Name: Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę miniendoskopowej oceny zapalenia okrężnicy u żywych myszy w badaniu przeszczepu przeciwko gospodarzowi. Ta technika umożliwia nieinwazyjne monitorowanie jelitowej postaci GvHD bez konieczności pobierania tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Collaborative Research Centers (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; project B03) (do K.H.) i CRC 1181 (CRC-DFG, project B05) (do K.H.), oba finansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza).

<ol><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li>
<li>Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+the+pathogenesis+of+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease.</a> British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).</li>
<li>Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+GvHD%3A+pathogenesis+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Acute GvHD: pathogenesis and classification.</a> Bone Marrow Transplantation. 41, Suppl 2 58-64 (2008).</li>
<li>Naymagon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+graft-versus-host+disease+of+the+gut%3A+considerations+for+the+gastroenterologist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).</li>
<li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease%3A+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation.</a> Blood. 127, 3117-3126 (2016).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li>
<li>Anthony, B. A., Hadley, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+graft-versus-host+disease+and+in+vivo+T+cell+monitoring+using+an+MHC-matched+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e3697(2012).</li>
<li>Beilhack, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+acute+graft-versus-host+disease+by+blocking+T-cell+entry+to+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs.</a> Blood. 111, 2919-2928 (2008).</li>
<li>Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+colonoscopy+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution colonoscopy in live mice.</a> Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).</li>
<li>Buchele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Inflammatory+T+Helper+Cells+via+Retinoic+Acid-Related+Orphan+Receptor+Gamma+t+Is+Ineffective+to+Prevent+Allo-Response-Driven+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1138(2018).</li>
<li>Ullrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BATF-dependent+IL-7RhiGM-CSF%2B+T+cells+control+intestinal+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).</li>
<li>Kaplan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+antigens+determine+graft-versus-host+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype.</a> Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W protokole opisano metodykę indukcji i miniendoskopowej oceny fenotypu jelita grubego obserwowanego w przebiegu jelitowej GvHD. Służy to szerszemu celowi, jakim jest umożliwienie naukowcom badania jelitowego GvHD podłużnie i nieinwazyjnie przez cały przebieg choroby (tj. od początku manifestacji i progresji okrężnicy do maksymalnej aktywności choroby).
Istnieją jednak pewne krytyczne kroki i ważne ograniczenia nieodłącznie związane z prezentowanymi metodologiami, których eksperymentator musi ...

