Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Tutaj prezentujemy protokół walidacji in vivo terapii komórkowej opartej na hydrożelu, zilustrowany przykładem przeszczepu wysp trzustkowych. Implantacja h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) pozwala na implantację mieszaniny komórkowo-hydrożelowej między warstwami omentalnymi, w pobliżu naczyń krwionośnych, aby zmaksymalizować wszczepienie w odpowiednim środowisku metabolicznym.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie terapii komórkowej, takie jak: czy przeszczep wysp trzustkowych można zoptymalizować za pomocą techniki chirurgicznej hOMING? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i możliwa do dostrojenia, a walidacja biomateriału jest również bardzo szybka. Wizualna demonstracja umieszczenia igły ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego wstrzyknięcia przeszczepu do sieci komórkowej, ponieważ nieprawidłowo umieszczona igła może spowodować nieszczelność wysp trzustkowych.

Aby wywołać cukrzycę, wstrzyknij 75 miligramów na kilogram streptozotocyny dootrzewnowo każdemu sześciotygodniowemu szczurowi o wadze od 150 do 190 gramów Lewisa i sprawdzaj stan cukrzycy za pomocą codziennego pomiaru stężenia glukozy we krwi przez pierwsze cztery dni po wstrzyknięciu. Kiedy szczury wykazują glikemię powyżej dwóch gramów na litr, wstrzyknij podskórnie sześć jednostek insuliny długodziałającej dziennie, aby zapobiec powikłaniom cukrzycy i utracie wagi. Włącz szczury do kohorty eksperymentalnej, gdy dwa pomiary poziomu glukozy we krwi w żyłach ogonowych są większe niż cztery do pięciu gramów na litr przez dwa kolejne dni, przy poziomie peptydu C poniżej 200 pikomolarów.

W przypadku implantacji granulek należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego biorcy z cukrzycą i oczyścić szyję jodem powidonu. Ogolić obszar implantacji i oczyścić odsłoniętą skórę dodatkowym jodem powidonu. Po trzech minutach wysterylizuj jedną 1/2 granulki insuliny w roztworze jodu od jednego do pięciu powidonów i użyj trokaru o rozmiarze 16, aby przekłuć odsłoniętą skórę szyi.

Następnie za pomocą prowadnicy i sztyletu włóż granulki i zszyj otwór jednym punktem. Oczyść ścieg większą ilością jodu powidonu i pozwól szczurowi dojść do siebie w klatce z monitorowaniem i jedzeniem, aby uniknąć hipoglikemii. Aby zmierzyć skuteczność granulek, należy mierzyć spadek glikemii co tydzień przez miesiąc po implantacji, w tym szczurów w kohorcie eksperymentalnej, gdy pomiar poziomu peptydu C we krwi żyły ogonowej utrzymuje się poniżej 200 pikomolarów po miesiącu po implantacji granulek insuliny.

W celu wypełnienia wysp trzustkowych z matrycą wewnątrzomentalną należy policzyć liczbę wysepek wyizolowanych od zdrowych szczurów dawców w ekwiwalentach wysp trzustkowych i przygotować jeden ekwiwalent 7 660 wysepek na kilogram biorcy w pojedynczych probówkach o pojemności 1,5 mililitra. Przemyć każdą podwielokrotność 500 mikrolitrami pożywki CMRL bez płodowej surowicy bydlęcej i ponownie zawiesić osady wysepek w 150 mikrolitrach świeżo przygotowanego nośnika hydrożelu alginianowego na probówkę, starannie mieszając przed umieszczeniem probówek na lodzie. Następnie załaduj jednomililitrowe strzykawki wyposażone w atraumatyczną igłę o rozmiarze 21 ze 150 mikrolitrami pustego alginianu bez martwej objętości, a następnie 150 mikrolitrów alginianu plus wysepki.

Umieścić strzykawki na lodzie i przygotować szyję pierwszego biorcy, jak pokazano poniżej. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie nad starą raną i użyj kleszczy, aby usunąć granulki. Zamknij ścieg jednym lub dwoma pojedynczymi punktami ściegu i umieść szczura w pozycji leżącej.

