowego przygotowania próbki (etap 2.2.1-2.2.4).
	<ol>
		<li>W dniu 1 zainfekuj samce much, jak opisano w kroku 2.1.1-2.1.2. Muchy wstrzykuje się grupowo w grupy po 20 osób i utrzymują je rosnące na świeżym pokarmie dla much przez pożądany czas (zwykle przez 24 godziny lub 3 dni). Codziennie dostarczaj muchom świeży pokarm.</li>
		<li>W dniu 2 wysiewać komórki Drosophila S2* w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej do gęstości około 5 x106 do 1x107 komórek/ml, jak opisano w kroku 1.1.1.</li>
		<li>W dniu 3 zbierz 5 much (pod lekkim przepływem CO2 ) i zmiel je w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 30 sekund z 200 μl buforu Tris i kulkami ceramicznymi za pomocą homogenizatora. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejść do następnego etapu.</li>
		<li>Dokładnie zwirować próbkę. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml i filtra 0,22 μm, aby przefiltrować supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Kontynuować miareczkowanie zgodnie z opisem w krokach 1.1.6.1-1.1.6.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obciążenie DCV mierzone metodą qRT-PCR 
	<ol>
		<li>W dniu 1 zainfekuj muchy, jak opisano powyżej. Samce much wstrzykuje się w grupy (20 much / grupę) i rosną na świeżym pokarmie dla much przez pożądany czas, zwykle przez 24 godziny lub 3 dni. Codziennie dostarczaj muchom świeży pokarm.</li>
		<li>W dniu 3 zbierz 5 much pod lekkim przepływem CO2 w probówce o pojemności 1,5 ml z 200 μl buforu do lizy i 20 kulkami ceramicznymi (średnica = 0,5 mm), miel próbki za pomocą homogenizatora z dużą prędkością przez 30 s. Do każdej probówki dodaj 800 μl dodatkowego buforu do lizy i przechowuj próbki w temperaturze -80 °C lub natychmiast przeprowadź ekstrakcję RNA i qRT-PCR.</li>
		<li>Przygotuj końcówki, rurki wolne od RNaz i dejonizowaną, nasączoną dietylowęglanem (DEPC) i przefiltrowaną membranowo o sile 0,22 μm. Dodać 200 μl chloroformu (≥99,5%) do próbki i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 s. Inkubować przez 5 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej, aż faza wodna i faza organiczna zostaną wyraźnie oddzielone. 
		UWAGA: Chloroform jest niezwykle niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. NIE należy wirować próbki, ponieważ zwiększa to ryzyko zanieczyszczenia DNA.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać 400 μl supernatantu i przenieść supernatant do nowych probówek. Zmieszać z izopropanolem o tej samej objętości (≥ 99,5%), delikatnie odwrócić próbki ręcznie 20 razy, a następnie wytrącić przez 10 minut lub dłużej w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Opady w temperaturze -20 °C zwiększą wydajność RNA.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki widoczne są białe granulki RNA.</li>
		<li>Wyrzuć supernatant i dodaj 1 ml 70% etanolu (etanol w wodzie DEPC) i odwróć kilka razy, aby przemyć RNA.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i suchy RNA na 5-10 minut; RNA powinno stać się przezroczyste.</li>
		<li>Dodać 50 μl wody DEPC do próbki, kilkakrotnie pipetować i odwirować.</li>
		<li>Weź 3 μl RNA do miareczkowania stężenia RNA. Określ ilościowo RNA przy długości fali 260 nm. Zwykle stężenie RNA ekstrahowane za pomocą tego protokołu wynosi około 100-500 μg/μL, co jest odpowiednie do syntezy cDNA.</li>
		<li>Użyj 2 μg RNA do syntezy cDNA. Rozcieńczyć próbkę do 100 μl roztworemddH2O i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wykonaj qRT-PCR zgodnie z instrukcjami producenta i uruchom qRT-PCR. 
		UWAGA: Do syntezy cDNA DCV losowe startery działały znacznie lepiej niż starter Poly A w naszych rękach. Ekspresja mRNA DCV jest znormalizowana do mRNA endogennego białka rybosomalnego 49 (rp49). Startery oligonukleotydowe stosowane w tej części: rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (do przodu) i 5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (do tyłu); DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (do przodu) i 5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (do tyłu); vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (do przodu) i 5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (do tyłu); indukowany przez wirusa RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (do przodu) i 5' GATTACAGCTGGGTGCACACA 3' (do tyłu).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiamy szczegółową procedurę, w jaki sposób ustalić wirusowy system zakaźny u dorosłego Drosophila melanogaster za pomocą nanoiniekcji. Protokoły obejmują przygotowanie odpowiednich linii muchowych i stada wirusów, techniki infekcji, ocenę wskaźników zakaźnych i pomiar odpowiedzi przeciwwirusowej. Chociaż DCV jest używany jako przykład patogenu wirusowego, dziesiątki różnych rodzajów wirusów zostały z powodzeniem zastosowane do badań w systemie Drosophila. Ponadto dzięki badaniom przesiewow...