Nowotwory układu krwiotwórczego bezpośrednio wynikające z przedziału krwiotwórczych komórek macierzystych oraz niekontrolowane, szybko postępujące i ciężkie zaburzenia o podłożu immunologicznym są często wskazaniami do przeprowadzenia allo-HCT1,2. Jednakże, chociaż uwzględnia się występowanie korzystnej prognostowo odpowiedzi przeszczep przeciwko nowotworowi, limfocyty dawcy często indukują i promują niepożądany atak za pośrednictwem układu immunologicznego zdrowych składników tkankowych w biorcy allo-HCT, proces ten nazywa się chorobą przeszczep przeciwko gospodarzowi3. Objawy w jelitach, tak zwane jelitowe GvHD, stanowią najbardziej przerażające powikłanie ostrej GvHD, której ciężkie formy są rutynowo związane z wysoką śmiertelnością1,2,4.
Ogólnie rzecz biorąc, mysie modele allo-HCT okazały się nieocenionymi narzędziami do identyfikacji i badania mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw patogenezy GvHD5. Jednak kinetyczna ocena, na przykład, korzystnych efektów nowych interwencji terapeutycznych w czasie u żywych myszy jest rutynowo oparta na określeniu klinicznych wyników GvHD6. Podczas gdy wyniki te są odpowiednie do odzwierciedlenia, na przykład, ogólnego obciążenia chorobą (tj. ogólnoustrojowej GvHD), wyniki kliniczne nie są wystarczająco czułe, aby wiarygodnie odzwierciedlić objawy specyficzne dla narządu (np. w jelitach). W związku z tym wnioski, na przykład w odniesieniu do działania ochronnego jelit danej interwencji terapeutycznej, które opierają się na tych systemach punktacji, zwykle są niewystarczające.
Pomimo znacznych postępów dzięki wynalazkowi nowatorskich metod obrazowania całego ciała w połączeniu z użyciem bioluminescencyjnych lub fluorescencyjnych genetycznych modeli myszy myszy7,8, brakuje metodologii do bezpośredniej i szczegółowej oceny jelitowej manifestacji GvHD u żywych myszy. W związku z tym uzasadnieniem protokołu endoskopowej oceny fenotypu jelitowego GvHD opisanego w następnym rozdziale jest pokonanie tej przeszkody. Co więcej, motywacją jest również zmniejszenie liczby myszy eksperymentalnych, ponieważ, jak dotąd, szczegółowa ocena cech komórkowych, morfologicznych i molekularnych (np. za pomocą histopatologii lub biologii molekularnej) objawów jelitowej GvHD ostatecznie wymagała poświęcenia myszy eksperymentalnej. 
Nasza instytucja wcześniej informowała o metodologii mini-endoskopowej oceny objawów okrężnicy w trakcie modeli syngenicznego zapalenia jelita grubego9. W przedstawionym tutaj protokole udoskonaliliśmy i dostosowaliśmy kolonoskopową matrycę punktacji dla zapalenia jelita grubego wywołanego alloodpowiedzią u żywych myszy z jelitowym GvHD po przeszczepieniu alloreaktywnych HCT i limfocytów dawcy w całkowicie niedopasowanym MHC klasy I. Zidentyfikowaliśmy cztery parametry odpowiednie do odzwierciedlenia zmian w jelitach grubych związanych z GvHD. Co więcej, opracowaliśmy system, który pozwala na precyzyjną ocenę dowolnego pojedynczego wyznacznika, co skutkuje nowym wynikiem, który łatwo informuje czytelnika o nasileniu jelitowego GvHD obecnego u danej myszy w danym punkcie czasowym. Analizy histopatologiczne potwierdziły, że wynik endoskopowy powyżej pewnego progu wiarygodnie przewiduje stan zapalny tkanek o umiarkowanym lub wysokim stopniu nasilenia. W związku z tym mini-endoskopowa ocena wydaje się stanowić działający substytut złotego standardu histopatologii, który rutynowo wymaga poświęcenia myszy eksperymentalnych. Co ważne, protokół ten może być stosowany praktycznie w dowolnym momencie i może być wielokrotnie stosowany w przebiegu choroby10,11. Ponadto, w przeciwieństwie do stosowania podejść zależnych od bioluminescencji, nie są wymagane żadne pracochłonne i czasochłonne środki, takie jak krzyżowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy, a zatem metodologia może być stosowana na praktycznie każdej linii myszy.
Podsumowując, biorąc pod uwagę szkodliwą perspektywę kliniczną pacjentów allo-HCT z ciężką GvHD jelitową, pilnie potrzebny jest szybki postęp naukowy i więcej wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogenezy immunologicznej. Podobnie, ważne względy etyczne wymagają, aby zdobywanie wiedzy odbywało się przy użyciu minimalnej liczby myszy doświadczalnych. W związku z tym, oba uznane twierdzenia w społeczności badawczej badającej jelitową GvHD mogą być rozwijane poprzez implementację seryjnych mini-endoskopowych ocen jelita grubego w eksperymentalnym łańcuchu roboczym w celu monitorowania i oceny jelitowej GvHD w żywych eksperymentalnych modelach mysich, zgodnie z opisem i walidacją w przedstawionym tutaj protokole.

