Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Metoda ta pozwala na badanie aktywności transportu protonów enzymów błony oddechowej, takich jak cytochrom BO3, w naturalnym środowisku dwuwarstwowym lipidów. Główną zaletą tej techniki pojedynczego enzymu jest możliwość rozpoczęcia i zatrzymania reakcji enzymatycznych w dowolnym momencie za pomocą elektrochemii. Za pomocą szklanej strzykawki przenieś 200 mikrolitrów chloroformu z lipidowego ekstraktu polarnego z Escherichia coli do szklanych fiolek, aby uzyskać pięć miligramowych porcji.

Dodaj 50 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr ubichinonu 10 do lipidów, aby uzyskać ostateczny stosunek 1 do 100 ubichinonu 10 do lipidów. Do mieszaniny dodać 20 mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr barwnika fluorescencyjnego o długiej długości fali, oznaczonego lipidem, w skrócie FDLL. Homogenizować roztwór chloroformu przez krótkie wirowanie i odparować większość chloroformu pod delikatnym przepływem azotu lub argonu.

Całkowicie usunąć ślady chloroformu przez dalsze odparowywanie w próżni przez co najmniej jedną godzinę. Dodaj 312,5 mikrolitrów 40-milimolowego buforu MOPS pH 7,4 do jednej podwielokrotności lipidów ubichinonu 10 FDLL suchej mieszanki. Mieszaj wir, aż film lipidowy zostanie całkowicie ponownie zawieszony, a następnie przez dwie minuty zabieg w kąpieli ultradźwiękowej.

Następnie dodaj 125 mikrolitrów 25-milimolowego HPTS, barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na pH, który zostanie zamknięty w liposomach. Teraz dodaj 137,5 mikrolitrów 250-milimolowego środka powierzchniowo czynnego OGP. Po wymieszaniu za pomocą wiru, sonikować mieszaninę w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 10 minut, aby upewnić się, że wszystkie lipidy są rozpuszczone w micele środka powierzchniowo czynnego.

Następnie przenieś dyspersję do 1,5 mililitrowej plastikowej tuby. Dodaj wymaganą ilość cytochromu BO3 i dodaj ultra czystą wodę, aby uzyskać łączną objętość 50 mikrolitrów. Mieszaninę do rozpuszczenia inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut na mieszalniku walcowym.

Następnie zważ 50 miligramów mikrogranulek polistyrenu do każdej z dwóch nasadek tubki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zważ 100 miligramów mikrogranulek polistyrenu do kolejnych dwóch nakrętek z rurką o pojemności 1,5 mililitra. Zamknij nakrętki folią parafinową, aby zapobiec wysuszeniu.

Dodaj pierwsze 50 miligramów mikrogranulek polistyrenu do mieszaniny do rozpuszczenia, nakładając nakrętkę z mikrogranulkami polistyrenu na 1,5-mililitrową plastikową rurkę z przygotowaną dyspersją. Następnie wykonaj krótkie wirowanie przez kilka sekund, aby doprowadzić mikrogranulki na dno tuby. Zawiesinę inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszalniku rolkowym, aby mikrogranulki polistyrenu mogły wchłonąć środek powierzchniowo czynny przez 30 minut.

Powtórz dodawanie mikrogranulek polistyrenu i inkubacje w następujący sposób. Dodaj 50 miligramów mikrogranulek na 60 minut inkubacji. Następnie dodaj 100 miligramów mikrogranulek na 60 minut inkubacji.

I na koniec dodaj 100 miligramów mikrogranulek na 120 minut inkubacji. Oddzielić roztwór proteoliposomu od mikrogranulek polistyrenu za pomocą mikropipety z cienką końcówką. Rozcieńczyć dyspersję w 90 mililitrach buforu MOPS w probówce ultrawirówki TI 45.

Ultraodwirować dyspersję za pomocą rotora typu 45 TI o temperaturze 125 000 razy G przez jedną godzinę w celu osadzenia proteoliposomów. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant i przepłukać granulki buforem MOPS bez ponownego zawieszania osadu. Po wyrzuceniu buforu płuczącego ponownie zawiesić proteoliposomy w 500 mikrolitrach buforu MOPS, pipetując go tam iz powrotem za pomocą mikropipety z cienką końcówką przed przeniesieniem zawiesiny do plastikowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 12 000 razy G w celu usunięcia zanieczyszczeń, przenieść supernatant, którym są odtworzone proteoliposomy, do nowej fiolki. Przyklej do dziewięciu szklanych nawierzchni na odparowaną złotą powierzchnię za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej o niskiej fluorescencji. Utwardź klej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Tuż przed modyfikacją za pomocą samodzielnie zmontowanej monowarstwy należy odłączyć szklane szkiełka osłonowe od wafli silikonowych za pomocą ostrza. Ze względu na cienkość szkiełek nakrywkowych należy zachować ostrożność podczas zdejmowania szkiełek nakrywkowych, aby nie pękły ani nie rozbiły szkiełek nakrywkowych. Zanurz świeżo oderwaną, pokrytą złotem powłokę w roztworze 6-marcaptoheksanolu i pozostaw na noc w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, aby utworzyć samodzielnie zmontowaną monowarstwę.

Następnego dnia usunąć pokryte złotem szkiełka nakrywkowe z roztworu i krótko przemyć wodą lub metanolem, a następnie izopropanolem. Wysuszyć pokryte złotem szkiełka osłonowe pod delikatnym przepływem gazu. Zmontować pokryte złotem szkiełko nakrywkowe w ogniwie spektro-elektrochemicznym, jak pokazano na schemacie w protokole tekstowym.