Pojawiające się infekcje wirusowe, zwłaszcza przez arbowirusy, takie jak wirus Chikungunya1, wirus dengi, wirus żółtej febry2 iwirus Zika3, stanowią ogromne zagrożenie dla zdrowia publicznego, powodując pandemie4. W związku z tym lepsze zrozumienie interakcji wirus-gospodarz staje się coraz ważniejsze dla kontroli epidemii i leczenia chorób wirusowych u ludzi. W tym celu należy stworzyć bardziej odpowiednie i wydajne modele w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw infekcji wirusowej.
Muszka owocowa, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), dostarcza potężnego systemu do badania interakcji wirus-gospodarz5,6 i okazała się jednym z najbardziej efektywnych modeli do badania ludzkich chorób wirusowych7,8,9. Wysoce konserwatywne przeciwwirusowe szlaki sygnałowe i niezrównane narzędzia genetyczne sprawiają, że muchy są doskonałym modelem do uzyskiwania znaczących wyników z realnymi implikacjami dla badań przeciwwirusowych na ludziach. Ponadto muchy są łatwe i niedrogie w utrzymaniu w laboratorium i są wygodne do badań przesiewowych na dużą skalę nowych czynników regulacyjnych6,10 w wirusie i gospodarzu podczas infekcji.
Cztery główne, wysoce konserwatywne szlaki przeciwwirusowe (np. szlak interferencji RNA (RNAi) class11, szlak JAK-STAT12, szlak NF-κB i szlak autofagii13) są dobrze zbadane u Drosophila w ostatnich latach6. Szlak RNAi jest szerokim mechanizmem przeciwwirusowym, który może tłumić większość rodzajów infekcji wirusowych6,14. Zakłócenie tego szlaku przez mutację w genach takich jak Dicer-2 (Dcr-2) lub Argonaute 2 (AGO2) może prowadzić do zwiększonego miana wirusa i śmiertelności gospodarza15,16,17. Szlak JAK-STAT jest zaangażowany w kontrolę infekcji wirusem z rodziny Dicistroviridae i rodziny Flaviviridae u owadów, np. wirusa Drosophila C (DCV) u much16 oraz wirusa Zachodniego Nilu (WNV) i wirusa dengi u komarów18,19. Szlaki Drosophila Toll (homologiczne do ludzkiego szlaku NF-κB) i niedoboru odporności (IMD) (podobne do ludzkiego szlaku NF-κB i TNF) są zaangażowane w obronę inwazji wirusa20,21,22. Autofagia to kolejny konserwatywny mechanizm zaangażowany w regulację infekcji wirusowej, który jest dobrze scharakteryzowany u Drosophila23,24. W ten sposób identyfikacja nowych czynników regulacyjnych tych szlaków i analiza wzajemnych przesłuchów między tymi sygnalizacjami przeciwwirusowymi a innymi szlakami biologicznymi, takimi jak metabolizm, starzenie się, reakcje neuronalne i tak dalej, może być łatwo skonfigurowana w systemie Drosophila.
Chociaż większość dobrze znanych modeli infekcji wirusowych u Drosophila jest indukowana przez wirusy RNA, infekcja wirusami opalizującego wirusa bezkręgowców 6I (IV-6) i Kallithea wykazała potencjał do badania wirusów DNA u muszek25,26. Co więcej, wirus może być również modyfikowany tak, aby umożliwić infekcję Drosophila, taką jak wirus grypy9. To znacznie rozszerzyło zastosowanie platformy do badań przesiewowych Drosophila. W tej procedurze używamy DCV jako przykładu, aby opisać, jak rozwinąć wirusowy system zakaźny u Drosophila. DCV to jednoniciowy wirus RNA o dodatnim sensie, składający się z około 9300 nukleotydów, kodujących 9 białek27. Jako naturalny patogen D. melanogaster, DCV jest uważany za odpowiedniego wirusa do badania fizjologicznej, behawioralnej i podstawowej odpowiedzi immunologicznej gospodarza podczas interakcji gospodarz-wirus i koewolucji28. Dodatkowo, jego szybka śmiertelność po zakażeniu u much dzikich sprawia, że DCV jest przydatny do badań przesiewowych pod kątem opornych lub podatnych genów w klasie host<sup="xref">29.
Jednakże, istnieje kilka aspektów budzących niepokój podczas badania infekcji wirusowych u Drosophila. Na przykład symbiotyczne bakterie Wolbachia mają zdolność hamowania szerokiego spektrum proliferacji wirusa RNA u Drosophila i komarów30,31,32. Ostatnie dowody wskazują na możliwy mechanizm, w którym Wolbachia blokuje zakażenie wirusem Sindbis (SINV) poprzez regulację w górę ekspresji metylotransferazy Mt2 w host33. Ponadto tło genetyczne owadów ma również kluczowe znaczenie dla infekcji wirusowej. Na przykład naturalny polimorfizm genu, pastrel (pst), określa podatność na zakażenie DCV u Drosophila34,35, podczas gdy loci Ubc-E2H i CG8492 są zaangażowane odpowiednio w zakażenie wirusem paraliżu świerszcza (CrPV) i wirusem Flock house (FHV)36.
Szczególne sposoby ustalenia interakcji wirus-gospodarz u muszek, muszą być wybrane zgodnie z celami badawczymi, takimi jak wysokoprzepustowe badanie przesiewowe składników komórkowych gospodarza w liniach komórkowych Drosophila37,38, infekcja jamy ustnej w celu zbadania specyficznej dla jelit odpowiedzi przeciwwirusowej22,39,40, nakłuwanie igłą41,42 lub nanoiniekcja poprzez przejście przez bariery nabłonkowe w celu stymulacji ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej. Nano-iniekcja może precyzyjnie kontrolować dawkę wirusa, aby wywołać kontrolowaną reakcję przeciwwirusową i zmianę fizjologiczną43, gwarantując w ten sposób wysoką odtwarzalność eksperymentalną44. W tym badaniu opisujemy metodę nanoiniekcji w celu zbadania interakcji wirus-gospodarz u Drosophila, podkreślając znaczenie efektów tła much.

<table><tbody><tr><td>Filtr 0,22um</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Marka</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml bez RNaz Probówki do mikrowirówek</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>CLS430167</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>100 Probówki zamienne</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>System ABI 7500 qPCR</td><td>ABI</td><td>7500</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Inkubator komórek</td><td>Sanyo</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendof</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendof</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>151858</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>DEPC woda</td><td>Sigma</td><td>95284-100ML</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Inkubator Drosophila</td><td>Percival</td><td>I-41NL</td><td>Hodowla Drosophila</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>12657-029</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>z płaskim dnem 96-dołkowa</td><td>płytka Sigma</td><td>CLS3922</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Bufor do lizy (ekstrakcja RNA)</td><td>Odczynnik Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td>TRIzol</td></tr><tr><td>Bufor do lizy (ekstrakcja RNA próbki cieczy)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296028</td><td>TRIzol LS Mikroskop odczynnikowy</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanolitr Injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Nanoject II o zmiennej objętości (2,3 do 69 nL) Automatyczny wtryskiwacz ze szklanymi kapilarnami (110 V)</td></tr> <tr><td>Optyczny film samoprzylepny</td><td>ABI</td><td>4360954</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płytka qPCR</td> do <td>hodowli komórkowych ABI</td><td>A32811</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S9895</td><td>Oprogramowanie statystyczne do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td></td><td>GraphPad Prism 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransScript Fly Synteza pierwszej nici cDNA SuperMix</td><td>TransScript</td><td>AT301</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>VORTEX 3</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u drosophila melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Rozprzestrzenianie się wirusa jest główną przyczyną chorób epidemicznych. Dlatego zrozumienie interakcji między wirusem a gospodarzem jest bardzo ważne dla poszerzenia naszej wiedzy na temat zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych. Muszka owocowa Drosophila melanogaster okazała się jednym z najbardziej wydajnych i produktywnych organizmów modelowych do badań przesiewowych pod kątem czynników przeciwwirusowych i badania interakcji wirus-gospodarz, dzięki potężnym narzędziom genetycznym i wysoce konserwatywnym wrodzonym szlakom sygnalizacji immunologicznej. Opisana tutaj procedura demonstruje metodę nanoiniekcji w celu ustalenia infekcji wirusowej i wywołania ogólnoustrojowej odpowiedzi przeciwwirusowej u dorosłych muszek. Precyzyjna kontrola dawki iniekcyjnej wirusa w tej metodzie umożliwia wysoką odtwarzalność doświadczalną. Protokoły opisane w tym badaniu obejmują przygotowanie much i wirusa, metodę wstrzykiwania, analizę wskaźnika przeżycia, pomiar obciążenia wirusem oraz ocenę szlaku przeciwwirusowego. Wspomniano tu o wpływie infekcji wirusowej na pochodzenie much. Ta metoda infekcji jest łatwa do wykonania i ilościowo powtarzalna; Może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem czynników gospodarz/wirus zaangażowanych w interakcję wirus-gospodarz oraz do analizy wzajemnych oddziaływań między wrodzoną sygnalizacją immunologiczną a innymi szlakami biologicznymi w odpowiedzi na infekcję wirusową.