<table><tbody><tr><td>BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator</td><td>Gamma-Service Meical GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>D8662-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Semken (długość: 13 cm; ząbkowane, zakrzywione końcówki)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Hartowane drobne nożyczki (długość: 8,5 cm; proste końcówki; krawędź tnąca: 24 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>Przekaźnik R8758-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna (26 G)</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka</td><td>Sarstedt Ag & Co.KG</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek z 40 &mikro; m siatka kratowa</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>11209</td><td>składnik buforu lizującego ACK</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól disodowa dwuwodna (Na2EDTA)</td><td>Carl Roth GmbH & Co.KG</td><td>8043.2</td><td>składnik buforu lizującego ACK</td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu (KHCO3)</td><td>Merck KGaA</td><td>1,048,540,500</td><td>składnik buforu lizującego ACK</td></tr><tr><td>CD90.2 MicroBeads, mysz</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-049-101</td><td>separacja komórek magnetycznych w celu wyizolowania komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek Pan T Cell Isolation II, mysz</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-095-130</td><td>separacja komórek magnetycznych w celu wyizolowania limfocytów T śledziony</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anty-mysie przeciwciało CD45.2 (klon: 104; partia: B252126; RRID: AB_493731)Biolegend</td><td></td> <td>109822</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue przeciwciało anty-mysie CD3 (klon: 17A2; partia: B227246; RRID: AB_493645)Biolegend</td><td></td> <td>100214</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało anty-mysie CD4 (klon: GK1.5; partia: B225057; RRID: AB_312691)Biolegend</td><td></td> <td>100406</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 przeciwciało anty-mysie CD45.1 (klon: A20; partia: B217246; RRID: AB_1134168)Biolegend</td><td></td> <td>110730</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 przeciwciało anty-mysie CD8a (klon: 53-6,7, partia: B247008; RRID: AB_312753)</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Filtrowana surowica bydlęca&nbsp;</td><td>Pan Biotec</td><td>P40-47500</td><td>składnik buforu FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki z dnem polistyrenu w kształcie litery V</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowa rurka okrągłodenna (5 ml)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa II cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscience Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa ze sterylnym wnętrzem (30 G)</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Oxy Vet Oxymat 3</td><td>Koncentrator tlenu Eickemeyer</td><td></td><td>&nbsp; do znieczulenia</td></tr><tr><td>NarkoVet&nbsp;</td><td>Eickemeyer</td><td>213062</td><td></td></tr><tr><td>Komora z pleksi&nbsp;</td><td>Eickemeyer</td><td>214620</td><td></td></tr><tr><td>Teleskop prosty</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>64301 AA</td><td>część eksperymentalnego zestawu do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Osłona ochronna i badawcza</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>61029 C</td><td>część zestawu eksperymentalnego do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Osłona badawcza z kanałem roboczym</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>61029 