Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Metoda ta jest istotna, ponieważ można ją stosować do otrzymywania dużych ilości w pełni zróżnicowanych osteoklastów in vitro. Główną zaletą tej metody jest to, że jest bardziej stabilna i bezpieczna oraz izoluje szpik kostny w krótszym czasie i przy mniejszym wysiłku w porównaniu z tradycyjnym postępowaniem. Technika ta może zapewnić stabilne źródło osteoklastów, które są ważnym obiektem chorób metabolicznych kości, w tym osteoporozy, zapalenia przyzębia i osteolizy okołoprotezowej.

Przy niewielkich modyfikacjach protokół ten może być również odpowiedni do uzyskiwania różnego rodzaju komórek pochodzących ze szpiku kostnego u szczurów lub innych zwierząt. Na początek umieść uśpione zwierzęta na zdezynfekowanej desce w pozycji leżącej. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj nacięcie o długości około jednego centymetra w bliższej części kości udowej, aby złuszczyć skórę.

Następnie wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Ostrożnie i delikatnie odetnij obustronne części łączące wokół stawów biodrowych, kolanowych i skokowych, aby odizolować piszczele i kości udowe. Odetnij część tkanek wokół kości, upewniając się, że jesteś dokładny.

Następnie umieść oczyszczone kości w naczyniu z pięcioma mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej. Użyj sterylnych nożyczek, aby odciąć kość długą. Użyj jednomililitrowej igły strzykawki, aby ostrożnie przepłukać jamę szpiku 10 mililitrami kompletnego podłoża, aż jama szpiku zmieni kolor na biały.

Przenieś tę zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki i przefiltruj ją za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć pozostałą tkankę. Dodaj pięć mililitrów buforu do czerwonej krwi i inkubuj komórki na lodzie przez osiem minut. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach kompletnego podłoża. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i obliczyć czas spędzony na działaniach podjętych tą metodą. Najpierw umieść uśpione zwierzęta na zdezynfekowanej desce w pozycji leżącej.

Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj nacięcie o długości około jednego centymetra w bliższej części kości udowej, aby złuszczyć skórę. Następnie wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Odetnij części tkanek wokół kości, chociaż nie ma potrzeby całkowitego usuwania tkanki.

Opłucz piszczele i kości udowe 12 mililitrami PBS, a następnie przekrój je na pół. Umieść odcięte piszczele i kości udowe w przygotowanej mililitrowej końcówce pipety i umieść ją w przygotowanej probówce do mikrowirówki. Odwirować probówkę trzy razy w temperaturze 1 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 45 sekund.

Następnie wyjmij końcówkę pipety zawierającą kość z probówki, pozostawiając szpik kostny w probówce. Dodaj 200 mikrolitrów PBS do probówki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie rozdrobnić szpik. Przenieś tę zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki i przefiltruj ją za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć wszelkie pozostałe tkanki.

Następnie użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i obliczyć czas spędzony na krokach wykonanych w tej sekcji. Dodaj sześć mililitrów roztworu do separacji komórek do sterylnej krzemionkowej rurki odśrodkowej. Dodać rozcieńczoną zawiesinę komórkową do probówki.

Po dodaniu zawiesiny pojawi się wyraźna granica między warstwą komórek a roztworem rozdzielającym. Następnie przyklej końcówkę pipety do wewnętrznej powierzchni rurki pod kątem 45 stopni. Odwirować warstwowy roztwór w wirówce poziomej o temperaturze 500 razy G przez 30 minut.

Następnie odessaj mętną drugą warstwę, która zawiera komórki docelowe od góry do dołu. Przenieś komórki docelowe do nowej probówki. Dodaj pięć mililitrów PBS, aby umyć komórki i odwirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut.

Powtórz ten proces mycia, dodając PBS i odwirowując, co daje w sumie trzy prania. Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki do indukcji szpiku kostnego. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.

Następnie dodaj od pięciu do ośmiu mililitrów pożywki indukcyjnej szpiku kostnego, aby uzyskać końcowy roztwór komórek 300 000 komórek na mililitr. Dodaj jeden mililitr tego roztworu komórkowego do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Po inkubacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, delikatnie odessać pożywkę i dodać jeden mililitr pożywki do indukcji osteoklastów do każdej studzienki.

Delikatnie wymieszać płytkę i włożyć ją z powrotem do inkubatora. Co 48 godzin usuwaj i zastępuj 0,8 mililitra pożywki indukcyjnej osteoklastów z każdej studzienki. Delikatnie wymieszać płytkę przed ponownym umieszczeniem jej w inkubatorze.

Aby rozpocząć wstępną obróbkę plastrów kości, użyj mikropiły elektrycznej, aby pociąć świeżą korę kości udowej bydła na plastry o grubości dwóch centymetrów wzdłuż osi podłużnej. Po pokrojeniu i zmieleniu plastrów umyj plastry, zanurzając je w zlewce z dejonizowaną wodą i poddając działaniu ultradźwięków o częstotliwości 100 Hz przez godzinę. Powtórz ten proces prania trzy razy.

Zanurz umyte plastry w 75% alkoholu na dwie godziny. Następnie odessaj alkohol i wystaw każdy szkiełko plasterków na działanie światła ultrafioletowego przez godzinę na czystej platformie. Aby rozpocząć barwienie błękitem toluidyny, umieść wstępnie obrobione plastry kości w dołkach płytki 24-dołkowej.

Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do płytki 24-dołkowej, aby zanurzyć plastry kości na dwie godziny. Posadź i indukuj komórki, jak pokazano wcześniej. Po pojawieniu się osteoklastów po czterech do sześciu dniach umyj plastry jednym mililitrem 0,25 molowego wodorotlenku amonu.

Poddaj sonikację plastrów trzy razy przez pięć minut każdy, aby usunąć żywe komórki i umożliwić analizę wżerów resorpcyjnych na wycinkach kości. Następnie usuń wodorotlenek amonu i zabarwij plastry jednym mililitrem 1% roztworu błękitu toluidynowego na plasterek przez dwie minuty. Umyj plastry plamy za pomocą PBS.

Losowo wybierz pięć widoków i użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby przeprowadzić półilościową analizę obszaru resorpcji. Najpierw poprzedź plastry kości jednym mililitrem 2,5% aldehydu glutarowego na plaster przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Sonizować plastry z prefiksem trzy razy przez trzy minuty za pomocą jednego molowego wodorotlenku amonu, aby usunąć komórki.

Następnie usuń wodorotlenek amonu i umyj plastry kości trzykrotnie PBS, przy czym każde płukanie trwa 12 minut. Umyte plastry kości utrwalić 1% kwasem osmowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Wykonaj odwadnianie gradientu etanolu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie zastąp etanol octanem izoamylu na 15 minut. Pokryj plastry złotym palladem i przeanalizuj je za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. W tym badaniu wyizolowano, oczyszczono i skutecznie indukowano dużą liczbę prekursorów osteoklastów, aby stały się osteoklastami.

Dzięki suplementacji M-CSF i RANKL, gigantyczne osteoklasty są widoczne w dniach od pięciu do sześciu. Powstawanie tych osteoklastów można z powodzeniem zidentyfikować za pomocą barwienia pułapek. Duże i fioletowe komórki są uważane za komórki TRAP dodatnie z wieloma jądrami.

Dzięki tej metodzie typowe jest uzyskanie 800 osteoklastów zawierających do 30 jąder na osteoklast w 24-dołkowej płytce. W porównaniu z tradycyjną metodą, ta ulepszona metoda pozwala zaoszczędzić około 20 minut podczas całego procesu izolacji. Wykorzystanie wycinków kostnych do oceny aktywności resorpcji kości jest typową metodą in vitro.

Poprzez barwienie błękitem toluidynowym obszar resorpcji jest wizualizowany jako jasnozielony. Strukturę i charakterystykę dołów kostnych można wyraźnie zaobserwować za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. CTR, jeden z markerów komórkowych specyficznych dla osteoklastów, ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji osteoklastów i badania powstawania osteoklastów w kościach.

Dodatnia ekspresja CTR wyraźnie identyfikuje osteoklasty i odróżnia je od polikarionów makrofagów. CTR jest wyraźnie oznaczony w testach immunofluorescencyjnych kolorem zielonym, podczas gdy niebieski oznacza jądra komórkowe. Upewnij się, że nie złamiesz kości udowych i piszczelowych, aby uniknąć utraty szpiku kostnego.

Osoba, która nigdy wcześniej nie wykonywała tej techniki, może mieć trudności ze wspomaganiem roztworu do operacji komórek. Końcówka pipety musi być przyklejona do wewnętrznej powierzchni rurki i trzymana pod kątem 45 stopni do wewnętrznej powierzchni.