Wyniki tej sekcji uzyskano po zakażeniu D. melanogaster wirusem DCV. Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy infekcji wirusowej u Drosophila. Muchy są poddawane iniekcji wewnątrztorakalnej, a następnie pobierane są próbki do pomiaru TCID50 wirusa oraz poziomu RNA genomowego (Rysunek 1). Infekcja wirusowa może indukować lizę komórek, a efekt cytopatyczny (CPE) obserwuje się 3 dni po zakażeniu (Rysunek 2A). Obciążenie wirusowe zmierzone testem CP...

Ten protokół opisuje, jak ustalić infekcję wirusową in vivo u Drosophila melanogaster przy użyciu metody nanoiniekcji i podstawowych technik analizy interakcji wirus-gospodarz.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji wirus-gospodarz dotyczące tego, jak skutecznie ustalić infekcję wirusową u Drosophila melanogaster. Ta metoda nanoiniekcji pozwala na precyzyjną kontrolę dawki infekcji wirusem i może być łatwo stosowana w przypadku zakażeń innymi patogenami drobnoustrojowymi. Zacznij od wyhodowania jednej razy 10 do siódmej żywotnej komórki gwiaździstej S2 na mililitr jako luźnej, półprzylegającej monowarstwy w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek z 10 mililitrami kompletnego podłoża Schneider's Drosophila Medium bez dodatkowego dwutlenku węgla w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Podczas inkubacji ponownie zawiesić świeżo rozmrożony wirus Drosophila C lub DCV do wielokrotności infekcji 0,01 w jednym mililitrze kompletnej pożywki i dodać roztwór wirusa do szalek z kulturami komórkowymi. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza na trzy do pięciu dni. Wirus jest gotowy do pobrania, gdy morfologia komórek wygląda na rozmytą, a pożywka hodowlana jest pełna czarnych cząstek wskazujących na szczątki komórkowe.Wymieszać supernatant przez odpipetowanie kilka razy przed przeniesieniem całej kultury komórkowej do 15-mililitrowej probówki w celu lizy komórek gospodarza w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wytworzyć robocze stężenia wirusa, należy rozmrozić zawiesinę komórkową w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przed granulowaniem resztek komórkowych przez odwirowanie. Następnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu wirowania i podwielokrotności do 200 mikrolitrów roztworu wirusa na probówkę.Aby określić średnią dawkę infekcyjną kultury tkankowej wirusa, najpierw wysiewa się jeden razy 10 do pięciu komórek gwiazdowych S2 w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki do ośmiu dołków na kolumnę w 12 rzędach płytki 96-dołkowej. Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Losowo wybierz pięć probówek z wirusem z pamięci przechowywanej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Podczas gdy komórki osiadają, napełnij 10 sterylnych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych 450 mikrolitrami sterylnego kompletnego podłoża i dodaj 50 mikrolitrów bulionu wirusa do pierwszej 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 450 mikrolitrów sterylnej kompletnej pożywki, rozcieńczając zawiesiny 10-krotnie na krok do 12. dołka. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do odpowiedniego dołka w każdej kolumnie dla tej probówki z wirusem i dodać 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez wirusa do jednego dołka na kolumnę jako studzienkę kontroli ujemnej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza na trzy dni i oceń efekt cytopatyczny każdego materiału wirusa pod mikroskopem Brightfield przy 20-krotnym powiększeniu dziennie.Studzienkę, w której komórki wyglądają na rozmyte, a podłoże jest pełne fragmentów, należy sklasyfikować jako studnię dodatnią, a studzienkę, w której morfologia komórki jest normalna, jako studzienkę ujemną. Przed hodowlą dokładnie wymieszaj 400 mikrolitrów 50 mikrogramów na mililitr tetracykliny z czterema gramami świeżego standardowego pokarmu na muchy z mąki kukurydzianej i umieść pokarm w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc, aby odparować etanol. Następnego ranka podgrzej pokarm do temperatury pokojowej i umieść pokarm wraz z 20 samicami i 10 samcami nowo zamkniętych dorosłych much w fiolce hodowlanej na trzydniową do czterodniowej inkubacji hodowlanej w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60% w