D</td><td>część zestawu doświadczalnego do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Kleszcze do biopsji</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>61071 ZJ&nbsp;</td><td>Część zestawu doświadczalnego do kolonoskopii</td></tr><tr><td>&nbsp; 175 Watt SCB XenonLight Źródło światła</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>20132120</td><td>częścią eksperymentalnego zestawu do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Światłowód światłowodowy</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>495 NL</td><td>część eksperymentalnego zestawu do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Obraz 1 S3 Głowica kamery</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>22220030</td><td>częścią eksperymentalnej konfiguracji do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Image 1 SCB Camera Control Unit</td><td>KARL STORZ SE & Co KG</td><td>22200020</td><td>częścią zestawu eksperymentalnego do kolonoskopii</td></tr><tr><td>LCD</td><td>Olympus</td><td>OEV181H</td><td>częścią zestawu eksperymentalnego do kolonoskopii</td></tr><tr><td>Forane / Isofluran</td><td>AbbVie Inc.&nbsp;</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 37 %</td><td>Carl Roth GmbH & Co.KG</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>5,0 ml Końcówka dozownika&nbsp;</td><td>Eppendorf AG</td><td>30089456</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Ostra choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) stanowi najpoważniejsze powikłanie, z jakim borykają się pacjenci przechodzący wcześniej allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych (allo-HCT) i często wiąże się ze słabym wynikiem klinicznym. Chociaż, na przykład, objawy GvHD na skórze zwykle reagują na uznane terapie immunosupresyjne i dlatego nie mają śmiertelnego przebiegu, obecność i intensywność jelitowej GvHD, zwłaszcza środkowej i dolnej części jelita, silnie wpływają na wynik i całkowite przeżycie pacjentów z ostrą GvHD. Opcje terapeutyczne są zasadniczo ograniczone do klasycznych środków immunosupresyjnych, które dają jedynie umiarkowane efekty łagodzące przebieg. W związku z tym pilnie potrzebna jest szczegółowa wiedza na temat kaskady immunologicznej rezydującej w tkankach, zmian w mikrobiocie jelitowej oraz odpowiedzi zrębu przed, w trakcie i po wystąpieniu jelitowej GvHD, aby zrozumieć zdarzenia i mechanizmy leżące u podstaw jej patogenezy oraz opracować innowacyjne opcje terapeutyczne. Mysie modele GvHD są często wykorzystywane do identyfikacji i funkcjonalnej oceny cząsteczek i szlaków przypuszczalnie napędzających jelitową GvHD. Jednak zasadniczo brakuje środków do specyficznego monitorowania i oceny stanu zapalnego jelit w czasie, ponieważ ustalone wyniki do oceny i oceny ostrej GvHD rutynowo składają się z różnych parametrów, które raczej odzwierciedlają ogólnoustrojowe objawy GvHD. Szczegółowa ocena jelitowej GvHD została ograniczona do badań z wykorzystaniem myszy poddanych eutanazji, co zasadniczo wyklucza analizy podłużne (tj. kinetyczne) przedziału okrężnicy w danych warunkach eksperymentalnych (np. Blokada cytokiny prozapalnej za pośrednictwem przeciwciał) u żywych myszy (tj. in vivo). Opisana tutaj mini-endoskopowa ocena in situ dystalnej części jelita grubego u myszy leczonych allo-HCT pozwala a) na szczegółową makroskopową ocenę różnych aspektów zapalenia jelit oraz b) możliwość pobierania próbek tkanek do dalszych analiz w różnych punktach czasowych w trakcie okresu obserwacji. Ogólnie rzecz biorąc, podejście miniendoskopowe stanowi istotny postęp w przedklinicznym nieinwazyjnym monitorowaniu i ocenie jelitowej GvHD.

Niniejszy protokół, opisujący miniendoskopową ocenę zmian w jelitach związanych z GvHD w dystalnym odcinku okrężnicy, został opracowany i zwalidowany u myszy, u których wcześniej przeprowadzono systemową indukcję ciężkiego modelu ostrej GvHD. W badaniu tym zastosowano model z pełną niezgodnością MHC klasy I, w którym myszy BALB/c poddano irradiacji letalnej, a następnie przeszczepiono im allogeniczny szpik kostny pozbawiony limfocytów T i podano alloreaktywne limfocyty T CD3+ z...

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje allogeniczny przeszczep krwiotwórczych komórek macierzystych i umożliwia powtarzalne mini-endoskopowe oceny dystalnej części jelita grubego in situ pod kątem obecności, cech i ciężkości zapalenia jelita grubego u żywych myszy cierpiących na chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi jelit.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Mini-endoskopowa ocena jelita grubego u żywych myszy stanowi kluczowe wsparcie eksperymentalne w badaniu objawów jelitowych ostrej choroby graf przeciwko gospodarzowi, GvHD, po alloicznym, krwiotwórczym przeszczepie komórek macierzystych. Nieinwazyjna ocena ostrego zapalenia jelita grubego związanego z GvHD może funkcjonować jako działający substytut złotego standardu histopatologii, sprawiając, że wielokrotne składanie ofiar ze zwierząt w celu uzyskania próbek tkanek nie jest konieczne. Procedurę zademonstruje Vera Buchele, post-doc z mojego laboratorium.Jednego dnia po napromieniowaniu całego ciała myszy biorcy BALB/c, umieść żywą mysz dawcy CD-45.1 5B6 SJL w pozycji leżącej na czystej pochwie roboczej i użyj jednej 13-cm zakrzywionej i ząbkowanej końcówki kleszczy simkin, aby podnieść futro na jednej pięcie achillesowej. Za pomocą utwardzonych cienkich nożyczek o długości 8,5 cm z prostymi końcówkami naciąć skórę między kleszczami a jedną piętą, wydłużając nacięcie czaszki, aby ułatwić usunięcie skóry i sierści z kończyn tylnych. Po usunięciu skóry z kończyn tylnych przeciąć każdy staw biodrowy, skokowy i kolanowy.Przechowuj udo i trzon każdej tylnej kończyny na jednej szalce Petriego o średnicy 92 mm wypełnionej PVS na lodzie i ostrożnie usuń jak najwięcej mięśni z każdej kości, przenosząc każdą oczyszczoną kość udową i piszczelową do 50-mililitrowej probówki sterylnego podłoża RPMI 1640 na mokrym lodzie. Aby wyizolować szpik kostny, przenoś jedną kość na raz do nowej szalki Petriego o pojemności 92 ml wypełnionej świeżą pożywką RPMI 1640 i użyj skalpela, aby odciąć końce każdej kości. Następnie użyj strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 rozmiarów, aby przepłukać kości 1 ml świeżej pożywki na raz do 50-mililitrowej probówki zbiorczej zawierającej 5 ml pożywki.Po przepłukaniu wszystkich kości delikatnie odpipetuj kruche kawałki szpiku kostnego w górę i w dół kilka razy, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, a następnie przefiltruj komórki przez sitko do komórek o siatku 40 mikrometrów do nowej probówki o pojemności 50 ml. Osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu na trzyminutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zatrzymać reakcję za pomocą 10 ml PVS i ponownie odwirować komórki.Ponownie zawiesić osad w 2 ml świeżego PVS w celu policzenia i odłożyć na bok sześciokrotną podwielokrotność 10 do szóstej komórki do analizy cytometrycznej przepływu w dół. Następnie użyj dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek, aby magnetycznie zubożyć limfocyty T CD90.2-dodatnie z zawiesiny jednokomórkowej szpiku kostnego, zgodnie z instrukcjami producenta, i odłóż na bok jednorazową porcję komórek od 10 do szóstej eluatu zubożonego w limfocyty T do dalszej analizy cytometrycznej czystości i składu komórek przed i po separacji. Następnie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 wstrzyknąć pięć razy 10 do piątych komórek szpiku kostnego zubożonych w limfocyty T w 100 mikrolitrach PVS dożylnie do przestrzeni zagałkowej zatoki żylnej każdego napromieniowanego biorcy.Następnego dnia umieść śledzionę pobraną od zwierzęcia dawcy na sitku o siatku o rozmiarze 40 mikrometrów w probówce o pojemności 50 ml i za pomocą tłoka strzykawki przeciśnij tkankę śledziony przez sitko do probówki. Umyj sitko i tłok PVS, aby zebrać wszystkie splenocyty i osadzać komórki przez odwirowanie. Po wykazaniu lizy krwinek czerwonych należy ponownie zawiesić białe krwinki w celu zliczenia i odłożyć na bok sześciokrotną porcję komórek od 10 do szóstej do analizy cytometrycznej przepływu w dół.W celu całkowitej izolacji limfocytów T CD3-dodatnich z całkowitej liczby splenocytów należy użyć dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania komórek zgodnie z instrukcjami producenta i odłożyć jednorazową 10 do szóstej porcji limfocytów T CD3-dodatnich z dodatniej frakcji komórek do analizy cytometrycznej przepływu końcowego czystości i składu komórek przed i po separacji. Następnie wstrzyknij siedem razy 10 do piątych alloreaktywnych limfocytów T CD3-dodatnich w 100 mikrolitrach PVS dożylnie do przestrzeni zagałkowej każdej myszy biorcy, aby indukować GvHD. Aby ocenić zmiany związane z GvHD za pomocą miniendoskopii dystalnego obszaru jelita grubego, jedną ręką podnieś ogon zwierzęcia biorcy tuż nad nasadą ogona, a drugą ręką ostrożnie włóż endoskop do odbytnicy przez odbyt.Podczas gdy strumień powietrza napełnia światło jelita grubego, powoli i ostrożnie przesuwaj endoskop do przodu w kierunku aboralnym. Aby uniknąć urazów jelita grubego, utrzymuj endoskop w środkowej części światła, korzystając z ekranu wideo na żywo, aby pomóc w tym ustawieniu. Rozpocznij nagrywanie strumienia wideo i ocenianie stanu zapalnego, oceniając stan zapalny jelita grubego związany z GvHD, oceniając parametry zgodnie z ilustracją.Po zlokalizowaniu miejsca punktacji delikatnie i lekko przesuwaj endoskop do przodu i do tyłu, aby ocenić różne parametry. Aby ocenić parametr przezierność i konsystencję stolca, należy ustawić endoskop w większej odległości w stosunku do ściany okrężnicy. Aby ocenić ziarnistość i unaczynienie zmiany, umieść endoskop w bliskiej odległości od ściany okrężnicy i ostrożnie przyłóż dobrze dozowane napięcie do ściany okrężnicy za pomocą końcówki endoskopu.Po zakończeniu procesu oceniania zatrzymaj nagrywanie. W porównaniu z grupą kontrolną, allogeniczne przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych, jak wykazano, powoduje powtarzalnie silną indukcję ogólnoustrojowego fenotypu GvHD, z stopniowo rosnącymi klinicznymi wynikami GvHD u zwierząt biorców. Te mini-endoskopowo oceniane kryteria zostały specjalnie dostosowane do wcześniej zgłoszonych syngenicznych zapaleń jelita grubego w kontekście parametrów oceny zapalenia jelita grubego opartego na allo-odpowiedzi w celu dokładnego opisu, oceny i oceny zmian związanych z chorobą jelitową GvHD w dalszej części okrężnicy.Rzeczywiście, mini-endoskopowy system klasyfikacji umożliwia łatwe odróżnienie myszy otrzymujących limfocyty dawcy z ciężkimi objawami zapalenia jelit od myszy kontrolnych, które są zasadniczo pozbawione GvHD. Unieważnienie mini-endoskopowego systemu klasyfikacji Badania histopatologiczne potwierdziły, że okrężnica myszy poważnie dotkniętych stanem zapalnym związanym z GvHD wykazuje podobnie silne histopatologiczne objawy zapalenia. W przeciwieństwie do tego, tkanki okrężnicy myszy kontrolnych nie wykazywały co najwyżej łagodnych histopatologicznych objawów zapalenia, co zgadza się z wirtualnym brakiem mini-endoskopowo wykrywalnych objawów zapalenia jelita grubego.Co więcej, badania korelacji między mini-endoskopowo i histopatologicznie ocenianą aktywnością zapalenia jelita grubego a ogólnoustrojowymi wynikami GvHD pokazują, że mini-endoskopowo wyznaczone niektóre wyniki mniejsze lub równe trzy wiarygodnie przewidują brak średnich i wyższych stopni zapalenia jelita grubego związanych z GvHD, uzyskanych z oceny histopatologicznej. Ponadto nasilenie endoskopowo ocenianej jelitowej GvHD wykazuje korelację z ogólnoustrojową aktywnością choroby GvHD. Aby ustandaryzować wyniki mini-endoskopowej oceny zapalenia okrężnicy i zapewnić porównywalność między różnymi myszami i eksperymentami w czasie, należy wybrać określone miejsce anatomiczne do oceny.Oprócz oceny stanu zapalnego jelita grubego, wbudowany kanał roboczy w konfiguracji mini-endoskopowej umożliwia pobieranie biopsji tkanek pod kontrolą widoku, które mają zastosowanie w różnych dalszych analizach, takich jak standardowa histopatologia. Ze względu na nieinwazyjny charakter miniendoskopii, ostre zapalenie jelita grubego związane z GvHD może być wielokrotnie oceniane u tego samego zwierzęcia w praktycznie dowolnym momencie, dostarczając w ten sposób fascynujących informacji na temat jelitowej GvHD.

