Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej
25 stycznia 2019
Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.
Nasz protokół jest istotny, ponieważ może być wykorzystany do identyfikacji sekwencji genomowych, których nie można wyizolować z sekwencji współoczyszczających, które same w sobie mogą być tylko częściowo znane. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niedroga, wykorzystuje głównie darmowe oprogramowanie, które można pobrać, a także jest elastyczna. Można go zastosować do wielu zagadnień biologicznych.
Potencjalne zastosowania obejmują identyfikację celów szczepionek bakteryjnych i identyfikację wirusów, których sekwencje znacznie różnią się od znanych drobnoustrojów. Metoda ta może być zastosowana do każdego systemu, w którym nieznane nie może być eksperymentalnie oddzielone, o ile dostępna jest sekwencja referencyjna bez celu genomowego. Ta technika wymaga trochę prób i błędów, więc ważna jest cierpliwość.
Może być konieczne rozwiązywanie problemów z programami. Możesz używać programów innych niż te, które tutaj opisujemy. W miarę możliwości korzystaj z instrukcji obsługi.
Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ praca obliczeniowa zależy od podstawowej wiedzy na temat struktury programowania wiersza poleceń. Na początek użyj Trimmomatic 0.32 do usunięcia adapterów illumina i podstaw niskiej jakości. Użyj Pear w wersji 0.9.11, aby utworzyć wysokiej jakości scalone odczyty ze sparowanych odczytów wyjściowych trimmomatic przy użyciu parametrów domyślnych.
Następnie użyj Reptile w wersji 1.1, aby poprawić błędy odczytów generowanych przez Pear. Na koniec użyj Trinity w wersji 2.4.0 w trybie domyślnym, aby złożyć poprawione sekwencje. W przypadku bibliotek specyficznych dla pasma należy użyć parametru SS_lib_type .
Wynikiem jest plik FASA, który zostanie umieszczony w nowym katalogu o nazwie trinity_output. Utwórz bazę danych BLAST sekwencji referencyjnej nucleotide_reference. fasta w wierszu poleceń.
BLAST dopasował zapytanie złożone do referencyjnej bazy danych. Aby uzyskać plik wyjściowy, użyj BLAST_results. txt Aby wygenerować tabelaryczne dane wyjściowe wymagane do etapów przetwarzania podsekwencji za pomocą skryptów Pythona, użyj outfmt 6 Aby zwiększyć rygorystyczność, użyj sekwencji białek z zestawu jako zapytania BLAST z przetłumaczonym nukleotydem BLAST, który wykonuje sześciokierunkową translację bazy danych nukleotydów.
Aby uzyskać sekwencje białek dla zapytania, uruchom TransDecoder. Long0rfs do identyfikowania najdłuższych otwartych ramek odczytu ze złożonych sekwencji zapytań. Teraz uruchom tblastn.
W razie potrzeby upewnij się, że wybrano prawidłowy kod genetyczny dla badanego organizmu za pomocą opcji db_gencode z odpowiednim kodem. Jeśli dostępne jest białko referencyjne wysokiej jakości, należy użyć dopasowania białko-białko za pomocą blastp, a nie tblastn Utwórz bazę danych BLAST odniesienia białka. Upewnij się, że wynik został zapisany jako plik do dalszego przetwarzania i użyj danych wyjściowych tabelarycznych, aby upewnić się, że skrypty języka Python mogą je poprawnie przeanalizować.
Teraz użyj subtraktywnego skryptu Pythona, aby usunąć wszelkie pasujące sekwencje. Aby zamapować odczyty na zestaw, użyj BWA-MEM w wersji 0.7.12 lub bowtie 2 w celu zamapowania pobranych nieprzetworzonych odczytów na zestaw zapytań. Najpierw zindeksuj zestaw, a następnie zamapuj odczyty.
Dane wyjściowe będą w formacie SAM. Uruchom skrypt języka Python removeUnmapped. py używając pliku SAM jako danych wejściowych.
Identyfikuje nazwy sekwencji zapytań bez żadnych pasujących odczytów i zapisuje je w nowym pliku tekstowym. Danymi wyjściowymi poprzedniego kroku jest lista nazw sekwencji w pliku txt. Wyodrębnij plik FASTA z tymi sekwencjami.
Wyjściem będzie plik fasta. Użyj programu Genius, aby ręcznie określić optymalne sekwencje starterów. Podkreśl sekwencję kandydującą od 21 do 28 par zasad dla startera do przodu, unikając przebiegów czterech lub więcej dowolnej zasady.
Spróbuj celować w region z dość jednolitą kombinacją wszystkich par zasad. Pojedyncze G lub C na trzech głównych końcach jest korzystne, pomagając zakotwiczyć starter. Kliknij kartę Statystyki po prawej stronie ekranu, aby wyświetlić szacowaną temperaturę topnienia tej sekwencji, gdy zaznaczony jest region kandydujący.
Dąż do temperatury topnienia między 55 a 60 stopni Celsjusza, unikając powtórzeń i długich serii G C. Wybierz odwrócony starter w ten sam sposób, umieszczony od 150 do 250 par zasad trzy prime przedniego startera. Chociaż długości podkładu nie muszą się zgadzać, przewidywana temperatura topnienia powinna być jak najbardziej zbliżona do temperatury startera przedniego. Pamiętaj, aby odwrócić uzupełnianie sekwencji, klikając prawym przyciskiem myszy w Genius, gdy sekwencja jest podświetlona w opcji menu.
Alternatywną metodą jest użycie funkcji Primer Design, która znajduje się na górnym pasku narzędzi w oknie Sekwencja. Wstaw region do wzmocnienia w obszarze Region docelowy. Na karcie charakterystyki wprowadź żądany rozmiar, temperaturę topnienia i procent G C, a następnie kliknij przycisk OK, aby wygenerować startery.
Aby przeprowadzić ilościową walidację pozostałej sekwencji metodą PCR, należy najpierw przygotować mieszaninę reakcyjną dla każdej matrycy w trzech egzemplarzach, z naszą mieszanką SYBR Green Master Mix, starterami do przodu i do tyłu oraz wodą, o łącznej objętości 25 mikrolitrów. Uruchom program qPCR w oparciu o wcześniej zweryfikowaną temperaturę i czas przedłużenia. Końcowe krzywe denaturacji powinny być generowane co najmniej przy pierwszym zastosowaniu starterów w qPCR w celu walidacji amplifikacji pojedynczego produktu DNA.
Zmierz zielone sygnały qPCR SYBR w stosunku do aktyny przez Ct We wszystkich przypadkach oblicz średnią i odchylenie standardowe dwa do Ct względem aktyny. Wykonaj elektroforezę żelu w punkcie końcowym, aby potwierdzić prawidłowe wykrycie rozmiaru produktu za pomocą qPCR. Tutaj uruchom 25 mikrolitrów produktu qPCR zmieszanego z pięcioma mikrolitrami barwnika 6X Glitterol na żelu agarozowym 2% TAE pod napięciem 200 woltów przez 20 minut.
Jeśli qPCR wykaże, że nie zidentyfikowałeś sekwencji docelowych, powtórz cały cykl z nowym odniesieniem, które można uzyskać z internetowej bazy danych. Projekt subtraktywny w tym przypadku rozpoczął się od sekwencjonowania RNA z tkanki wyściełanej zarodkami samca i samicy dorosłego zeberki. Ostatecznie zidentyfikowano 935 genów somatycznych, które wcześniej nie były uwzględnione w adnotacji całego genomu.
Po filtrowaniu obliczeniowym ilościowy PCR może dać ujemny wynik, w którym nie było różnicy w wykrywalności w tkankach ptaków. I odwrotnie, pozytywny wynik reprezentujący identyfikację prawdziwej sekwencji docelowej jest potwierdzony, gdy qPCR genomowego DNA wykazuje statystycznie większą wykrywalność w tkance będącej przedmiotem zainteresowania w stosunku do wartości referencyjnej. W tym przypadku potwierdzono, że gen alfa snap jest ograniczony do linii zarodkowej, ponieważ był zubożony w tkance somatycznej w stosunku do DNA jądra, w którym występował na poziomie równoważnym aktynie.
Ważne jest, aby pamiętać o użyciu właściwych danych wejściowych podczas każdego z kroków obliczeniowych. Być może będziesz musiał wielokrotnie przejść przez odejmowanie cyklu, aby uzyskać docelową sekwencję lub sekwencje. Odkryte geny można przeprowadzić różnorodną analizę filonetyczną, strukturalną i funkcjonalną.
Te dodatkowe metody dają wgląd w ewolucyjną i funkcjonalną rolę genów. Zidentyfikowaliśmy pierwszy gen na chromosomie ptaka śpiewającego z ograniczeniami linii zarodkowej, co poszerzyło zainteresowanie tym zaskakującym elementem genomu. Późniejsze prace wykazały podobne chromosomy u wielu gatunków ptaków śpiewających zawierających wiele dodatkowych genów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia identyfikację sekwencji genomowych, które są trudne do wyizolowania z sekwencji współoczyszczanych. Wykorzystuje on zarówno techniki obliczeniowe, jak i laboratoryjne, co czyni go możliwym do zastosowania w różnych badaniach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Biologia obliczeniowa
- Mikrobiologia
Wstęp
- Identyfikacja sekwencji genomowych może być trudna, gdy współoczyszczają się one z innymi sekwencjami.
- Niektóre współoczyszczone sekwencje mogą być znane jedynie częściowo.
- Metoda ta jest kosztowo efektywna, ponieważ wykorzystuje głównie bezpłatne oprogramowanie.
- Jest ona elastyczna i pozwala na rozstrzygnięcie wielu pytań biologicznych.
Cel badania
- W celu znalezienia nowych sekwencji genomicznych, których nie można łatwo oddzielić od sekwencji współoczyszczonych.
- W celu dostarczenia metody stosowalnej w różnych systemach biologicznych.
- W celu usprawnienia identyfikacji potencjalnych celów dla szczepionek bakteryjnych oraz nieznanych sekwencji wirusowych.
Zastosowane metody
- Połączenie analizy obliczeniowej i technik eksperymentalnych.
- Wykorzystanie bezpłatnego oprogramowania do analizy genomicznej.
- Zastosowanie metody prób i błędów w celu udoskonalenia procedury.
- Do skutecznej implementacji wymagane są sekwencje referencyjne.
Główne wyniki
- Protokół z sukcesem identyfikuje sekwencje genomowe, które są trudne do wyizolowania.
- Wykazuje on elastyczność w różnych kontekstach biologicznych.
- Potencjalne zastosowania obejmują identyfikację celów szczepionek oraz nieznanych sekwencji wirusowych.
- Z uwagi na metodę prób i błędów kluczowa jest cierpliwość.
Wnioski
- Technika ta jest cennym narzędziem w badaniach genomowych.
- Otwiera ona nowe możliwości identyfikacji ważnych sekwencji biologicznych.
- Dalsze udoskonalenie i zastosowanie tej metody mogą prowadzić do istotnych odkryć w mikrobiologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Genomika subtraktywna umożliwia identyfikację nowych sekwencji genomowych, których nie można wyizolować fizycznie z mieszanin złożonych, rozwiązując tym samym kluczowy problem w procesie odkrywania celów dla rozwoju szczepionek i badań nad lekami przeciwwirusowymi. Poprzez obliczeniowe odjęcie znanych sekwencji referencyjnych z mieszanych danych genomicznych, metoda ta wspiera wczesną walidację celów w sytuacjach, gdy oczyszczanie fizyczne jest niepraktyczne lub zbyt kosztowne. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji głównych kandydatów, zapewniając skalowalną i niskokosztową drogę do odkrywania biologicznie istotnych sekwencji, takich jak antygeny wirusowe czy bakteryjne czynniki wirulencji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację sekwencji specyficznych dla patogenu z szumu genomicznego gospodarza lub tła.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez iteracyjne filtrowanie komputerowe i potwierdzenie ekspresji tkankowo-specyficznej za pomocą qPCR.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację genów ograniczonych do linii zarodkowej lub wzbogaconych w patogenach, które mogą stanowić selektywne punkty interwencji.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Wartość naukowa: Generuje zwalidowane sekwencje kwasów nukleowych odpowiednie do opracowywania testów opartych na qPCR oraz do przesiewania wysokoprzepustowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację schematów detekcji poprzez projektowanie starterów i walidację wydajności amplifikacji.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dla wielu celów poprzez dostosowanie cykli odejmowania referencyjnego do nowych kontekstów genomicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie wzbogacenia celu w tkankach istotnych dla choroby za pomocą ilościowego PCR.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Redukuje niejednoznaczność w biologii celu poprzez weryfikację tkankowo specyficznych wzorców ekspresji przed badaniami funkcjonalnymi.
- Dopasowanie biomarkerów: Wspiera identyfikację sekwencji o różnicowej ekspresji, które mogą służyć jako biomarkery translacyjne w modelach infekcji lub chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, umożliwiając identyfikację celów na podstawie postawionych hipotez przed generowaniem związków wiodących i oceną przedkliniczną, szczególnie w sytuacjach, gdy sekwencje celowe są utrudnione przez złożoność genomiczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez odejmowanie znanych elementów genomowych w celu ujawnienia nowych sekwencji o znaczeniu badawczym, takich jak geny specyficzne dla patogenów lub geny o ograniczonej ekspresji.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie sekwencji gotowych do analizy z walidowanymi starterami, co umożliwia wiarygodne przesiewanie związków lub interwencji w dalszych etapach procesu.
- Analityka: Generuje ilościowe wartości Ct oraz dane z krzywych topnienia z qPCR, co pozwala na analizę porównawczą obfitości celu w różnych typach próbek.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkrywania z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację wzbogacenia celu w komórkach linii płciowej lub zakażonych tkankach w stosunku do kontroli somatycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku cykl obliczeniowo-eksperymentalny służący do iteracyjnego doprecyzowania sekwencji celów w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich dzięki filtrowaniu subtrakcyjnemu i potwierdzeniu eksperymentalnemu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym potokom bioinformatycznym i pomiarom qPCR w trzech powtórzeniach z normalizacją do genów housekeepingowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesne wykrycie biologicznie istotnych celów przy minimalnych nakładach infrastrukturalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ekspresję tkankowo-specyficzną i konserwację ewolucyjną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w obsłudze narzędzi bioinformatycznych, takich jak BLAST, Trinity, TransDecoder oraz w analizie danych qPCR.
- Zależy od dostępu do referencyjnych zbiorów danych genomicznych, transkryptomicznych lub wyników asemblacji w celu skutecznego przeprowadzenia cykli substrakcji.
- Wymaga dostępności próbek biologicznych T-dodatnich i T-ujemnych do walidacji metodą qPCR.
- Wiąże się z iteracyjnym rozwiązywaniem problemów w narzędziach wiersza poleceń oraz optymalizacją parametrów dla etapów asemblacji i dopasowania sekwencji.
- Jest ograniczone przez kompletność i odpowiedniość sekwencji referencyjnych; nieadekwatne referencje mogą pozostawić szum resztkowy lub doprowadzić do nadmiernej substrakcji sygnałów docelowych.
FAQ Biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
De novo Assemble Starting Sequence
2:03
BLAST the Assembly Against the Reference Sequence
4:44
Design Primers for the Sequence that Remains
6:25
qPCR Validation of the Remaining Sequence
7:51
Results: Example Data of qPCR Results Including Negative and Positive Outcomes
8:53
Conclusion
