Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit

Mini-endoskopowa ocena jelita grubego u żywych myszy stanowi kluczowe wsparcie eksperymentalne w badaniu objawów jelitowych ostrej choroby graf przeciwko gospodarzowi, GvHD, po alloicznym, krwiotwórczym przeszczepie komórek macierzystych. Nieinwazyjna ocena ostrego zapalenia jelita grubego związanego z GvHD może funkcjonować jako działający substytut złotego standardu histopatologii, sprawiając, że wielokrotne składanie ofiar ze zwierząt w celu uzyskania próbek tkanek nie jest konieczne. Procedurę zademonstruje Vera Buchele, post-doc z mojego laboratorium.

Jednego dnia po napromieniowaniu całego ciała myszy biorcy BALB/c, umieść żywą mysz dawcy CD-45.1 5B6 SJL w pozycji leżącej na czystej pochwie roboczej i użyj jednej 13-cm zakrzywionej i ząbkowanej końcówki kleszczy simkin, aby podnieść futro na jednej pięcie achillesowej. Za pomocą utwardzonych cienkich nożyczek o długości 8,5 cm z prostymi końcówkami naciąć skórę między kleszczami a jedną piętą, wydłużając nacięcie czaszki, aby ułatwić usunięcie skóry i sierści z kończyn tylnych. Po usunięciu skóry z kończyn tylnych przeciąć każdy staw biodrowy, skokowy i kolanowy.

Przechowuj udo i trzon każdej tylnej kończyny na jednej szalce Petriego o średnicy 92 mm wypełnionej PVS na lodzie i ostrożnie usuń jak najwięcej mięśni z każdej kości, przenosząc każdą oczyszczoną kość udową i piszczelową do 50-mililitrowej probówki sterylnego podłoża RPMI 1640 na mokrym lodzie. Aby wyizolować szpik kostny, przenoś jedną kość na raz do nowej szalki Petriego o pojemności 92 ml wypełnionej świeżą pożywką RPMI 1640 i użyj skalpela, aby odciąć końce każdej kości. Następnie użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 rozmiarów, aby przepłukać kości 1 ml świeżej pożywki na raz do 50-mililitrowej probówki zbiorczej zawierającej 5 ml pożywki.

Po przepłukaniu wszystkich kości delikatnie odpipetuj kruche kawałki szpiku kostnego w górę i w dół kilka razy, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, a następnie przefiltruj komórki przez sitko do komórek o siatku 40 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 ml. Osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu na trzyminutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą 10 ml PVS i ponownie odwirować komórki.

Ponownie zawiesić osad w 2 ml świeżego PVS w celu policzenia i odłożyć na bok sześciokrotną podwielokrotność 10 do szóstej komórki do analizy cytometrycznej przepływu w dół. Następnie użyj dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek, aby magnetycznie zubożyć limfocyty T CD90.2-dodatnie z zawiesiny jednokomórkowej szpiku kostnego, zgodnie z instrukcjami producenta, i odłóż na bok jednorazową porcję komórek od 10 do szóstej eluatu zubożonego w limfocyty T do dalszej analizy cytometrycznej czystości i składu komórek przed i po separacji. Następnie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 wstrzyknąć pięć razy 10 do piątych komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T w 100 mikrolitrach PVS dożylnie do przestrzeni zagałkowej zatoki żylnej każdego napromieniowanego biorcy.

Następnego dnia umieść śledzionę pobraną od zwierzęcia dawcy na sitku o siatku o rozmiarze 40 mikrometrów w probówce o pojemności 50 ml i za pomocą tłoka strzykawki przeciśnij tkankę śledziony przez sitko do probówki. Umyj sitko i tłok PVS, aby zebrać wszystkie splenocyty i osadzać komórki przez odwirowanie. Po wykazaniu lizy krwinek czerwonych należy ponownie zawiesić białe krwinki w celu zliczenia i odłożyć na bok sześciokrotną porcję komórek od 10 do szóstej do analizy cytometrycznej przepływu w dół.