induction-intestinal-graft-versus-host-disease-its-mini-endoscopic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model transplantacji jelita cienkiego myszy jest uznawany za istotne narzędzie do badania mechanizmów odrzutu immunologicznego oraz przesiewowego badania nowych leków immunosupresyjnych. Jednak zastosowanie tego modelu jest ograniczone, ponieważ techniki w nim wykorzystywane stanowią niezwykle trudne wyzwanie techniczne. W niniejszym materiale przedstawiamy zmodyfikowaną technikę.

Przeszczep jelita cienkiego u myszy

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Przeszczep cienkiego jelita stał się uznaną opcją terapeutyczną dla pacjentów z nieodwracalną niewydolnością jelit. Nasz eksperymentalny model ortotopowego przeszczepu cienkiego jelita u szczurów służy jako niezawodne narzędzie do badania podstawowych procesów immunologicznych i zapalnych, które komplikują transplantację jelita.

Ortotopowe przeszczepianie jelita cienkiego u szczurów

Ten film demonstruje indukcję choroby jelitowej przeszczep przeciwko gospodarzowi, GvHD, u śmiertelnie napromieniowanej myszy biorcy przy użyciu allogenicznych hematopoetycznych komórek macierzystych i indukujących GvHD alloreaktywnych limfocytów T indukujących śledzionę. Protokół ten pomaga w ustaleniu modelu ciężkiej ostrej choroby jelitowej GvHD, aby zrozumieć mechanizm choroby i opracować innowacyjne opcje terapeutyczne.

Indukcja choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w modelach mysich za pomocą allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego i komórek śledziony

Techniki obrazowania małych zwierząt pozwalają na seryjne badania diagnostyczne i interwencje terapeutyczne in vivo. W ostatnim czasie zakres zastosowań znacznie się poszerzył i obecnie obejmuje ocenę rozwoju guza jelita grubego, gojenie się ran oraz monitorowanie stanu zapalnego. Protokół ten ilustruje te różnorodne potencjalne zastosowania endoskopii mysiej skóry.

Endoskopia mysia do multimodalnego obrazowania in vivo kancerogenezy i oceny gojenia się ran jelitowych i stanów zapalnych

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Tutaj prezentujemy protokół do wywoływania i oceniania choroby w modelu xenoGVHD (xenoGVHD) ksenogenicznej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. xenoGVHD dostarcza model in vivo do badania immunosupresji ludzkich limfocytów T. Dodatkowo opisujemy, jak wykrywać ludzkie limfocyty T w tkankach za pomocą cyfrowego PCR jako narzędzia do ilościowego określania immunosupresji.

Indukcja i ocena choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi w ksenogenicznym mysim modelu i kwantyfikacja ludzkich limfocytów T w tkankach myszy przy użyciu cyfrowego PCR

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia ważnych punktów końcowych i markerów proliferacyjnych uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej przy użyciu modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią. Demonstrujemy wykrywanie proliferujących komórek za pomocą markera specyficznego dla cyklu komórkowego i przy użyciu masy jelita cienkiego, głębokości krypty i wysokości kosmków jako punktów końcowych.

Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

Interakcja genetycznej podatności, odporności błony śluzowej i mikroekologicznego środowiska jelitowego jest zaangażowana w patogenezę nieswoistego zapalenia jelit (IBD). W tym badaniu zastosowaliśmy przeszczep mikrobioty kałowej myszom z niedoborem IL-10 i zbadaliśmy jej wpływ na zapalenie okrężnicy i czynność serca.

Ocena terapeutyczna przeszczepu mikrobioty kałowej w mysim modelu z niedoborem interleukiny 10

Protokół ten opisuje model przeszczepu jelita na szczurach z ileostomią w celu oceny w czasie interwencji lekowej w przypadku odrzucenia przeszczepu.

Model odrzucenia przeszczepu przeszczepu jelita szczura z zewnętrzną ileostomią do oceny rokowania podłużnego

Poznaj metodę miniendoskopowej oceny zapalenia okrężnicy u żywych myszy w badaniu przeszczepu przeciwko gospodarzowi. Ta technika umożliwia nieinwazyjne monitorowanie jelitowej postaci GvHD bez konieczności pobierania tkanek.

Indukcja choroby przeszczep jelitowy przeciwko gospodarzowi i jej miniendoskopowa ocena u żywych myszy

Przeglądaj więcej filmów