Colletotrichum fioriniae Rozwój ekstraktów z kwiatów borówki i żurawiny na bazie wody i chloroformu

Protokół ten zapewnia niedrogi i elastyczny system do oceny czasowej dynamiki sygnałów fluorochemicznych na Colletotrichum fiorniae i innych patogenach roślinnych, które infekują zakwit terminowy. Nowatorskie urządzenia do zbierania wody deszczowej na podłodze umożliwiają użytkownikowi monitorowanie naturalnych stymulantów i warunków wpływających na rozwój patogenów w sposób zbliżony do rzeczywistego w zależności od miejsca. Rozpocznij tę procedurę od hodowli Colletotrichum fiorniae od naturalnie zakażonego żywiciela, jak opisano w protokole tekstowym.

Kiedy kolonie zaczynają zarodnikować, rozprowadź konidia na innym agarze z sokiem V 8 zawierającym naczynie do hodowli komórkowych, aby wytworzyć kulturę zarodnikowania o dużej gęstości. Po siedmiu dniach wzrostu użyj standardowej sterylnej pętli, aby zebrać niewielką ilość konidiów z kultury o dużej gęstości, lekko dotykając pętli do masy konidialnej. Wymieszaj to z 15-mililitrową probówką wirówkową zawierającą 10 mililitrów sterylnej wody dejonizowanej.

Wiruj tę próbkę przez 10 sekund. Za pomocą standardowej pipety zanurz kilkakrotnie w górę i w dół, aby dalej wymieszać próbkę. Następnie umieść kroplę wirowanej próbki na hemocytometrze i oszacuj stężenie zarodników.

Dostosuj stężenie do 0,1 miliona konidiów na mililitr sterylnej wody destylowanej o końcowej objętości pięciu mililitrów. Jest to określane jako zawiesina zarodników i jest wykonywana tylko bezpośrednio przed użyciem w dowolnym teście biologicznym. Aby przeprowadzić ekstrakcję kwiatów na bazie chloroformu, należy dwukrotnie oczyścić wszystkie elementy 95% etanolem.

Następnie wyczyść elementy dwukrotnie chloroformem, aby zapobiec zanieczyszczeniu przy każdej ekstrakcji. Nie czyścić nasadek wyłożonych PTFE chloroformem, ponieważ może to spowodować ich uszkodzenie. Po oczyszczeniu odłóż elementy na bok do wyschnięcia do góry nogami.

Połącz jedną część przetworzonych kwiatów z dziewięcioma częściami chloroformu w zlewce, dodając kwiaty, a następnie chloroform. Delikatnie mieszać przez 30 sekund i przecedzić przez sitko ze stali nierdzewnej do drugiej zlewki. Wlać ekstrakt na bazie chloroformu z drugiej zlewki do szklanej probówki hodowlanej i założyć nasadkę z PTFE.

Owiń nakrętkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu. Powstały ekstrakt kwiatowy na bazie chloroformu należy przechowywać w ciemności, aby zmniejszyć degradację światła w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia eksperymentalnego. Powtórz ekstrakcje z wieloma próbkami, aby uzyskać kontrpróby.

Aby utworzyć urządzenie zbierające dla każdej wybranej lokalizacji, użyj końcówki schodkowej dołączonej do wiertarki, aby wywiercić otwór w dolnej części kubka z rozpylaczem. Następnie wytnij linię prostą od górnej krawędzi otworu do wylotu kubka z rozpylaczem. Teraz wywierć cztery równoodległe otwory wystarczająco duże, aby przewlec drut pokryty tworzywem sztucznym u wylotu kubka z rozpylaczem.

Przymocuj jeden koniec drutów pokrytych tworzywem sztucznym, pozostawiając jeden koniec wolny. Wywierć otwór wystarczająco duży, aby wkręcić spray do malowania lub adapter kubka do 50-mililitrowej pokrywy wirówki. Uszczelnij gwinty adaptera parafilmem, aby zapobiec wyciekom.