Zetknij się ze złotem płaskim drutem na zewnątrz obszaru wyznaczonego przez gumowy O-ring i mocno przykręć ogniwo elektrochemiczne na górze. Dodaj dwa mililitry roztworu buforu elektrolitu i umieść elektrody odniesienia i pomocnicze w ogniwie. Przystąp do sprawdzenia jakości samodzielnie złożonej monowarstwy i uruchom puste miejsca zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Dodaj proteoliposomy do komórki elektrochemicznej przy końcowym stężeniu lipidów 0,5 miligrama na mililitr i lekko wymieszaj pipetą. Odczekaj 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej, aż absorpcja proteoliposomów na powierzchni elektrody zostanie zakończona. Umyj ogniwo, zmieniając roztwór buforowy co najmniej 10 razy, ale unikaj pozostawiania powierzchni elektrody całkowicie suchej.

Teraz uruchom elektrochemiczną spektroskopię impedancji na otwartym potencjale komórki, aby potwierdzić, że samoorganizująca się monowarstwa na złotej elektrodzie pozostaje niezmieniona. Uruchom cykliczne woltammogramy z szybkością skanowania 10 i 100 miliwoltów na sekundę, aby zaobserwować katalatywne utlenianie ubichinolu i redukcję tlenu przez cytochrom BO3 przy początkach potencjałów elektrochemicznej redukcji chinonu. Zmodyfikuj złotą elektrodę jak poprzednio, ale używając pięciu mikrogramów na mililitr proteoliposomów.

W przypadku badań pojedynczych enzymów zmniejsz stosunek cytochromu BO3 do lipidów do 0,1 do 0,2%Umieść kroplę olejku immersyjnego, a następnie ogniwo elektrochemiczne na 60-krotnym obiektywie odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Używając odpowiednich filtrów do fluorescencji FDLL, skup się na powierzchni elektrody. Pojedyncze liposomy powinny pojawiać się jako jasne punkty na granicy dyfrakcji obiektywu mikroskopu.

Zrób zdjęcie kwiatostanu FDLL. Przełącz się na jeden z zestawów filtrów fluorescencyjnych HPTS w mikroskopie, aby sprawdzić, czy kwiatostan HTPS jest wyraźnie widoczny i można go odróżnić od tła. Zwiększ natężenie światła, jeśli tak nie jest.

Zaprogramuj oprogramowanie mikroskopu tak, aby wykonywało akwizycję obrazu w czasie, zmieniając dwa zestawy filtrów HTPS. Aby to zrobić, ustaw jednosekundową ekspozycję, a następnie przejdź do aplikacji menu. Następnie zdefiniuj/uruchom akwizycję ND i wybierz dwa kanały HTPS.

Ustaw opóźnienie między akwizycjami obrazu na minimum. W tym eksperymencie użyj 0,3 sekundy opóźnienia i pięciu minut całkowitego czasu trwania. Dostosuj ustawienia potencjostatu, aby zmienić potencjał podczas akwizycji obrazu, jak wskazano w protokole tekstowym.

Teraz należy jednocześnie uruchomić czasową akwizycję obrazu na mikroskopie i sekwencję potencjału na potencjostacie, ręcznie rozpoczynając oba pomiary w tym samym czasie. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne liposomów wchłoniętych na elektrodach w trzech różnych zakresach. Barwnik zawierający liposomy są widoczne na obrazach jako jasne punkty.

Środkowa część obrazu została wybielona fotograficznie, aby odsłonić poziom kwiecenia tła. Obrazy na dwóch kanałach HTPS są bardzo imponujące, gdy stosunek między dwoma kanałami odpowiada pH 7,4 użytemu w tym eksperymencie. Większa liczba liposomów jest widoczna w kanale FDLL, co wskazuje na obecność liposomów, które nie mają zamkniętego HPTS.

Różnica między kanałami HPTS i FDLL jest bardziej wyraźna przy wyższych zasięgach. Być może dlatego, że przy wysokim pokryciu liposomów liposomy są bardziej podatne na pękanie lub łączenie się na powierzchni. W tym przypadku zmiana florescencji liposomu na dwóch kanałach HTPS jest pokazana jako wykres powierzchniowy 3D odpowiedniego obszaru w ciągu 300 sekund eksperymentu.

Potencjał redukcyjny zastosowano w okresie od 60 sekund do 180 sekund. Pokazano odpowiedni wykres stosunku intensywności metrycznej objętości dwóch kanałów HPTS w funkcji czasu. Pokazano tutaj mediany wszystkich zmian pH pęcherzyków w obrębie jednego obrazu, gdy zawartość cytochromu BO3 wynosi 1,3%Wzrost pH jest wyraźnie widoczny, gdy przyłożony jest potencjał od 0,1 do 0,3 wolta.

Gdy zawartość cytochromu BO3 jest znacznie niższa i wynosi 0,1%, mediana krzywych staje się prawie nie do odróżnienia od tych w pustych liposomach. Ważne jest, aby zapewnić całkowite usunięcie środka powierzchniowo czynnego z dozowania liposomów, ponieważ pozostałości mogą zwiększać przepuszczalność liposomów dla protonów. Metody te pozwalają nam na zadawanie konkretnych pytań dotyczących naturalnego lipofilnego substratu chinonu w przeciwieństwie do często stosowanych rozpuszczalnych w wodzie analogów chinonu.

Co więcej, eksperymenty z pojedynczym enzymem zidentyfikowały nieznany wcześniej stan wycieku, w którym białko działa jak kanał protonowy, w którym protony swobodnie przepływają do tyłu.