W celu całkowitej izolacji limfocytów T CD3-dodatnich z całkowitej liczby splenocytów należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek zgodnie z instrukcjami producenta i odłożyć jednorazową 10 do szóstej porcji limfocytów T CD3-dodatnich z dodatniej frakcji komórek do analizy cytometrycznej przepływu końcowego czystości i składu komórek przed i po separacji. Następnie wstrzyknij siedem razy 10 do piątych alloreaktywnych limfocytów T CD3-dodatnich w 100 mikrolitrach PVS dożylnie do przestrzeni zagałkowej każdej myszy biorcy, aby indukować GvHD. Aby ocenić zmiany związane z GvHD za pomocą miniendoskopii dystalnego obszaru jelita grubego, jedną ręką podnieś ogon zwierzęcia biorcy tuż nad nasadą ogona, a drugą ręką ostrożnie włóż endoskop do odbytnicy przez odbyt

Podczas gdy strumień powietrza napełnia światło jelita grubego, powoli i ostrożnie przesuwaj endoskop do przodu w kierunku aboralnym. Aby uniknąć urazów jelita grubego, utrzymuj endoskop w środkowej części światła, korzystając z ekranu wideo na żywo, aby pomóc w tym ustawieniu. Rozpocznij nagrywanie strumienia wideo i ocenianie stanu zapalnego, oceniając stan zapalny jelita grubego związany z GvHD, oceniając parametry zgodnie z ilustracją.

Po zlokalizowaniu miejsca punktacji delikatnie i lekko przesuwaj endoskop do przodu i do tyłu, aby ocenić różne parametry. Aby ocenić parametr przezierność i konsystencję stolca, należy ustawić endoskop w większej odległości w stosunku do ściany okrężnicy. Aby ocenić ziarnistość i unaczynienie zmiany, umieść endoskop w bliskiej odległości od ściany okrężnicy i ostrożnie przyłóż dobrze dozowane napięcie do ściany okrężnicy za pomocą końcówki endoskopu.

Po zakończeniu procesu oceniania zatrzymaj nagrywanie. W porównaniu z grupą kontrolną, allogeniczne przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych, jak wykazano, powoduje powtarzalnie silną indukcję ogólnoustrojowego fenotypu GvHD, z stopniowo rosnącymi klinicznymi wynikami GvHD u zwierząt biorców. Te mini-endoskopowo oceniane kryteria zostały specjalnie dostosowane do wcześniej zgłoszonych syngenicznych zapaleń jelita grubego w kontekście parametrów oceny zapalenia jelita grubego opartego na allo-odpowiedzi w celu dokładnego opisu, oceny i oceny zmian związanych z chorobą jelitową GvHD w dalszej części okrężnicy.

Rzeczywiście, mini-endoskopowy system klasyfikacji umożliwia łatwe odróżnienie myszy otrzymujących limfocyty dawcy z ciężkimi objawami zapalenia jelit od myszy kontrolnych, które są zasadniczo pozbawione GvHD. Unieważnienie mini-endoskopowego systemu klasyfikacji Badania histopatologiczne potwierdziły, że okrężnica myszy poważnie dotkniętych stanem zapalnym związanym z GvHD wykazuje podobnie silne histopatologiczne objawy zapalenia. W przeciwieństwie do tego, tkanki okrężnicy myszy kontrolnych nie wykazywały co najwyżej łagodnych histopatologicznych objawów zapalenia, co zgadza się z wirtualnym brakiem mini-endoskopowo wykrywalnych objawów zapalenia jelita grubego.

Co więcej, badania korelacji między mini-endoskopowo i histopatologicznie ocenianą aktywnością zapalenia jelita grubego a ogólnoustrojowymi wynikami GvHD pokazują, że mini-endoskopowo wyznaczone niektóre wyniki mniejsze lub równe trzy wiarygodnie przewidują brak średnich i wyższych stopni zapalenia jelita grubego związanych z GvHD, uzyskanych z oceny histopatologicznej. Ponadto nasilenie endoskopowo ocenianej jelitowej GvHD wykazuje korelację z ogólnoustrojową aktywnością choroby GvHD. Aby ustandaryzować wyniki mini-endoskopowej oceny zapalenia okrężnicy i zapewnić porównywalność między różnymi myszami i eksperymentami w czasie, należy wybrać określone miejsce anatomiczne do oceny.

Oprócz oceny stanu zapalnego jelita grubego, wbudowany kanał roboczy w konfiguracji mini-endoskopowej umożliwia pobieranie biopsji tkanek pod kontrolą widoku, które mają zastosowanie w różnych dalszych analizach, takich jak standardowa histopatologia. Ze względu na nieinwazyjny charakter miniendoskopii, ostre zapalenie jelita grubego związane z GvHD może być wielokrotnie oceniane u tego samego zwierzęcia w praktycznie dowolnym momencie, dostarczając w ten sposób fascynujących informacji na temat jelitowej GvHD.