Name: Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metody obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania mioblastów myszy. Technika ta umożliwia automatyczną analizę dynamiki jądrowej w tworzeniu włókien mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez AFM-Telethon to E.V. (#21545) oraz przez Ospedale San Raffaele (OSR) Seed Grant dla S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr Jean-Yves Tinevez z Centrum Analizy Obrazów Instytutu Pasteura jest znany z publicznego udostępniania swoich procedur MATLAB "Simple Tracker".

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w San Raffaele.
1. Analiza mięśni kończyn tylnych myszy
<ol>
	<li>Sterylizuj pęsety i nożyczki (zarówno proste, jak i zakrzywione) przez autoklawowanie.</li>
	<li>Przygotować i przefiltrować (0,22 μm) wszystkie pożywki (pożywkę blokującą, pożywkę mineralizującą, pożywkę proliferacyjną i pożywkę różnicującą) przed rozpoczęciem doświadczenia (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na szalce Petriego o średnicy 35 mm w celu pobrania mięśni.</li>
	<li>Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy lub za pomocą CO2 i wysterylizuj skórę etanolem. Usuń skórę z kończyn tylnych i kończyn górnych za pomocą nożyczek i pęsety, aby ułatwić izolację mięśni. 
	UWAGA: Mięśnie można wyizolować od noworodków lub dorosłych myszy. Nowonarodzone myszy mają zwiększoną liczbę komórek satelitarnych w porównaniu z dorosłymi myszami. Jednak całkowita liczba komórek satelitarnych, które można wyizolować od jednej dorosłej myszy, jest wystarczająca do przeprowadzenia eksperymentu opisanego poniżej.</li>
	<li>Wyizoluj piszczel, płaszczkowaty, prostownik długi palca (EDL), brzuchaty łydki, mięsień czworogłowy uda i triceps i umieść je na szalce Petriego zawierającej PBS. Pozostaw danie na lodzie. Ostrożnie usuń ścięgna i tłuszcz za pomocą wysterylizowanych nożyczek i pęsety.</li>
</ol>
2. Izolacja pierwotnych mioblastów
UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórkowej odbywają się w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Usuń mięśnie z PBS. Pokrój i zmiel mięśnie za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek, aż do uzyskania jednolitej masy. Włóż kawałki mięśni do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki wytrawiającej do części mięśniowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy silnym wzburzeniu (250 min-1) w łaźni wodnej w celu enzymatycznego trawienia mięśni.</li>
	<li>Dodaj 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Sole (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% gentamycyny (pożywki blokującej), aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Wirować przy 40 x g przez 5 minut i zebrać supernatant do probówki o pojemności 50 ml. Zachowaj pellet na lodzie. 
	UWAGA: Po odwirowaniu supernatant zawiera kilka komórek satelitarnych, komórek krwi, komórek śródbłonka i fibroblastów, podczas gdy osad zawiera kawałki niestrawionych mięśni i tkanki łącznej. Aby zwiększyć liczbę izolowanych komórek, osad musi zostać poddany dodatkowym etapom trawienia, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Odwirować supernatant przy 650 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml DMEM zawierającym 10% FBS. Zawieszone osady należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.2–2.5 2x dla reszty osadu otrzymanego w kroku 2.4 i dodaj następnie ponownie zawieszone granulki do pierwszego ponownie zawieszonego osadu zakonserwowanego na lodzie.</li>
	<li>Przepuść zawieszone granulki przez filtr 70 μm, a następnie przez filtr 40 μm. Dodać 15 ml DMEM z 10% FBS i odwirować przy 650 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek, aby zubożyć czerwone krwinki. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 40 ml PBS, aby zatrzymać lizę czerwonych krwinek, i odwirować przy 650 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml DMEM z 10% FBS.</li>
	<li>Na etapie wstępnego powlekania należy pokryć komórki w 20 ml pożywki proliferacyjnej na niepowlekanej szalce Petriego o średnicy 150 mm. Po 1 godzinie inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2) zebrać pożywkę. 