normalnym cyklu światło/ciemność.Po złożeniu wystarczającej ilości jaj zbierz nowo zamknięte dorosłe muchy pod lekkim strumieniem dwutlenku węgla i ponownie rozmnażaj Drosophila jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano. Po trzech pokoleniach leczenia tetracykliną zbierz pięć much pod lekkim strumieniem dwutlenku węgla i homogenizuj muchy za pomocą 250 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i kilku 0,5 milimetra sterylnych kulek ceramicznych. Po jednej minucie dodaj 250 mikrolitrów 2X buforu A do próbki w celu wirowania przed zamrożeniem próbek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Następnie szybko rozmrozić próbki z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza, a następnie 30-minutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza przed ekstrakcją genomowego DNA i amplifikacją DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy zgodnie ze standardowymi protokołami. Potwierdź brak małego RNA Wolbachia 16 i wsp w każdym homogenacie muchy za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie hoduj stado much wolne od Wolbachii na standardowym pokarmie dla much z mąki kukurydzianej, jak pokazano.W przypadku infekcji wirusowej należy najpierw użyć mikroskopu stereoskopowego i cienkich kleszczy, aby złamać końcówkę szklanej igły kapilarnej do odpowiedniej średnicy do nanoiniekcji. Aby zmontować wtryskiwacz, umieść sufitowy O-ring i białą przekładkę na metalowym tłoku wtryskiwacza z dużym wgłębieniem skierowanym na zewnątrz. Za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 napełnić szklaną igłę olejem mineralnym i umieścić igłę przez kołnierz.Umieść większy O-ring wokół podstawy kołnierza około jednego milimetra od końca igły i zamontuj igłę na tłoku wtryskiwacza. Przymocować igłę do tłoka i nacisnąć pusty przycisk, aby wysunąć tłok mikrowstrzykiwacza, aż usłyszysz sygnał dźwiękowy. Teraz naciśnij przycisk FILL, aby cofnąć tłok na pięć milimetrów i zanurz igłę w zawiesinie wirusowej tworzącej 100 płytek nazębnych.Delikatnie wstrząśnąć jedną lub co najmniej trzema fiolkami z 20 samcami Drosophila niezawierającymi Wolbachii na naczyniu do wstrzykiwań. Samce obdarowane muchami są preferowane podczas krycia, a rozmnażanie może wpływać na samice. Następnie wstrzyknąć do klatki piersiowej każdej muchy 50,6 nanolitrów roztworu wirusa w nieco jaśniejszy obszar między mezopleurą a pteropleurą i zmierzyć obciążenie DCV za pomocą testu efektu cytopatycznego i ilościowego RT PCR od muszek naziemnych, jak właśnie pokazano.Po wstrzyknięciu należy ostrożnie przenieść muchy do świeżej fiolki i umieścić fiolkę w pozycji poziomej, aby zapobiec przywieraniu much do podłoża podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Wstrzyknięcie jest czasochłonne, ale replikacja DCV jest bardzo szybka, dlatego bardzo ważne jest, aby zapisać dokładny czas na probówce po wstrzyknięciu wszystkich much z każdej fiolki. Zakażenie wirusem może indukować lizę komórek, a efekty cytopatyczne obserwuje się po trzech dniach od zakażenia.Startery Wolbachia 16s, rRNA i wsp mogą być używane do wykrywania obecności Wolbachia i Drosophila, jak wykazano. Muchy wolne od Wolbachii wykazują znacznie obniżoną przeżywalność po zakażeniu DCV i w sposób zależny od dawki. DCV aktywuje przeciwwirusowe szlaki sygnałowe w gospodarzu, które są krytyczne dla infekcji przeciwwirusowej u Drosophila, o czym świadczy zmniejszona przeżywalność i zwiększone miano wirusa u zmutowanych muszek Dicer-2.Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że zakażenie genotypem Wolbachia może wpływać na podatność much Drosophila melanogaster na zakażenie DCV. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak genetyczne badanie przesiewowe na większą skalę, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące niedostatecznie zdefiniowanych genów gospodarza wymaganych do infekcji wirusowej lub odpowiedzi przeciwwirusowej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami wirusowymi u ludzi do zbadania mechanizmów leżących u podstaw wybuchów endemicznych infekcji wirusowych u ludzi w modelu Drosophila melanogaster.Nie zapominaj, że praca z wirusem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego.

