Ustalenie infekcji wirusowej i analiza interakcji gospodarz-wirus u Drosophila melanogaster

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji wirus-gospodarz dotyczące tego, jak skutecznie ustalić infekcję wirusową u Drosophila melanogaster. Ta metoda nanoiniekcji pozwala na precyzyjną kontrolę dawki infekcji wirusem i może być łatwo stosowana w przypadku zakażeń innymi patogenami drobnoustrojowymi. Zacznij od wyhodowania jednej razy 10 do siódmej żywotnej komórki gwiaździstej S2 na mililitr jako luźnej, półprzylegającej monowarstwy w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek z 10 mililitrami kompletnego podłoża Schneider's Drosophila Medium bez dodatkowego dwutlenku węgla w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji ponownie zawiesić świeżo rozmrożony wirus Drosophila C lub DCV do wielokrotności infekcji 0,01 w jednym mililitrze kompletnej pożywki i dodać roztwór wirusa do szalek z kulturami komórkowymi. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza na trzy do pięciu dni. Wirus jest gotowy do pobrania, gdy morfologia komórek wygląda na rozmytą, a pożywka hodowlana jest pełna czarnych cząstek wskazujących na szczątki komórkowe.

Wymieszać supernatant przez odpipetowanie kilka razy przed przeniesieniem całej kultury komórkowej do 15-mililitrowej probówki w celu lizy komórek gospodarza w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby wytworzyć robocze stężenia wirusa, należy rozmrozić zawiesinę komórkową w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przed granulowaniem resztek komórkowych przez odwirowanie. Następnie przenieś supernatant do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu wirowania i podwielokrotności do 200 mikrolitrów roztworu wirusa na probówkę.

Aby określić średnią dawkę infekcyjną kultury tkankowej wirusa, najpierw wysiewa się jeden razy 10 do pięciu komórek gwiazdowych S2 w 100 mikrolitrach kompletnej pożywki do ośmiu dołków na kolumnę w 12 rzędach płytki 96-dołkowej. Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Losowo wybierz pięć probówek z wirusem z pamięci przechowywanej w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Podczas gdy komórki osiadają, napełnij 10 sterylnych 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych 450 mikrolitrami sterylnego kompletnego podłoża i dodaj 50 mikrolitrów bulionu wirusa do pierwszej 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 450 mikrolitrów sterylnej kompletnej pożywki, rozcieńczając zawiesiny 10-krotnie na krok do 12. dołka. Pod koniec inkubacji dodać 50 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do odpowiedniego dołka w każdej kolumnie dla tej probówki z wirusem i dodać 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej bez wirusa do jednego dołka na kolumnę jako studzienkę kontroli ujemnej. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza na trzy dni i oceń efekt cytopatyczny każdego materiału wirusa pod mikroskopem Brightfield przy 20-krotnym powiększeniu dziennie.

Studzienkę, w której komórki wyglądają na rozmyte, a podłoże jest pełne fragmentów, należy sklasyfikować jako studnię dodatnią, a studzienkę, w której morfologia komórki jest normalna, jako studzienkę ujemną. Przed hodowlą dokładnie wymieszaj 400 mikrolitrów 50 mikrogramów na mililitr tetracykliny z czterema gramami świeżego standardowego pokarmu na muchy z mąki kukurydzianej i umieść pokarm w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc, aby odparować etanol. Następnego ranka podgrzej pokarm do temperatury pokojowej i umieść pokarm wraz z 20 samicami i 10 samcami nowo zamkniętych dorosłych much w fiolce hodowlanej na trzydniową do czterodniowej inkubacji hodowlanej w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności 60% w normalnym cyklu światło/ciemność.

Po złożeniu wystarczającej ilości jaj zbierz nowo zamknięte dorosłe muchy pod lekkim strumieniem dwutlenku węgla i ponownie rozmnażaj Drosophila jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano. Po trzech pokoleniach leczenia tetracykliną zbierz pięć much pod lekkim strumieniem dwutlenku węgla i homogenizuj muchy za pomocą 250 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i kilku 0,5 milimetra sterylnych kulek ceramicznych. Po jednej minucie dodaj 250 mikrolitrów 2X buforu A do próbki w celu wirowania przed zamrożeniem próbek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie szybko rozmrozić próbki z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w łaźni wodnej o temperaturze 25 stopni Celsjusza, a następnie 30-minutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza przed ekstrakcją genomowego DNA i amplifikacją DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy zgodnie ze standardowymi protokołami. Potwierdź brak małego RNA Wolbachia 16 i wsp w każdym homogenacie muchy za pomocą elektroforezy żelowej zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie hoduj stado much wolne od Wolbachii na standardowym pokarmie dla much z mąki kukurydzianej, jak pokazano.

W przypadku infekcji wirusowej należy najpierw użyć mikroskopu stereoskopowego i cienkich kleszczy, aby złamać końcówkę szklanej igły kapilarnej do odpowiedniej średnicy do nanoiniekcji. Aby zmontować wtryskiwacz, umieść sufitowy O-ring i białą przekładkę na metalowym tłoku wtryskiwacza z dużym wgłębieniem skierowanym na zewnątrz. Za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 napełnić szklaną igłę olejem mineralnym i umieścić igłę przez kołnierz.

Umieść większy O-ring wokół podstawy kołnierza około jednego milimetra od końca igły i zamontuj igłę na tłoku wtryskiwacza. Przymocować igłę do tłoka i nacisnąć pusty przycisk, aby wysunąć tłok mikrowstrzykiwacza, aż usłyszysz sygnał dźwiękowy. Teraz naciśnij przycisk FILL, aby cofnąć tłok na pięć milimetrów i zanurz igłę w zawiesinie wirusowej tworzącej 100 płytek nazębnych.

Delikatnie wstrząśnąć jedną lub co najmniej trzema fiolkami z 20 samcami Drosophila niezawierającymi Wolbachii na naczyniu do wstrzykiwań. Samce obdarowane muchami są preferowane podczas krycia, a rozmnażanie może wpływać na samice. Następnie wstrzyknąć do klatki piersiowej każdej muchy 50,6 nanolitrów roztworu wirusa w nieco jaśniejszy obszar między mezopleurą a pteropleurą i zmierzyć obciążenie DCV za pomocą testu efektu cytopatycznego i ilościowego RT PCR od muszek naziemnych, jak właśnie pokazano.

Po wstrzyknięciu należy ostrożnie przenieść muchy do świeżej fiolki i umieścić fiolkę w pozycji poziomej, aby zapobiec przywieraniu much do podłoża podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Wstrzyknięcie jest czasochłonne, ale replikacja DCV jest bardzo szybka, dlatego bardzo ważne jest, aby zapisać dokładny czas na probówce po wstrzyknięciu wszystkich much z każdej fiolki. Zakażenie wirusem może indukować lizę komórek, a efekty cytopatyczne obserwuje się po trzech dniach od zakażenia.

Startery Wolbachia 16s, rRNA i wsp mogą być używane do wykrywania obecności Wolbachia i Drosophila, jak wykazano. Muchy wolne od Wolbachii wykazują znacznie obniżoną przeżywalność po zakażeniu DCV i w sposób zależny od dawki. DCV aktywuje przeciwwirusowe szlaki sygnałowe w gospodarzu, które są krytyczne dla infekcji przeciwwirusowej u Drosophila, o czym świadczy zmniejszona przeżywalność i zwiększone miano wirusa u zmutowanych muszek Dicer-2.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że zakażenie genotypem Wolbachia może wpływać na podatność much Drosophila melanogaster na zakażenie DCV. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak genetyczne badanie przesiewowe na większą skalę, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące niedostatecznie zdefiniowanych genów gospodarza wymaganych do infekcji wirusowej lub odpowiedzi przeciwwirusowej. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami wirusowymi u ludzi do zbadania mechanizmów leżących u podstaw wybuchów endemicznych infekcji wirusowych u ludzi w modelu Drosophila melanogaster.

Nie zapominaj, że praca z wirusem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego.