Name: Colletotrichum fioriniae Rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Poznaj metodę bioanalizy rozwoju grzyba Colletotrichum fioriniae z wykorzystaniem ekstraktów kwiatowych z borówki i żurawiny. Technika ta umożliwia badanie dynamiki patogenów roślinnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Williamowi S. Hainesowi, Sr. Endowed Cranberry Research Fund oraz New Jersey Blueberry and Cranberry Research Council, Inc. za wsparcie. Dziękujemy również Jennifer Vaiciunas (wskazówki i przygotowania kwiatowe), Christine Constantelos (hodowla grzybów i preparaty kwiatowe), Davidowi Jonesowi (preparaty kwiatowe i ekstrakcje), Langley Oudemans (preparaty kwiatowe, filmowanie/fotografia), Jesse Lynch (przygotowania kwiatowe), Roxanne Tumnalis (ogólne wsparcie) oraz licznym studentom/stażystom letnim.

<ol><li>Pszczółkowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167(2016).</li>
<li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast%3A+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li>
<li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Colletotrichum+acutatum+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Studies+in+Mycology%22%5BJournal%5D)">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li>
<li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+%28teleomorph%3A+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.%29+infection+of+a+scale+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li>
<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
<li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum%2C+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li>
<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
<li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li>
<li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilholland%2C+RD+%22Compendium+of+Blueberry+and+Cranberry+Diseases%22">Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases</a>. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).</li>
<li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anthracnose+fruit+rot+of+highbush+blueberry%3A+biology+and+epidemiology%22">Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).</li>
<li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li>
<li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li>
<li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86(2002).</li>
<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
<li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li>
<li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li>
<li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+influence+of+cranberry+floral+wax+on+appressorium+formation+in+Colletotrichum+fioriniae%22">The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).</li>
<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
<li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community%3A+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li>
<li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Testy biologiczne wykrywające reakcję C. fioriniae na ekstrakty kwiatowe (FE) zostały opracowane dla patosystemów zgnilizny owoców borówki i żurawiny, ale można je łatwo dostosować do innych upraw ogrodniczych. Protokół opisany powyżej był cenny w pozyskiwaniu wielu ważnych zestawów danych, w tym między innymi: wpływu FE na wiele izolatów wielu patogenów, informacji o przebiegu czasowym dotyczących etapów wzrostu grzybów w obecności różnych FE, porównania technik ekstrakcji, kontroli poszczególnych substancji chemicznych pod kątem wzrostu i różnicowania C. fioriniae , oceny ekstraktów z poszczególnych organów kwiatowych, wpływ temperatury na C. fioriniae w obecności FE, wpływ zależnej od fenologii ekstrakcji wosku i wpływ kwiatowej wody deszczowej. Dzięki zastosowaniu tych technik uzyskane dane pozwoliły również na znacznie lepsze zrozumienie etapów życia C. fioriniae i częściowo wyjaśniają, dlaczego okres kwitnienia jest tak ważny dla zwalczania wielu patogenów gnijących owoce.
Początkowo wszystkie kwiaty były przetwarzane identycznie jak aktywny-FE, ale proces ekstrakcji przesunął się w kierunku wykorzystania całych kwiatów. Sekcja kwiatowa była czasochłonna i miała bardzo mały wpływ na bioaktywność otrzymanych FE. Jednak poszczególne organy kwiatowe mogą być i były oceniane przy użyciu tego protokołu, ale należy zachować szczególną ostrożność, aby nie ulec całkowitej maceracji tkanek kwiatowych (film uzupełniający 1, ze środkami ostrożności wyszczególnionymi w kroku 2.3), ponieważ może to spowodować uwolnienie do FE toksycznych dla grzybów/związków statycznych, które mogą zniekształcić oceny mikroskopowe. Mniej inwazyjne ekstrakcje, takie jak pass-FE (film uzupełniający 2) i rw-FE, są teraz korzystniejsze ze względu na łatwość ich pozyskiwania. Ponadto te techniki ekstrakcji wymagają jedynie filtracji próżniowej, aby uzyskać biologicznie aktywne kwiatowe sygnały chemiczne.
Kwiaty wykorzystywane we wszystkich ekstrakcjach były zazwyczaj przechowywane w lodówce przez 0-3 dni przed przygotowaniem ekstraktu. Wyzwaniem tego protokołu jest zarządzanie czasem obrotu FE (zbieranie w terenie poprzez przechowywanie ekstraktów). Sytuację pogorszyły liczne próbki z wielu źródeł i dat. Zamrożone kwiaty nie zostały ocenione w żadnym realnym stopniu, ponieważ rozmrożone kwiaty wydają się zepsute i odbarwione. Jednak po przygotowaniu FE na bazie wody, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie wykazało wpływu na bioaktywność FE, o ile FE są szybko ponownie zamrażane po przygotowaniu do testu biologicznego (żywotne 3-letnie FE).
Ekstrakcja na bazie chloroformu umożliwia badanie reakcji patogenów na trójwymiarowe woski z powierzchni kwiatów/owoców w płaszczyźnie dwuwymiarowej poprzez odparowywanie ch-FE na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Jest jednak mało prawdopodobne, aby rzeczywiste struktury krystaliczne wosków zdeponowanych z ch-FE były identyczne z powierzchnią, z której zostały zebrane. Oznacza to, że techniki uzupełniające powinny być stosowane, jeśli głównym celem badań jest reakcja grzybów na określone struktury wosku in vivo . Ekstrakty na bazie chloroformu wymagają więcej konserwacji podczas przechowywania niż ekstrakcje na bazie wody. Oprócz utrzymywania ekstraktów ch-FE w ciemności, nasadki probówek do hodowli komórkowych wyłożone PTFE i folia uszczelniająca parafilm muszą być regularnie sprawdzane pod kątem wycieków parowania i wymieniane w razie potrzeby.
Koncepcja monitorowania spływu wody deszczowej z kwiatów jest zakorzeniona w idei rozwoju narzędzi do monitorowania chorób specyficznych dla danego miejsca. Urządzenia do zbierania wody deszczowej można dostosować do wielu innych architektur roślinnych, o ile urządzenie do zbierania wychwytuje wodę deszczową, która spływa z kwiatów. Takie podejście dostarcza informacji o tym, czy stymulacja kwiatów jest obecna na polu w danym momencie i może być monitorowana przez cały sezon. Alternatywnie, urządzenia zbierające mogą być rozmieszczone w wielu miejscach baldachimu, aby określić, jak daleko zostały zmyte wskazówki kwiatowe podczas danego zdarzenia zwilżania. W przyszłych eksperymentach rw-FE będzie dyktować, kiedy należy rozpocząć stosowanie fungicydów i kiedy można je bezpiecznie zakończyć. Dodatkowo, dzięki monitorowaniu ekstrakcji wosku zależnej od fenologii (sekcja 9 protokołu), znaczenie okresu zakwitu dla biologii patogenów stało się jeszcze bardziej oczywiste. Sekcja ta została również dołączona, aby zademonstrować elastyczność tych testów biologicznych, zapewniając metody, które pozwalają na bezpośrednie porównanie wosków na powierzchni gospodarza, które są czasowo oddzielone. Dane wygenerowane przy użyciu technik ekstrakcji kwiatów i testów biologicznych reprezentują namacalne wskaźniki stymulacji patogenów, określone klasy chemiczne ważne dla biologii patogenów oraz cele dla przyszłych strategii kontroli.

Colletotrichum fioriniae powoduje zgniliznę owoców zarówno borówki wysokiej (Vaccinium corymbosum L.), jak i dużej żurawiny amerykańskiej (V. macrocarpon Aiton)1,2. Patogen ten został niedawno wyodrębniony z kompleksu gatunków C. acutatum3,4,5,6 i jest czynnikiem sprawczym antraknozy borówki amerykańskiej oraz członkiem kompleksu zgnilizny owoców żurawiny, a także powoduje wiele innych chorób roślin na całym świecie7. C. fioriniae prowadzi utajony, hemibiotroficzny tryb życia8, przy czym infekcje występują podczas kwitnienia, a rozwój objawów nie staje się widoczny, dopóki owoce nie znajdą się w końcowym stadium dojrzewania9. W przypadku borówki amerykańskiej i żurawiny zgnilizna owoców jest odpowiednio zwalczana tylko za pomocą fungicydów stosowanych w okresie kwitnienia. Patogen zimuje w uśpionych pąkach kwiatowych borówki scales10 i zarodnikuje podczas kwitnienia. Konidia są przenoszone po całym baldachimie poprzez rozpryskiwanie deszczu11,12, a nagromadzenie inokulum jest silnie skorelowane z okresem kwitnienia13. Reakcja gatunku Colletotrichum na kwiaty żywiciela nie jest unikalna dla Vaccinium, ponieważ kwiaty są ważnymi składnikami owoców cytrusowych po kwitnieniu (PFD)14, a także antraknozy truskawkowej15, w obu przypadkach powodując zarodnikowanie patogenu. Wszystkie te przypadki podkreślają potrzebę skutecznych metod oceny czasowej dynamiki chemicznych kwiatów na C. fioriniae i inne patogeny, które infekują podczas kwitnienia. Wglądy dostarczane przez opisane tutaj metody stają się coraz bardziej wartościowe.
Ten protokół szczegółowo opisuje metody pozyskiwania ekstraktu kwiatowego (FE) i prowadzi do oceny odpowiedzi C. fioriniae na FE za pomocą testów biologicznych szkiełka nakrywkowego15,16. Techniki ekstrakcji kwiatów dzielą się na dwa główne typy; ekstrakcje na bazie wody (aktywne-FE, pasywne (pass-FE) i na bazie polowej wody deszczowej (rw-FE)) oraz ekstrakcje na bazie chloroformu (ch-FE)17. Ekstrakcje na bazie wody pozwalają na kontrolę mobilizowanych przez wodę kwiatowych sygnałów chemicznych. Te zmobilizowane sygnały są prawdopodobnie ważnymi składnikami sądu ds. infekcji, ponieważ FE znacznie zwiększa szybkość infekcji16, a także zapewnia wilgoć wymaganą do wystąpienia infekcji. Ponadto reprezentują one bardziej naturalne warunki, ponieważ stymulacja kwiatowa może być zmywana w całym baldachimie podczas zwilżania, co wcześniej zaobserwowano w borówkach i innych systemach uprawowych14,16. Ekstrakcje kwiatowe na bazie chloroformu (ch-FE) dostarczają również cennych informacji dotyczących odpowiedzi patogenów na woski powierzchniowe gospodarza17,18, wyjaśniając wczesne etapy wzrostu konidiów po zdeponowaniu się na podatnych narządach gospodarza (tj. kwiatach, jajnikach i rozwijających się owocach). Za pomocą tego protokołu można również monitorować reakcję patogenu na sezonowe zmiany wosków na powierzchni gospodarza. W związku z tym testy biologiczne są dostosowane do pracy z FE na bazie wody lub FE na bazie chloroformu, aby złagodzić nieodłączne różnice między tymi dwoma materiałami.
Dane wygenerowane z testów biologicznych wykazały, że ekstrakcje na bazie wody stymulują wyższy poziom wtórnego konidiacji niż ekstrakcje na bazie chloroformu, gdzie wystąpiła ostateczna odpowiedź apresoryjna, co sugeruje obecność wielu związków w FE. Co ciekawe, obie te reakcje wzrostu zaobserwowano przy użyciu wody deszczowej, która spłynęła z kwiatów borówki i żurawiny, co wskazuje, że wiele związków stymulujących może zostać zmytych z powierzchni kwiatów. W związku z tym monitorowanie stymulacji kwiatów zapewni wgląd w prawdopodobieństwo sukcesu patogenów w systemie rolniczym.
Ostatecznym celem tego protokołu jest dostarczenie metodologii generowania podstawowych informacji biologicznych na temat patogenów grzybów roślinnych w odpowiedzi na sygnały chemiczne kwiatów, a także zainicjowanie metodologii, które mogą wykorzystać te informacje o kwiatach, aby pomóc w zarządzaniu chorobami specyficznymi dla danego miejsca i procesach decyzyjnych.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m wielkość porów, filtr sterylizujący octan</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>Oczyszczanie ekstraktu z kwiatów borówki (FE)&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 i mikro; l pipeta z końcówkami</td> <td>-</td><td></td> <td>sprzęt, każda marka w zakresie będzie odpowiednia</td></tr><tr><td>40-200 i mikro; l pipeta z końcówkami</td> <td>-</td><td></td> <td>sprzęt, każda marka w zakresie będzie odpowiednia</td></tr><tr><td>5-40 i mikro; l pipeta z końcówkami</td> <td>-</td><td></td> <td>Sprzęt, każda marka w zasięgu będzie odpowiednia</td></tr><tr><td>Jednorazowy kubek na spray do pistoletu natryskowego z adapterem połączeniowym&nbsp;</td><td>Fracht portowy</td><td>97098</td><td>Kolekcja borówki deszczowej (rw-)FE</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Amsco</td><td>3011</td><td>Sprzęt, przygotowanie podłoża</td></tr><tr><td>Mata siatkowa prętowa (arkusz siatki z tworzywa sztucznego)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>Kolekcja pasywna (pass)-FE</td></tr><tr><td>Zegar stołowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-47</td><td>Sprzęt, przygotowanie MES</td></tr><tr><td>wąż ciśnieniowo-podciśnieniowy</td><td>VWR</td><td>62994-795</td><td>Element filtra próżniowego</td></tr><tr><td>Lejek Buchnera</td><td>Coors USA</td><td>60240</td><td>Element filtra próżniowego, akceptuje krążki z bibuły filtracyjnej 55 mm</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Składnik mediów</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Sprzęt RC 5B Plus</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>Sprzęt, kolekcja rw-FE</td></tr><tr><td>Gaza (klasa 