Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Bez protokołu możliwe jest zbadanie dynamicznego procesu różnicowania mioblastów i tworzenia włókien mięśniowych, w szczególności pozycjonowania jądrowego poprzez wykorzystanie obrazowania żywych komórek. Obrazowanie żywych komórek mioblastu z jądrami obcych komórek umożliwia badanie różnicowania mioblastów w żywych komórkach i automatyczne śledzenie jąder. Demonstracja wizualna pomaga zrozumieć, jak połączyć pierwotną izolację komórek z obrazowaniem na żywo i analizą obrazową.

Procedurę zademonstruje wraz z Fredericą Colombo Giorga Careccia, doktorantka w naszym laboratorium. Zacznij od zebrania mięśni piszczelowych płaszczkowatych, prostowników długich palców, mięśni brzuchatych łydki, mięśnia czworogłowego uda i tricepsa z obu tylnych kończyn dorosłej myszy na szalkę Petriego PBS na lodzie. Użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby ostrożnie usunąć ścięgna i tłuszcz z każdego mięśnia i przenieść mięśnie do pustej szalki Petriego.

Za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek pokrój i zmiel mięśnie, aż uzyskasz jednolitą masę i przenieś kawałki mięśni do 50-mililitrowej tubki. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki wytrawiającej do kawałków mięśni na 30-minutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 250 obrotów na minutę. Pod koniec trawienia enzymatycznego zatrzymaj reakcję za pomocą 10 mililitrów pożywki blokującej.

I odwirować próbkę przez odwirowanie. Umieść probówkę na lodzie i przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ponownie odwirować supernatant.

I ponownie zawiesić pelety w jednym milimetrze DMEM. Uzupełnij go dziesięcioprocentową płodową surowicą bydlęcą lub FBS na lodzie. Strawić zarezerwowany osad w 10 mililitrach świeżej pożywki do wytrawiania, jak właśnie pokazano, i połączyć strawiony osad z zawiesiną komórek rezerwowych na lodzie.

Przecedź wyciągnięte komórki przez filtr o długości 70 mikrometrów, a następnie przez filtr o średnicy 40 mikrometrów. I umyj komórki w 15 milimetrach świeżego DMEM, uzupełnionego 10 procentami FBS. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek w temperaturze pokojowej.

Zatrzymanie lizy po pięciu minutach za pomocą 40 mililitrów PBS i dodatkowego odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w 20 mililitrach DMEM uzupełnionym 10 procentami FBS i wstępnie pokryć komórki na niepowlekanej szalce Petriego. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla zbierz komórkę satelitarną zawierającą supernatant.

I wstępnie pokryj zawiesinę ogniw jeszcze dwa razy, jak pokazano. Po ostatnim posiewaniu zbierz komórki satelitarne przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 40 mililitrach świeżej pożywki proliferacyjnej. Podzielono komórki między dwie pokryte kolagenem 150-mililitrowe szalki Petriego z jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny na miskę, aby wywołać ekspresję H2BGFP.

I włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na dwa lub trzy dni. Gdy mioblasty osiągną odpowiednią gęstość doświadczalną, umyj komórki w każdym naczyniu pięcioma mililitrami PBS i odłącz komórki od dna płytki dwoma mililitrami trypsyny na naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Potwierdź oderwanie za pomocą mikroskopii świetlnej i zatrzymaj reakcję za pomocą pięciu mililitrów DMEM plus dziesięć procent FBS na płytkę.

W przypadku obrazowania żywych komórek należy umieścić dwie komórki dwa razy po dziesięć do piątej w każdym dołku 12-dołkowej płytki pokrytej 350 mikrolitrami pożywki różnicującej, uzupełnionej matrycą błony podstawnej na studzienkę przez dwie godziny. Gdy komórki przylgną do dna płytki, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla na stoliku mikroskopu konfokalnego i użyj 20-krotnie suchego obiektywu, aby uzyskać pola widzenia z setkami komórek, aby uzyskać 16-bitowe obrazy o wymiarach 1024 na 1024 pikseli na klatkę co sześć minut przez 16 godzin. Dla każdej uzyskanej pozycji wygeneruj wieloramkowy plik dot tif, a następnie pobierz i rozpakuj oprogramowanie dot zip dostarczone w wybranym folderze.

Otwórz przykładowy folder śledzenia segmentacji i kliknij do segmentacji kropka M, aby otworzyć okno poleceń w Matlabie. Zmień skrypty kropki M z odpowiednią segmentacją tak, aby ścieżka zmiennej nazwy pliku była nazwą pliku tif, a ścieżka wejściowa ścieżki była folderem, w którym znajduje się kropka tif. Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić skrypt.

Wynik segmentacji zostanie zapisany jako plik dot mat, natomiast segmentacja jąder może być zwizualizowana na rysunku wyjściowym. Aby wygenerować ścieżki, najpierw kliknij dwukrotnie generuj ścieżki kropkę M w tym samym folderze roboczym. Następnie zmień nazwę pliku na nazwę pliku, wskaż odpowiedni plik kropkowy Mat dla segmentowanych jąder.

Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić skrypt. Wynik śledzenia zostanie zapisany jako kolejny plik z kropkami, a wygenerowane ścieżki zostaną wykreślone. Aby ocenić jakość utworów.

Najpierw kliknij dwukrotnie kropkę śledzenia Sprawdź M i zmień nazwę pliku na odpowiednią nazwę kropki tif. Następnie kliknij ścieżkę nazwy pliku, aby użyć pliku z kropkami i kliknij uruchom. W oknie rysunku użyj dolnego paska przewijania, aby wybrać jądro.

Wybrane jądro zostanie zakreślone na czerwono, a trajektorię wybranej komórki można śledzić w czasie za pomocą górnego paska przewijania. Zielone krzyżyki wskazują wykryte jądra. Proliferacja i różnicowanie są silnie upośledzone w mioblastach hodowanych za pomocą Hoechst.

W porównaniu z mioblastami wyizolowanymi od myszy H2BGFP i hodowanymi z doksycykliną lub typem dzikim, miozyny o ciężkim łańcuchu znakowanym mioblastami. Obrazowanie żywych komórek z pierwotnymi mioblastami wykazującymi ekspresję białka H2BGFP umożliwia śledzenie jąder podczas różnicowania. Połączone obrazy transmisji w kanałach GFP w początkowych i końcowych punktach czasowych okresu różnicowania pozwalają na identyfikację miotub, a w konsekwencji jąder, które ostatecznie integrują się z miotubami lub które nie łączą się z miotubami.

Po zobrazowaniu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej jądra można podzielić na segmenty, jak pokazano, a transformację zlewiska można wykorzystać do oddzielenia pobliskich obiektów. Dzięki takiemu podejściu większość jąder jest identyfikowana na obrazie, co pozwala na śledzenie ruchu jąder w sposób, jak pokazano. Na przykład wydaje się, że całkowita długość trajektorii jest nieco wyższa w przypadku komórek barwionych Hoechstem.

Chociaż różnica nie jest znacząca. Jednak obliczenia całkowitego przemieszczenia podczas upływu czasu ujawniają, że całkowite przemieszczenie komórek barwionych Hoechstem jest znacznie mniejsze niż w przypadku komórek niebarwionych. Zgodnie z przewidywaniami, całkowita roczna zmienność dla komórek niebarwionych jest znacznie mniejsza w porównaniu z komórkami barwionymi metodą Hoechst.

Ważne jest, aby postępować zgodnie z protokołem dokładnie tak, jak wykazano, w szczególności podczas łączenia umiejętności technicznych z etapów biologicznych z mikroskopem konfokalnym i używanym oprogramowaniem. Aby zbadać różnicowanie mioblastów i pozycjonowanie jądra w innym modelu mięśniowym, możliwe jest przeniesienie izolowanych mioblastów za pomocą fluorescencyjnego białka jądrowego. Technika ta utorowała drogę do zbadania dynamiki komórkowej i jądrowej podczas różnicowania mięśni oraz do dalszego badania defektów w tych procesach.

W różnych stanach patologicznych, takich jak dystrofie mięśniowe.