Wysterylizuj obszar otrzewnej i ogol się. Użyj skalpela, aby wykonać laparotomię o długości jednego 1/2 centymetra tuż pod mostkiem. Umieść mokrą wysterylizowaną gazę wokół nacięcia i zidentyfikuj omentalną poduszkę tłuszczową znajdującą się obok brzucha.

Za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij poduszeczkę tłuszczową z jamy otrzewnej, rozprowadzając ją na gazie. Dobrze nawodnij tkankę jajową dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej, sterylnej soli fizjologicznej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i, trzymając tkankę małymi zakrzywionymi kleszczami w jednej ręce, przebij krawędź omentalną między warstwami omentalnymi igłą strzykawki z wysepką drugiej. Podczas wprowadzania igły należy upewnić się, że jest ona otoczona cienką warstwą tkanki jajowej przed rozpoczęciem wstrzykiwania.

Wprowadzić igłę całkowicie i powoli rozpocząć wstrzykiwanie preparatu na wyspę trzustkową, jednocześnie chowając igłę, aby umożliwić rozprowadzenie wstrzykniętych wysp trzustkowych w tkance. Podczas wstrzyknięcia należy cofnąć igłę do krawędzi tkanek, przerywając wstrzyknięcie, gdy igła jest prawie wyjęta. Następnie należy odczekać pięć sekund przed rozpoczęciem nowego wstrzyknięcia w następnym miejscu.

I wstrzyknąć kolejne trzy do czterech porcji, jak pokazano. Po dozowaniu całego hydrożelu należy ostrożnie wyjąć igłę, aby uniknąć utraty wstrzykniętych wysp trzustkowych, sprawdzając, czy wysepki nie są skupione w strzykawce pod koniec wstrzyknięcia. Po dostarczeniu wszystkich wysp trzustkowych należy nawodnić sieć i ścianę laparotomii, a następnie ostrożnie przywrócić tkankę jajową do jamy brzusznej.

Wstrzyknij dwa mililitry wstępnie podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby nawodnić szczura. Następnie zamknij ścianę mięśniową ciągłym szwem nici i zszyj warstwę skórną pojedynczym punktem szwu. Po jednym do dwóch miesięcy obserwacji metabolicznej otwórz nacięcie chirurgiczne każdego biorcy, jak pokazano, i użyj kleszczy, aby ostrożnie rozprowadzić omentę na nasączonych solą fizjologiczną kawałkach gazy ułożonych obok nacięć.

Zaczynając od obszaru przylegającego do ogona trzustki, użyj nożyczek, aby wyciąć tkankę omentalną i wstrzyknąć dwa mililitry wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej przed zamknięciem każdego zwierzęcia, jak pokazano. Odzyskaną omentę utrwalić w 4% paraformaldehydzie przed zatopieniem w parafinie. Następnie należy pobrać skrawki tkanek o grubości czterech mikrometrów na mikrotomie i zastosować barwienie hematoksyliną i eozyną do oceny morfologicznej przeszczepów.

Kulki dekstranu przeszczepione metodą hOMING, jak wykazano, były często obserwowane w pobliżu naczyń krwionośnych i były dobrze zagnieżdżone w tkance tłuszczowej. W tym reprezentatywnym badaniu izogenicznym glikemię najpierw kontrolowano przez wszczepienie jednej 1/2 granulki insuliny, jak wykazano, a następnie przez wszczepienie wysp trzustkowych, co wykazano przez glikemię około dwóch gramów na litr i peptydemię C większą niż 500 pikomolarów u zwierząt biorców. Ponadto analiza histologiczna eksplantowanych omentów wykazała silnie unaczynione wysepki, najprawdopodobniej w wyniku ich bliskości do naczyń krwionośnych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkową do badania bioinżynieryjnego mikrośrodowiska komórkowego w modelach przedklinicznych.