Badanie funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy za pomocą laserowej fotolizy fotoaktywowanej nikotyny

Technika ta wykorzystuje wielofotonową laserową mikroskopię skaningową w połączeniu z fotolizą fotoaktywowaną cząsteczką nikotyny z błyskiem laserowym. Umożliwia precyzyjną aktywację nikotynowych receptorów cholinergicznych. Technika ta pozwala na precyzyjną kontrolę czasoprzestrzenną nad zastosowaniem agonisty receptora nikotynowego, zapewniając potężne narzędzie do badania wzorców funkcjonalnej ekspresji receptora i cholinergicznej transmisji synaptycznej lub objętościowej.

Przed rozpoczęciem procedury należy użyć programowalnego ściągacza do pipet, aby wyciągnąć szklaną mikropipetę o średnicy otworu od 20 do 40 mikrometrów. Przecedź około jednego mililitra roztworu nagrywającego przez filtr 0,22 mikrona. I ponownie zawiesić wystarczającą ilość liofilizowanej fotoaktywowanej nikotyny w przefiltrowanym roztworze nagrywającym, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch milimolów.

Wypełnij wyciągniętą mikropipetę do aplikacji miejscowej 50 mikrolitrami leku fotoaktywowanego i zabezpiecz pipetę w uchwycie na pipety zamontowanym na mikromanipulatorze. Podłącz uchwyt pipety za pomocą rurki o odpowiedniej długości do systemu wyrzutu ciśnienia, który może być stosowany przy niskim ciśnieniu. I użyj mikromanipulatora, aby manewrować lokalną pipetą aplikacyjną do zewnątrzkomórkowego roztworu rejestrującego.

Umieść końcówkę pipety nieco nad próbką tkanki mózgowej myszy, około 50 mikrometrów od interesującej nas komórki. I krótko przyłóż od jednego do dwóch funtów na cal kwadratowy ciśnienia na pipetę. Przemieszczenie komórki będącej przedmiotem zainteresowania powinno być minimalne lub żadne.

Po uzyskaniu stabilnego zacisku krosowego na całe komórki, włącz niską aplikację na urządzeniu do wyrzutu ciśnienia i nasyc tkankę otaczającą komórkę fotoaktywowaną nikotyną na jedną do dwóch minut. Aplikacja lokalna wprowadza dodatkową złożoność do eksperymentu. Ale oszczędza związek i pozwala na wykorzystanie wyższych stężeń PA-Nic.

W przypadku stosowania fotoaktywowanej nikotyny w kąpieli, najpierw rozpuść wystarczającą ilość liofilizowanego leku w objętości roztworu rejestrującego odpowiedniej do ciągłej recyrkulacji do końcowego stężenia 100 mikromolów. I załaduj powstałą mieszaninę do systemu perfuzyjnego. Następnie rozpocznij recyrkulację fotoaktywowanego roztworu nikotyny z szybkością od 1,5 do 2 milimetrów na minutę, używając rurek o minimalnej średnicy wewnętrznej i całkowitej długości, aby zminimalizować wymaganą objętość recyrkulacji.

Podczas recyrkulacji należy w sposób ciągły bąbelkować roztwór karbogenem i utrzymywać temperaturę kąpieli na poziomie 32 stopni Celsjusza w warunkach słabego oświetlenia. Aplikacja do kąpieli korzysta z prostoty i jednorodności przenikania PA-Nic przez tkankę. Ale z konieczności wykorzystuje niższe mikromolowe stężenia PA-Nic i zużywa większe całkowite ilości związku.

Do wizualizacji na żywo neuronu przyśrodkowego habenula użyj optycznej optyki kontrastowej z interferencją przechodzącą lub w podczerwieni oraz kamery wideo, aby uzyskać stabilny zapis z klamrą krosową całej komórki. Po ustaleniu konfiguracji ogniwa o wysokiej rezystancji, ale przed włamaniem, przełącz konfigurację i oprogramowanie w tryb skanowania laserowego. Po włamaniu użyj skanowania laserowego, aby sprawdzić, czy interesujący nas barwnik obrazowania pasywnie wypełnia neuron przez dyfuzję.

Pozwól barwnikowi wypełnić przedziały komórkowe przez co najmniej 20 do 30 minut przed użyciem funkcji skanowania na żywo w celu wizualizacji interesującego neuronu i przedziału subkomórkowego. Wybierz parametry obrazowania, które umożliwiają dokładną wizualizację na żywo cech neuronalnych, manipulując odpowiednimi ustawieniami, aby w razie potrzeby wpłynąć na wizualizację wyświetlacza, rozdzielczość, stosunek sygnału do szumu i czas akwizycji klatki obrazu lub zmienić je. Aby zwiększyć kontrast sygnału, otwórz okno tabeli przeglądów i dostosuj ustawienia podłogi i sufitu tabeli przeglądów.

Aby zlokalizować obszar zainteresowania w tkance, wybierz 1-krotny zoom optyczny i użyj elementów sterujących panoramowaniem. Użyj narzędzia Seria Z, aby wybrać pozycję początkową i końcową, która zawiera interesującą komórkę. Ustaw rozmiar kroku równy jednemu mikrometrowi i wybierz rozmiar obrazu, który zapewni obraz o najwyższej rozdzielczości.

Często 1 024 na 1 024 piksele na linię. Następnie kolejno wyobraź sobie neuron w każdej płaszczyźnie Z, która zawiera komórkę. Aby skalibrować stymulację laserową, rozpocznij skanowanie systemu z mocą lasera obrazowania większą niż minimalna i dostosuj ostrość obiektywu do cienkiej warstwy fluorescencji z czerwonym markerem.

Wybierz obszar w polu fluorescencji wolny od zanieczyszczeń i równomiernie pokryty markerem, a następnie otwórz menu narzędzi, kalibracji i wyrównania, aby wybrać funkcję galvokalibracji odblokowywania. Postępuj zgodnie z samouczkiem dotyczącym miejsc oparzenia, aby przeprowadzić kalibrację przestrzenną drugiej pary luster galwanometru, wybierając laser 405 nm, moc stymulacji laserowej 400 i czas trwania stymulacji 20 milisekund. Aby uzyskać otwory o średnicy od jednego do pięciu mikrometrów w czerwonym znaczniku.

Wybierz opcję Aktualizuj, aby stymulować i odświeżać obraz po wypaleniu środkowego punktu, a następnie przesuń okrągły czerwony wskaźnik do rzeczywistego położenia punktu środkowego, prawego, środkowego i dolnego środkowego, aby uzyskać siatkę dziewięciu punktów. Aby przetestować kalibrację, należy otworzyć okno oznaczania punktów i ręcznie aktywować parametry stymulacji zdefiniowanych punktów w nowym obszarze próbki, zwracając uwagę na to, aby do okna punktów znaczników został załadowany prawidłowy najnowszy plik kalibracyjny. Następnie zastosuj impuls testowy, aby zweryfikować poprawność kalibracji.

Aby krótko zobrazować i zlokalizować subkomórkowy obszar zainteresowania, wybierz skanowanie na żywo i użyj zwiększonego zoomu optycznego, aby w razie potrzeby zobrazować wszelkie małe struktury. Umieść punkt oznaczający pojedynczy punkt celownika bezpośrednio przylegający do błony komórkowej i ustaw parametry fotostymulacji na czas trwania od jednej do 50 milisekund, moc lasera od jednego do czterech miliwatów i co najmniej jedną próbę. Następnie wybierz opcję uruchom oznaczanie punktów, aby zainicjować protokół oznaczania punktów i obserwować akwizycję danych elektrofizjologicznych w czasie rzeczywistym.

Fotoaktywowana fluorescencja nikotyny 2PE jednomilimolowego PA-Nic jest łatwo wykrywalna podczas wyrzucania ciśnienia z lokalnej pipety, jak pokazano. Natomiast dostarczanie głównych produktów fotochemicznych reakcji fotolizy nikotyny fotoaktywowanej nie generuje sygnału fluorescencyjnego o tym samym stężeniu i mocy wzbudzenia oraz długości fali. Wykazanie swoistości wyników fotoaktywowanej nikotyny.

Obrazowanie fotoaktywowanej nikotyny zastosowanej do tkanki mózgowej, jak wykazano, ujawnia obecność leku w promieniu od 100 do 200 mikrometrów od miejscowej pipety aplikacyjnej. Potwierdzenie, że fotoaktywowana nikotyna może być skutecznie dostarczana do tkanki mózgowej poprzez aplikację miejscową. Tutaj pokazane są wysokiej jakości obrazy, w których morfologia neuronów wydaje się być kompletna, szum jest zminimalizowany, a szczątki nie przeszkadzają w interpretacji morfologii komórkowej.

Obrazy te są jednak gorszej jakości. Ze względu na niższy stosunek sygnału do tła i znaczne ilości zanieczyszczeń. Połączenie dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej przyśrodkowych neuronów habenula w wycinkach mózgu z laserową fotolizą błyskową PA-Nic, jak pokazano, pozwala na pogodzenie odpowiedzi elektrofizjologicznych z morfologią komórkową.

Fotoliza jednopunktowa wykonywana w 10-sekundowych odstępach czasu pozwala na wystarczający czas powrotu do podstawowego prądu podtrzymania. Podczas gdy krótszy jednosekundowy interwał prowadzi do stopniowego wzrostu prądu trzymania w miarę postępu protokołu. Sugeruje to, że nikotyna nie ma wystarczająco dużo czasu, aby rozproszyć się z systemu w krótszych odstępach czasu.

Projektując eksperymenty wykorzystujące cząsteczki fotoaktywowane, należy pamiętać o doborze wskaźników fluorescencyjnych i raportowaniu fluoroforów o kompatybilnych widmach emisji wzbudzenia. PA-Nic jest kompatybilny z większością popularnych fluoroforów ze względu na pik fotolizy o krótkiej długości fali. Wybierając najbardziej odpowiednią technikę aplikacji PA-Nic, ważne jest, aby dokładnie rozważyć ekspresję funkcjonalną, fizjologiczną aktywność receptorów nikotynowych w neuronach będących przedmiotem zainteresowania.

Umiejętne wykorzystanie tej techniki pozwala na precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aplikacji nikotyny, co otwiera nowe, ekscytujące możliwości badania kinetyki natywnego zaangażowania receptorów nikotynowych, lokalizacji subkomórkowej i modulacji aktywności neuronalnej przez aktywację receptora nikotynowego.