Name: Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj metodę badania aktywności transportu protonów w enzymach oddechowych z rodziny cytochromów bo 3 przy użyciu pojedynczych liposomów. Technika łączy elektrochemię z mikroskopią fluorescencyjną do analizy zmian pH w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują BBSRC (BB/P005454/1) za wsparcie finansowe. NH został sfinansowany przez VILLUM Foundation Young Investigator Program.

<ol><li>Claessen, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Biomolecule+Kinetics%3A+The+Art+of+Studying+a+Single+Enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).</li>
<li>Rojek, M. J., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Single+Enzyme+Molecules+Interconvert+between+Activity+States+upon+Heating%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating.</a> PLoS ONE. 9 (1), e86224(2014).</li>
<li>Velonia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Enzyme+Kinetics+of+CALB-Catalyzed+Hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).</li>
<li>Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLu%2C+HP+%22Single-molecule+enzymatic+dynamics%22">Single-molecule enzymatic dynamics</a>. 282 (5395), Science. New York, N.Y. 1877-1882 (1998).</li>
<li>Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+enzymes+sleep+and+work%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Do enzymes sleep and work?</a> Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Hsin, T. -M., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Reactions+in+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Reactions in Liposomes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li>
<li>Onoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+giant+liposome+for+single-molecule+observation+of+conformational+changes+in+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).</li>
<li>Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Single-Molecule+Methods+to+Membrane+Protein+Folding+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Jesorka, A., Orwar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Technologies+and+Analytical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Technologies and Analytical Applications.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+Not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Enzyme+Experiments+Reveal+a+Long-Lifetime+Proton+Leak+State+in+a+Heme-Copper+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).</li>
<li>Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+histidine-tagged+cytochrome+bo3+from+Escherichia+coli+and+demonstration+that+associated+quinone+is+not+required+for+the+structural+integrity+of+the+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).</li>
<li>Jeuken, L. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+in+mixed+self-assembled+monolayers+and+its+effect+on+biomimetic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).</li>
<li>Barsoukov, E., Macdonald, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarsoukov%2C+E+%22Impedance+Spectroscopy+Theory%2C+Experiment%2C+and+Applications%22">Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications</a>. , John Wiley & Sons. Chapters 1-2 (2005).</li>
<li>Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Enzymes+in+Tethered+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Redox Enzymes in Tethered Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).</li>
<li>Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCompton%2C+RG+%22Understanding+voltammetry%22">Understanding voltammetry</a>. , World Scientific Publishing Europe Ltd. Singapore. (2018).</li>
<li>Girault, H. H. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGirault%2C+HH+%22Analytical+and+Physical+Electrochemistry%22">Analytical and Physical Electrochemistry</a>. , EPFL Press. Lausanne. (2004).</li>
<li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMazurenko%2C+I+%22Timelapse+%28movie%29+of+single+vesicles+fluorescence+change+upon+potential+application%22">Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application</a>. , (2018).</li>
<li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li>
<li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22MATLAB+code+for+the+analysis+of+proton+transport+activity+in+single+liposomes%22">MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes</a>. , (2017).</li>
<li>Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+M+%22Time-resolved+fluorescence+microscopic+data+%28traces%29+of+individual+lipid+vesicles+with+proton+transport+activity%22">Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity</a>. , (2017).</li>
<li>Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+of+protons%2C+potassium+ions%2C+and+small+polar+molecules+through+phospholipid+bilayers+as+a+function+of+membrane+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).</li>
<li>Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proton+permeability+of+liposomes+made+from+mitochondria%29+inner+membrane+phospholipids%3A+No+effect+of+fatty+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).</li>
<li>Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li>
<li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li>
<li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana metoda jest odpowiednia do badania pompowania protonów przez białka błony oddechowej, które mogą być odtwarzane w liposomach i są zdolne do wymiany elektronów z pulą chinonu. Aktywność pompowania protonów można monitorować na poziomie pojedynczego enzymu za pomocą barwników wrażliwych na pH (ratiometrycznych) zamkniętych w świetle liposomu (ryc. 1A).
Metoda opiera się na zdolności ubichinonu (lub innych chinonów), wbudowanego w dwuwarstwę lipidową, do wymi...

Informacje o mechanizmach i kinetyce enzymów są zazwyczaj uzyskiwane na poziomie zespołu lub makroskali z populacją enzymów w tysiącach do milionów molekuł, gdzie pomiary reprezentują średnią statystyczną. Wiadomo jednak, że złożone makrocząsteczki, takie jak enzymy, mogą wykazywać niejednorodność w swoim zachowaniu, a mechanizmy molekularne obserwowane na poziomie zespołu niekoniecznie są prawidłowe dla każdej cząsteczki. Takie odchylenia w skali poszczególnych cząsteczek zostały szeroko potwierdzone przez badania pojedynczych enzymów przy użyciu różnych metod, które pojawiły się w ciągu ostatnich dwóch dekad1. Warto zauważyć, że detekcja fluorescencyjna aktywności poszczególnych enzymów została wykorzystana do zbadania niejednorodności aktywności enzymów2,3 lub odkrycia tzw. efektu pamięci (okresy wysokiej aktywności enzymów następują po okresach niskiej aktywności i odwrotnie)4,5.
Wiele badań nad pojedynczymi enzymami wymaga, aby enzymy były unieruchomione na powierzchni lub przestrzennie utrwalone w inny sposób, aby pozostawały wystarczająco długo w polu widzenia do ciągłej obserwacji. Wykazano, że enkapsulacja enzymów w liposomach umożliwia immobilizację enzymu, jednocześnie zapobiegając negatywnemu wpływowi interakcji powierzchnia-enzym lub białko-białko6,7. Ponadto liposomy oferują unikalną możliwość badania pojedynczych białek błonowych w ich naturalnym środowisku dwuwarstwowym lipidów8,9,10.
Klasa białek błonowych, transporterów, przeprowadza kierunkową translokację substancji przez błonę komórkową, zachowanie, które można badać tylko wtedy, gdy białka są odtwarzane w dwuwarstwach lipidowych (np. liposomach)11,12,13. Na przykład translokacja protonów, wykazywana przez kilka enzymów prokariotycznych i eukariotycznych łańcuchów transportu elektronów, odgrywa ważną rolę w oddychaniu komórkowym, tworząc siłę napędową protonów wykorzystywaną do syntezy ATP. W tym przypadku aktywność pompowania protonów jest sprzężona z transferem elektronów, chociaż szczegółowy mechanizm tego procesu często pozostaje nieuchwytny.
Niedawno pokazaliśmy możliwość połączenia detekcji fluorescencyjnej z elektrochemią w celu zbadania aktywności pompowania protonów pojedynczych enzymów końcowej oksydazy ubichinolowej Escherichia coli (cytochrom bo3) odtworzonych w liposomach14. Osiągnięto to poprzez enkapsulację wrażliwego na pH, nieprzepuszczalnego dla błony barwnika fluorescencyjnego w świetle liposomów przygotowanych z polarnych lipidów E. coli (Figura 1A). Ilość białka została zoptymalizowana tak, że większość liposomów albo nie zawierała żadnej, albo zawierała tylko jedną odtworzoną cząsteczkę enzymu (zgodnie z rozkładem Poissona). Dwa substraty cytochromu bo3 uzyskano przez dodanie ubichinonu do mieszanki lipidów, która utworzyła liposomy i (otoczenia) tlen w roztworze. Liposomy są następnie słabo adsorbowane na półprzezroczystej, ultragładkiej złotej elektrodzie, pokrytej samoorganizującą się monowarstwą 6-merkaptoheksanolu. Na koniec elektroda jest montowana na spodzie prostego ogniwa spektroelektrochemicznego (rysunek 1B). Elektrochemiczna kontrola stanu redoks puli chinonowej pozwala na elastyczne wywołanie lub zatrzymanie reakcji enzymatycznej w dowolnym momencie, podczas gdy barwnik wrażliwy na pH służy do monitorowania zmian pH wewnątrz światła liposomów w wyniku translokacji protonów przez enzymy. Wykorzystując intensywność fluorescencji drugiego, związanego z lipidami barwnika fluorescencyjnego, można określić wielkość i objętość poszczególnych liposomów, a tym samym określić ilościowo aktywność pompowania protonów enzymu. Korzystając z tej techniki, odkryliśmy w szczególności, że cząsteczki cytochromu bo3 są w stanie wejść w stan spontanicznego wycieku, który szybko rozprasza siłę napędową protonów. Celem tego artykułu jest szczegółowe przedstawienie techniki pomiarów pojedynczych liposomów.

<table><tbody><tr><td>6-Mercapto-1-heksanol (6MH)</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>97%</td></tr><tr><td>8-hydroksypiren-1,3,6-trisulfonowy kwas (HPTS)</td><td>BioChemika</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt aluminiowy (ogniwo elektrochemiczne)</td><td>Wykonany</td><td></td><td>na zamówienie 30x30x7 mm; średnica wewnętrzna: 26 mm; średnica otworu: 15 mm</td></tr><tr><td>Elektroda</td><td></td><td></td><td>pomocnicza drut platynowy</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Chemikalia</td><td>83627</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polarne lipidy</td><td>Avanti</td><td>100600C</td><td>25 mg/mL w chloroformie</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>EPO-TEK</td><td>301-2FL</td><td>żywica epoksydowa o niskiej fluorescencji</td></tr><tr><td>Fidżi (ImageJ 1.52d)</td><td></td><td></td><td>Wymagane wtyczki: StackReg i TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td></tr><tr><td>Kostka filtra ("ATTO633")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Przykład: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td></tr><tr><td>Kostka filtra ("HPTS1")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td></tr><tr><td>Kostka filtra ("HPTS2")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td></tr><tr><td>Kostka filtrująca ("Texas Red")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td></tr><tr><td>Lipidy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym (FDLL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td>TexasRed-DHPC został użyty w tej pracy (&lambda; EXC 595 nm; &lambda; em 615 nm)</td></tr><tr><td>Lipidy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym (FDLL) (alternatywnie)</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 633-161</td><td>ATTO633-DOPE mogą być stosowane jako alternatywa (&lambda; EXC 630 nm; &lambda; em 651 nm)</td></tr><tr><td>Żelowa kolumna filtracyjna</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-33</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, do dodatkowego oczyszczania białek</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>VWR International</td><td>631-0172</td><td>nr 1,5</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>1725 RNR</td><td>250 &micro; L</td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td><td>T101/V1</td><td>Pojemność 1,75 ml</td></tr><tr><td>Złoto</td><td>GoodFellow</td><td></td><td>99,99%</td></tr> <tr><td>Gramacidin</td><td>Sigma</td><td>G5002</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna siarczanu rtęci</td><td>Radiometr (haszysz E21M012</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mikrowirówka</td><td>Mikroskop Eppendorf</td><td>Minispin NL040</td><td></td></tr><tr><td></td> Aparat mikroskopowy <td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Lampa mikroskopowa</td><td>Nikon</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.0.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Oprogramowanie do akwizycji mikroskopu</td></tr><tr><td>n-oktyl &beta;-D-glukopiranozyd</td><td>Melford Laboratories</td><td>B2007</td><td></td></tr><tr><td>Nova 1.10</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Oprogramowanie sterujące potencjostatem</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; 60x/1.4 olej</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Oprogramowanie do kreślenia</td></tr><tr><td>O-ring (ogniwo elektrochemiczne)</td><td>Orinoko</td><td></td><td>Średnica wewnętrzna: 16 mm; przekrój: 1,5 mm</td></tr><tr><td>Rurki plastikowe</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Mikrogranulki polistyrenowe</td><td>Bio-RAD</td><td>152-3920</td><td>Biokoraliki, siatka 20-50</td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>Metrohm Autolab</td><td>PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>CH Instrumenty</td><td>CHI604C</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do skryptów</td><td>Matlab</td><td>R2017a</td><td>Wymagane zestawy narzędzi: 'Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu', 'Zestaw narzędzi do obliczeń równoległych', 'Zestaw narzędzi do dopasowywania krzywych', 'Zestaw narzędzi do identyfikacji systemu', 'Zestaw narzędzi optymalizacyjnych'Płytki</td></tr> <tr><td>krzemowe</td><td>IDB Technologies LTD</td><td>Si-C2 (N< 100>P)</td><td>&Oslash; 25 mm, grubość 525 um</td></tr><tr><td>Ogniwo teflonowe (ogniwo elektrochemiczne)</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Średnica zewnętrzna: 26 mm; Średnica wewnętrzna: 13,5 mm</td></tr><tr><td>Ultrapłaskie złote powierzchnie z odłożonymi zausznikami</td><td>Platypus Technologies</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td>Alternatywne, gotowe do użycia ultrapłaskie powierzchnie ze złota (grubość poniżej 100 nm na żądanie)</td></tr><tr><td>Cienkie końcówki do mikropipet</td><td>Sarstedt</td><td>70.1190.100</td><td>lub podobne końcówki gelloader 200 &MICRO; L</td></tr><tr><td>Ubichinone-10</td><td>Sigma</td><td>C-9538</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L-80XP</td><td>z wirnikiem Ti 45</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15063</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enzymy pompujące protony łańcuchów przenoszenia elektronów łączą reakcje redoks z translokacją protonów przez błonę, tworząc siłę napędową protonów używaną do produkcji ATP. Amfifilowy charakter białek błonowych wymaga szczególnej uwagi na ich obchodzenie się, a rekonstytucja w naturalnym środowisku lipidowym jest niezbędna podczas badania procesów transportu błonowego, takich jak translokacja protonów. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę, która została wykorzystana do zbadania mechanizmu pompowania protonów przez błonowe enzymy redoks, biorąc za przykład cytochrom bo3 z Escherichia coli. Połączenie elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej służy do kontrolowania stanu redoks puli chinonów i monitorowania zmian pH w świetle. Ze względu na rozdzielczość przestrzenną mikroskopii fluorescencyjnej, setki liposomów mogą być mierzone jednocześnie, podczas gdy zawartość enzymu można zmniejszyć do pojedynczego enzymu lub transportera na liposom. Odpowiednia analiza pojedynczego enzymu może ujawnić wzorce w dynamice funkcjonalnej enzymu, które w przeciwnym razie mogłyby być ukryte przez zachowanie całej populacji. Załączamy opis skryptu do automatycznej analizy obrazu.

Jakość szkiełka podstawowego modyfikowanego złotem (elektrody) z SAM z 6MH jest sprawdzana przed każdym eksperymentem za pomocą spektroskopii impedancyjnej elektrochemicznej. Rycina 2A przedstawia reprezentatywne wykresy Cole'a-Cole'a, pomiarowane za pomocą spektroskopii impedancyjnej przed i po adsorpcji liposomów. Jeśli jakość SAM jest wystarczająca, spektroskopia impedancyjna powinna wykazać niemal czysty charakter pojemnościowy, co objawia się w postaci p...

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Metoda ta pozwala na badanie aktywności transportu protonów enzymów błony oddechowej, takich jak cytochrom BO3, w naturalnym środowisku dwuwarstwowym lipidów. Główną zaletą tej techniki pojedynczego enzymu jest możliwość rozpoczęcia i zatrzymania reakcji enzymatycznych w dowolnym momencie za pomocą elektrochemii. Za pomocą szklanej strzykawki przenieś 200 mikrolitrów chloroformu z lipidowego ekstraktu polarnego z Escherichia coli do szklanych fiolek, aby uzyskać pięć miligramowych porcji.Dodaj 50 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr ubichinonu 10 do lipidów, aby uzyskać ostateczny stosunek 1 do 100 ubichinonu 10 do lipidów. Do mieszaniny dodać 20 mikrolitrów po jednym miligramie na mililitr barwnika fluorescencyjnego o długiej długości fali, oznaczonego lipidem, w skrócie FDLL. Homogenizować roztwór chloroformu przez krótkie wirowanie i odparować większość chloroformu pod delikatnym przepływem azotu lub argonu.Całkowicie usunąć ślady chloroformu przez dalsze odparowywanie w próżni przez co najmniej jedną godzinę. Dodaj 312,5 mikrolitrów 40-milimolowego buforu MOPS pH 7,4 do jednej podwielokrotności lipidów ubichinonu 10 FDLL suchej mieszanki. Mieszaj wir, aż film lipidowy zostanie całkowicie ponownie zawieszony, a następnie przez dwie minuty zabieg w kąpieli ultradźwiękowej.Następnie dodaj 125 mikrolitrów 25-milimolowego HPTS, barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na pH, który zostanie zamknięty w liposomach. Teraz dodaj 137,5 mikrolitrów 250-milimolowego środka powierzchniowo czynnego OGP. Po wymieszaniu za pomocą wiru, sonikować mieszaninę w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 10 minut, aby upewnić się, że wszystkie lipidy są rozpuszczone w micele środka powierzchniowo czynnego.Następnie przenieś dyspersję do 1,5 mililitrowej plastikowej tuby. Dodaj wymaganą ilość cytochromu BO3 i dodaj ultra czystą wodę, aby uzyskać łączną objętość 50 mikrolitrów. Mieszaninę do rozpuszczenia inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut na mieszalniku walcowym.Następnie zważ 50 miligramów mikrogranulek polistyrenu do każdej z dwóch nasadek tubki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie zważ 100 miligramów mikrogranulek polistyrenu do kolejnych dwóch nakrętek z rurką o pojemności 1,5 mililitra. Zamknij nakrętki folią parafinową, aby zapobiec wysuszeniu.Dodaj pierwsze 50 miligramów mikrogranulek polistyrenu do mieszaniny do rozpuszczenia, nakładając nakrętkę z mikrogranulkami polistyrenu na 1,5-mililitrową plastikową rurkę z przygotowaną dyspersją. Następnie wykonaj krótkie wirowanie przez kilka sekund, aby doprowadzić mikrogranulki na dno tuby. Zawiesinę inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszalniku rolkowym, aby mikrogranulki polistyrenu mogły wchłonąć środek powierzchniowo czynny przez 30 minut.Powtórz dodawanie mikrogranulek polistyrenu i inkubacje w następujący sposób. Dodaj 50 miligramów mikrogranulek na 60 minut inkubacji. Następnie dodaj 100 miligramów mikrogranulek na 60 minut inkubacji.I na koniec dodaj 100 miligramów mikrogranulek na 120 minut inkubacji. Oddzielić roztwór proteoliposomu od mikrogranulek polistyrenu za pomocą mikropipety z cienką końcówką. Rozcieńczyć dyspersję w 90 mililitrach buforu MOPS w probówce ultrawirówki TI 45.Ultraodwirować dyspersję za pomocą rotora typu 45 TI o temperaturze 125 000 razy G przez jedną godzinę w celu osadzenia proteoliposomów. Po ultraodwirowaniu wyrzucić supernatant i przepłukać granulki buforem MOPS bez ponownego zawieszania osadu. Po wyrzuceniu buforu płuczącego ponownie zawiesić proteoliposomy w 500 mikrolitrach buforu MOPS, pipetując go tam iz powrotem za pomocą mikropipety z cienką końcówką przed przeniesieniem zawiesiny do plastikowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Po odwirowaniu przez pięć minut w temperaturze 12 000 razy G w celu usunięcia zanieczyszczeń, przenieść supernatant, którym są odtworzone proteoliposomy, do nowej fiolki. Przyklej do dziewięciu szklanych nawierzchni na odparowaną złotą powierzchnię za pomocą dwuskładnikowej żywicy epoksydowej o niskiej fluorescencji. Utwardź klej w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Tuż przed modyfikacją za pomocą samodzielnie zmontowanej monowarstwy należy odłączyć szklane szkiełka osłonowe od wafli silikonowych za pomocą ostrza. Ze względu na cienkość szkiełek nakrywkowych należy zachować ostrożność podczas zdejmowania szkiełek nakrywkowych, aby nie pękły ani nie rozbiły szkiełek nakrywkowych. Zanurz świeżo oderwaną, pokrytą złotem powłokę w roztworze 6-marcaptoheksanolu i pozostaw na noc w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza, aby utworzyć samodzielnie zmontowaną monowarstwę.Następnego dnia usunąć pokryte złotem szkiełka nakrywkowe z roztworu i krótko przemyć wodą lub metanolem, a następnie izopropanolem. Wysuszyć pokryte złotem szkiełka osłonowe pod delikatnym przepływem gazu. Zmontować pokryte złotem szkiełko nakrywkowe w ogniwie spektro-elektrochemicznym, jak pokazano na schemacie w protokole tekstowym.Zetknij się ze złotem płaskim drutem na zewnątrz obszaru wyznaczonego przez gumowy O-ring i mocno przykręć ogniwo elektrochemiczne na górze. Dodaj dwa mililitry roztworu buforu elektrolitu i umieść elektrody odniesienia i pomocnicze w ogniwie. Przystąp do sprawdzenia jakości samodzielnie złożonej monowarstwy i uruchom puste miejsca zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Dodaj proteoliposomy do komórki elektrochemicznej przy końcowym stężeniu lipidów 0,5 miligrama na mililitr i lekko wymieszaj pipetą. Odczekaj 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej, aż absorpcja proteoliposomów na powierzchni elektrody zostanie zakończona. Umyj ogniwo, zmieniając roztwór buforowy co najmniej 10 razy, ale unikaj pozostawiania powierzchni elektrody całkowicie suchej.Teraz uruchom elektrochemiczną spektroskopię impedancji na otwartym potencjale komórki, aby potwierdzić, że samoorganizująca się monowarstwa na złotej elektrodzie pozostaje niezmieniona. Uruchom cykliczne woltammogramy z szybkością skanowania 10 i 100 miliwoltów na sekundę, aby zaobserwować katalatywne utlenianie ubichinolu i redukcję tlenu przez cytochrom BO3 przy początkach potencjałów elektrochemicznej redukcji chinonu. Zmodyfikuj złotą elektrodę jak poprzednio, ale używając pięciu mikrogramów na mililitr proteoliposomów.W przypadku badań pojedynczych enzymów zmniejsz stosunek cytochromu BO3 do lipidów do 0,1 do 0,2%Umieść kroplę olejku immersyjnego, a następnie ogniwo elektrochemiczne na 60-krotnym obiektywie odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Używając odpowiednich filtrów do fluorescencji FDLL, skup się na powierzchni elektrody. Pojedyncze liposomy powinny pojawiać się jako jasne punkty na granicy dyfrakcji obiektywu mikroskopu.Zrób zdjęcie kwiatostanu FDLL. Przełącz się na jeden z zestawów filtrów fluorescencyjnych HPTS w mikroskopie, aby sprawdzić, czy kwiatostan HTPS jest wyraźnie widoczny i można go odróżnić od tła. Zwiększ natężenie światła, jeśli tak nie jest.Zaprogramuj oprogramowanie mikroskopu tak, aby wykonywało akwizycję obrazu w czasie, zmieniając dwa zestawy filtrów HTPS. Aby to zrobić, ustaw jednosekundową ekspozycję, a następnie przejdź do aplikacji menu. Następnie zdefiniuj/uruchom akwizycję ND i wybierz dwa kanały HTPS.Ustaw opóźnienie między akwizycjami obrazu na minimum. W tym eksperymencie użyj 0,3 sekundy opóźnienia i pięciu minut całkowitego czasu trwania. Dostosuj ustawienia potencjostatu, aby zmienić potencjał podczas akwizycji obrazu, jak wskazano w protokole tekstowym.Teraz należy jednocześnie uruchomić czasową akwizycję obrazu na mikroskopie i sekwencję potencjału na potencjostacie, ręcznie rozpoczynając oba pomiary w tym samym czasie. Pokazano tutaj obrazy fluorescencyjne liposomów wchłoniętych na elektrodach w trzech różnych zakresach. Barwnik zawierający liposomy są widoczne na obrazach jako jasne punkty.Środkowa część obrazu została wybielona fotograficznie, aby odsłonić poziom kwiecenia tła. Obrazy na dwóch kanałach HTPS są bardzo imponujące, gdy stosunek między dwoma kanałami odpowiada pH 7,4 użytemu w tym eksperymencie. Większa liczba liposomów jest widoczna w kanale FDLL, co wskazuje na obecność liposomów, które nie mają zamkniętego HPTS.Różnica między kanałami HPTS i FDLL jest bardziej wyraźna przy wyższych zasięgach. Być może dlatego, że przy wysokim pokryciu liposomów liposomy są bardziej podatne na pękanie lub łączenie się na powierzchni. W tym przypadku zmiana florescencji liposomu na dwóch kanałach HTPS jest pokazana jako wykres powierzchniowy 3D odpowiedniego obszaru w ciągu 300 sekund eksperymentu.Potencjał redukcyjny zastosowano w okresie od 60 sekund do 180 sekund. Pokazano odpowiedni wykres stosunku intensywności metrycznej objętości dwóch kanałów HPTS w funkcji czasu. Pokazano tutaj mediany wszystkich zmian pH pęcherzyków w obrębie jednego obrazu, gdy zawartość cytochromu BO3 wynosi 1,3%Wzrost pH jest wyraźnie widoczny, gdy przyłożony jest potencjał od 0,1 do 0,3 wolta.Gdy zawartość cytochromu BO3 jest znacznie niższa i wynosi 0,1%, mediana krzywych staje się prawie nie do odróżnienia od tych w pustych liposomach. Ważne jest, aby zapewnić całkowite usunięcie środka powierzchniowo czynnego z dozowania liposomów, ponieważ pozostałości mogą zwiększać przepuszczalność liposomów dla protonów. Metody te pozwalają nam na zadawanie konkretnych pytań dotyczących naturalnego lipofilnego substratu chinonu w przeciwieństwie do często stosowanych rozpuszczalnych w wodzie analogów chinonu.Co więcej, eksperymenty z pojedynczym enzymem zidentyfikowały nieznany wcześniej stan wycieku, w którym białko działa jak kanał protonowy, w którym protony swobodnie przepływają do tyłu.

single-liposome-measurements-for-study-proton-pumping-membrane

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj prezentujemy metodę elektrofizjologiczną opartą na solidnych membranach z naciskiem na jej zastosowania do charakterystyki elektrogenicznych transporterów membranowych.

Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Prezentowany protokół opisuje analizę transportu za pośrednictwem białka błonowego na poziomie pojedynczego transportera przy użyciu dwuwarstw lipidowych bez rozpuszczalników rozciągających się na pore. Osiągnięto to poprzez stworzenie masowo produkowanych chipów z matrycami nanoporowymi, w połączeniu z wysoce równoległym pozyskiwaniem i analizą danych, co umożliwi w przyszłości tworzenie badań przesiewowych efektorów białek błonowych.

Procesy transportu błonowego analizowane przez wysoce równoległy system chipów nanoporowych w rozdzielczości pojedynczego białka

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania fluorescencyjnego, która wykorzystuje klasę wrażliwych na pH fluoroforów lipidowych do monitorowania transportu błony lipidowej podczas egzocytozy komórkowej i cyklu endocytozy.

Pomiar obrotu lipidów w błonie za pomocą wrażliwego na pH fluorescencyjnego analogu lipidowego ND6

Opisujemy protokoły pomiaru pH, zdarzeń oksydacyjnych i trawienia białek w poszczególnych makropinosomach w żywych komórkach. Nacisk kładziony jest na mikroskopię ratiometryczną z podwójnym fluoroforem i zalety, jakie oferuje w porównaniu z technikami populacyjnymi.

Pomiar pH, chemii redoks i zdolności degradacyjnej makropinosomów za pomocą mikroskopii ratiometrycznej z podwójnym fluoroforem

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę badania aktywności transportu protonów w enzymach oddechowych z rodziny cytochromów bo 3 przy użyciu pojedynczych liposomów. Technika łączy elektrochemię z mikroskopią fluorescencyjną do analizy zmian pH w czasie rzeczywistym.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Przeglądaj więcej filmów