50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS240</td><td>Sprzęt do przygotowania MES</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>Chemiczny, trichlorometan: klasa testu, &ge; 99% czysty, dla biologii molekularnej, wolny od nadtlenków</td></tr><tr><td>agar z mączki kukurydzianej (CMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp; Podłoże do wstępnego mieszania, izolowanie przechowywania na skosach</td></tr><tr><td>Bejca bawełniano-niebieska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>Laktofenol bawełniano-niebieska bejca</td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>Komponent medialny</td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td></td><td></td> <td>Delta-Equipment, kolekcja rw-FE</td></tr><tr><td>EASYpure LF Woda ultraczysta</td><td>Barnstead</td><td>D738</td><td>Sprzęt, źródło wody dejonizowanej</td></tr><tr><td>Etanol (95%)</td><td>-</td><td>-</td><td>Filtr chemiczny</td></tr><tr><td>kolba (500 ml)</td><td>Pyrex</td><td>nr 5340</td><td>Element filtra próżniowego</td></tr><tr><td>Dygestoria</td><td></td> <td>Hamilton-Equipment</td><td>, użycie chloroformu</td></tr><tr><td>Lejek (7 X 7 cm)&nbsp;</td><td>Kolekcja VWR</td><td>60820-110</td><td>Cranberry rw-FE, przygotowanie FE</td></tr><tr><td>Prowadnica szklana ogólna&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-101</td><td>Przewodność testu biologicznego</td></tr><tr><td>Ogólna plastikowa butelka z rozpylaczem z pompką</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>kolekcja pass-FE, pojemność co najmniej 250 ml</td></tr><tr><td>Probówki do hodowli komórek szklanych</td> <td>-</td><td></td> Przechowywanie <td></td></tr><tr><td>szkiełek nakrywkowych ch-FE (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>Test biologiczny przewodność</td></tr><tr><td>Szklane komórki Van Tieghema (ręcznie cięte szklane rurki)</td><td>- </td><td>-</td><td>Test biologiczny chloroformu (ch)-FE, (8 mm OD, 6 mm ID)</td></tr><tr><td>Szklana pipeta (1-100 &mikro; l)</td> <td>Hamilton Co., Inc.</td><td>#710</td><td>test biologiczny ch-FE</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Laktofenol bawełniano-niebieska plama</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kwas mlekowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>Laktofenol bawełniano-niebieska bejca</td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>Sprzęt, sterylne środowisko pracy</td></tr><tr><td>Sonda metalowa (ogólny)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Przechowywanie i przygotowanie mieszaniny do uzdatniania wody</td></tr><tr><td>Mikroskop, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Zaprawa (ceramiczna)</td><td>Coors USA</td><td>60313</td><td>Element filtra próżniowego</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td>Kolekcja kwiatów</td></tr><tr><td>Krążki papierowe (cięte ręczniki papierowe)</td><td>Podstawy biurowe</td><td>KCC01510</td><td>kontroli wilgotności w teście biologicznym</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Folia parafinowa z tworzywa sztucznego&nbsp;</td></tr><tr><td>Tłuczek (ceramiczny)</td><td>Coors USA</td><td>60314</td><td>Element filtra próżniowego</td></tr><tr><td>Kryształy fenolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A92-100</td><td>Bejca bawełniana z laktofenolem</td></tr><tr><td>Worki foliowe (~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td><td>Sprzęt do chłodzenia kwiatów</td></tr><tr><td>Plastikowe naczynia do hodowli komórkowych (średnica 9 cm)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td> <td>(szalka Petriego),</td></tr><tr><td>nasadki wyłożone politetrafluoroetylenem (PTFE) do testów biologicznych wyłożone politetrafluoroetylenem (PTFE)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td> Przechowywanie zlewek <td>ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex (100 ml)</td><td>Pyrex</td><td>nr 1000</td> Przygotowanie <td></td></tr><tr><td>formy do chleba ch-FE Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>pass-FE kolekcja</td></tr><tr><td>Cylinder z podziałką Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>Wyposażenie, przygotowanie MES</td></tr><tr><td>Szczelny pojemnik z tworzywa sztucznego (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Przewodność testu biologicznego</td></tr><tr><td>Ostre zakończone nożyczki preparacyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Sprzęt do cięcia gazy serowej i krążków papierowych</td></tr><tr><td>Sitko siatkowe ze stali nierdzewnej</td><td>VWR</td><td>470149-756</td> Przygotowanie <td></td></tr><tr><td>wiertła stopniowego ch-FE (wiertło stopniowe)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, kolekcja rw-FE</td></tr><tr><td>Sterylna pętla (combi-loop)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602&nbsp;</td><td>Przygotowanie kultury</td></tr><tr><td>Przewód telefoniczny (przewody wewnętrzne)</td><td>-</td><td>-</td><td>Blueberry rw-FE kolekcja</td></tr><tr><td>Kosz na probówki&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>Łatwo dostępny zamiennik plastikowego kosza siatkowego [truskawkowego]&nbsp;</td></tr><tr><td>V8 Sok</td><td>Campbell's Soup</td> <td>Company-Składnik</td> <td>podłoża grzybowego</td></tr><tr><td>Kosze z siatki plastikowej w stylu vintage [truskawka] Zbiórka</td><td>Donation-pass-FE</td><td></td><td>, może zastąpić kosz na probówki (470137-792)</td></tr><tr><td>Vortex Genie (Vortex)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>Preparat zawiesiny zarodników</td></tr><tr><td>Whatman No. 1 Jakościowe koła 55 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Element filtra próżniowego</td></tr><tr><td>Białe plastikowe opaski zaciskowe (100 mm)</td><td>Uline</td><td>S-566W</td><td>Cranberry rw-FE collection</td></tr></tbody></table>

colletotrichum fioriniae rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Aby dokładnie monitorować fenologię okresu kwitnienia i czasową dynamikę chemicznych sygnałów kwiatowych na patogeny gnijące owoce grzybów, opracowano metody ekstrakcji kwiatów i testy biologiczne szkiełek nakrywkowych przy użyciu Colletotrichum fioriniae. W borówce amerykańskiej i żurawinie patogen ten jest optymalnie zwalczany poprzez stosowanie fungicydów w okresie kwitnienia ze względu na rolę, jaką kwiaty odgrywają w początkowych stadiach infekcji. Szczegółowy tutaj protokół opisuje, w jaki sposób ekstrakty kwiatowe (FE) zostały uzyskane przy użyciu metod na bazie wody, chloroformu i polowej wody deszczowej w celu późniejszego wykorzystania w odpowiednich testach biologicznych szkiełka nakrywkowego. Każdy FE służył do dostarczenia innego zestawu informacji: reakcji C. fioriniae na zmobilizowane sygnały chemiczne kwiatów w wodzie (na bazie wody), odpowiedzi patogenów na woski na powierzchni kwiatów i owoców (na bazie chloroformu) oraz monitorowania w terenie zebranej wody deszczowej z kwiatów, przenosząc obserwacje in vitro do środowiska rolniczego. FE jest szeroko opisywany jako oparty na wodzie lub chloroformie, z opisanym odpowiednim testem biologicznym w celu skompensowania nieodłącznych różnic między tymi dwoma materiałami. Woda deszczowa, która spływała z kwiatów, była zbierana w unikalnych urządzeniach dla każdej uprawy, co nawiązuje do elastyczności i zastosowania tego podejścia w innych systemach upraw. Testy biologiczne są szybkie, niedrogie, proste i zapewniają możliwość generowania informacji czasoprzestrzennych i specyficznych dla danego miejsca na temat obecności stymulujących związków kwiatowych z różnych źródeł. Informacje te ostatecznie przyczynią się do lepszego opracowania strategii zarządzania chorobą, ponieważ FE skracają czas potrzebny do wystąpienia infekcji, zapewniając w ten sposób wgląd w zmieniające się ryzyko infekcji patogenami w okresie wegetacji.

Przedstawione tutaj wyniki są przykładami wielu testów, które można przeprowadzić przy użyciu tej metodologii. Rysunek 1 stanowi ilustracyjny przewodnik po bioanalizie FE w środowisku wodnym, a uzupełnia go Rysunek 2, który odnosi się do bioanalizy FE w środowisku chloroformowym. Rysunek 3 stanowi wizualny przewodnik po tym, czego można spodziewać się podczas oceny mikroskopowej C. fioriniae po 24 h, zarówno w bioanalizach opartych na wodzie, jak i na chloroformie (w porównaniu do kontroli SDW). Rysunek 4 szczegółowo opisuje badanie przebiegu czasowego w ciągu 24 h z udziałem C. fioriniae w obecności ch-FE odmiany żurawiny „Stevens” i stanowi wizualny punkt odniesienia dla istotnego wyniku tych badań: FE skróciło czas potrzebny na utworzenie struktur infekcyjnych w porównaniu z SDW. Rysunek 5 przedstawia przykład danych zebranych podczas bioanalizy na szkiełkach nakrywkowych z wykorzystaniem spływu wody deszczowej z kwiatów żurawiny (CB „Flower” rw-FE). Rysunek 6 reprezentuje kolejny istotny wynik: ch-FE z zalążni kwiatowej działało znacznie silniej stymulująco niż ch-FE z owoców, co wskazuje na znaczenie kwitnienia w cyklu życiowym C. fioriniae. Uzupełniające zdjęcia i filmy zawierają ważne materiały wizualne dotyczące kwiatów użytych do ekstrakcji oraz urządzeń/sposobów rozmieszczenia do zbierania deszczówki z kwiatów, a także filmy wizualizujące procesy ekstrakcji aktywnej i pasywnej (w środowisku wodnym).
<img alt="Schemat chromatografii; układ do obróbki wodnej z konidiami, analiza przy powiększeniu 20X/40X na szkiełku przedmiotowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Ogólny przegląd bioanalizy z wykorzystaniem wodnego ekstraktu z kwiatów (FE). Analizę tę zastosowano w odniesieniu do wodnych ekstraktów z kwiatów borówki oraz żurawiny: aktywny-ekstrakty z kwiatów (aktywny-FE), pasywny-ekstrakty z kwiatów (Przejdź-FE) oraz spływ wód opadowych z kwiatów (rw-FE). Część -FE zazwyczaj stanowi czynnik eksperymentalny/zmienną. Z kolei część -FE może pozostać stała, a oceniane mogą być punkty czasowe/godziny po inokulacji. Wybrano analizę 4 pól widzenia przy powiększeniu 20X. Skróty: sterylna woda dejonizowana, SDW; powierzchnia pola widzenia, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu równowagi statycznej; komora VanT, SDW, mieszanina konidiów do analizy przy 200-krotnym powiększeniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2Ogólny opis bioanalizy z wykorzystaniem ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu (ch-FE). Analizę tę zastosowano zarówno w przypadku borówki ogrodowej, jak i żurawiny (kwiaty, zalążki i owoce). W badaniu wykorzystano tylko jeden rodzaj wodnej mieszaniny traktującej: 1 część zawiesiny zarodników na 2 części SDW (aby zachować stałe stężenie konidiów ze względu na odparowywanie ch-FE). Analizę tę można wykorzystać do porównania wielu ch-FE (wosków z różnych powierzchni roślinnych) lub wielu punktów czasowych/godzin po inokulacji przy użyciu jednego ch-FE. Skróty: sterylna woda dejonizowana, SDW; komórki [szklane] Van Tieghema, VanT. cell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy porównujący grupę kontrolną z grupą active-FE oraz ch-FE, przedstawiający struktury komórkowe, wyniki doświadczalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Porównanie wizualne Colletotrichum fioriniae w obecności wodnego FE oraz ch-FE. W niniejszym teście zastosowano borówkę 'Bluecrop' (aktywny-FE, na bazie wody) (izolat grzyba: BB#10) oraz kwiatowe ekstrakty z żurawiny 'Stevens' na bazie chloroformu (ch-FE) (izolat grzyba: CB-PMAP182) porównano z kontrolnymi próbami SDW. Gwałtowny wzrost wtórnego konidiowania (pierścienie) oraz tworzenia apliktoriów (groty strzałek) zaobserwowano podczas porównania konidiów w obecności SDW (kontrola) (A) Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aktywny-FE (B) w 24 godzinie po inokulacji. Jednakże wtórna konidiacja była mniej wyraźna w porównaniu z kontrolą SDW w bioanalizie z użyciem chloroformu (C) to ch-FE (D)lecz; *C. fioriniae* wzrost przesunął się w stronę tworzenia apresoriów. Przedstawiono typową odpowiedź dla każdego rodzaju ekstrakcji – na bazie wody oraz na bazie chloroformu – niezależnie od opisanych gatunków roślin żywicielskich lub kwiatowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Time-lapse wzrostu bakteryjnego, obraz mikroskopowy, warunki SDW i ch-FE, analiza zachowania komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Badanie przebiegu czasowego (24 h) z Colletotrichum fioriniae w obecności ch-FE. W niniejszym badaniu jako kontrolę zastosowano sterylną wodę destylowaną (SDW) (A-D) or żurawina 'Stevens' ch-FE (E-F) poddano ocenie wizualnej w 0, 6, 12 i 24 h po inokulacji (przykład zmiennych punktów czasowych zamiast porównywania wielu FE). Tworzenie aprezoriów (groty strzałek) rozpoczęło się w 6 h w ch-FE i sukcesywnie zwiększało się w kolejnych punktach czasowych. Wyniki te wskazują na istotny czynnik biologii patogenu w okresie kwitnienia: kwiaty skracają czas potrzebny do sformowania struktur infekcyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący liczbę konidiów i apresoriów po 24 h; wzrost grzybni, różne traktowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5Graficzna prezentacja danych zebranych za pomocą rw-FE w bioanalizie. Woda opadowa spływająca z kwiatów żurawiny (CB „Flower” rw-FE) oraz czysta woda opadowa, która nie miała kontaktu z żadnymi tkankami rośliny żurawiny („Ground” rw-FE), pochodzące z pojedynczego zdarzenia zwilżania, oraz standard aktywny, wodny ekstrakt kwiatowy z żurawiny (CB aktywny-FE) (kontrola pozytywna) oraz SDW (kontrola negatywna) poddano wodnemu bioanalizie z użyciem szkiełek cover-slip i oceniono pod kątem C. fioriniae wzrostu. CB „Flower” rw-FE wykazywało taki sam poziom wtórnego konidiowania i tworzenia apresoriów, jak standardowy szczep CB aktywny-FE w 24 h po inokulacji, co wskazuje, że urządzenia zbierające były skuteczne w wychwytywaniu stymulantów kwiatowych uwalnianych podczas zdarzenia nawodnienia. Całkowita liczba konidiów składa się z konidiów pierwotnych (osadzonych) oraz nowo powstałych konidiów wtórnych. Litery oznaczają istotne różnice przy p &lt; 0,05 zgodnie z testem najmniejszej istotnej różnicy (LSD) Fischera; wielkie litery – całkowita liczba konidiów; małe litery – apresoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sieci neuronalnej, obraz mikroskopowy, synapsy, połączenia neuronalne, pasek skali 40 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6Bioanaliza ch-FE oparta na fenologii żurawiny, inspekcja wizualna. Zwalczanie grzybów powodujących gnicie owoców często obejmuje stosowanie fungicydów w okresie kwitnienia. W niniejszej pracy przeprowadzono wizualną ocenę ekstraktów z żurawiny ('Stevens') sporządzonych na bazie chloroformu (ch-FE), pozyskanych z wielu etapów wzrostu rośliny, w celu zbadania wpływu wosków powierzchniowych na C. fioriniae w 24 h po inokulacji. Jajniki pobrane w czerwcu (A), niedojrzałe owoce zebrane w lipcu i sierpniu (B, C), zebrane owoce zebrane w październiku (D)or kontrolę z użyciem sterylnej wody destylowanej (SDW) (E) sprawdzono pod kątem tworzenia apliktoriów (groty strzałek). W przypadku jajników ch-FE odnotowano największą skalę tworzenia apliktoriów, co wskazuje, że ta faza fenologiczna rośliny (kwitnienie) ma krytyczne znaczenie dla cyklu życiowego C. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Stadium kwitnienia borówki, zbliżenie; rozwój rośliny, botanika, badanie procesu zapylania podczas kwitnienia." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek dodatkowy 1"> 
Rysunek dodatkowy 1: Kwiatostan borówki. Kwiaty borówki zebrano do ekstrakcji w okresie pełnego kwitnienia (kwiecień-maj w New Jersey, USA) (odmiana „Bluecrop”). Zwrócono uwagę na nakładanie się koroli/zalążni sąsiednich kwiatów oraz ogólną architekturę kwiatostana w porównaniu do Rycina dodatkowa 2 (żurawina w pozycji pionowej). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost polnych kwiatów, badanie botaniczne; pędy kwieciste, różowe płatki, zielone liście w naturalnym środowisku." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina uzupełniająca 2"> 
Rysunek dodatkowy 2: Żurawina w pozycji pionowej. Kwiaty żurawiny do ekstrakcji zbierano w czasie pełnego kwitnienia (czerwiec–lipiec w New Jersey, USA) (odmiana „Stevens”). Zwrócono uwagę na zróżnicowane stadia rozwoju kwiatów w obrębie jednego kwiatostanu żurawiny (pozycja pionowa) oraz na haczykowaty kształt koroli, zatrzymujący krople wody. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Eksperyment dotyczący transpiracji roślin z zestawem do zbierania wody w ogrodzie." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina dodatkowa 3"> 
Rysunek dodatkowy 3: Rozmieszczenie deszczówki na borówce (kwiat). Gotowe urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki, umieszczone bezpośrednio pod gronem kwiatostanów. Zwróć uwagę na drut w plastikowej izolacji, użyty do pionowej orientacji urządzenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Pomiar fotosyntezy z wykorzystaniem komory wymiany gazowej na krzewie; badania środowiskowe." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina uzupełniająca 4"> 
Rycina dodatkowa 4: rozmieszczenie wody deszczowej dla borówek (łodyga). Gotowe urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki, umieszczone w połowie wysokości łodygi, pomiędzy kwiatostanem a koroną krzewu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ do pomiaru wilgotności gleby, eksperyment polowy, pozyskiwanie danych w badaniach środowiskowych." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina dodatkowa 5"> 
Rycina dodatkowa 5: Aplikacja wody deszczowej na borówkę (korona). Gotowe urządzenie do zbierania wody deszczowej z kwiatów borówki, umieszczone u podstawy krzewu (w koronie). Uwaga: plastikowe powłoki na drutach można usunąć, jeśli nie są one wymagane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Pluwiometr do zbierania opadów, układ eksperymentalny, pomiar poziomu wody deszczowej w gruncie." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina dodatkowa 6"> 
Rysunek dodatkowy 6: Rozmieszczenie deszczówki borówkowej (grunt). Gotowe urządzenie do zbierania pierwotnej wody deszczowej, umieszczone obok krzewów borówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment dotyczący transpiracji roślin z wykorzystaniem czujnika w krzewie żurawiny." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina uzupełniająca 7"> 
Rycina uzupełniająca 7: Rozmieszczenie deszczówki z żurawiną (zbliżenie). Gotowe urządzenie do zbierania deszczówki z kwiatów żurawiny, z dwoma wspornikami wsuniętymi pod starannie skrzyżowane wiązania druciane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Eksperyment zapylania roślin żurawiny, schemat worków do zapylania w celu badania interakcji z pszczołami." src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina uzupełniająca 8"> 
Rycina dodatkowa 8: Rozmieszczenie deszczówki z żurawiną. Wiele ukończonych urządzeń do zbierania wody deszczowej z kwiatów żurawiny rozmieszczonych na torfowisku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do ekstrakcji związku organicznego; moździerz, lejek, zlewki w laboratorium; proces separacji FE." src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film uzupełniający 1"> 
Film uzupełniający 1: Aktywne wodne ekstrakty kwiatowe (aktywnyFE). Dodatkowe wsparcie wideo dla kroków 2.3–2.5.1. Wykorzystano kwiaty borówki wysokiej odmiany 'Bluecrop'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Konfiguracja procesu filtracji z użyciem zlewki, lejka i roztworu dla eksperymentu z separacji laboratoryjnej." src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film uzupełniający 2"> 
Film uzupełniający 2: Bierna, wodne ekstrakty z kwiatów (Przejdź-FE). Pomocniczy materiał wideo do kroków 3.3–3.4. Wykorzystano kwiaty borówki gardennej 'Bluecrop'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<img alt="Metoda pobierania próbek w terenie z wykorzystaniem rękawiczek podczas zbierania próbek roślin do analizy środowiskowej." src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Film uzupełniający 3"> 
Film uzupełniający 3: Rozmieszczenie urządzeń do zbierania deszczówki z kwiatów żurawinyDodatkowe wsparcie wideo po kroku 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj w celu wyświetlenia tego filmu. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Tutaj opisane są testy biologiczne przeznaczone do monitorowania rozwoju patogenu grzybowego, Colletotrichum fioriniae, w obecności ekstraktów z kwiatów borówki lub żurawiny na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Techniki ekstrakcji kwiatów na bazie wody, chloroformu i wody deszczowej są szczegółowe, a także wgląd w to, jak można zastosować te informacje.

Colletotrichum fioriniae Rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Protokół ten zapewnia niedrogi i elastyczny system do oceny czasowej dynamiki sygnałów fluorochemicznych na Colletotrichum fiorniae i innych patogenach roślinnych, które infekują zakwit terminowy. Nowatorskie urządzenia do zbierania wody deszczowej na podłodze umożliwiają użytkownikowi monitorowanie naturalnych stymulantów i warunków wpływających na rozwój patogenów w sposób zbliżony do rzeczywistego w zależności od miejsca. Rozpocznij tę procedurę od hodowli Colletotrichum fiorniae od naturalnie zakażonego żywiciela, jak opisano w protokole tekstowym.Kiedy kolonie zaczynają zarodnikować, rozprowadź konidia na innym agarze z sokiem V 8 zawierającym naczynie do hodowli komórkowych, aby wytworzyć kulturę zarodnikowania o dużej gęstości. Po siedmiu dniach wzrostu użyj standardowej sterylnej pętli, aby zebrać niewielką ilość konidiów z kultury o dużej gęstości, lekko dotykając pętli do masy konidialnej. Wymieszaj to z 15-mililitrową probówką wirówkową zawierającą 10 mililitrów sterylnej wody dejonizowanej.Wiruj tę próbkę przez 10 sekund. Za pomocą standardowej pipety zanurz kilkakrotnie w górę i w dół, aby dalej wymieszać próbkę. Następnie umieść kroplę wirowanej próbki na hemocytometrze i oszacuj stężenie zarodników.Dostosuj stężenie do 0,1 miliona konidiów na mililitr sterylnej wody destylowanej o końcowej objętości pięciu mililitrów. Jest to określane jako zawiesina zarodników i jest wykonywana tylko bezpośrednio przed użyciem w dowolnym teście biologicznym. Aby przeprowadzić ekstrakcję kwiatów na bazie chloroformu, należy dwukrotnie oczyścić wszystkie elementy 95% etanolem.Następnie wyczyść elementy dwukrotnie chloroformem, aby zapobiec zanieczyszczeniu przy każdej ekstrakcji. Nie czyścić nasadek wyłożonych PTFE chloroformem, ponieważ może to spowodować ich uszkodzenie. Po oczyszczeniu odłóż elementy na bok do wyschnięcia do góry nogami.Połącz jedną część przetworzonych kwiatów z dziewięcioma częściami chloroformu w zlewce, dodając kwiaty, a następnie chloroform. Delikatnie mieszać przez 30 sekund i przecedzić przez sitko ze stali nierdzewnej do drugiej zlewki. Wlać ekstrakt na bazie chloroformu z drugiej zlewki do szklanej probówki hodowlanej i założyć nasadkę z PTFE.Owiń nakrętkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu. Powstały ekstrakt kwiatowy na bazie chloroformu należy przechowywać w ciemności, aby zmniejszyć degradację światła w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia eksperymentalnego. Powtórz ekstrakcje z wieloma próbkami, aby uzyskać kontrpróby.Aby utworzyć urządzenie zbierające dla każdej wybranej lokalizacji, użyj końcówki schodkowej dołączonej do wiertarki, aby wywiercić otwór w dolnej części kubka z rozpylaczem. Następnie wytnij linię prostą od górnej krawędzi otworu do wylotu kubka z rozpylaczem. Teraz wywierć cztery równoodległe otwory wystarczająco duże, aby przewlec drut pokryty tworzywem sztucznym u wylotu kubka z rozpylaczem.Przymocuj jeden koniec drutów pokrytych tworzywem sztucznym, pozostawiając jeden koniec wolny. Wywierć otwór wystarczająco duży, aby wkręcić spray do malowania lub adapter kubka do 50-mililitrowej pokrywy wirówki. Uszczelnij gwinty adaptera parafilmem, aby zapobiec wyciekom.Przymocuj go zarówno do nasadki wirówki, jak i gwintowanej części kubka opryskiwacza. Następnie podłącz dopasowaną 50-milimetrową rurkę wirówkową. Utwórz cztery urządzenia do zbierania próbek na lokalizację pobierania próbek.Rozmieść urządzenia w wybranych miejscach, zginając kubki opryskiwacza, aby pasowały do łodyg. Ustaw odciętą stronę kubka opryskiwacza do góry za pomocą drutów pokrytych tworzywem sztucznym przymocowanych do innych trzpieni. Dzięki temu woda przepływająca przez kwiaty jest wychwytywana.Aby zebrać wodę deszczową z kwiatów żurawiny, najpierw przebij osiem równoodległych otworów wokół ujścia lejka za pomocą metalowej sondy. Włóż opaski zaciskowe do czterech otworów. Przymocuj drugie końce do przeciwległego miejsca tego otworu, tworząc zgrabny wzór skrzyżowania.Owiń lejek parą z parafilmem i odstaw na bok. Wywierć otwór wystarczająco duży, aby włożyć lejek w dół trzpienia do 50-mililitrowej nasadki wirówki za pomocą wiertła stopniowego. Włóż przygotowany lejek do nasadki wirówki.Po opadach deszczu lub nawadnianiu górnym wyjmij i wymień dolną część probówki wirówki. Rury zbierające wodę deszczową należy szybko wymienić po zwilżeniu, ponieważ są one podatne na degradację przez naturalne zanieczyszczenia mobilizowane w odpływie, takie jak bakterie i inne grzyby. Umieść dwie warstwy papierowych krążków w naczyniach hodowlanych i namocz w dwóch mililitrach sterylnej wody destylowanej.Następnie wymieszaj równe objętości sterylnej wody destylowanej i ekstraktu kwiatowego na bazie wody w dwóch mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Następnie dodaj równą objętość zawiesiny zarodników do przygotowanych dwóch mililitrowych probówek do mikrowirówek. Otrzymany preparat określa się mianem wodnej mieszaniny do uzdatniania.W celu kontroli pomiń część ekstraktu kwiatowego i zastąp ją sterylną wodą destylowaną, aby utrzymać stałe stężenia konidiów. Teraz umieść wstępnie oczyszczone szklane szkiełka nakrywkowe na nasączonych ręcznikach papierowych w naczyniu do hodowli komórkowych. Umieść 40 mikrolitrów kropli wodnej mieszaniny do uzdatniania wody na środku szkiełka nakrywkowego.Powtórz to dla pożądanych zabiegów, w tym kontroli. Następnie zamknij naczynie do hodowli komórkowych. Po dozowaniu wszystkich zabiegów i powtórzeń umieść wszystkie replikowane szalki z kultur komórkowych w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności.W określonych wcześniej punktach czasowych dodaj 10 mikrolitrów utrwalacza do kropel, zatrzymując wzrost i częściowo konserwując wierzchowiec. Po dodaniu utrwalacza ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe, umieszczając każde z nich kropelką do dołu na szklanym szkiełku mikroskopowym, aby ułatwić badanie mikroskopowe. Gdy wszystkie szkiełka nakrywkowe znajdą się na szklanych szkiełkach mikroskopowych, pozostaw je do osadzenia i częściowego wyschnięcia w kapturze przepływowym przez 20 minut.Policz wszystkie konidia obecne na szkiełku nakrywkowym, w tym konidia pierwotne, konidia kiełkujące i nowo utworzone konidia wtórne, a także appressoria. Pracuj w powiększeniu 400 razy lub 200 razy, uzyskując łączną powierzchnię 3.808 milimetrów kwadratowych. W okapie z przepływem laminarnym dodaj dwie równe objętości sterylnej wody destylowanej i jedną objętość zawiesiny zarodników do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.Odłóż tę wodną mieszaninę do uzdatniania wody do testów biologicznych ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu. W dygestorium umieść Van T Cell na szklanym szkiełku nakrywkowym w przygotowanym plastikowym naczyniu do hodowli komórek. Dozuj 33 mikrolitry pożądanego ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu do środka komórki i pozostaw do wyschnięcia.Nie dotykaj ścian komórki. Do zabiegu kontrolnego dodać chloroform z pierwszego tłoczenia. Po wyschnięciu ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu, należy dozować 99 mikrolitrów przygotowanej wodnej mieszaniny do zabiegu za pomocą standardowej pipety do środka komórki Van T.Następnie zamknij wszystkie szalki do hodowli komórkowych i inkubuj. W określonych wcześniej punktach czasowych dodaj 15 mikrolitrów utrwalacza do komórki Van T i pozostaw na co najmniej pięć minut, aby zapewnić odpowiednie zabarwienie grzybów. Po tym czasie ostrożnie wyjmij komórkę Van T.Wykonaj etapy odwrócenia szkiełka nakrywkowego i akwizycji danych jak poprzednio. Po ocenie mikroskopowej C. fiorniae w ciągu 24 godzin po inokulacji, porównanie konidiów w obecności sterylnej wody destylowanej z ekstraktem kwiatowym na bazie wody ujawnia dramatyczny wzrost wtórnego konidiacji i tworzenia appressorium. Jednak wtórne konidiacja nie była tak widoczna, gdy porównano kontrolę sterylnej wody destylowanej z użyciem chloroformu z ekstraktami na bazie chloroformu.Wzrost C.fiorniae przesunął się raczej w kierunku formacji apresoralnej. W tym teście sterylna kontrola wody destylowanej i ekstrakcje kwiatów na bazie chloroformu żurawiny zostały wizualnie sprawdzone po zero, sześciu, 12 i 24 godzinach po inokulacji. Tworzenie się appressorium rozpoczęło się po sześciu godzinach w ekstrakcie kwiatowym na bazie chloroformu i stopniowo wzrastało w kolejnych punktach czasowych.Wynik ten potwierdza odkrycie, że kwiaty skracają czas potrzebny do tworzenia struktur infekcyjnych. Zwalczanie chorób grzybów gnijących owoce często obejmuje stosowanie fungicydów w czasie kwitnienia. W tym przypadku ekstrakty na bazie chloroformu żurawiny z wielu etapów wzrostu żurawiny zostały wizualnie ocenione pod kątem skutecznych wosków powierzchniowych na C. fiorniae po 24 godzinach od inokulacji.Jajniki zebrane w czerwcu, niedojrzałe owoce zebrane w lipcu i w sierpniu, zebrane owoce zebrane w październiku oraz sterylną kontrolę wody destylowanej pod kątem tworzenia się apresoriów. Ekstrakty na bazie chloroformu jajników charakteryzowały się największą wielkością tworzenia się appressorial, co wskazuje na znaczenie zakwitu w cyklu życiowym C. fiorniae. Patogen jest najważniejszym elementem tego protokołu.Grzyby powinny być rutynowo przenoszone na świeże podłoża, aby zachować spójność między próbami. Ze względów bezpieczeństwa wszelkie prace z chloroformem muszą być wykonywane pod wyciągiem. Obejmuje to przygotowanie materiałów i wyrobów szklanych, procedury ekstrakcji i prowadzenie testu biologicznego na bazie chloroformu.Kombinacje punktów czasowych, patogenów, kwiecistych zbiorów wody deszczowej lub ekstrakcji żywiciela można wykorzystać do oceny różnych interakcji gospodarz-patogen. Urządzenia do zbierania wody deszczowej i związane z nimi testy biologiczne umożliwią innym pracę ze stymulantami gospodarza mobilizowanymi podczas opadów deszczu w wielu systemach ścieżek.

colletotrichum-fioriniae-development-water-chloroform-based-blueberry

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisano metodę push-pull służącą do zbierania lotnych substancji roślinnych. Metoda ta umożliwia porównanie substancji lotnych indukowanych przez żerowanie roślinożerców, egzogenny jasmonian metylu oraz uszkodzenia mechaniczne. Technika ta jest również wykorzystywana do badania odpowiedzi lotnej nieuszkodzonych gałązek na ekspozycję na substancje lotne z gałązek uszkodzonych przez roślinożerców w obrębie roślin borówki.

Lotne związki borówki indukowane przez roślinożerców i sygnalizacja wewnątrzroślinna

Opisano metody cienkowarstwowej chromatografii (TLC) separacji ekstraktów roślinnych i kontaktowej bioautografii w celu identyfikacji metabolitów przeciwbakteryjnych. Metody te stosuje się do badań przesiewowych związków fenolowych koniczyny czerwonej hamujących bakterie wytwarzające hiperamoniak (HAB) pochodzące ze żwacza bydła.

Separacje metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i testy biologiczne ekstraktów roślinnych w celu identyfikacji związków przeciwdrobnoustrojowych

Prezentujemy tutaj protokół do konstruowania i walidacji modeli do nieniszczącego przewidywania całkowitej zawartości cukru, całkowitej zawartości kwasu organicznego i całkowitej zawartości antocyjanów w poszczególnych jagodach za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni.

Budowa modeli do nieniszczącego przewidywania zawartości składników w borówkach za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni w oparciu o pomiary HPLC

Ta praca szczegółowo opisuje krok po kroku metodę przygotowania bogatych w polifenole ekstraktów z liofilizowanego proszku jagodowego. Ponadto zawiera dokładny opis sposobu stosowania tych bogatych w polifenole ekstraktów w hodowli komórkowej w obecności hormonu peptydowego angiotensyny II (Ang II) przy użyciu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC).

Ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro

Platforma mikroekstrakcji gazowej w fazie stałej jest tutaj opisana do szybkiej, niezawodnej i półautomatycznej identyfikacji i kwantyfikacji substancji lotnych w dojrzałych owocach czarnej porzeczki. Technika ta może być wykorzystana do poszerzenia wiedzy na temat aromatu owoców oraz do selekcji odmian o wzmocnionym smaku do celów hodowlanych.

Profilowanie związków lotnych w owocach czarnej porzeczki przy użyciu mikroekstrakcji w fazie stałej w przestrzeni nad powierzchnią sprzężoną z chromatografią gazową i spektrometrią mas

Tutaj opisana jest metoda uczynienia tkanek roślinnych przezroczystymi przy jednoczesnym zachowaniu stabilności białek fluorescencyjnych. Technika ta ułatwia głębokie obrazowanie oczyszczonych tkanek roślinnych bez fizycznego cięcia.

Optyczne oczyszczanie tkanek roślinnych do obrazowania fluorescencyjnego

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Ten protokół szczegółowo opisuje wykorzystanie metody ekstrakcji mikrofalowej na bazie poliolu do ekstrakcji związków fenolowych i naturalnych przeciwutleniaczy, reprezentując praktyczne i przyjazne dla środowiska podejście do rozwoju gotowych do użycia ekstraktów.

Ekstrakcja mikrofalowa związków fenolowych i przeciwutleniaczy do zastosowań kosmetycznych z wykorzystaniem technologii poliolowej

Protokół testu biologicznego z oderwanymi liśćmi został opracowany dla masowej hodowli wciornastków chili przy użyciu zmodyfikowanej metody oderwanych liści w szklanych pojemnikach zawierających agar, zapewniając wysoką przeżywalność i zsynchronizowany rozwój. System ten umożliwia skuteczne badania przesiewowe zjadliwości grzybów entomopatogenicznych przeciwko larwom w drugimstadium rozwojowym i zapewnia niezawodne dostarczanie wciornastków do ocen laboratoryjnych, szklarniowych i terenowych.

Ustanowienie systemu hodowli wciornastków chili (Scirtothrips dorsalis hood) do badań przesiewowych zjadliwości grzybów entomopatogenicznych

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę bioanalizy rozwoju grzyba Colletotrichum fioriniae z wykorzystaniem ekstraktów kwiatowych z borówki i żurawiny. Technika ta umożliwia badanie dynamiki patogenów roślinnych w czasie rzeczywistym.

Colletotrichum fioriniae Rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu

Przeglądaj więcej filmów