Name: Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę izolacji i różnicowania prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura. Ta technika umożliwia uzyskanie dużych ilości komórek do badań nad chorobami metabolicznymi kości, w tym osteoporozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81473692) dla Yong Ma. Autorzy dziękują całemu personelowi Centrum Badań Medycznych Pierwszego Kolegium Medycyny Klinicznej na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Nankinie.

Wszystkie metody z udziałem zwierząt opisane tutaj są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie.
1. Konfiguracja
<ol>
	<li>Przygotuj kilka podłużnie przeciętych końcówek do pipet o pojemności 1 ml (1 cm) i kilka probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Umieścić końcówki pipet i probówki do mikrowirówek w temperaturze 103 kPa i 121 °C na 20 minut i upewnić się, że są sterylne.</li>
	<li>Przygotuj pudełko z lodem i kilka sterylnych naczyń, aby zachować wyizolowane tkanki podczas procedury izolacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki hodowlanej
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną. Należy użyć minimalnej niezbędnej pożywki alfa (α-MEM), która zawiera końcowy roztwór 1% penicyliny/streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Przefiltruj media z kroku 2.1 za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Przygotować podłoże do indukcji szpiku kostnego. Na 50 ml roztworu dodać 125 μl M-CSF o stężeniu 10 000 ng/ml (tabela materiałów) do 49,875 ml kompletnej pożywki hodowlanej (od kroku 2.2), aby uzyskać końcowy roztwór 25 ng/ml M-CSF.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów. Na 50 ml roztworu dodać 500 μl RANKL o stężeniu 10 000 ng/ml (tabela materiałów) do 49,5 ml pożywki do indukcji szpiku kostnego (od kroku 2.3), aby uzyskać końcowy roztwór 25 ng/mL M-CSF i 100 ng/ml RANKL.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek pochodzących ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>eutanazja
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji cztery szczury Sprague Dawley przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy i zanurz je w 75% etanolu na 1 minutę 
		nuta: Upewnij się, że zwierzęta są tej samej płci i w podobnym wieku. Zalecane są zwierzęta w wieku od 2 do 3 tygodni. Dwa szczury są przygotowane do metody odśrodkowej, podczas gdy pozostałe dwa są przeznaczone do metody tradycyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda tradycyjna
	<ol>
		<li>Ułóż zwierzęta na tablicy ze środkiem dezynfekującym w pozycji leżącej. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) na bliższej części kości udowej, aby złuszczyć skórę za pomocą sterylnych nożyczek.</li>
		<li>Wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Przetnij obustronne części łączące wokół stawów biodrowych, kolanowych i skokowych, aby ostrożnie i delikatnie odizolować piszczele i kości udowe. Odetnij część tkanek wokół kości; Bądź dokładny. Nie należy łamać kości piszczelowych i udowych podczas całego procesu.</li>
		<li>Umieść oczyszczone kości w naczyniu z 5 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Odciąć kość długą sterylnymi nożyczkami i za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml ostrożnie przepłukać jamę szpiku 10 ml kompletnego podłoża, aż jama szpiku zmieni kolor na biały.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek z kroku 3.2.3 do probówki o pojemności 50 ml, a następnie przefiltrować ją za pomocą sitka o wielkości 70 μm w celu usunięcia pozostałej tkanki.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (tabela materiałów) do zawiesiny komórek. Inkubować komórki przez 8 minut na lodzie. Następnie odwirować komórki o sile 250 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
		<li>Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnego podłoża. Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz czas spędzony na czynnościach z tej sekcji (sekcja 3.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ulepszona metoda
	<ol>
		<li>Ułóż zwierzęta na tablicy ze środkiem dezynfekującym w pozycji leżącej. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) w bliższej części kości udowej sterylnymi nożyczkami, aby złuszczyć skórę.</li>
		<li>Wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Prawidłowo odetnij część tkanek wokół kości (nie ma potrzeby całkowitego usuwania). Nie należy łamać kości piszczelowych i udowych podczas całego procesu.</li>
		<li>Opłucz piszczele i kości udowe 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przekrój je na pół. Umieścić odcięte kości piszczelowe i udowe w końcówce do pipety o pojemności 1 ml (z kroku 1.1), którą następnie umieszcza się w probówce do mikrowirówki i odwirowuje 3x przy 1 000 x g przez 45 s w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po odwirowaniu należy zdjąć końcówkę pipety zawierającą kość i pozostawić szpik kostny w probówce. Dodać 200 μl kompletnej pożywki do probówki do mikrowirówki i powtórzyć pipetowanie, aby dokładnie rozdrobnić szpik.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek z kroku 3.3.4 do probówki o pojemności 50 ml, a następnie przefiltrować ją za pomocą sitka o wielkości 70 μm, aby usunąć pozostałą tkankę.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz czas spędzony na krokach z tej sekcji (sekcja 3.3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oczyszczanie przez wirowanie w gradiacji gęstości
<ol>
