Name: Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę fotolizy fotoaktywowanej nikotyny do badania nikotynowych receptorów acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy. Technika łączy mikroskopię wielofotonową z rejestracją patch clamp, umożliwiając precyzyjną analizę funkcji receptorów i morfologii komórkowej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium następujących głównych badaczy z Northwestern: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy i Anis Contractor. Praca ta była wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) (granty DA035942 i DA040626 dla R.M.D.), PhRMA Foundation (stypendium dla M.C.A.) i HHMI.

<ol><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+tone+in+ventral+tegmental+area%3A+Functional+organization+and+behavioral+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications.</a> Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).</li>
<li>Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasic+acetylcholine+release+and+the+volume+transmission+hypothesis%3A+time+to+move+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 383-390 (2009).</li>
<li>Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+a+disorder+of+cortical+cholinergic+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation.</a> Science. 219 (4589), 1184-1190 (1983).</li>
<li>Katz, B., Thesleff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+desensitization+produced+by+acetylcholine+at+the+motor+end-plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate.</a> Journal of Physiology. 138 (1), 63-80 (1957).</li>
<li>Banala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+drugs+for+nicotinic+optopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology.</a> Nature Methods. 15 (5), 347-350 (2018).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+Cholinergic+Receptors+in+VTA+Glutamate+Neurons+Modulate+Excitatory+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission.</a> Cell Reports. 23 (8), 2236-2244 (2018).</li>
<li>Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B14%CE%B16%CE%B22%2A+nicotinic+acetylcholine+receptor+activation+on+ventral+tegmental+area+dopamine+neurons+is+sufficient+to+stimulate+a+depolarizing+conductance+and+enhance+surface+AMPA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function.</a> Molecular Pharmacology. 84 (3), 393-406 (2013).</li>
<li>Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+application+of+drugs+to+study+nicotinic+acetylcholine+receptor+function+in+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habenula+%26%2334%3Bcholinergic%26%2334%3B+neurons+co-release+glutamate+and+acetylcholine+and+activate+postsynaptic+neurons+via+distinct+transmission+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Habenula &#34;cholinergic&#34; neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes.</a> Neuron. 69 (3), 445-452 (2011).</li>
<li>Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cooperative+Mechanism+Involving+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+and+Retrograde+Activation+of+GABAB+Receptors+in+Interpeduncular+Nucleus+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity.</a> Cell Reports. 20 (5), 1111-1122 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Baseline+and+Nicotine-Mediated+Behavioral+and+Cholinergic+Profiles+in+ChAT-Cre+Mouse+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines.</a> The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2177-2188 (2018).</li>
<li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+increased+acetylcholine+release+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus.</a> Neuroscience. 218, 1-11 (2012).</li>
<li>Ting, J. T., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+strategies+for+developing+next+generation+BAC+transgenic+tools+for+optogenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111(2014).</li>
<li>Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+drug-induced+repetitive+behaviors+and+striatal+overexpression+of+VAChT+in+ChAT-ChR2-EYFP+BAC+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8, 57(2014).</li>
<li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li>
<li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li>
<li>Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+scanning+photochemical+microscopy%3A+mapping+ligand-gated+ion+channel+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6629-6633 (1994).</li>
<li>Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+and+Ca2%2B+regulation+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+channels+in+rat+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (27), 9024-9031 (2003).</li>
<li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li>
<li>Tochitsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+control+of+genetically+engineered+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Chemistry. 4 (2), 105-111 (2012).</li>
<li>Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+workstation+with+concurrent%2C+independent+multiphoton+imaging+and+experimental+laser+microbeam+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (1), 193-201 (2003).</li>
<li>Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+driven+state+transitions+in+distal+dendrites+of+striatal+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons.</a> Nature Neuroscience. 14 (7), 881-888 (2011).</li>
<li>Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pedunculopontine+glutamatergic+neurons+control+spike+patterning+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Science+STKE%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Science STKE. (219), pl5(2004).</li>
<li>Inoue, S., Spring, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInoue%2C+S+%22Video+microscopy%3A+The+fundamentals%22">Video microscopy: The fundamentals</a>. , 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+ratioing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing.</a> Biophysical Journal. 78 (5), 2655-2667 (2000).</li>
<li>Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+reconstruction+of+the+quantal+event+at+nicotinic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses.</a> Biophysical Journal. 27 (1), 145-164 (1979).</li>
<li>Shih, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+and+function+of+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+subdivisions+of+medial+habenula%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (29), 9789-9802 (2014).</li>
<li>Verhoog, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+cholinergic+control+of+human+and+mouse+cortical+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity.</a> Nature Communications. 7, 12826(2016).</li>
<li>Koukouli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reverses+hypofrontality+in+animal+models+of+addiction+and+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia.</a> Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).</li>
<li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+selectively+enhances+%CE%B14%CE%B22%2A+nicotinic+acetylcholine+receptors+in+the+nigrostriatal+dopamine+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (40), 12428-12439 (2009).</li>
<li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Editing+Vectors+for+Studying+Nicotinic+Acetylcholine+Receptors+in+Cholinergic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission.</a> European Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
</ol>

D.L.W. pełni funkcję płatnego konsultanta w firmie Bruker Nano Fluorescence Microscopy.

Wybór metody aplikacji/dostarczania PA-Nic jest najbardziej krytycznym krokiem w tej zlokalizowanej technice fotostymulacji. Obie metody, aplikacja w kąpieli i perfuzja miejscowa, mają różne zalety i ograniczenia. Na wybór duży wpływ ma poziom funkcjonalnej ekspresji nAChR w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Często preferowane jest stosowanie kąpieli, gdy poziomy ekspresji funkcjonalnej są wysokie, ponieważ aplikacja w kąpieli pozwala na uzyskanie równomiernego stężenia sondy wokół zarejestrowanej komórki, ułatwiając interpretację danych. Aplikacja w kąpieli eliminuje również potrzebę stosowania drugiej pipety perfuzyjnej w tkance, co ułatwia cały proces. Jednak stosowanie drogich związków w kąpieli kosztuje więcej w jednym eksperymencie.
Zwykle rozwiązywanie problemów polega na próbie zrozumienia, dlaczego po fotolizie błysku nie obserwuje się aktywacji nAChR. Podczas pracy z typem komórki, który nie był wcześniej badany za pomocą PA-Nic, badacz powinien przeprowadzić miejscowe zaciągnięcie ACh lub nikotyny, aby określić, czy funkcjonalniewyrażają się wystarczające receptory5. Aby sprawdzić, czy system jest zdolny do wykrywania reakcji fotolizy, należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne na przyśrodkowych neuronach habenula, które wyrażają duże ilości receptora30. W tym obszarze mózgu możliwe jest zastosowanie kąpieli PA-Nic, która jest preferowana w przypadku eksperymentów walidacyjnych. Dopiero po przeprowadzeniu tych eksperymentów walidacyjnych należy przejść do niebadanego typu komórki. Jeśli system eksperymentalny został zwalidowany, a odpowiedzi pozostają bardzo małe lub niewykrywalne, może być uzasadnione zwiększenie stężenia PA-Nic, zwiększenie intensywności błysku lub czasu trwania impulsu, dodanie dodatniego modulatora allosterycznego nAChR w celu zwiększenia aktywności nAChR6 lub pewna kombinacja powyższych.
Czasami reakcje odblokowania są zbyt duże, ze znaczną aktywacją nAChR, co skutkuje pośrednią aktywacją kanału Na+ bramkowanego napięciem i niezaciśniętymi prądami wewnętrznymi z powodu słabego zacisku przestrzennego. Te artefakty, które całkowicie zasłaniają prądy wewnętrzne nAChR i uniemożliwiają interpretację danych, można wyeliminować poprzez włączenie QX-314 (2 mM) do pipety rejestrującej. Można je również wyeliminować poprzez zmniejszenie stężenia PA-Nic lub zmniejszenie intensywności błysku lub czasu trwania impulsu. We wszystkich eksperymentach fotostymulacji światłem widzialnym należy zachować ostrożność przy wyborze miejsc stymulacji, aby uniknąć niezamierzonej stymulacji/fotolizy powyżej lub poniżej pożądanej płaszczyzny ogniskowej. Dodatkowo, w stosownych przypadkach, moc lasera musi być zawsze miareczkowana, aby odtworzyć reakcje fizjologiczne. Szczególnie ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z fotostymulacji osi Z podczas pracy z ligandami w klatkach, ponieważ ligandy, które są aktywowane powyżej/poniżej ogniska, mogą nadal dyfundować i wchodzić w interakcje z badanym systemem biologicznym (tj. receptorami).
Laserowa fotoliza błyskowa PA-Nic może nie być odpowiednia dla wszystkich badaczy, ponieważ istnieje kilka ograniczeń. Pierwszym z nich jest stosunkowo wysoki koszt odpowiedniej konfiguracji. Podczas pracy z nienaruszonymi wycinkami mózgu, odtworzenie w klatkach w pobliżu struktur o małej średnicy, takich jak dendryty, wymaga zaawansowanego systemu wizualizacji, takiego jak mikroskop 2-fotonowy. Oprócz wysokich kosztów Ti:sapphire, przestrajalnego lasera impulsowego w podczerwieni do wykonywania mikroskopii 2-fotonowej, system z podwójnym galwanometrem zdolny do niezależnego pozycjonowania dwóch wiązek laserowych dodatkowo zwiększa koszt systemu. Całkowite koszty systemu można zmniejszyć, korzystając z systemu zbudowanego w domu, jeśli badacz ma wystarczającą wiedzę i czas na budowę, rozwiązywanie problemów i konserwację takiego systemu. Drugie ograniczenie często wiąże się z niską ekspresją funkcjonalną nAChR, którą można częściowo złagodzić, podejmując kroki jak wspomniano powyżej, ale może to nie gwarantować sukcesu. Zazwyczaj, jeśli nie można zmierzyć prądów aktywowanych ligandem po zaciągnięciu agonistów, fotoliza błyskowa PA-Nic pod cęgami napięciowymi może nie dać akceptowalnych wyników. Trzecie ograniczenie dotyczy wewnętrznej fluorescencji PA-Nic. PA-Nic pochłania światło o długości fali ~405 nm i emituje w podobnym zakresie jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) czy Alexa 4885. Gdy stężenia PA-Nic przekraczają ~1 mM, ta właściwość fluorescencji może utrudnić jednoczesną wizualizację struktur neuronalnych. Aby temu zapobiec, bardzo ważne jest, aby móc łatwo kontrolować przepływ PA-Nic z pipety perfuzyjnej. Okresowo przepływ PA-Nic był zatrzymywany, aby umożliwić dyfuzję cząsteczek fluorescencyjnych. Pozwoliło to na ponowne zobrazowanie neuronu w celu sprawdzenia pozycji punktowej wiązki odłączającej się od klatkowni. Czwartym potencjalnym ograniczeniem, o którym należy wspomnieć, jest wykorzystanie światła o długości fali 405 nm do fotolizy. Krótsze fale, takie jak 405 nm, są bardziej podatne na rozpraszanie w złożonych tkankach, takich jak wycinek mózgu. Tak więc, przy danej intensywności i czasie trwania błysku, amplitudy odpowiedzi na odblokowanie i kinetyka zaniku mogą być różnie zależne od głębokości ogniska uncageingu w przekroju. Wnioski dotyczące biologicznych aspektów nAChR powinny uwzględniać to ważne zastrzeżenie.
Ta zlokalizowana technika laserowej fotolizy błyskowej została niedawno wykorzystana do odkrycia nowych szczegółów na temat neurobiologii nAChR. Na przykład przewlekła ekspozycja na nikotynę poprawia perysomatyczną i dendrytyczną funkcję nAChR w przyśrodkowych neuronach habenula5. Wykorzystano go również do wykazania, po raz pierwszy, że neurony glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki wyrażają funkcjonalne nAChR w swoich perymatycznych i dendrytycznych przedziałach komórkowych6. Istnieje wiele potencjalnych przyszłych zastosowań tej techniki, a podejście to można zastosować do innych kluczowych typów neuronów, o których wiadomo, że wyrażają nAChR, takich jak neurony piramidowe kory mózgowej31 lub interneurony w korze mózgowej32, prążkowiu33 i hipokampie19. Technikę tę można również połączyć z farmakologią i/lub edycją genów nAChR34 w celu zlokalizowania określonych podtypów receptorów w różnych przedziałach neuronalnych. Podejście to można łatwo dostosować do innych związków umieszczanych w klatkach kumarynowych, w tym między innymi do tych opracowanych równolegle z PA-Nic5. Wreszcie, fotoliza błyskowa PA-Nic może pewnego dnia zostać wykorzystana u obudzonego / zachowującego się zwierzęcia do badania działania nikotyny w nowych paradygmatach farmakologii behawioralnej.

Sygnalizacja cholinergiczna moduluje liczne procesy zachodzące w mózgu, w tym kontrolę uwagi, ruchy wolicjonalne i nagrodę1,2. Leki, które zwiększają przekaźnictwo acetylocholiny (ACh) są stosowane w leczeniu zaburzeń poznawczych związanych z chorobą Alzheimera, co sugeruje ważną rolę układów cholinergicznych w funkcjach poznawczych3. Lepsze zrozumienie receptorów i obwodów cholinergicznych w stanach zdrowych i chorych może prowadzić do lepszych podejść terapeutycznych w przypadku kilku chorób/zaburzeń neurologicznych.
Nikotynowe receptory ACh (nAChR) to rodzina kanałów jonowych bramkowanych ligandem, które przepływają kationy w odpowiedzi na endogenne ACh lub egzogenną nikotynę z wyrobów tytoniowych. Biorąc pod uwagę fakt, że były to jedne z pierwszych receptorów neuroprzekaźników, które zostały opisane4, farmakologia nAChR i lokalizacja we włóknach mięśniowych jest dobrze poznana dla receptorów typu mięśniowego. W przeciwieństwie do tego, stosunkowo niewiele wiadomo na temat farmakologii i subkomórkowej dystrybucji natywnych nAChR w mózgu. Ta luka w wiedzy została niedawno wypełniona poprzez opracowanie nowej sondy chemicznej, która pozwala na przestrzennie ograniczoną i szybką aktywację nAChR w tkance mózgowej podczas obrazowania komórkowego i zapisu elektrofizjologicznego5. W tym miejscu opisano kluczowe kroki metodologiczne związane z tym podejściem, którego ogólnym celem jest zwiększenie zdolności do łączenia funkcji nAChR ze strukturą neuronalną.
Fotoaktywna nikotyna (PA-Nic; nazwa chemiczna: 1-[7-[bis(karboksymetylo)-amino]kumaryno-4-yl]metylo-nikotyna) może być fotolizowana za pomocą błysków laserowych ~405 nm, aby skutecznie uwalniać nikotynę5,6. Przed rozpakowaniem, PA-Nic jest stabilny w roztworze i nie wykazuje żadnych niepożądanych cech farmakologicznych lub fotochemicznych5. Po fotolizie uwolniona nikotyna w przewidywalny sposób aktywuje nAChR, a produkty uboczne odklejania są farmakologicznie obojętne5. Jako źródło światła do fotolizy stosuje się laser o fali ciągłej o mocy wyjściowej >1 mW mierzonej na próbce. W przypadku lokalizacji, ukierunkowana fotostymulacja jest połączona ze zdolnością do lokalizacji błon komórkowych za pomocą 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (2PLSM), a dwie kluczowe zalety tego podejścia są w pełni zrealizowane: szybkość fotolizy i precyzja przestrzenna.
Pod wieloma względami, fotoliza PA-Nic jest lepsza od innych metod dostarczania ligandów nAChR do receptorów w wycinkach mózgu. Takie podejścia obejmują aplikację w kąpieli7 i miejscowe podawanie leku za pomocą pipety puffer8. Podczas gdy pierwsze podejście ma tendencję do nadmiernego podkreślania długoterminowych skutków stosowanego leku, drugie podejście może cierpieć z powodu zmienności kinetyki odpowiedzi między badaniami i między komórkami. Żadne z tych alternatywnych podejść nie jest w stanie odpowiednio odróżnić aktywności receptorów w różnych lokalizacjach komórkowych od tego samego neuronu. Optogenetycznie aktywowane uwalnianie ACh zostało wykorzystane do badania natywnych lokalizacji nAChRs 9,10,11, ale nie okazało się przydatne do mapowania subkomórkowych lokalizacji nAChR. Co więcej, większość badań wykorzystujących to podejście opierała się na transgenicznej myszy bakteryjnej z ekspresją ChR2 z ekspresją ChR2 z nieprawidłową transmisją cholinergiczną12,13,14,15,16,17.
PA-Nic fotoliza nie jest jedynym optycznym podejściem do badania receptorów cholinergicznych. Karbachol w klatce został użyty do funkcjonalnego mapowania aktywności receptora ACh w hodowanych komórkach18 i brain slices19, ale nie był komercyjnie dostępny do badań porównawczych podczas opracowywania PA-Nic. Doniesiono, że kompleks rubinowy bis(bipirydyna)-nikotyna (RuBi-nikotyna) pozwala na odtworzenie nikotyny20, ale komercyjne preparaty RuBi-nikotyny okazały się gorsze od PA-Nic w bezpośrednim badaniu porównawczym5. Przydatne może być powtórzenie takich eksperymentów porównawczych z niekomercyjną, wysoce oczyszczoną RuBi-nikotyną, ponieważ jej widoczna absorpcja może uzupełniać cechy PA-Nic, aby prowadzić badania cholinergiczne. Wreszcie, nAChR zostały również optycznie zmanipulowane przy użyciu kombinacji fotoprzełączalnych ligandów i genetycznie zmodyfikowanych receptorów21. Podejście to jest komplementarne do fotolizy PA-Nic w tkance mózgowej, przy czym zdolność/wymóg genetycznego celowania zmodyfikowanego nAChR jest postrzegany zarówno jako zaleta, jak i wada.
Należy zwrócić uwagę na kilka kluczowych wymagań tego podejścia. Po pierwsze, potrzebna jest odpowiednia metoda wizualizacji, aby dokładnie zlokalizować błonę neuronalną. Obrazowanie za pomocą konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej może być wystarczające podczas badania hodowanych komórek, ale do rejestracji z neuronów w wycinkach mózgu lub innych preparatach z grubych tkanek wymagane jest 2PLSM lub mikroskopia konfokalna. Po drugie, potrzebna jest odpowiednia metoda pozycjonowania wiązki lasera fotolizy. Podejście to wykorzystuje głowicę skanującą z podwójnym galwanometrem z dwoma niezależnymi lustrami x-y do skanowania rastrowego wiązki obrazowania i fotoaktywacji punktowej za pomocą wiązki laserowej do odblokowywania 22,23,24. Możliwe są inne, bardziej ograniczone rozwiązania, takie jak (1) pojedyncza głowica skanująca galwanometru, która na przemian skanuje raster wiązki obrazowania i wiązki nieklatkowej, lub (2) po prostu skierowanie wiązki odblokowującej na środek pola widzenia, tak aby komórka została doprowadzona do tej pozycji w celu fotolizy błyskowej. Po trzecie, system do jednoczesnej rejestracji elektrofizjologicznej jest wymagany, jeśli ktoś chce zbierać sygnały fizjologiczne podczas eksperymentów. Powyższe wymagania można spełnić za pomocą odpowiedniej techniki obrazowania w pełni optycznego, jak niedawno opisano5. Poniżej znajduje się szczegółowy protokół, który opisuje kluczowe kroki tego podejścia.

<table><tbody><tr><td>Instruments, materiały eksploatacyjne i różne chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices Corp.</td><td></td><td>Wzmacniacz zacisków krosowych</td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ściągacz do mikropipet PV820</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Regulator temperatury Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Warner</td><td>Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom z ostrzem wibracyjnym</td><td>Filtr</td><td></td> odśrodkowy Leica Biosystems VT1200S <td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC30GV0S</td><td>wewnętrzny filtr roztworu</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td>łatka i aplikacja miejscowa pipeta</td></tr> <tr><td>(-) -Sól wodorowinianu nikotyny</td><td>Glentham</td><td>GL9693</td><td>sól nikotynowa</td></tr><tr><td>7-karboksymetyloamino-4-metylo kumaryna</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>PA-Nic produkt</td></tr> <tr><td>uboczny1-[7-[bis(karboksymetylo)-amino]kumaryno-4-ylo]metylo-nikotyna</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>PA-Nic</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodowa)</td><td>Virbac</td><td>ANADA #200-071</td><td></td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10436</td><td>zielony barwnik wypełniający</td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10437</td><td>czerwony barwnik wypełniający</td></tr><tr><td>6- karboksyl-AF594 (Alexa Fluor 594)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>czerwony barwnik</td></tr><tr><td>wypełniający QX 314 chlorek</td><td>Tocris</td><td>2313</td><td>bramkowany napięciem bloker kanałów sodowych</td></tr><tr><td>Miernik mocy&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>S120C</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Chemicals for Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Sigma</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime; Kwas -tetraoctowy</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sól magnezowa adenozyno-5&trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa guanozyny 5&prime;-trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Elementy mikroskopu 2-fotonowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Skaner laserowy Ultima do mikroskopu Olympus BX51</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie do obrazowania i galvos</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Galwanometry obrazowania X-Y</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Mai Tai HP1040</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Dostrajalny laser na podczerwień</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ogniwo Pockels M350-80-02-BK z M302RM Driver</td><td>Conoptics, Inc.</td><td></td><td>do tłumienia lasera IR</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Integracja czujnika mocy fotodiody sferycznej</td><td>Thorlabs, Inc</td><td></td><td>fotodioda laserowa do odbierania energii</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Galwanometry X-Y Uncaging</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Wprowadzenie na rynek 2-liniowego lasera Helios</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td>Odblokowywanie elementów lasera</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Punktowy moduł fotoaktywacji / wejścia światłowodowego do wózka bocznego limuzyny - Uncaging</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>><silny>Mikroskop pionowy</silny></td><td>&nbsp; Olympus</td><td>BX51WIF</td><td>Pionowa obudowa mikroskopu</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Cel: Olympus M Plan FL 10x; NA 0,3 WD 11 mm</td><td>&nbsp; Obiektyw Olympus</td><td></td><td>10x</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Obiektyw: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td><td>&nbsp; Olympus</td><td></td><td>60x, obiektyw do zanurzania w wodzie</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; X-Cite 110, czterodiodowe źródło światła epi-fluorescencji LLG</td><td>Źródło światła LED</td> <td>Excelitas Technologies</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtr Epi-Fluorescencyjny: ET-GFP (FITC/CY2) do Epi-Turret</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>Filtr LED do wzbudzenia światła niebieskiego</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtr Epi-Fluorescencyjny: ET-DsRed (TRITC/CY3) do Epi-Turret</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>Filtr LED do wzbudzenia światła zielonego</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; B& Kamera CCD W; Watec, 0,5 cala B/W CCD</td><td>Watec Co., LTD.</td><td></td><td>Kamera CCD do nagrywania z zaciskiem krosowym</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Detektory zewnętrzne - Podwójna emisja odbita - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Multi-alkaliczny boczny PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>czerwony kanał PMT</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtr</td><td>spalinowy czerwonokanałowy</td> 595/50m <td>Chroma Technologies</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Rozdzielacz</td><td>wiązki dichroicznej</td> 565lpxr <td>Chroma Technologies</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; GaAsP end-on PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>7422PA-40</td><td>zielony kanał PMT</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtr</td><td>emisji spalin zielonokanałowy</td> 525/70m <td>Chroma Technologies</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Szybka migawka do Hamamatsu H7422 PMT</td><td>Vincent Associates / Bruker</td><td>517329</td><td>PMT montaż migawki</td></tr> <tr><td><silny>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Dodt Moduł detekcji transmisji kontrastu gradientowego</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Wieloalkaliczny PMT z boku</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>Dodt PMT</td></tr></tbody></table>

badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylocholina (ACh) działa poprzez receptory, modulując różne procesy neuronalne, ale trudno było powiązać funkcję receptora ACh z subkomórkowym położeniem w komórkach, w których ta funkcja jest realizowana. Aby zbadać subkomórkową lokalizację nikotynowych receptorów ACh (nAChR) w natywnej tkance mózgowej, opracowano metodę optyczną precyzyjnego uwalniania nikotyny w dyskretnych miejscach w pobliżu błon neuronalnych podczas zapisów elektrofizjologicznych. Neurony zaciśnięte w plasterkach mózgu są wypełniane barwnikiem, aby uwidocznić ich morfologię podczas 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, a odblokowanie nikotyny odbywa się za pomocą błysku światła poprzez skupienie wiązki laserowej 405 nm w pobliżu jednej lub więcej błon komórkowych. Mierzone są odchylenia prądu komórkowego i tworzony jest trójwymiarowy (3D) obraz zarejestrowanego neuronu o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić pogodzenie odpowiedzi nAChR z morfologią komórkową. Metoda ta pozwala na szczegółową analizę dystrybucji funkcjonalnej nAChR w złożonych preparatach tkankowych, co może przyczynić się do lepszego zrozumienia neuroprzekaźnictwa cholinergicznego.

W przypadku stymulacji fotolizą kluczowymi zmiennymi są dawka ekspozycji (natężenie i czas), miejsce ekspozycji oraz geometria wiązki. System opisany w niniejszym artykule umożliwia zastosowanie dwóch różnych wiązek fotostymulacyjnych, regulowanych poprzez przesuwanie soczewki do wewnątrz lub na zewnątrz ścieżki światła fotostymulacyjnego, zanim wiązka trafi do systemu galwanometru. Bez tej soczewki wiązka fotostymulacyjna wypełnia źrenicę wejściową obiektywu wodnego 60x/1.0 NA [60x WD], tworząc w płaszczyźnie ogniskowej wewnątrz próbki plamkę o rozmiarze sub-µm, bliską granicy dyfrakcyjnej. Jest to związane ze światłem fotostymulacyjnym o kształcie klepsydry, rozciągającym się powyżej i poniżej plamki ogniskowej symetrycznie względem osi optycznej. Po wstawieniu soczewki do ścieżki, światło lasera fotostymulacyjnego jest skupiane w źrenicy wejściowej obiektywu, a następnie wychodzi w postaci wiązki przypominającej ołówek. Wiązka ta, której średnica dla obiektywu 60x powinna wynosić ~10 µm, rozciąga się jednorodnie i pionowo przez całą próbkę. W tym trybie natężenie światła w dowolnym miejscu w obrębie plamki stymulacji będzie wynosić ~1% natężenia małej plamki bliskiej granicy dyfrakcyjnej. W związku z tym przy stymulacji plamką o rozmiarze ~10 µm zazwyczaj wymagana jest wyższa moc lasera. we wszystkich eksperymentach opisanych w niniejszym artykule zastosowano wiązkę fotostymulacyjną typu klepsydra.
Dostarczoną moc próbki można przedstawić na wykresie w zależności od nastawy napięcia wejściowego, po zmierzeniu mocy lasera w miejscu próbki za pomocą miernika mocy. W badaniach tych wykorzystano obiektyw 60x WD o odległości roboczej 2 mm, jednak w celu uniknięcia potencjalnego uszkodzenia elementu detektora nie zanurzano go w wodzie podczas pomiarów mocy. W przypadku pomiarów w powietrzu (bez medium imersyjnego) obiektywów o podanej wartości NA &gt; 0,95 mogą wystąpić straty wynikające z całkowitego wewnętrznego odbicia na przedniej soczewce ze względu na niższy współczynnik załamania (powietrze). W takim przypadku, aby uzyskać dokładniejszy pomiar mocy próbki (w celu skorygowania strat z powodu całkowitego wewnętrznego odbicia), należy zwiększyć zmierzoną moc o wartość dla obiektywu 1,0 NA (1,0/0,95)2 zmierzoną w powietrzu. Rysunek 1a przedstawia typowy wykres wejścia/wyjścia dla laserów widzialnych o długości fali 405 nm i 473 nm, które zostały włączone do systemu wprowadzania wiązki laserowej w niniejszym badaniu. Systemy laserowe te są idealne do kontroli dawki ekspozycji podczas fotostymulacji z następujących powodów: (1) są wstępnie skalibrowane tak, aby zapewnić bezpośrednio liniową moc wyjściową w stosunku do napięcia wejściowego (0-5 V), (2) zapewniają cichą pracę migawki (bez emisji lasera) oraz (3) posiadają szybką kontrolę czasu trwania impulsu intensywności w skali sub-ms (czas odpowiedzi 0,1 ms). Podczas stosowania punktowej fotostymulacji w systemie laser/galvo niezbędnym zadaniem jest rutynowa kalibracja punktów MarkPoints. Rysunek 1b (panel lewy) przedstawia system rozkalibrowany (pożądany punkt do fotostymulacji nie skutkuje dokładną stymulacją tego punktu, co wskazuje lokalizacja wypalonego otworu), a następnie powrót do dokładnego pozycjonowania punktu po kalibracji (Rysunek 1b, panel prawy). 
PA-Nic wykazuje umiarkowaną fluorescencję (pików emisji przy ok. 510 nm), wykazując efektywne wzbudzenie w zakresie 350–450 nm (wzbudzenie jednofotonowe) lub 700–900 nm (wzbudzenie dwufotonowe)5Aby zwizualizować PA-Nic podczas aplikacji lokalnej, naniesiono PA-Nic (1 mM) w pobliże tkanki mózgowej, po czym przeprowadzono jednoczesne obrazowanie: (1) przekroju optycznego tkanki mózgowej w kontekście transmisyjnym przy użyciu kontrastu Dodt oraz (2) fluorescencji emitowanej na skutek wzbudzenia (900 nm) PA-Nic. Fluorescencję 2PE PA-Nic można było łatwo wykryć podczas wtrysku pod ciśnieniem z pipety do aplikacji lokalnej (Rycina 2a). Nikotyna i monoalkilokumaryna, 7-karboksymetyloamino-4-metylokumaryna, są głównymi produktami fotochemicznymi reakcji fotolizy PA-Nic5Stosując te same ustawienia/parametry obrazowania, które wykorzystano do obrazowania PA-Nic, wykonano obrazowanie tkanki podczas podawania nikotyny (1 mM) lub 7-karboksymetylamino-4-metylokumaryny (1 mM). Nie wykryto sygnału fluorescencyjnego (Rycina 2a, panele środkowy i dolny), co potwierdza specyficzność wyników PA-Nic. Na koniec zastosowano PA-Nic w tkance mózgowej i wykonano obrazowanie emisji fluorescencji PA-Nic (Rycina 2b). Podejście to potwierdza, że PA-Nic znajduje się w obrębie 100-200 µm pipety do aplikacji miejscowej. Dane te wspólnie potwierdzają, że PA-Nic jest skutecznie dostarczany do tkanki mózgowej poprzez aplikacja miejscowa
Rejestracje elektrofizjologiczne z jednoczesnym zastosowaniem 2PLSM do wizualizacji struktur komórkowych wymagają od badacza zrównoważenia kwestii dotyczących obu komponentów eksperymentu; często dostępny jest jedynie wąski przedział czasowy (~20 min) na uzyskanie prawidłowych danych z komórki poddanej patch-clampowi. Bez uwzględnienia wizualizacji komórkowej najlepszą praktyką jest rozpoczęcie rejestracji tak szybko, jak to możliwe po przerwaniu błony, ponieważ stabilność rejestracji ma tendencję do spadku w czasie. Jednakże, gdy obrazowanie jest wymagane, rozważania elektrofizjologiczne muszą uwzględniać czas niezbędny do zwiększenia stężenia fluorescencji w małych lub odległych strukturach. Przykładem jest analiza krzywej wypełniania stężeniem barwnika28, której wyznaczenie jest czasami przydatne przy obrazowaniu nowego typu komórek. Rycina 3 przedstawia kilka przykładowych neuronów obrazowanych jako stosy Z (Z-stacks) za pomocą 2PLSM, a następnie scalonych do projekcji maksymalnej intensywności w celach prezentacyjnych. Rycina 3a pokazuje wysokiej jakości obrazy, na których morfologia neuronów wydaje się być kompletna, szum jest zminimalizowany, a zanieczyszczenia nie utrudniają interpretacji morfologii komórkowej. Rycina 3b przedstawia obrazy niższej jakości ze względu na niższy stosunek sygnału do tła oraz znaczną ilość zanieczyszczeń. Zanieczyszczenia te często występują jako sferyczne obszary intensywnej fluorescencji, powstające w wyniku wyrzutu barwnika obrazującego z pipety patch podczas zbliżania się do komórki. Warto zauważyć, że dodanie 100 µM PA-Nic do kąpieli (przy aplikacji kąpielowej) ma tendencję do obniżania stosunku sygnału do tła i prowadzi do nieoptymalnego kontrastu obrazu. Alexa Fluor 568 lub 594 jest często bardzo użyteczna w eksperymentach z aplikacją lokalną jako barwnik pomocniczy (finder dye) lub jako normalizacyjny sygnał odniesienia/normalizacji 2PE. Efektywna długość fali dla dwufotonowego wzbudzenia tych barwników wynosi ~780 nm27, co pozwala na jednoczesną wizualizację PA-Nic i identyfikację przedziałów komórkowych. Ta długość fali nie pozwala jednak całkowicie uniknąć dwufotonowej fotolizy PA-Nic5. Alexa Fluor 488 jest korzystna w eksperymentach z aplikacją kąpielową PA-Nic; przy wzbudzeniu odpowiednią długością fali ≥900 nm można uniknąć dwufotonowej fotolizy PA-Nic5, zachowując jednocześnie odpowiednią wizualizację przedziałów komórkowych.
Rysunek 4 przedstawia przykładowe dane dla zlokalizowanej fotolizy błyskowej PA-Nic laserem w neuronach MHb w skrawkach mózgu. Rysunek 4a (panele górne) pokazuje przykład obrazu „referencyjnego”, który jest zrzutem ekranu ostatniego obrazu 2PLSM wykonanego przed uruchomieniem protokołu MarkPoints, z nałożonym położeniem punktu fotostymulacji. Rysunek 4a (dolne panele obrazów) przedstawia powiększony widok punktu fotostymulacji nałożony na morfologię komórkową. Odpowiadająca mu, skorelowana czasowo odpowiedź elektrofizjologiczna na fotolizę PA-Nic jest pokazana w dolnych panelach Rysunku 4a. Wcześniejsze prace wykazały, że prądy te są wrażliwe na antagonisty nAChR5. Rysunek 4b przedstawia reprezentatywne dane z różnych komórek, w których fotoliza pojedynczego punktu była przeprowadzana w odstępach 1 s lub 10 s. Podczas gdy odstęp 10 s zapewnił wystarczający czas regeneracji prądu podtrzymującego linii bazowej, krótszy odstęp 1 s doprowadził do stopniowego wzrostu prądu podtrzymującego w miarę postępu protokołu. Wzrost prądu sugeruje, że przy odstępie 1 Hz nikotyna nie miała wystarczająco dużo czasu, aby zdyfundować z układu29. Takie analizy odpowiedzi czasowej muszą być przeprowadzane de novo dla każdego nowego badanego typu komórek, ponieważ neurofarmakologia nAChR może różnić się w zależności od typu komórki.
<img alt="Wykres kalibracji lasera i obrazy mikroskopowe; pokazuje skalowanie mocy i wyniki kalibracji ogniskowania wiązki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Kalibracja lasera do fotostymulacji. (a) Moc wyjściowa lasera do fotostymulacji. Moc w płaszczyźnie próbki (przez obiektyw zanurzany w wodzie 60x/1.0 NA) została zmierzona dla laserów do fotostymulacji 405 nm i 473 nm przy wskazanych ustawieniach wyjściowych. (b) Kalibracja lasera do fotostymulacji. Zrzuty ekranu pokazują relację przestrzenną między zamierzonym punktem fotostymulacji a odpowiadającą mu lokalizacją, w której nastąpiła fotostymulacja (otwór wypalony), przed (lewo) i po (prawo) przeprowadzeniu kalibracji w programie MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia z liczeniem fotonów pokazująca detekcję nikotyny z intensywnością GaAsP PMT, analiza schematu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Lokalna aplikacja PA-Nic. (a) Detekcja PA-Nic z pipety do aplikacji lokalnej. 1 mM PA-Nic, produkt uboczny fotolizy lub nikotyna zostały rozpuszczone w ACSF, wprowadzone do pipety do aplikacji lokalnej i podane na tkankę mózgu podczas obrazowania 2PLSM (wzbudzenie 900 nm), stosując te same ustawienia obrazowania dla każdego związku. Skanujący obraz transmisyjny w kontraście Dodta pokazuje tkankę/pipetę, natomiast do rejestracji emisji fluorescencji wykorzystano PMT z katodą GaAsP. (b) PA-Nic (1 mM) wprowadzono do tkanki mózgu drogą perfuzji i obrazowano za pomocą 2PLSM tak jak w punkcie (a), aby wykazać lateralne rozprzestrzenianie się PA-Nic przy użyciu jego wewnętrznej fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie tworzenia kropli mikrofluidycznych; obraz mikroskopowy; dynamika płynów, rozmiar kropli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Pozyskiwanie obrazów z dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej. (a) Optymalne stosy Z 2PLSM. Przedstawiono dwa przykłady projekcji maksymalnej intensywności stosów Z 2PLSM dla neuronów MHb z dobrze rozdzielonymi dendrytami i niewielką lub żadną ilością zakłócających zanieczyszczeń. (b) Suboptymalne stosy Z 2PLSM. Przedstawiono dwa przykłady projekcji maksymalnej intensywności stosów Z 2PLSM dla neuronów MHb otoczonych zanieczyszczeniami (barwnik wydostający się z pipety podczas zbliżania się do komórki). Takie obrazy są trudniejsze do interpretacji niż obrazy pokazane w (a). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i elektrofizjologia wykazująca aktywność neuronów wraz z pomiarami prądu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Fotoliza błyskowa laserowa PA-Nic. (a) Obrazy referencyjne MarkPoints i prądy wewnątrzkomórkowe wywołane fotolizą PA-Nic. Dla jednego neuronu MHb pokazano surowe obrazy referencyjne dla prób fotostymulacji MarkPoints w jednej (wskazanej) lokalizacji komórkowej. Należy zauważyć, że dla niektórych lokalizacji fotostymulacji (obraz najbardziej po prawej w tej serii) struktura dendrytyczna jest w ostrości, ale soma i dendryt proksymalny nie są. Poniżej każdego obrazu referencyjnego naniesiono wykres prądu wewnątrzkomórkowego wywołanego uwalnianiem nikotyny. (b) Odstępy między bodźcami dla fotolizy PA-Nic. Pokazano przykładowe rejestracje dla neuronów MHb, w których nikotyna była wielokrotnie uwalniana w tej samej lokalizacji perisomatycznej z odstępem między bodźcami wynoszącym 1 s lub 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł przedstawia metodę badania nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR) w wycinkach mózgu myszy poprzez uwalnianie nikotyny. W połączeniu z jednoczesnym rejestrowaniem za pomocą klamry krosowej i 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, odblokowanie nikotyny łączy funkcję receptora nikotynowego z morfologią komórki, zapewniając głębsze zrozumienie neurobiologii cholinergicznej.

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Technika ta wykorzystuje wielofotonową laserową mikroskopię skaningową w połączeniu z fotolizą fotoaktywowaną cząsteczką nikotyny z błyskiem laserowym. Umożliwia precyzyjną aktywację nikotynowych receptorów cholinergicznych. Technika ta pozwala na precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną nad zastosowaniem agonisty receptora nikotynowego, zapewniając potężne narzędzie do badania wzorców funkcjonalnej ekspresji receptora i cholinergicznej transmisji synaptycznej lub objętościowej.Przed rozpoczęciem procedury należy użyć programowalnego ściągacza do pipet, aby wyciągnąć szklaną mikropipetę o średnicy otworu od 20 do 40 mikrometrów. Przecedź około jednego mililitra roztworu nagrywającego przez filtr 0,22 mikrona. I ponownie zawiesić wystarczającą ilość liofilizowanej fotoaktywowanej nikotyny w przefiltrowanym roztworze nagrywającym, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch milimolów.Wypełnij wyciągniętą mikropipetę do aplikacji miejscowej 50 mikrolitrami leku fotoaktywowanego i zabezpiecz pipetę w uchwycie na pipety zamontowanym na mikromanipulatorze. Podłącz uchwyt pipety za pomocą rurki o odpowiedniej długości do systemu wyrzutu ciśnienia, który może być stosowany przy niskim ciśnieniu. I użyj mikromanipulatora, aby manewrować lokalną pipetą aplikacyjną do zewnątrzkomórkowego roztworu rejestrującego.Umieść końcówkę pipety nieco nad próbką tkanki mózgowej myszy, około 50 mikrometrów od interesującej nas komórki. I krótko przyłóż od jednego do dwóch funtów na cal kwadratowy ciśnienia na pipetę. Przemieszczenie komórki będącej przedmiotem zainteresowania powinno być minimalne lub żadne.Po uzyskaniu stabilnego zacisku krosowego na całe komórki, włącz niską aplikację na urządzeniu do wyrzutu ciśnienia i nasyc tkankę otaczającą komórkę fotoaktywowaną nikotyną na jedną do dwóch minut. Aplikacja lokalna wprowadza dodatkową złożoność do eksperymentu. Ale oszczędza związek i pozwala na wykorzystanie wyższych stężeń PA-Nic.W przypadku stosowania fotoaktywowanej nikotyny w kąpieli, najpierw rozpuść wystarczającą ilość liofilizowanego leku w objętości roztworu rejestrującego odpowiedniej do ciągłej recyrkulacji do końcowego stężenia 100 mikromolów. I załaduj powstałą mieszaninę do systemu perfuzyjnego. Następnie rozpocznij recyrkulację fotoaktywowanego roztworu nikotyny z szybkością od 1,5 do 2 milimetrów na minutę, używając rurek o minimalnej średnicy wewnętrznej i całkowitej długości, aby zminimalizować wymaganą objętość recyrkulacji.Podczas recyrkulacji należy w sposób ciągły bąbelkować roztwór karbogenem i utrzymywać temperaturę kąpieli na poziomie 32 stopni Celsjusza w warunkach słabego oświetlenia. Aplikacja do kąpieli korzysta z prostoty i jednorodności przenikania PA-Nic przez tkankę. Ale z konieczności wykorzystuje niższe mikromolowe stężenia PA-Nic i zużywa większe całkowite ilości związku.Do wizualizacji na żywo neuronu przyśrodkowego habenula użyj optycznej optyki kontrastowej z interferencją przechodzącą lub w podczerwieni oraz kamery wideo, aby uzyskać stabilny zapis z klamrą krosową całej komórki. Po ustaleniu konfiguracji ogniwa o wysokiej rezystancji, ale przed włamaniem, przełącz konfigurację i oprogramowanie w tryb skanowania laserowego. Po włamaniu użyj skanowania laserowego, aby sprawdzić, czy interesujący nas barwnik obrazowania pasywnie wypełnia neuron przez dyfuzję.Pozwól barwnikowi wypełnić przedziały komórkowe przez co najmniej 20 do 30 minut przed użyciem funkcji skanowania na żywo w celu wizualizacji interesującego neuronu i przedziału subkomórkowego. Wybierz parametry obrazowania, które umożliwiają dokładną wizualizację na żywo cech neuronalnych, manipulując odpowiednimi ustawieniami, aby w razie potrzeby wpłynąć na wizualizację wyświetlacza, rozdzielczość, stosunek sygnału do szumu i czas akwizycji klatki obrazu lub zmienić je. Aby zwiększyć kontrast sygnału, otwórz okno tabeli przeglądów i dostosuj ustawienia podłogi i sufitu tabeli przeglądów.Aby zlokalizować obszar zainteresowania w tkance, wybierz 1-krotny zoom optyczny i użyj elementów sterujących panoramowaniem. Użyj narzędzia Seria Z, aby wybrać pozycję początkową i końcową, która zawiera interesującą komórkę. Ustaw rozmiar kroku równy jednemu mikrometrowi i wybierz rozmiar obrazu, który zapewni obraz o najwyższej rozdzielczości.Często 1 024 na 1 024 piksele na linię. Następnie kolejno wyobraź sobie neuron w każdej płaszczyźnie Z, która zawiera komórkę. Aby skalibrować stymulację laserową, rozpocznij skanowanie systemu z mocą lasera obrazowania większą niż minimalna i dostosuj ostrość obiektywu do cienkiej warstwy fluorescencji z czerwonym markerem.Wybierz obszar w polu fluorescencji wolny od zanieczyszczeń i równomiernie pokryty markerem, a następnie otwórz menu narzędzi, kalibracji i wyrównania, aby wybrać funkcję galvokalibracji odblokowywania. Postępuj zgodnie z samouczkiem dotyczącym miejsc oparzenia, aby przeprowadzić kalibrację przestrzenną drugiej pary luster galwanometru, wybierając laser 405 nm, moc stymulacji laserowej 400 i czas trwania stymulacji 20 milisekund. Aby uzyskać otwory o średnicy od jednego do pięciu mikrometrów w czerwonym znaczniku.Wybierz opcję Aktualizuj, aby stymulować i odświeżać obraz po wypaleniu środkowego punktu, a następnie przesuń okrągły czerwony wskaźnik do rzeczywistego położenia punktu środkowego, prawego, środkowego i dolnego środkowego, aby uzyskać siatkę dziewięciu punktów. Aby przetestować kalibrację, należy otworzyć okno oznaczania punktów i ręcznie aktywować parametry stymulacji zdefiniowanych punktów w nowym obszarze próbki, zwracając uwagę na to, aby do okna punktów znaczników został załadowany prawidłowy najnowszy plik kalibracyjny. Następnie zastosuj impuls testowy, aby zweryfikować poprawność kalibracji.Aby krótko zobrazować i zlokalizować subkomórkowy obszar zainteresowania, wybierz skanowanie na żywo i użyj zwiększonego zoomu optycznego, aby w razie potrzeby zobrazować wszelkie małe struktury. Umieść punkt oznaczający pojedynczy punkt celownika bezpośrednio przylegający do błony komórkowej i ustaw parametry fotostymulacji na czas trwania od jednej do 50 milisekund, moc lasera od jednego do czterech miliwatów i co najmniej jedną próbę. Następnie wybierz opcję uruchom oznaczanie punktów, aby zainicjować protokół oznaczania punktów i obserwować akwizycję danych elektrofizjologicznych w czasie rzeczywistym.Fotoaktywowana fluorescencja nikotyny 2PE jednomilimolowego PA-Nic jest łatwo wykrywalna podczas wyrzucania ciśnienia z lokalnej pipety, jak pokazano. Natomiast dostarczanie głównych produktów fotochemicznych reakcji fotolizy nikotyny fotoaktywowanej nie generuje sygnału fluorescencyjnego o tym samym stężeniu i mocy wzbudzenia oraz długości fali. Wykazanie swoistości wyników fotoaktywowanej nikotyny.Obrazowanie fotoaktywowanej nikotyny zastosowanej do tkanki mózgowej, jak wykazano, ujawnia obecność leku w promieniu od 100 do 200 mikrometrów od miejscowej pipety aplikacyjnej. Potwierdzenie, że fotoaktywowana nikotyna może być skutecznie dostarczana do tkanki mózgowej poprzez aplikację miejscową. Tutaj pokazane są wysokiej jakości obrazy, w których morfologia neuronów wydaje się być kompletna, szum jest zminimalizowany, a szczątki nie przeszkadzają w interpretacji morfologii komórkowej.Obrazy te są jednak gorszej jakości. Ze względu na niższy stosunek sygnału do tła i znaczne ilości zanieczyszczeń. Połączenie dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej przyśrodkowych neuronów habenula w wycinkach mózgu z laserową fotolizą błyskową PA-Nic, jak pokazano, pozwala na pogodzenie odpowiedzi elektrofizjologicznych z morfologią komórkową.Fotoliza jednopunktowa wykonywana w 10-sekundowych odstępach czasu pozwala na wystarczający czas powrotu do podstawowego prądu podtrzymania. Podczas gdy krótszy jednosekundowy interwał prowadzi do stopniowego wzrostu prądu trzymania w miarę postępu protokołu. Sugeruje to, że nikotyna nie ma wystarczająco dużo czasu, aby rozproszyć się z systemu w krótszych odstępach czasu.Projektując eksperymenty wykorzystujące cząsteczki fotoaktywowane, należy pamiętać o doborze wskaźników fluorescencyjnych i raportowaniu fluoroforów o kompatybilnych widmach emisji wzbudzenia. PA-Nic jest kompatybilny z większością popularnych fluoroforów ze względu na pik fotolizy o krótkiej długości fali. Wybierając najbardziej odpowiednią technikę aplikacji PA-Nic, ważne jest, aby dokładnie rozważyć ekspresję funkcjonalną, fizjologiczną aktywność receptorów nikotynowych w neuronach będących przedmiotem zainteresowania.Umiejętne wykorzystanie tej techniki pozwala na precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aplikacji nikotyny, co otwiera nowe, ekscytujące możliwości badania kinetyki natywnego zaangażowania receptorów nikotynowych, lokalizacji subkomórkowej i modulacji aktywności neuronalnej przez aktywację receptora nikotynowego.

probing-nicotinic-acetylcholine-receptor-function-mouse-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Ten film pokazuje, jak aktywacja nikotynowych receptorów acetylocholiny w brzusznym hipokampie myszy za pośrednictwem nikotyny powoduje trwałą sygnalizację wapniową wzdłuż aksonów.

Obrazowanie sygnalizacji wapniowej indukowanej nikotyną wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa w kokulturach synaptycznych

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu.  Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Opracowaliśmy genowo-chimeryczny preparat brzusznego obwodu hipokamp – półleżący in vitro, który umożliwia bezpośrednie obrazowanie na żywo w celu analizy presynaptycznych mechanizmów transmisji synaptycznej za pośrednictwem nikotynowych receptorów acetylocholiny (nAChR). Preparat ten zapewnia również pouczające podejście do badania pre- i postsynaptycznych mechanizmów plastyczności synaptycznej.

Obrazowanie na żywo indukowanej nikotyną sygnalizacji wapnia i uwalniania neuroprzekaźników wzdłuż brzusznych aksonów hipokampa

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Przedstawiamy protokół do oceny równowagi między uwalnianiem glutaminianu a klirensem w pojedynczych synapsach glutaminergicznym korowo-prążkowych w ostrych wycinkach od dorosłych myszy. Protokół ten wykorzystuje czujnik fluorescencyjny iGluu do wykrywania glutaminianu, kamerę sCMOS do akwizycji sygnału oraz urządzenie do ogniskowego oświetlenia laserowego.

Wskaźniki uwalniania i wychwytu glutaminianu w pojedynczych synapsach w ostrych wycinkach mózgu od myszy normalnych i myszy z chorobą Huntingtona

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

Fotoliza związków klatkowanych pozwala na gwałtowny i zlokalizowany wzrost stężenia różnych związków aktywnych fizjologicznie. W niniejszej pracy przedstawiamy sposób uzyskiwania rejestracji metodą patch-clamp w połączeniu z fotolizą klatkowanego cAMP lub klatkowanego Ca w celu badania transdukcji węchowej w dysocjowanych neuronach sensorycznych węchu myszy.

Fotoliza błyskowa związków klatkowych w rzęskach neuronów sensorycznych węchu

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).

Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila

Poznaj metodę fotolizy fotoaktywowanej nikotyny do badania nikotynowych receptorów acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy. Technika łączy mikroskopię wielofotonową z rejestracją patch clamp, umożliwiając precyzyjną analizę funkcji receptorów i morfologii komórkowej w czasie rzeczywistym.

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny (Wideo) | JoVE Journal

Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Przeglądaj więcej filmów