establishment-viral-infection-analysis-host-virus-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Źródło: Siva-Jothy, J. A. i inni. Infekcja bakteryjna jamy ustnej i wypadanie u Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)Film pokazuje infekcję jamy ustnej Drosophila melanogaster bakteriami patogennymi. Obejmuje przygotowanie fiolek z infekcją oraz przenoszenie głodnych much w celu umożliwienia spożycia bakterii. Procedura obejmuje kolonizację jelit, następnie sterylizację powierzchniową i homogenizację much. Na koniec pokazuje ilościowe określenie wewnętrznego obciążenia bakteryjnego...

Zakażenie jamy ustnej Drosophila melanogaster bakteriami patogennymi

Źródło: Hiroyasu, A., D i in., Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do zakażeń drobnoustrojowych i analiza. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wywoływania infekcji bakteryjnej u larw Drosophila poprzez umieszczenie ich w kropli bakteryjnej i nakłucie igłą wolframową. Larwy są następnie wysiadane na rowkowatej, bogatej w składniki odżywcze płytce agarowej w celu badania interakcji żywiciel-patogen.

Ustanowienie infekcji bakteryjnej u larw Drosophila

W tym filmie opisujemy procedurę polegającą na wykonaniu nano-iniekcji jednoniciowego wirusa RNA o pozytywnym sensie do dorosłego samca muszki Drosophila, a następnie badaniu odpowiedzi przeciwwirusowych zainicjowanych w wyniku infekcji. Analiza reakcji łańcuchowej polimerazy identyfikuje regulację w górę określonych genów u zakażonych muszek, które wskazują na aktywację szlaków odpowiedzi immunologicznej, w tym interferencji RNA i sygnalizacji JAK/STAT.

Nanoiniekcja wirusa do klatki piersiowej w celu zbadania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych much

W tym filmie demonstrujemy test efektu cytopatycznego w celu określenia zakaźnej dawki wirusa Drosophila C w hodowli tkankowej na komórkach Drosophila S2*. Do zakażenia hodowanych komórek wykorzystuje się szereg stężeń wirusa. Określa się odsetek komórek wykazujących zmiany strukturalne, a dane te są wykorzystywane do obliczenia dawki infekcyjnej dla hodowli tkankowej.

Test mający na celu określenie dawki zakaźnej wirusa Drosophila C w hodowanych komórkach owadów

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Ta metoda pokazuje, jak wizualizować inwazję patogenów na komórki owadów za pomocą trójwymiarowych (3D) modeli. Hemocyty larw Drosophila były zakażone patogenami wirusowymi lub bakteryjnymi, zarówno ex vivo, jak i in vivo. Zainfekowane hemocyty zostały następnie utrwalone i wybarwione w celu obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego, a następnie rekonstrukcji komórkowej 3D.

Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do infekcji mikrobiologicznej i analizy

Ten protokół opisuje metody doustnego wystawiania i zarażania muszki owocowej Drosophila melanogaster patogenami bakteryjnymi, a także mierzenia liczby zakaźnych bakterii wydalanych po infekcji jelitowej. Dalej opisujemy wpływ mutantów immunologicznych na przeżywalność much po zakażeniu bakteryjnym jamy ustnej.

Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Poznaj metodę nanoiniekcji do ustalania infekcji wirusowej u Drosophila melanogaster. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dawki wirusa i analizę interakcji gospodarz-wirus w badaniach nad chorobami zakaźnymi.

Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów