Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej
25 stycznia 2019
Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.
Nasz protokół jest istotny, ponieważ może być wykorzystany do identyfikacji sekwencji genomowych, których nie można wyizolować z sekwencji współoczyszczających, które same w sobie mogą być tylko częściowo znane. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niedroga, wykorzystuje głównie darmowe oprogramowanie, które można pobrać, a także jest elastyczna. Można go zastosować do wielu zagadnień biologicznych.
Potencjalne zastosowania obejmują identyfikację celów szczepionek bakteryjnych i identyfikację wirusów, których sekwencje znacznie różnią się od znanych drobnoustrojów. Metoda ta może być zastosowana do każdego systemu, w którym nieznane nie może być eksperymentalnie oddzielone, o ile dostępna jest sekwencja referencyjna bez celu genomowego. Ta technika wymaga trochę prób i błędów, więc ważna jest cierpliwość.
Może być konieczne rozwiązywanie problemów z programami. Możesz używać programów innych niż te, które tutaj opisujemy. W miarę możliwości korzystaj z instrukcji obsługi.
Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ praca obliczeniowa zależy od podstawowej wiedzy na temat struktury programowania wiersza poleceń. Na początek użyj Trimmomatic 0.32 do usunięcia adapterów illumina i podstaw niskiej jakości. Użyj Pear w wersji 0.9.11, aby utworzyć wysokiej jakości scalone odczyty ze sparowanych odczytów wyjściowych trimmomatic przy użyciu parametrów domyślnych.
Następnie użyj Reptile w wersji 1.1, aby poprawić błędy odczytów generowanych przez Pear. Na koniec użyj Trinity w wersji 2.4.0 w trybie domyślnym, aby złożyć poprawione sekwencje. W przypadku bibliotek specyficznych dla pasma należy użyć parametru SS_lib_type .
Wynikiem jest plik FASA, który zostanie umieszczony w nowym katalogu o nazwie trinity_output. Utwórz bazę danych BLAST sekwencji referencyjnej nucleotide_reference. fasta w wierszu poleceń.
BLAST dopasował zapytanie złożone do referencyjnej bazy danych. Aby uzyskać plik wyjściowy, użyj BLAST_results. txt Aby wygenerować tabelaryczne dane wyjściowe wymagane do etapów przetwarzania podsekwencji za pomocą skryptów Pythona, użyj outfmt 6 Aby zwiększyć rygorystyczność, użyj sekwencji białek z zestawu jako zapytania BLAST z przetłumaczonym nukleotydem BLAST, który wykonuje sześciokierunkową translację bazy danych nukleotydów.
Aby uzyskać sekwencje białek dla zapytania, uruchom TransDecoder. Long0rfs do identyfikowania najdłuższych otwartych ramek odczytu ze złożonych sekwencji zapytań. Teraz uruchom tblastn.
W razie potrzeby upewnij się, że wybrano prawidłowy kod genetyczny dla badanego organizmu za pomocą opcji db_gencode z odpowiednim kodem. Jeśli dostępne jest białko referencyjne wysokiej jakości, należy użyć dopasowania białko-białko za pomocą blastp, a nie tblastn Utwórz bazę danych BLAST odniesienia białka. Upewnij się, że wynik został zapisany jako plik do dalszego przetwarzania i użyj danych wyjściowych tabelarycznych, aby upewnić się, że skrypty języka Python mogą je poprawnie przeanalizować.
Teraz użyj subtraktywnego skryptu Pythona, aby usunąć wszelkie pasujące sekwencje. Aby zamapować odczyty na zestaw, użyj BWA-MEM w wersji 0.7.12 lub bowtie 2 w celu zamapowania pobranych nieprzetworzonych odczytów na zestaw zapytań. Najpierw zindeksuj zestaw, a następnie zamapuj odczyty.
Dane wyjściowe będą w formacie SAM. Uruchom skrypt języka Python removeUnmapped. py używając pliku SAM jako danych wejściowych.
Identyfikuje nazwy sekwencji zapytań bez żadnych pasujących odczytów i zapisuje je w nowym pliku tekstowym. Danymi wyjściowymi poprzedniego kroku jest lista nazw sekwencji w pliku txt. Wyodrębnij plik FASTA z tymi sekwencjami.
Wyjściem będzie plik fasta. Użyj programu Genius, aby ręcznie określić optymalne sekwencje starterów. Podkreśl sekwencję kandydującą od 21 do 28 par zasad dla startera do przodu, unikając przebiegów czterech lub więcej dowolnej zasady.
Spróbuj celować w region z dość jednolitą kombinacją wszystkich par zasad. Pojedyncze G lub C na trzech głównych końcach jest korzystne, pomagając zakotwiczyć starter. Kliknij kartę Statystyki po prawej stronie ekranu, aby wyświetlić szacowaną temperaturę topnienia tej sekwencji, gdy zaznaczony jest region kandydujący.
Dąż do temperatury topnienia między 55 a 60 stopni Celsjusza, unikając powtórzeń i długich serii G C. Wybierz odwrócony starter w ten sam sposób, umieszczony od 150 do 250 par zasad trzy prime przedniego startera. Chociaż długości podkładu nie muszą się zgadzać, przewidywana temperatura topnienia powinna być jak najbardziej zbliżona do temperatury startera przedniego. Pamiętaj, aby odwrócić uzupełnianie sekwencji, klikając prawym przyciskiem myszy w Genius, gdy sekwencja jest podświetlona w opcji menu.
Alternatywną metodą jest użycie funkcji Primer Design, która znajduje się na górnym pasku narzędzi w oknie Sekwencja. Wstaw region do wzmocnienia w obszarze Region docelowy. Na karcie charakterystyki wprowadź żądany rozmiar, temperaturę topnienia i procent G C, a następnie kliknij przycisk OK, aby wygenerować startery.
Aby przeprowadzić ilościową walidację pozostałej sekwencji metodą PCR, należy najpierw przygotować mieszaninę reakcyjną dla każdej matrycy w trzech egzemplarzach, z naszą mieszanką SYBR Green Master Mix, starterami do przodu i do tyłu oraz wodą, o łącznej objętości 25 mikrolitrów. Uruchom program qPCR w oparciu o wcześniej zweryfikowaną temperaturę i czas przedłużenia. Końcowe krzywe denaturacji powinny być generowane co najmniej przy pierwszym zastosowaniu starterów w qPCR w celu walidacji amplifikacji pojedynczego produktu DNA.
Zmierz zielone sygnały qPCR SYBR w stosunku do aktyny przez Ct We wszystkich przypadkach oblicz średnią i odchylenie standardowe dwa do Ct względem aktyny. Wykonaj elektroforezę żelu w punkcie końcowym, aby potwierdzić prawidłowe wykrycie rozmiaru produktu za pomocą qPCR. Tutaj uruchom 25 mikrolitrów produktu qPCR zmieszanego z pięcioma mikrolitrami barwnika 6X Glitterol na żelu agarozowym 2% TAE pod napięciem 200 woltów przez 20 minut.
Jeśli qPCR wykaże, że nie zidentyfikowałeś sekwencji docelowych, powtórz cały cykl z nowym odniesieniem, które można uzyskać z internetowej bazy danych. Projekt subtraktywny w tym przypadku rozpoczął się od sekwencjonowania RNA z tkanki wyściełanej zarodkami samca i samicy dorosłego zeberki. Ostatecznie zidentyfikowano 935 genów somatycznych, które wcześniej nie były uwzględnione w adnotacji całego genomu.
Po filtrowaniu obliczeniowym ilościowy PCR może dać ujemny wynik, w którym nie było różnicy w wykrywalności w tkankach ptaków. I odwrotnie, pozytywny wynik reprezentujący identyfikację prawdziwej sekwencji docelowej jest potwierdzony, gdy qPCR genomowego DNA wykazuje statystycznie większą wykrywalność w tkance będącej przedmiotem zainteresowania w stosunku do wartości referencyjnej. W tym przypadku potwierdzono, że gen alfa snap jest ograniczony do linii zarodkowej, ponieważ był zubożony w tkance somatycznej w stosunku do DNA jądra, w którym występował na poziomie równoważnym aktynie.
Ważne jest, aby pamiętać o użyciu właściwych danych wejściowych podczas każdego z kroków obliczeniowych. Być może będziesz musiał wielokrotnie przejść przez odejmowanie cyklu, aby uzyskać docelową sekwencję lub sekwencje. Odkryte geny można przeprowadzić różnorodną analizę filonetyczną, strukturalną i funkcjonalną.
Te dodatkowe metody dają wgląd w ewolucyjną i funkcjonalną rolę genów. Zidentyfikowaliśmy pierwszy gen na chromosomie ptaka śpiewającego z ograniczeniami linii zarodkowej, co poszerzyło zainteresowanie tym zaskakującym elementem genomu. Późniejsze prace wykazały podobne chromosomy u wielu gatunków ptaków śpiewających zawierających wiele dodatkowych genów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół umożliwia identyfikację sekwencji genomowych, które są trudne do odizolowania od współczyszczających się sekwencji. Wykorzystuje zarówno techniki komputerowej analizy danych, jak i laboratoryjne badania eksperymentalne, co sprawia, że jest zastosowany do różnych pytań biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Biologia obliczeniowa
- Mikrobiologia
Tło
- Identyfikowanie sekwencji genomowych może być wyzwaniem, gdy współczyszczają się one z innymi sekwencjami.
- Niektóre współczyszczające się sekwencje mogą być tylko częściowo znane.
- Ta metoda jest opłacalna, wykorzystując głównie bezpłatne oprogramowanie.
- Jest elastyczna i może służyć do rozwiązywania wielu pytań biologicznych.
Cel badania
- Znalezienie nowych sekwencji genomowych, które nie mogą być łatwo oddzielone od współczyszczających się sekwencji.
- Dostarczenie metody zastosowania do różnych systemów biologicznych.
- Poprawa identyfikacji potencjalnych celów szczepionek bakteryjnych i nieznanych sekwencji wirusowych.
Stosowane metody
- Kombinacja analizy komputerowej i technik eksperymentalnych.
- Wykorzystanie bezpłatnego oprogramowania do analizy genomowej.
- Zastosowanie prób i błędów do uszczegółowienia metody.
- Do efektywnego wdrożenia wymagane są sekwencje referencyjne.
Główne wyniki
- Protokół z powodzeniem identyfikuje sekwencje genomowe, które są trudne do odizolowania.
- Wykazuje elastyczność w różnych kontekstach biologicznych.
- Potencjalne zastosowania obejmują identyfikację celów szczepionek i nieznanych sekwencji wirusowych.
- Cierpliwość jest konieczna ze względu na charakter metody oparty na próbach i błędach.
Wnioski
- Ta technika jest cennym narzędziem do badań genomowych.
- Otwiera nowe szlaki w identyfikacji ważnych sekwencji biologicznych.
- Dalsze uszczegółowienie i zastosowanie może prowadzić do znaczących odkryć w mikrobiolologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Subtractive genomics enables the identification of novel genomic sequences that cannot be physically isolated from complex mixtures, addressing a key bottleneck in target discovery for vaccine development and antiviral research. By computationally subtracting known reference sequences from mixed genomic data, the method supports early-stage target validation when physical purification is impractical or cost-prohibitive. This approach enhances predictive confidence in lead identification by providing a scalable, low-cost route to discover biologically relevant sequences such as viral antigens or bacterial virulence factors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pathogen-specific sequences from host or background genomic noise.
- Operational Value: Supports functional target validation through iterative computational filtering and qPCR confirmation of tissue-specific expression.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying germline-restricted or pathogen-enriched genes with potential as selective intervention points.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated nucleic acid sequences suitable for qPCR-based assay development and high-throughput screening.
- Operational Value: Enables standardization of detection workflows through primer design and amplification efficiency validation.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by adapting reference subtraction cycles to new genomic contexts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery to preclinical validation by confirming target enrichment in disease-relevant tissues via quantitative PCR.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target biology by verifying tissue-specific expression patterns before functional studies.
- Biomarker Alignment: Supports identification of sequences with differential expression that may serve as translational biomarkers in infection or disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis-driven target identification prior to lead generation and preclinical evaluation, particularly when target sequences are obscured by genomic complexity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by subtracting known genomic elements to reveal novel sequences of interest, such as pathogen-specific or restricted-expression genes.
- Screening: Produces assay-ready sequences with validated primers, enabling reliable compound or intervention screening in downstream workflows.
- Analytics: Generates quantitative Ct values and melt curve data from qPCR, allowing comparative analysis of target abundance across sample types.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by validating target enrichment in germ cells or infected tissues relative to somatic controls.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable computational-experimental cycle for iterative refinement of target sequences across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives through subtractive filtering and experimental confirmation.
- Operational Value: Delivers reproducibility via standardized bioinformatics pipelines and triplicate qPCR measurements with normalization to housekeeping genes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of biologically relevant targets with minimal infrastructure investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on tissue-specific expression and evolutionary conservation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics tools such as BLAST, Trinity, TransDecoder, and qPCR data analysis.
- Depends on access to reference genomic, transcriptomic, or assembly datasets for effective subtraction cycles.
- Necessitates availability of T-positive and T-negative biological samples for qPCR-based validation.
- Involves iterative troubleshooting of command-line tools and parameter optimization for assembly and alignment steps.
- Limited by the completeness and suitability of reference sequences; inadequate references may leave residual noise or over-subtract target signals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
De novo Assemble Starting Sequence
2:03
BLAST the Assembly Against the Reference Sequence
4:44
Design Primers for the Sequence that Remains
6:25
qPCR Validation of the Remaining Sequence
7:51
Results: Example Data of qPCR Results Including Negative and Positive Outcomes
8:53
Conclusion