	<li>Dostosuj zawiesinę komórek od kroku 3.2.6 lub kroku 3.3.5 do 2 ml za pomocą α-MEM.</li>
	<li>Przygotować jedną sterylną krzemionkową probówkę odśrodkową i dodać do niej 8 ml roztworu do separacji komórek (tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową z kroku 4.1 do roztworu do separacji komórek. Przyklej końcówkę pipety do wewnętrznej powierzchni probówki i utrzymuj kąt 45° względem wewnętrznej powierzchni. Po dodaniu zawiesiny pojawi się wyraźna granica między warstwą komórek a roztworem rozdzielającym. 
	nuta: Operacja wymaga dużej staranności i musi być wykonywana powoli.</li>
	<li>Odwirować warstwowy roztwór w wirówce poziomej o sile 500 x g przez 30 minut. Po odwirowaniu odessać mętną drugą warstwę, która zawiera komórki docelowe, od góry do dołu. 
	nuta: Anulować przyspieszanie i zwalnianie wirówki przed odwirowaniem. Po odwirowaniu jest sześć warstw; Pierwsza warstwa to warstwa rozcieńczalnika, druga warstwa to warstwa monocytów, trzecia warstwa to warstwa komórek jednojądrzastych, czwarta warstwa to przezroczysta ciecz separacyjna jedna warstwa, piąta to ziarnista warstwa komórek, a szósta warstwa to warstwa czerwonych krwinek.</li>
	<li>Przenieś komórki docelowe do nowej probówki. Dodaj 5 ml PBS, aby przemyć komórki 3x. Po każdym myciu odwirować komórki docelowe przy 250 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki do indukcji szpiku kostnego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Dodać 5–8 ml pożywki do indukcji szpiku kostnego z kroku 2.3, aby uzyskać końcowy roztwór komórek o objętości 300 000 komórek/ml. Dodaj 1 ml do każdego dołka na 24-dołkowej płytce.</li>
</ol>
5. Kultura i zróżnicowanie
<ol>
	<li>Po inkubacji komórek w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, delikatnie odessać pożywkę i dodać 1 ml pożywki do indukcji osteoklastów do każdego dołka. Delikatnie wymieszać płytkę i umieścić ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę do indukcji osteoklastów co 48 godzin. Robiąc to, zmień 0,8 ml pożywki w studzience i delikatnie pomieszaj płytkę. 
	nuta: Duże, ruchliwe i wielojądrowe osteoklasty należy obserwować w studzience pod odwróconym mikroskopem, zwykle około 4-6 dnia.</li>
</ol>
6. Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian
UWAGA: Wielojądrowe osteoklasty pojawią się po 4-6 dniach, jeśli indukcja (sekcja 5) się powiedzie.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór utrwalający, łącząc 4 ml 37% formaldehydu, 32,5 ml acetonu i 12,5 ml roztworu cytrynianu. Przechowywać roztwór utrwalający w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwienia kwaśnej fosfatazy odpornej na winian (TRAP) (tabela materiałów), dodając 50 μl azotynu sodu, 50 μl roztworu zasady Fast Garnet GBC, 50 μl roztworu fosforanu naftolu AS-BI, 200 μl roztworu octanu i 100 μl roztworu winianu do 4,55 ml wody dejonizowanej podgrzanej do 37 °C. Następnie delikatnie mieszaj przez odwrócenie przez 1 minutę i odstaw na 2 minuty.</li>
	<li>Po udanej indukcji osteoklastów odessać pożywkę i delikatnie przemyć studzienki 3x PBS.</li>
	<li>Doprowadź roztwór utrwalający do temperatury pokojowej (RT). Dodaj 2 ml roztworu utrwalającego do studzienek przez 30 s i nie pozwól, aby komórki wyschły.</li>
	<li>Odessać roztwór utrwalający, delikatnie przemyć go 3x wodą dejonizowaną podgrzaną do 37 °C, a następnie odessać wodę.</li>
	<li>Dodać 2 ml roztworu barwienia TRAP przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i utrzymywać próbkę w ciemności.</li>
	<li>Po 1 godzinie odessać plamę i delikatnie umyć próbkę wodą dejonizowaną, która jest wstępnie podgrzana do 37 °C, a następnie odessać wodę.</li>
	<li>Przeciwbarwić komórki przez 1 minutę w roztworze hematoksyliny. Po zabarwieniu odessać roztwór hematoksyliny i delikatnie umyć komórki 3x wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Zobrazuj osteoklasty za pomocą mikroskopii jasnego pola, a komórki TRAP+ z trzema lub więcej jądrami będą fioletowe.</li>
</ol>
7. Test resorpcji kości z użyciem barwienia błękitem toluidyny
<ol>
	<li>Obróbka wstępna plastrów kostnych
	<ol>
		<li>Świeżą korę kości udowej bydła pokroić w plastry o grubości 2 cm wzdłuż osi podłużnej za pomocą piły mikroelektrycznej. Następnie pokrój i zmiel plastry za pomocą młynków do tkanek twardych na 80 μm.</li>
		<li>Umyj plastry w zlewce z wodą dejonizowaną i ultradźwiękami 100 Hz przez 1 godzinę i powtórz 3x.</li>
		<li>Zanurz plastry w 75% alkoholu na 2 godziny. Następnie odessaj alkohol i wystaw każdą stronę plastrów na działanie światła ultrafioletowego przez 1 godzinę na czystej platformie.</li>
		<li>Przed posadzeniem komórek zanurz plastry w pożywce hodowlanej na co najmniej 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie błękitem toluidynowym
	<ol>
		<li>Umieść wstępnie poddane obróbce plastry kości na płytce 24-dołkowej. Posadzić komórki, jak wspomniano w kroku 4.6 i indukować komórki, jak wspomniano w sekcji 5.</li>
		<li>Po pojawieniu się osteoklastów (po 4-6 dniach) przemyj plastry 1 ml 0,25 M wodorotlenku amonu i poddaj je sonikacji 3x przez 5 minut każdy, aby usunąć żywe komórki, aby umożliwić analizę wgłębień resorpcyjnych na wycinkach kości. Następnie usuń wodorotlenek amonu i zabarwij plastry 1 ml 1% (wag./obj.) roztworu błękitu toluidynowego na plaster przez 2 minuty.</li>
		<li>Umyj plastry PBS. Losowo wybierz pięć widoków i przeprowadź półilościową analizę obszaru resorpcji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Skaningowa mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Plastry kości należy poprzedzić 1 ml 2,5% aldehydu glutarowego na plasterek przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie sonikować plastry 3 razy przez 3 minuty każdy 1 M wodorotlenkiem amonu w celu usunięcia komórek i usunięcia wodorotlenku amonu.</li>
	<li>Plastry kości myć 3x przez 12 minut każdy za pomocą PBS.</li>
	<li>Utrwalić plastry kości 1% kwasem osmowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj odwodnienie gradientu etanolu, z 50%, 70%, 80%, 90% i 95% etanolem, przez 15 minut dla każdego gradientu, a następnie zastąp etanol octanem izoamylu na 15 minut.</li>
	<li>Pokryj plastry złotym palladem, a następnie przeanalizuj za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.</li>
</ol>
9. Barwienie immunofluorescencyjne receptora kalcytoniny
UWAGA: Wielojądrowe osteoklasty pojawią się po 4-6 dniach, jeśli indukcja się powiedzie (sekcja 5).
<ol>
	<li>Odessać pożywkę i delikatnie umyć studzienkę 3x PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki na 10 minut za pomocą 4% paraformaldehydu, który jest wstępnie schłodzony do 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS z 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym na studzienkę przez 30 minut na lodzie. Następnie odessać PBS 0,3% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym i dodać 1 ml PBS z 5% FBS na studzienkę przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Odessać PBS i inkubować błony z receptorem anty-kalcytoninowym (anty-CTR) w rozcieńczeniu 1:100 w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Odessać roztwór i inkubować błony z przeciwciałami anty-króliczymi IgG sprzężonymi z Alexa-488 w rozcieńczeniu 1:1,000 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór i delikatnie przemyć komórki 3x PBS. Wybarwić jądra barwnikiem Hoechst 33342 przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór i delikatnie przemyć komórki 3x PBS. Obserwuj intensywność CTR za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+regulation+of+bone+remodelling+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level.</a> Clinical Biochemistry. 45 (12), 863-873 (2012).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+of+the+reduced+enamel+epithelium+and+its+implications+for+bone+resorption+during+tooth+eruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption.</a> Journal Of Molecular Histology. 44 (1), 65-73 (2013).</li>
<li>Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resorption+of+dentine+by+isolated+osteoclasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22British+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro.</a> British Dental Journal. 156 (6), 216-220 (1984).</li>
<li>Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resorption+of+bone+by+isolated+rabbit+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast-like+cell+formation+and+its+regulation+by+osteotropic+hormones+in+mouse+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures.</a> Endocrinology. 122 (4), 1373-1382 (1988).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine Reviews. 13 (1), 66-80 (1992).</li>
<li>Yoshida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+mutation+osteopetrosis+is+in+the+coding+region+of+the+macrophage+colony+stimulating+factor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene.</a> Nature. 345 (6274), 442-444 (1990).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+is+a+ligand+for+osteoprotegerin%2Fosteoclastogenesis-inhibitory+factor+and+is+identical+to+TRANCE%2FRANKL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+The+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.</a> Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culture+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation and culture of osteoclasts.</a> BoneKEy Reports. 3, 570(2014).</li>
<li>Pei, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride+decreased+osteoclastic+bone+resorption+through+the+inhibition+of+NFATc1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression.</a> Environmental Toxicology. 29 (5), 588-595 (2014).</li>
<li>Arnett, T. R., Dempster, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+bone+resorption+by+rat+osteoclasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro.</a> Endocrinology. 119 (1), 119-124 (1986).</li>
<li>Arnett, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+is+a+major+stimulator+of+osteoclast+formation+and+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (1), 2-8 (2003).</li>
<li>Orriss, I. R., Arnett, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+osteoclast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rodent osteoclast cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).</li>
<li>Quinn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+receptor+antibodies+in+the+identification+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts.</a> Bone. 25 (1), 1-8 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność do pozyskiwania i badania osteoklastów in vitro jest krytyczną i podstawową umiejętnością dla każdego badacza chcącego badać metabolizm kości, co może pomóc w zrozumieniu mechanizmów chorób wchłaniających kości i opracowaniu nowych środków terapeutycznych. W niniejszym badaniu opisano protokół z pewnymi modyfikacjami w oparciu o poprzednie metody.
Dzięki zastosowaniu końcówek do pipet i probówek do mikrowirówek do uzyskania szpiku kostnego, znacznie skrócono czas operacji pozyskiwania...

Homeostaza kości to złożony proces fizjologiczny, który jest regulowany przez osteoklasty resorbujące kości i osteoblasty tworzące kości1. Równowaga między aktywnością osteoblastyczną i osteoklastyczną, w której pośredniczą odpowiednio osteoblasty i osteoklasty, jest bardzo istotna dla utrzymania zdrowia i homeostazy kości, ponieważ zaburzenia homeostazy kości mogą prowadzić do chorób kości, takich jak nieprawidłowy wzrost kości lub utrata gęstości kości. Jako unikalne komórki resorpcyjne kości, osteoklasty są ważne w chorobach związanych z nieprawidłowym niszczeniem kości, w tym osteoporozie, zapaleniu przyzębia i osteolizie okołoprotezowej2,3.
Rozwój kultury osteoklastów dzieli się głównie na dwa etapy. Metody opracowane przez Boyde'a i wsp.4 oraz Chambers et al.5 skomponowały pierwszy etap w latach 80. Uzyskali stosunkowo obfite osteoklasty z kości nowonarodzonych zwierząt, co jest okresem szybkiej przebudowy. Osteoklasty są uwalniane przez rozdrobnienie i wymieszanie kości w specjalnym podłożu. Jednak komórki uzyskane tą metodą mają niską ilość i czystość. Drugim etapem było opracowanie hodowli osteoklastów dalekiego zasięgu, przy użyciu komórek linii krwiotwórczej pochodzących ze szpiku kostnego6. Cytokiny, takie jak 1α,25-dihydroksywitamina D3, prostaglandyna E2 (PGE-2) i parathormon (PTH), które są dodawane do pożywki hodowlanej, działają poprzez system osteoblastów/komórek zrębu, stymulując tworzenie osteoklastów7,8. Jednak czystość i ilość osteoklastów uzyskanych tą metodą nie jest w stanie sprostać potrzebom współczesnych badań biologii molekularnej. Następnie, odkrycie czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora dla liganda czynnika jądrowego-κB (RANKL) ułatwia osteoklastogenezę9,10,11, a metoda wykorzystania M-CSF i RANKL do bezpośredniej stymulacji tworzenia osteoklastów jest szeroko stosowana na całym świecie. Nadal jednak istnieją pewne szczegóły w metodyce, które wymagają poprawy.
Obecnie, najczęściej stosowana metoda hodowli osteoklastów, opisana przez Marino et al.12 i Pei et al.13, często wymaga usunięcia otaczającej tkanki wokół kości i używa wysterylizowanej igły do płukania jamy szpiku za pomocą gotowego podłoża. Proces ten ma pewne wady, w tym fakt, że (1) usunięcie otaczającej tkanki wokół kości wymaga dużo czasu i doskonałej techniki chirurgicznej, (2) kości są kruche i mogą prowadzić do odpływu szpiku kostnego, (3) jama szpiku kostnego może być zbyt mała, aby ją przepłukać, oraz (4) istnieje ryzyko zranienia igłą. Aby uniknąć tych problemów, odwirowujemy probówki zawierające kości szpiku kostnego zamiast płukać szpik kostny igłą. Tutaj wprowadzamy stabilną i bezpieczną metodę, która izoluje szpik kostny w krótszym czasie i przy mniejszym wysiłku w porównaniu z tradycyjną procedurą. Wraz z zastosowaniem wirowania w gradionym gradimencie gęstości otrzymujemy duże ilości w pełni zróżnicowanych osteoklastów in vitro.

<table><tbody><tr><td>Zestaw fosfatazy kwasowej, lekocytów (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna krajalnica do tkanek twardych</td><td>Lecia</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Kość</td><td></td><td></td> udowa bydła <td>Zakupiona przez nas</td></tr><tr><td>Inkubator komórek</td><td>Heraus</td><td>BB16/BB5060</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sarana</td><td>s-fbs-au-015</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anti-Rabbit IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Szlifierki do tkanek twardych</td><td>Lecia</td><td>SP-2600</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do histopaku</td><td>TianJing Haoyang</td><td>TBD2013DR</td><td>Krzemionkowa rurka odśrodkowa i roztwór do separacji komórek</td></tr><tr><td>Hochest33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconą fazą</td><td>Olympus</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencji odwróconej</td><td>Lecia</td><td>DMI-3000</td><td></td></tr><tr><td>MEM, bez glutaminy</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płynny</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Królik Receptor antykalcytoninowy</td><td>Bioss</td><td>bs-0124R</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany szczur M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ligand</td> <td>szczura sRANKPeproTech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Absin</td><td>abs47014932</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa</td><td>FEI</td><td>Quanta 200</td><td></td></tr><tr><td>Toluidyna Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89649</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoklasty to duże, wielojądrowe i resorbujące kości komórki linii monocyty-makrofagi, które powstają w wyniku fuzji monocytów lub prekursorów makrofagów. Nadmierna resorpcja kości jest jednym z najważniejszych mechanizmów komórkowych prowadzących do chorób osteolitycznych, w tym osteoporozy, zapalenia przyzębia i osteolizy okołoprotezowej. Główną funkcją fizjologiczną osteoklastów jest wchłanianie zarówno składnika mineralnego hydroksyapatytu, jak i organicznej macierzy kości, generując charakterystyczny wygląd resorpcji na powierzchni kości. Osteoklastów jest stosunkowo niewiele w porównaniu z innymi komórkami w organizmie, zwłaszcza w kościach dorosłych. Ostatnie badania koncentrowały się na tym, jak uzyskać bardziej dojrzałe osteoklasty w krótszym czasie, co zawsze stanowiło problem. W laboratoriach opracowano kilka ulepszeń w technikach izolacji i hodowli w celu uzyskania bardziej dojrzałych osteoklastów. Tutaj wprowadzamy metodę, która izoluje szpik kostny w krótszym czasie i przy mniejszym wysiłku w porównaniu z tradycyjną procedurą, przy użyciu specjalnego i prostego urządzenia. Za pomocą wirowania w gradionym tempie gęstości uzyskujemy duże ilości w pełni zróżnicowanych osteoklastów ze szpiku kostnego szczura, które są identyfikowane klasycznymi metodami.

Celem protokołu było wygodne wyizolowanie i oczyszczenie dużej liczby prekursorów osteoklastów oraz skuteczna indukcja osteoklastów. Dzięki suplementacji M-CSF i RANKL, w dniach 5–6 zaobserwowano gigantyczne osteoklasty. Powstanie osteoklastów pomyślnie zidentyfikowano za pomocą barwienia TRAP (Rycina 1A). Duże, fioletowe komórki uznano za komórki TRAP-dodatnie z wieloma jądrami (zazwyczaj ≥ trzy jądra). Stosując tę metodę, w płytce 24-dołkowej typowo uzyskiw...

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Metoda ta jest istotna, ponieważ można ją stosować do otrzymywania dużych ilości w pełni zróżnicowanych osteoklastów in vitro. Główną zaletą tej metody jest to, że jest bardziej stabilna i bezpieczna oraz izoluje szpik kostny w krótszym czasie i przy mniejszym wysiłku w porównaniu z tradycyjnym postępowaniem. Technika ta może zapewnić stabilne źródło osteoklastów, które są ważnym obiektem chorób metabolicznych kości, w tym osteoporozy, zapalenia przyzębia i osteolizy okołoprotezowej.Przy niewielkich modyfikacjach protokół ten może być również odpowiedni do uzyskiwania różnego rodzaju komórek pochodzących ze szpiku kostnego u szczurów lub innych zwierząt. Na początek umieść uśpione zwierzęta na zdezynfekowanej desce w pozycji leżącej. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj nacięcie o długości około jednego centymetra w bliższej części kości udowej, aby złuszczyć skórę.Następnie wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Ostrożnie i delikatnie odetnij obustronne części łączące wokół stawów biodrowych, kolanowych i skokowych, aby odizolować piszczele i kości udowe. Odetnij część tkanek wokół kości, upewniając się, że jesteś dokładny.Następnie umieść oczyszczone kości w naczyniu z pięcioma mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej. Użyj sterylnych nożyczek, aby odciąć kość długą. Użyj jednomililitrowej igły strzykawki, aby ostrożnie przepłukać jamę szpiku 10 mililitrami kompletnego podłoża, aż jama szpiku zmieni kolor na biały.Przenieś tę zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki i przefiltruj ją za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć pozostałą tkankę. Dodaj pięć mililitrów buforu do czerwonej krwi i inkubuj komórki na lodzie przez osiem minut. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy.Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach kompletnego podłoża. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i obliczyć czas spędzony na działaniach podjętych tą metodą. Najpierw umieść uśpione zwierzęta na zdezynfekowanej desce w pozycji leżącej.Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj nacięcie o długości około jednego centymetra w bliższej części kości udowej, aby złuszczyć skórę. Następnie wypreparuj kości udowe i piszczelowe. Odetnij części tkanek wokół kości, chociaż nie ma potrzeby całkowitego usuwania tkanki.Opłucz piszczele i kości udowe 12 mililitrami PBS, a następnie przekrój je na pół. Umieść odcięte piszczele i kości udowe w przygotowanej mililitrowej końcówce pipety i umieść ją w przygotowanej probówce do mikrowirówki. Odwirować probówkę trzy razy w temperaturze 1 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 45 sekund.Następnie wyjmij końcówkę pipety zawierającą kość z probówki, pozostawiając szpik kostny w probówce. Dodaj 200 mikrolitrów PBS do probówki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie rozdrobnić szpik. Przenieś tę zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki i przefiltruj ją za pomocą sitka o średnicy 70 mikrometrów, aby usunąć wszelkie pozostałe tkanki.Następnie użyj hemocytometru, aby policzyć komórki i obliczyć czas spędzony na krokach wykonanych w tej sekcji. Dodaj sześć mililitrów roztworu do separacji komórek do sterylnej krzemionkowej rurki odśrodkowej. Dodać rozcieńczoną zawiesinę komórkową do probówki.Po dodaniu zawiesiny pojawi się wyraźna granica między warstwą komórek a roztworem rozdzielającym. Następnie przyklej końcówkę pipety do wewnętrznej powierzchni rurki pod kątem 45 stopni. Odwirować warstwowy roztwór w wirówce poziomej o temperaturze 500 razy G przez 30 minut.Następnie odessaj mętną drugą warstwę, która zawiera komórki docelowe od góry do dołu. Przenieś komórki docelowe do nowej probówki. Dodaj pięć mililitrów PBS, aby umyć komórki i odwirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut.Powtórz ten proces mycia, dodając PBS i odwirowując, co daje w sumie trzy prania. Zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki do indukcji szpiku kostnego. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.Następnie dodaj od pięciu do ośmiu mililitrów pożywki indukcyjnej szpiku kostnego, aby uzyskać końcowy roztwór komórek 300 000 komórek na mililitr. Dodaj jeden mililitr tego roztworu komórkowego do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Po inkubacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, delikatnie odessać pożywkę i dodać jeden mililitr pożywki do indukcji osteoklastów do każdej studzienki.Delikatnie wymieszać płytkę i włożyć ją z powrotem do inkubatora. Co 48 godzin usuwaj i zastępuj 0,8 mililitra pożywki indukcyjnej osteoklastów z każdej studzienki. Delikatnie wymieszać płytkę przed ponownym umieszczeniem jej w inkubatorze.Aby rozpocząć wstępną obróbkę plastrów kości, użyj mikropiły elektrycznej, aby pociąć świeżą korę kości udowej bydła na plastry o grubości dwóch centymetrów wzdłuż osi podłużnej. Po pokrojeniu i zmieleniu plastrów umyj plastry, zanurzając je w zlewce z dejonizowaną wodą i poddając działaniu ultradźwięków o częstotliwości 100 Hz przez godzinę. Powtórz ten proces prania trzy razy.Zanurz umyte plastry w 75% alkoholu na dwie godziny. Następnie odessaj alkohol i wystaw każdy szkiełko plasterków na działanie światła ultrafioletowego przez godzinę na czystej platformie. Aby rozpocząć barwienie błękitem toluidyny, umieść wstępnie obrobione plastry kości w dołkach płytki 24-dołkowej.Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do płytki 24-dołkowej, aby zanurzyć plastry kości na dwie godziny. Posadź i indukuj komórki, jak pokazano wcześniej. Po pojawieniu się osteoklastów po czterech do sześciu dniach umyj plastry jednym mililitrem 0,25 molowego wodorotlenku amonu.Poddaj sonikację plastrów trzy razy przez pięć minut każdy, aby usunąć żywe komórki i umożliwić analizę wżerów resorpcyjnych na wycinkach kości. Następnie usuń wodorotlenek amonu i zabarwij plastry jednym mililitrem 1% roztworu błękitu toluidynowego na plasterek przez dwie minuty. Umyj plastry plamy za pomocą PBS.Losowo wybierz pięć widoków i użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby przeprowadzić półilościową analizę obszaru resorpcji. Najpierw poprzedź plastry kości jednym mililitrem 2,5% aldehydu glutarowego na plaster przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Sonizować plastry z prefiksem trzy razy przez trzy minuty za pomocą jednego molowego wodorotlenku amonu, aby usunąć komórki.Następnie usuń wodorotlenek amonu i umyj plastry kości trzykrotnie PBS, przy czym każde płukanie trwa 12 minut. Umyte plastry kości utrwalić 1% kwasem osmowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Wykonaj odwadnianie gradientu etanolu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie zastąp etanol octanem izoamylu na 15 minut. Pokryj plastry złotym palladem i przeanalizuj je za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. W tym badaniu wyizolowano, oczyszczono i skutecznie indukowano dużą liczbę prekursorów osteoklastów, aby stały się osteoklastami.Dzięki suplementacji M-CSF i RANKL, gigantyczne osteoklasty są widoczne w dniach od pięciu do sześciu. Powstawanie tych osteoklastów można z powodzeniem zidentyfikować za pomocą barwienia pułapek. Duże i fioletowe komórki są uważane za komórki TRAP dodatnie z wieloma jądrami.Dzięki tej metodzie typowe jest uzyskanie 800 osteoklastów zawierających do 30 jąder na osteoklast w 24-dołkowej płytce. W porównaniu z tradycyjną metodą, ta ulepszona metoda pozwala zaoszczędzić około 20 minut podczas całego procesu izolacji. Wykorzystanie wycinków kostnych do oceny aktywności resorpcji kości jest typową metodą in vitro.Poprzez barwienie błękitem toluidynowym obszar resorpcji jest wizualizowany jako jasnozielony. Strukturę i charakterystykę dołów kostnych można wyraźnie zaobserwować za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. CTR, jeden z markerów komórkowych specyficznych dla osteoklastów, ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji osteoklastów i badania powstawania osteoklastów w kościach.Dodatnia ekspresja CTR wyraźnie identyfikuje osteoklasty i odróżnia je od polikarionów makrofagów. CTR jest wyraźnie oznaczony w testach immunofluorescencyjnych kolorem zielonym, podczas gdy niebieski oznacza jądra komórkowe. Upewnij się, że nie złamiesz kości udowych i piszczelowych, aby uniknąć utraty szpiku kostnego.Osoba, która nigdy wcześniej nie wykonywała tej techniki, może mieć trudności ze wspomaganiem roztworu do operacji komórek. Końcówka pipety musi być przyklejona do wewnętrznej powierzchni rurki i trzymana pod kątem 45 stopni do wewnętrznej powierzchni.

isolation-purification-differentiation-osteoclast-precursors-from-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Ten artykuł przedstawia metodę, która łączy przyleganie całego szpiku kostnego i sortowanie cytometrią przepływową do izolacji, hodowli, sortowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego z żuchwy szczura.

Izolacja i hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego żuchwy u szczurów

Tutaj prezentujemy protokół izolacji BMM od szczurów SD, zwany metodą wtórnego przylegania.<br...

Izolacja komórek linii monocytów-makrofagów z kości szczurów metodą wtórnej adherencji

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

To badanie przedstawia dwie techniki izolowania licznych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) ze szpiku kostnego szczura. Jedna metoda łączy komercyjny zestaw do izolacji neutrofili z wirowaniem w gradionym przepływie gęstości, podczas gdy druga wykorzystuje tylko wirowanie w gradiencie gęstości. Oba podejścia dają funkcjonalne NET przewyższające te z neutrofili krwi obwodowej.

Unikalne podejście do izolowania neutrofili szpiku kostnego szczurów o porównywalnej pojemności

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego szczęki pełnią znaczące funkcje w różnorodnym różnicowaniu, samoodnawianiu i modulacji immunologicznej. Stały się one kluczowym rezerwuarem komórek prekursorowych w terapii genowej, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy unikalną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczęki u szczurów.

Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów

Poznaj metodę izolacji i różnicowania prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura. Ta technika umożliwia uzyskanie dużych ilości komórek do badań nad chorobami metabolicznymi kości, w tym osteoporozą.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Przeglądaj więcej filmów