Przymocuj go zarówno do nasadki wirówki, jak i gwintowanej części kubka opryskiwacza. Następnie podłącz dopasowaną 50-milimetrową rurkę wirówkową. Utwórz cztery urządzenia do zbierania próbek na lokalizację pobierania próbek.

Rozmieść urządzenia w wybranych miejscach, zginając kubki opryskiwacza, aby pasowały do łodyg. Ustaw odciętą stronę kubka opryskiwacza do góry za pomocą drutów pokrytych tworzywem sztucznym przymocowanych do innych trzpieni. Dzięki temu woda przepływająca przez kwiaty jest wychwytywana.

Aby zebrać wodę deszczową z kwiatów żurawiny, najpierw przebij osiem równoodległych otworów wokół ujścia lejka za pomocą metalowej sondy. Włóż opaski zaciskowe do czterech otworów. Przymocuj drugie końce do przeciwległego miejsca tego otworu, tworząc zgrabny wzór skrzyżowania.

Owiń lejek parą z parafilmem i odstaw na bok. Wywierć otwór wystarczająco duży, aby włożyć lejek w dół trzpienia do 50-mililitrowej nasadki wirówki za pomocą wiertła stopniowego. Włóż przygotowany lejek do nasadki wirówki.

Po opadach deszczu lub nawadnianiu górnym wyjmij i wymień dolną część probówki wirówki. Rury zbierające wodę deszczową należy szybko wymienić po zwilżeniu, ponieważ są one podatne na degradację przez naturalne zanieczyszczenia mobilizowane w odpływie, takie jak bakterie i inne grzyby. Umieść dwie warstwy papierowych krążków w naczyniach hodowlanych i namocz w dwóch mililitrach sterylnej wody destylowanej.

Następnie wymieszaj równe objętości sterylnej wody destylowanej i ekstraktu kwiatowego na bazie wody w dwóch mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Następnie dodaj równą objętość zawiesiny zarodników do przygotowanych dwóch mililitrowych probówek do mikrowirówek. Otrzymany preparat określa się mianem wodnej mieszaniny do uzdatniania.

W celu kontroli pomiń część ekstraktu kwiatowego i zastąp ją sterylną wodą destylowaną, aby utrzymać stałe stężenia konidiów. Teraz umieść wstępnie oczyszczone szklane szkiełka nakrywkowe na nasączonych ręcznikach papierowych w naczyniu do hodowli komórkowych. Umieść 40 mikrolitrów kropli wodnej mieszaniny do uzdatniania wody na środku szkiełka nakrywkowego.

Powtórz to dla pożądanych zabiegów, w tym kontroli. Następnie zamknij naczynie do hodowli komórkowych. Po dozowaniu wszystkich zabiegów i powtórzeń umieść wszystkie replikowane szalki z kultur komórkowych w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności.

W określonych wcześniej punktach czasowych dodaj 10 mikrolitrów utrwalacza do kropel, zatrzymując wzrost i częściowo konserwując wierzchowiec. Po dodaniu utrwalacza ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe, umieszczając każde z nich kropelką do dołu na szklanym szkiełku mikroskopowym, aby ułatwić badanie mikroskopowe. Gdy wszystkie szkiełka nakrywkowe znajdą się na szklanych szkiełkach mikroskopowych, pozostaw je do osadzenia i częściowego wyschnięcia w kapturze przepływowym przez 20 minut.

Policz wszystkie konidia obecne na szkiełku nakrywkowym, w tym konidia pierwotne, konidia kiełkujące i nowo utworzone konidia wtórne, a także appressoria. Pracuj w powiększeniu 400 razy lub 200 razy, uzyskując łączną powierzchnię 3.808 milimetrów kwadratowych. W okapie z przepływem laminarnym dodaj dwie równe objętości sterylnej wody destylowanej i jedną objętość zawiesiny zarodników do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Odłóż tę wodną mieszaninę do uzdatniania wody do testów biologicznych ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu. W dygestorium umieść Van T Cell na szklanym szkiełku nakrywkowym w przygotowanym plastikowym naczyniu do hodowli komórek. Dozuj 33 mikrolitry pożądanego ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu do środka komórki i pozostaw do wyschnięcia.

Nie dotykaj ścian komórki. Do zabiegu kontrolnego dodać chloroform z pierwszego tłoczenia. Po wyschnięciu ekstraktu kwiatowego na bazie chloroformu, należy dozować 99 mikrolitrów przygotowanej wodnej mieszaniny do zabiegu za pomocą standardowej pipety do środka komórki Van T.

Następnie zamknij wszystkie szalki do hodowli komórkowych i inkubuj. W określonych wcześniej punktach czasowych dodaj 15 mikrolitrów utrwalacza do komórki Van T i pozostaw na co najmniej pięć minut, aby zapewnić odpowiednie zabarwienie grzybów. Po tym czasie ostrożnie wyjmij komórkę Van T.

Wykonaj etapy odwrócenia szkiełka nakrywkowego i akwizycji danych jak poprzednio. Po ocenie mikroskopowej C. fiorniae w ciągu 24 godzin po inokulacji, porównanie konidiów w obecności sterylnej wody destylowanej z ekstraktem kwiatowym na bazie wody ujawnia dramatyczny wzrost wtórnego konidiacji i tworzenia appressorium. Jednak wtórne konidiacja nie była tak widoczna, gdy porównano kontrolę sterylnej wody destylowanej z użyciem chloroformu z ekstraktami na bazie chloroformu.

Wzrost C.fiorniae przesunął się raczej w kierunku formacji apresoralnej. W tym teście sterylna kontrola wody destylowanej i ekstrakcje kwiatów na bazie chloroformu żurawiny zostały wizualnie sprawdzone po zero, sześciu, 12 i 24 godzinach po inokulacji. Tworzenie się appressorium rozpoczęło się po sześciu godzinach w ekstrakcie kwiatowym na bazie chloroformu i stopniowo wzrastało w kolejnych punktach czasowych.

Wynik ten potwierdza odkrycie, że kwiaty skracają czas potrzebny do tworzenia struktur infekcyjnych. Zwalczanie chorób grzybów gnijących owoce często obejmuje stosowanie fungicydów w czasie kwitnienia. W tym przypadku ekstrakty na bazie chloroformu żurawiny z wielu etapów wzrostu żurawiny zostały wizualnie ocenione pod kątem skutecznych wosków powierzchniowych na C. fiorniae po 24 godzinach od inokulacji.

Jajniki zebrane w czerwcu, niedojrzałe owoce zebrane w lipcu i w sierpniu, zebrane owoce zebrane w październiku oraz sterylną kontrolę wody destylowanej pod kątem tworzenia się apresoriów. Ekstrakty na bazie chloroformu jajników charakteryzowały się największą wielkością tworzenia się appressorial, co wskazuje na znaczenie zakwitu w cyklu życiowym C. fiorniae. Patogen jest najważniejszym elementem tego protokołu.

Grzyby powinny być rutynowo przenoszone na świeże podłoża, aby zachować spójność między próbami. Ze względów bezpieczeństwa wszelkie prace z chloroformem muszą być wykonywane pod wyciągiem. Obejmuje to przygotowanie materiałów i wyrobów szklanych, procedury ekstrakcji i prowadzenie testu biologicznego na bazie chloroformu.

Kombinacje punktów czasowych, patogenów, kwiecistych zbiorów wody deszczowej lub ekstrakcji żywiciela można wykorzystać do oceny różnych interakcji gospodarz-patogen. Urządzenia do zbierania wody deszczowej i związane z nimi testy biologiczne umożliwią innym pracę ze stymulantami gospodarza mobilizowanymi podczas opadów deszczu w wielu systemach ścieżek.