	UWAGA: Fibroblasty, przyczepiając się do płytki, są następnie odrzucane, podczas gdy komórki satelitarne pozostają w zawiesinie.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.9 3 razy, a na ostatnim etapie wstępnego powlekania zebrać pożywkę zawierającą komórki satelitarne w zawiesinie.</li>
	<li>Wirować przy 650 x g przez 5 min.</li>
	<li>Podczas wirowania komórek pokryj dwie 150-milimetrowe szalki Petriego kolagenem (10 ml 0,1% roztworu w 0,1 M kwasie octowym). W tym celu połóż kolagen na płytce, inkubuj przez 5 minut i usuń go. Pozostaw talerz do wyschnięcia na 30 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant otrzymany w kroku 2.11 i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 ml pożywki proliferacyjnej (tabela materiałów). Umieść komórki na dwóch pokrytych kolagenem płytkach Petriego o średnicy 150 mm (20 ml na szalkę) i trzymaj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2, 5% O2) w pożywce proliferacyjnej przez 2-3 dni z 1 μg/ml doksycykliny w celu indukcji ekspresji H2B-GFP. 
	UWAGA: Ten krok pozwala na proliferację mioblastów w celu uzyskania większej liczby komórek do dalszych testów. Gęstość komórek jest utrzymywana na bardzo niskim poziomie, aby uniknąć spontanicznego różnicowania mioblastów w miotuby.</li>
</ol>
3. Testy proliferacji i różnicowania mioblastów
UWAGA: Gdy gęstość mioblastów jest wysoka, niektóre komórki inicjują wydłużenie, a następnie konieczne jest ich rozdzielenie. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe jest podzielenie komórek 2x–3x bez wpływu na ich fenotyp.
<ol>
	<li>Wyrzucić pożywkę, przemyć komórki 5 ml PBS, dodać 2 ml trypsyny (1x) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 5 minut. Sprawdź pod mikroskopem, a gdy okrągłe komórki się oderwą, dodaj 5 ml DMEM z 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę. Policz liczbę komórek (zwykle można uzyskać około 1 x 106 komórek/mysz). 
	UWAGA: Inkubacja z trypsyną przez 5 minut zwykle wystarcza do odłączenia proliferujących mioblastów.</li>
	<li>Poddaj komórki jednemu z testów opisanych poniżej.
	<ol>
		<li>Test proliferacji 
		<ol>
			<li>Umieść 50 000 komórek/basenik w 1 ml/studzienkę pożywki proliferacyjnej na pokrytej kolagenem płytce 12-dołkowej i inkubuj posiane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ). Napraw i policz komórki w 24, 48 lub 72 godz. 
			UWAGA: Pożywka jest wymieniana co 48 godzin, aby uniknąć wyczerpania składników odżywczych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Test różnicowania 
		<ol>
			<li>Pokryć 12-dołkową płytkę 350 μl pożywki różnicującej zawierającej matrycę błony podstawnej (1:100). Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut i usunąć pożywkę.</li>
			<li>Płytka 200 000 komórek/studzienkę w podłożu różnicującym na płytce pokrytej matrycą. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 , 5 % O2 ) aż do przylegania do płytki (2 godziny zwykle wystarczają, aby komórki przylegały i zaczęły się różnicować).</li>
			<li>Aby ocenić różnicowanie, należy przeprowadzić barwienie ciężkiego łańcucha i jąder miozyny, jak opisano wcześniej11. Alternatywnie można przeprowadzić analizy obrazowania na żywo, jak opisano poniżej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo różnicowania mioblastów i śledzenia jądra
<ol>
	<li>W celu obrazowania żywych komórek umieścić komórki, uzyskane w sekcji 3.2.2 i posiane na płytce 12-dołkowej, pod mikroskopem konfokalnym, wyposażonym w system inkubacji w celu utrzymania komórek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
	<li>Użyj suchego obiektywu 20x (0,7 NA), aby uzyskać pole widzenia z setkami komórek, wystarczające do monitorowania tworzenia się włókien mięśniowych. Komórki H2B-GFP można obrazować za pomocą lasera argonowego o niskiej intensywności 488 nm. 
	UWAGA: Otwarty otwór otworkowy zapewnia, że głębia obrazu (~10 μm) zawiera grubość komórki, dzięki czemu komórki są utrzymywane w ostrości przez cały czas trwania eksperymentu. Użycie mikroskopu konfokalnego jest korzystne, ponieważ poprawia stosunek sygnału do szumu obrazów, chociaż można również zastosować mikroskopię szerokokątną. Powstawanie włókien mięśniowych można monitorować za pośrednictwem kanału transmisyjnego.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy 16-bitowe i 1,024 x 1,024 pikseli na klatkę co 6 minut przez 16 godzin. Dla każdej uzyskanej pozycji wygeneruj plik multiframe.tif (patrz przykład w plikach uzupełniających). 
	UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano komercyjne oprogramowanie powiązane z mikroskopem (Tabela materiałów); Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby osiągnąć ten sam cel podczas korzystania z innych mikroskopów.</li>
	<li>Pobierz oprogramowanie dostarczone jako .zip plik uzupełniający. 
	UWAGA: Procedury są skryptami, które muszą być uruchamiane w programie MATLAB. Oprogramowanie jest adaptacją opublikowanego oprogramowania12 zoptymalizowanego pod kątem śledzenia jąder podczas tworzenia miotub. Oprogramowanie to jest podzielone na dwie części: pierwsza identyfikuje jądra w każdej ramce poprzez ich segmentację, podczas gdy druga generuje "ślady" (trajektorie) ruchu jąder. Pełny kod do segmentacji i śledzenia jądra atomowego oraz przewodnik krok po kroku, jak rozpocząć pracę, znajdują się w plikach uzupełniających.</li>
	<li>Rozpakuj plik zip i zapisz go w żądanej ścieżce na używanym komputerze osobistym (PC). Wykonaj wszystkie poniższe przejścia na komputerze z już zainstalowanym niezbędnym oprogramowaniem. Zauważ, że plik .zip składa się z trzech folderów, jak wspomniano poniżej. 
	UWAGA: Procedury segmentacji zawierają funkcje, które mają być uruchamiane dla segmentacji. Tracking Routines zawiera natomiast funkcje wymagane do śledzenia. Przykład: Segmentation Tracking udostępnia podstawowe skrypty i pliki umożliwiające zapoznanie się z systemem. Oprogramowanie służące do segmentacji i śledzenia jąder działa poprawnie w MATLAB, R2015a lub nowszych wersjach.</li>
	<li>Aby podzielić jądra na segmenty z pliku .tif, nazwij go na przykład NameFile.tif.
	<ol>
		<li>Otwórz folder Przykładowe śledzenie segmentacji i kliknij DoSegmentation.m. Spowoduje to otwarcie okna poleceń w MATLAB.</li>
		<li>Sprawdź okno Bieżący folder po lewej stronie, aby zobaczyć wszystkie elementy w folderze Przykład śledzenia segmentacji. Kliknij dwukrotnie DoSegmentation.m. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat modyfikacji, które należy wykonać w skrypcie znajdują się w pliku StepbyStep.txt. Obowiązkowe jest zmodyfikowanie skryptu w taki sposób, aby zmienna filenameinput była NameFile.tif, a folderinput był folderem, w którym znajduje się plik .tif.</li>
		<li>Uruchom skrypt (klikając zielony przycisk Uruchom). Wynik segmentacji zostanie zapisany jako file.mat (SegmentedNameFile.mat), natomiast segmentację jąder można zwizualizować na rysunku wyjściowym. 
		UWAGA: Parametry segmentacji, opisane w skrypcie, mogą być modyfikowane w razie potrzeby. Jakość segmentacji można sprawdzić za pomocą skryptu CheckSegmentation.m (patrz plik StepbyStep.txt). Na tej podstawie, jeśli jakość segmentacji jest słaba (wykryto tylko kilka jąder), dostosuj parametry segmentacji, wyraźnie wskazane w skrypcie DoSegmentation.m, i powtórz procedurę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wygenerować ścieżki (tj. trajektorie każdego z jąder w czasie), korzystając z pozycji jądrowych uzyskanych w segmentacji, uruchom skrypt GenerateTracks.m w tym samym folderze roboczym. Upewnij się, że dodałeś odpowiedni plik segmentacji jako dane wejściowe, uzyskany wcześniej (więcej informacji można znaleźć w pliku StepbyStep.txt). 
	UWAGA: Jako dane wyjściowe użytkownik otrzyma plik TrackedNameFile.mat z macierzą dla współrzędnych x i inną macierzą dla współrzędnych y wygenerowanych ścieżek.</li>
	<li>Oceń jakość ścieżek za pomocą CheckTracking.m (więcej informacji można znaleźć w pliku StepbyStep.txt). Użyj rysunku wyjściowego tego ostatniego fragmentu, aby pomóc w wizualizacji położenia każdego jądra w czasie. Sprawdź po lewej stronie, czy nie ma zielonych krzyżyków, które wskazują każde segmentowane jądro. Aby wybrać jedno konkretne jądro, użyj dolnego paska przewijania. Zwróć uwagę, że wybrane jądro zostanie zakreślone na czerwono, podczas gdy po prawej stronie trajektorię wybranej komórki można śledzić w czasie (za pomocą górnego paska przewijania).</li>
</ol>

<ol><li>Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mass+and+distribution+in+468+men+and+women+aged+18-88+yr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr.</a> Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).</li>
<li>Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+factors+and+cell+populations+involved+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50846(2014).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+individual+myofibers+and+their+satellite+cells+from+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50074(2013).</li>
<li>Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Culture+of+Myogenic+Precursor+Cells%2FPrimary+Myoblasts+from+Skeletal+Muscle+of+Adult+and+Aged+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55047(2017).</li>
<li>Roman, W., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+positioning+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear positioning in skeletal muscle.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).</li>
<li>Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Differentiation+of+Mature+Myofibers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55141(2017).</li>
<li>Foudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+histone+2B-GFP+retention+reveals+slowly+cycling+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).</li>
<li>Tirone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+box+1+orchestrates+tissue+regeneration+via+CXCR4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).</li>
<li>Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+oscillations+translate+into+functionally+related+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression.</a> eLife. 5, e09100(2016).</li>
<li>Adamski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Hoechst+33342+on+C2C12+and+PC12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation.</a> FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker">https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker</a> (2016).</li>
<li>Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurkard%2C+R+%22Assignment+Problems%2C+Revised+Reprint%22">Assignment Problems, Revised Reprint</a>. , SIAM. (2009).</li>
<li>Falcone, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-WASP+is+required+for+Amphiphysin-2%2FBIN1-dependent+nuclear+positioning+and+triad+organization+in+skeletal+muscle+and+is+involved+in+the+pathophysiology+of+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).</li>
<li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Satellite+Cells+for+Skeletal+Muscle+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Włókna mięśniowe (miofibery) to komórki wielojądrowe, które powstają w wyniku fuzji komórek prekursorowych mięśni (mioblastów) pochodzących z komórek macierzystych mięśni (komórek satelitarnych), które ulegają proliferacji i różnicowaniu 2,3,4. Aby ocenić różnicowanie mioblastów, powszechna procedura polega na hodowli mioblastów w pożywce różnicującej i utrwaleniu komórek w różnych punktach czasowych w celu przeprowadzenia barwi...

Mięśnie szkieletowe to największa tkanka w ludzkim ciele, stanowiąca 35%-40% masy ciała1. Komórki satelitarne to komórki macierzyste mięśni, anatomicznie charakteryzujące się swoim położeniem (przeciwstawione błonie plazmatycznej, pod blaszką podstawy włókien mięśniowych), które dają początek proliferującym mioblastom (miogennym komórkom progenitorowym), które ostatecznie różnicują się i integrują z istniejącymi włóknami mięśniowymi i/lub łączą się, tworząc nowe włókna miologiczne2,3,4. Ich odkrycie i postęp w badaniach nad ich biologią doprowadziły do istotnych spostrzeżeń na temat rozwoju i regeneracji mięśni.
Protokoły do izolowania i różnicowania mioblastów w miotubach zostały opracowane wiele lat temu i nadal są powszechnie stosowane do badania różnicowania mięśni szkieletowych5,6,7. Jednak większość z tych metod to procedury statyczne, które opierają się na analizie utrwalonych komórek i w związku z tym nie pozwalają naukowcom w pełni zbadać wysoce dynamicznych procesów, takich jak fuzja mioblastów i dojrzewanie włókien mięśniowych. Najbardziej uderzającym przykładem jest pozycjonowanie jądra, które jest ściśle regulowane, z jądrami początkowo w środku włókna mięśniowego, a następnie zlokalizowanymi na obrzeżach po dojrzewaniu włókien mięśniowych8,9. Obrazowanie na żywo jest najodpowiedniejszą techniką do uzyskania dalszych informacji na temat tak osobliwego zjawiska.
Tutaj opisujemy metodę, która umożliwia naukowcom rejestrowanie różnicowania mioblastów i powstawania miotub za pomocą mikroskopii poklatkowej oraz przeprowadzanie analiz ilościowych z automatycznego śledzenia jąder mioblastów. Metoda ta zapewnia wysokoprzepustową ilościową charakterystykę dynamiki jądrowej i zachowania mioblastów podczas różnicowania i fuzji. Protokół jest podzielony na cztery różne części, a mianowicie: (1) zbieranie mięśni z tylnych kończyn myszy, (2) izolację pierwotnych mioblastów, która polega na trawieniu mechanicznym i enzymatycznym, (3) proliferację i różnicowanie mioblastów oraz (4) obrazowanie na żywo w celu śledzenia jąder w ciągu pierwszych 16 godzin różnicowania mioblastów.
W poniższej procedurze, mioblasty są izolowane od myszy H2B-GFP i traktowane 1 μg/ml doksycykliny w celu wywołania ekspresji H2B-GFP, jak opisano wcześniej10. Alternatywnie możliwe jest wyizolowanie mioblastów od innych myszy transgenicznych, które wyrażają białko fluorescencyjne w jądrze lub transfekcja komórek wyizolowanych od myszy typu dzikiego w celu ekspresji białka fluorescencyjnego w jądrze, jak opisano przez Pimentel et al.9.

<table><tbody><tr>ekstrakt z <td>zarodków kurczaka</td><td>Seralab</td><td>CE-650-J</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C9263-1G</td><td>125 jednostek / mg</td></tr><tr><td>kolagenu ze skóry cielęcia</td><td>Sigma</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>dispaza</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>1,78 jednostki / mg</td></tr><tr><td>doksycyklina</td><td>Sigma</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Technologie życia</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Invitrogen</td><td>16050-098</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>life technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Sigma</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>pożywka do lizy czerwonych krwinek</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże trawiące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenaza</td><td>40 mg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dispaza</td><td>70 mg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>20 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przefiltrowanej 0,22um</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium blokujące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>10%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>1 i permil;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przefiltrowane 0,22um</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka proliferacyjna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>20%</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>L-glutamina</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>1 i permil;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt z zarodków chichen</td><td>3%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtrowany 0,22um</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka różnicująca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>2%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>1 & permil;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z zarodków Chichen</td><td>1%</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>filtrowany 0,22um</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Umiejscowienie jądra w komórkach jest ważne dla wielu procesów komórkowych w rozwoju i regeneracji. Najbardziej intrygujący przykład ułożenia jądra występuje podczas różnicowania mięśni szkieletowych. Włókna mięśniowe (miofibery) to wielojądrzaste komórki powstałe w wyniku fuzji komórek prekursorowych mięśni (mioblastów) pochodzących z komórek macierzystych mięśni (komórek satelitarnych), które ulegają proliferacji i różnicowaniu. Prawidłowe ułożenie jądra w obrębie włókien mięśniowych jest wymagane do prawidłowej regeneracji i funkcjonowania mięśni. Powszechna procedura oceny różnicowania mioblastów i tworzenia włókien mięśniowych opiera się na utrwalonych komórkach analizowanych za pomocą immunofluorescencji, co utrudnia badanie ruchu jądra i zachowania komórek w czasie. W tym miejscu opisujemy metodę analizy różnicowania mioblastów i tworzenia włókien mięśniowych za pomocą obrazowania żywych komórek. Dostarczamy oprogramowanie do automatycznego śledzenia jądra w celu uzyskania wysokoprzepustowej ilościowej charakterystyki dynamiki jądrowej i zachowania mioblastów (tj. trajektorii) podczas różnicowania i fuzji.

Aby automatycznie śledzić ruch jąder podczas różnicowania mioblastów w obrazowaniu na żywo, jądra powinny być preferencyjnie znakowane fluorescencyjnie. Należy zauważyć, że zastosowanie cząsteczek interpokalujących DNA nie jest możliwe, ponieważ cząsteczki te zakłócają proliferację i różnicowanie pierwotnych mioblastów13. Przykładowo, przeanalizowano proliferację i różnicowanie w pierwotnych mioblastach hodowanych z dodatkiem Hoechst lub bez niego (<strong class="x...

Różnicowanie mięśni szkieletowych jest bardzo dynamicznym procesem, który szczególnie opiera się na pozycjonowaniu jądra. W tym miejscu opisujemy metodę śledzenia ruchów jąder za pomocą obrazowania żywych komórek podczas różnicowania mioblastów i tworzenia miotubek oraz przeprowadzania ilościowej charakterystyki dynamiki jąder poprzez ekstrakcję informacji z automatycznego śledzenia.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Bez protokołu możliwe jest zbadanie dynamicznego procesu różnicowania mioblastów i tworzenia włókien mięśniowych, w szczególności pozycjonowania jądrowego poprzez wykorzystanie obrazowania żywych komórek. Obrazowanie żywych komórek mioblastu z jądrami obcych komórek umożliwia badanie różnicowania mioblastów w żywych komórkach i automatyczne śledzenie jąder. Demonstracja wizualna pomaga zrozumieć, jak połączyć pierwotną izolację komórek z obrazowaniem na żywo i analizą obrazową.Procedurę zademonstruje wraz z Fredericą Colombo Giorga Careccia, doktorantka w naszym laboratorium. Zacznij od zebrania mięśni piszczelowych płaszczkowatych, prostowników długich palców, mięśni brzuchatych łydki, mięśnia czworogłowego uda i tricepsa z obu tylnych kończyn dorosłej myszy na szalkę Petriego PBS na lodzie. Użyj sterylnych nożyczek i pęsety, aby ostrożnie usunąć ścięgna i tłuszcz z każdego mięśnia i przenieść mięśnie do pustej szalki Petriego.Za pomocą sterylnych zakrzywionych nożyczek pokrój i zmiel mięśnie, aż uzyskasz jednolitą masę i przenieś kawałki mięśni do 50-mililitrowej tubki. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki wytrawiającej do kawałków mięśni na 30-minutową inkubację w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 250 obrotów na minutę. Pod koniec trawienia enzymatycznego zatrzymaj reakcję za pomocą 10 mililitrów pożywki blokującej.I odwirować próbkę przez odwirowanie. Umieść probówkę na lodzie i przenieś supernatant do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ponownie odwirować supernatant.I ponownie zawiesić pelety w jednym milimetrze DMEM. Uzupełnij go dziesięcioprocentową płodową surowicą bydlęcą lub FBS na lodzie. Strawić zarezerwowany osad w 10 mililitrach świeżej pożywki do wytrawiania, jak właśnie pokazano, i połączyć strawiony osad z zawiesiną komórek rezerwowych na lodzie.Przecedź wyciągnięte komórki przez filtr o długości 70 mikrometrów, a następnie przez filtr o średnicy 40 mikrometrów. I umyj komórki w 15 milimetrach świeżego DMEM, uzupełnionego 10 procentami FBS. Pod koniec wirowania ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek w temperaturze pokojowej.Zatrzymanie lizy po pięciu minutach za pomocą 40 mililitrów PBS i dodatkowego odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w 20 mililitrach DMEM uzupełnionym 10 procentami FBS i wstępnie pokryć komórki na niepowlekanej szalce Petriego. Po godzinie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla zbierz komórkę satelitarną zawierającą supernatant.I wstępnie pokryj zawiesinę ogniw jeszcze dwa razy, jak pokazano. Po ostatnim posiewaniu zbierz komórki satelitarne przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 40 mililitrach świeżej pożywki proliferacyjnej. Podzielono komórki między dwie pokryte kolagenem 150-mililitrowe szalki Petriego z jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny na miskę, aby wywołać ekspresję H2BGFP.I włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na dwa lub trzy dni. Gdy mioblasty osiągną odpowiednią gęstość doświadczalną, umyj komórki w każdym naczyniu pięcioma mililitrami PBS i odłącz komórki od dna płytki dwoma mililitrami trypsyny na naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Potwierdź oderwanie za pomocą mikroskopii świetlnej i zatrzymaj reakcję za pomocą pięciu mililitrów DMEM plus dziesięć procent FBS na płytkę.W przypadku obrazowania żywych komórek należy umieścić dwie komórki dwa razy po dziesięć do piątej w każdym dołku 12-dołkowej płytki pokrytej 350 mikrolitrami pożywki różnicującej, uzupełnionej matrycą błony podstawnej na studzienkę przez dwie godziny. Gdy komórki przylgną do dna płytki, umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla na stoliku mikroskopu konfokalnego i użyj 20-krotnie suchego obiektywu, aby uzyskać pola widzenia z setkami komórek, aby uzyskać 16-bitowe obrazy o wymiarach 1024 na 1024 pikseli na klatkę co sześć minut przez 16 godzin. Dla każdej uzyskanej pozycji wygeneruj wieloramkowy plik dot tif, a następnie pobierz i rozpakuj oprogramowanie dot zip dostarczone w wybranym folderze.Otwórz przykładowy folder śledzenia segmentacji i kliknij do segmentacji kropka M, aby otworzyć okno poleceń w Matlabie. Zmień skrypty kropki M z odpowiednią segmentacją tak, aby ścieżka zmiennej nazwy pliku była nazwą pliku tif, a ścieżka wejściowa ścieżki była folderem, w którym znajduje się kropka tif. Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić skrypt.Wynik segmentacji zostanie zapisany jako plik dot mat, natomiast segmentacja jąder może być zwizualizowana na rysunku wyjściowym. Aby wygenerować ścieżki, najpierw kliknij dwukrotnie generuj ścieżki kropkę M w tym samym folderze roboczym. Następnie zmień nazwę pliku na nazwę pliku, wskaż odpowiedni plik kropkowy Mat dla segmentowanych jąder.Kliknij przycisk Uruchom, aby uruchomić skrypt. Wynik śledzenia zostanie zapisany jako kolejny plik z kropkami, a wygenerowane ścieżki zostaną wykreślone. Aby ocenić jakość utworów.Najpierw kliknij dwukrotnie kropkę śledzenia Sprawdź M i zmień nazwę pliku na odpowiednią nazwę kropki tif. Następnie kliknij ścieżkę nazwy pliku, aby użyć pliku z kropkami i kliknij uruchom. W oknie rysunku użyj dolnego paska przewijania, aby wybrać jądro.Wybrane jądro zostanie zakreślone na czerwono, a trajektorię wybranej komórki można śledzić w czasie za pomocą górnego paska przewijania. Zielone krzyżyki wskazują wykryte jądra. Proliferacja i różnicowanie są silnie upośledzone w mioblastach hodowanych za pomocą Hoechst.W porównaniu z mioblastami wyizolowanymi od myszy H2BGFP i hodowanymi z doksycykliną lub typem dzikim, miozyny o ciężkim łańcuchu znakowanym mioblastami. Obrazowanie żywych komórek z pierwotnymi mioblastami wykazującymi ekspresję białka H2BGFP umożliwia śledzenie jąder podczas różnicowania. Połączone obrazy transmisji w kanałach GFP w początkowych i końcowych punktach czasowych okresu różnicowania pozwalają na identyfikację miotub, a w konsekwencji jąder, które ostatecznie integrują się z miotubami lub które nie łączą się z miotubami.Po zobrazowaniu za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej jądra można podzielić na segmenty, jak pokazano, a transformację zlewiska można wykorzystać do oddzielenia pobliskich obiektów. Dzięki takiemu podejściu większość jąder jest identyfikowana na obrazie, co pozwala na śledzenie ruchu jąder w sposób, jak pokazano. Na przykład wydaje się, że całkowita długość trajektorii jest nieco wyższa w przypadku komórek barwionych Hoechstem.Chociaż różnica nie jest znacząca. Jednak obliczenia całkowitego przemieszczenia podczas upływu czasu ujawniają, że całkowite przemieszczenie komórek barwionych Hoechstem jest znacznie mniejsze niż w przypadku komórek niebarwionych. Zgodnie z przewidywaniami, całkowita roczna zmienność dla komórek niebarwionych jest znacznie mniejsza w porównaniu z komórkami barwionymi metodą Hoechst.Ważne jest, aby postępować zgodnie z protokołem dokładnie tak, jak wykazano, w szczególności podczas łączenia umiejętności technicznych z etapów biologicznych z mikroskopem konfokalnym i używanym oprogramowaniem. Aby zbadać różnicowanie mioblastów i pozycjonowanie jądra w innym modelu mięśniowym, możliwe jest przeniesienie izolowanych mioblastów za pomocą fluorescencyjnego białka jądrowego. Technika ta utorowała drogę do zbadania dynamiki komórkowej i jądrowej podczas różnicowania mięśni oraz do dalszego badania defektów w tych procesach.W różnych stanach patologicznych, takich jak dystrofie mięśniowe.

exploiting-live-imaging-to-track-nuclei-during-myoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Techniki mikroskopii świetlnej w połączeniu z testami biochemicznymi wyjaśniają udział egzocytozy za pośrednictwem SNARE w zależnym od netryny rozgałęzianiu aksonów. Ta kombinacja technik pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych kontrolujących rozgałęzianie się aksonów i zmianę kształtu komórki.

Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów

Komórki mięśniowe należą do najbardziej złożonych komórek eukariotycznych. Przedstawiamy protokół różnicowania in vitro wysoko dojrzałych włókien mięśniowych, który pozwala na manipulację genetyczną i wyraźne obrazowanie na wszystkich etapach rozwoju.

In vitro Różnicowanie dojrzałych włókien mięśniowych do obrazowania na żywo

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Ten proces wykorzystuje mikroskopi konfokalną w połączeniu z fluorescencyjnie oznaczoną linią jądra i markerem chromatyny w Arabidopsis thaliana, aby jednocześnie rejestrować dynamikę jądra i chromatyny w korzeniach Arabidopsis oraz badać zmiany w tej dynamice w odpowiedzi na wskazówki rozwojowe i środowiskowe.

Ilościowa obrazowanie komórek Arabidopsis thaliana in vivo w czasie rzeczywistym w celu analizy kształtu jądra komórkowego oraz dynamiki chromatyny podczas rozwoju i stresu środowiskowego korzeni

Poznaj metody obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania mioblastów myszy. Technika ta umożliwia automatyczną analizę dynamiki jądrowej w tworzeniu włókien mięśniowych.

Wykorzystanie obrazowania na żywo do śledzenia jąder podczas różnicowania i fuzji mioblastów

Przeglądaj więcej filmów