Name: Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj technikę hOMING do przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych u szczurów. Ta metoda wykorzystuje hydrogel alginianowy, aby zoptymalizować wszczepienie komórek i poprawić kontrolę glikemii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Région Alsace, BioArtMAtrix-Pôle Alsace Biovalley-CQDM; 53/14/C1. Autorzy są wdzięczni zespołowi pr. Bruanta-Rodiera z Hôpitaux Universitaires de Strasbourg za pomoc w opracowaniu tej innowacyjnej techniki.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health, z numerem zezwolenia: AL/60/67/02/13.
1. Przygotowanie biorcy
<ol>
	<li>Chemiczna indukcja cukrzycy u szczurów biorców.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć szczurom do jam brzusznych 75 mg/kg streptozotocyny (STZ, w sterylnym 0,1 M buforze cytrynianowym, pH 4)10. 
		UWAGA: W badaniach nad transplantacją wykorzystano 6-tygodniowe szczury szczepu Lewis o masie 150-190 g.</li>
		<li>Sprawdzać stan cukrzycy poprzez codzienne pomiary glukozy we krwi przez pierwsze cztery dni. W przypadku stwierdzenia glikemii powyżej 2 g/L wstrzykiwać podskórnie insulinę o przedłużonym działaniu w dawce 6 U/dobę, aby zapobiec powikłaniom cukrzycy i utracie masy ciała, aż do momentu implantacji peletek insulinowych.</li>
		<li>Włączyć szczury do grupy badawczej, gdy dwa pomiary glukozy we krwi z żyły ogonowej wyniosą &gt;4-5 g/L przez 2 kolejne dni, a poziom C-peptydu będzie &lt;200 pM. Glikemię mierzyć za pomocą glukometru, a C-peptydemię za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).</li>
		<li>Zaimplantować podskórnie peletki insulinowe (patrz sekcja 1.2). 
		UWAGA: Przewlekła terapia insuliną pozwala na lepszą regulację glikemii i zapobiega powikłaniom cukrzycowym (które nasilają stres oksydacyjny w miejscu transplantacji)11. Ponadto terapia ta utrzymuje stan cukrzycy przy zachowaniu prawidłowej krzywej wzrostu (bez typowej dla zwierząt cukrzycowych utraty masy ciała). Może to skutkować większą tkanką tłuszczową sieci, która jest idealna do przeprowadzenia transplantacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja peletek insulinowych
	<ol>
		<li>Zanestezjować szczura za pomocą anestezji gazowej (3% izofluranu w 500 mL/min O2) i ułożyć go w pozycji brzusznej.</li>
		<li>Zweryfikować stan znieczulenia, sprawdzając brak odruchu (ucisk łapy). Oczyścić szyję povidonem jodkowym i ogolić ten obszar żyletką. Ponownie nałożyć povidon jodkowy i pozostawić na 3 min.</li>
		<li>Umieścić 1,5 peletki insulinowej (3 jednostki (U)/200 g szczura) w 5-krotnie rozcieńczonym roztworze povidonu jodkowego w celu sterylizacji peletek. Przebić skórę szyi trokarem 16 G i wprowadzić peletkę za pomocą dołączonego prowadnika i kaniuli. Wyjąć prowadnik i kaniulę, a następnie założyć pojedynczy szew. Miejsce szwu oczyścić povidonem jodkowym. 
		UWAGA: Przeciwbólowe leczenie pooperacyjne nie było konieczne, ponieważ interwencja była porównywalna do pojedynczego wstrzyknięcia podskórnego (SC).</li>
		<li>Pozwolić szczurowi wybudzić się z anestezji i zapewnić dostęp do pokarmu, aby uniknąć hipoglikemii.</li>
		<li>Ocenić skuteczność peletki poprzez pomiar spadku glikemii po implantacji.</li>
		<li>Kontrolować skuteczność peletki poprzez monitorowanie poziomu glikemii co tydzień przez 1 miesiąc.</li>
		<li>Włączyć szczury do grupy badawczej, gdy poziom C-peptydu we krwi z żyły ogonowej utrzyma się poniżej 200 pM miesiąc po implantacji peletki insulinowej. 
		UWAGA: Kontrola poziomu C-peptydu jest niezbędna do oceny zwierząt w stanie wyjściowym przed transplantacją oraz do potwierdzenia stanu cukrzycowego. Niska regeneracja C-peptydu zawsze występuje podczas obserwacji. Najniższa C-peptydemia wskazuje na najniższy stopień regeneracji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. hOMING: Wypełnianie macierzy wewnątrzomentalnej wysepkami
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny wysp z macierzą.
	<ol>
		<li>Przygotować lepki nośnik wysp w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozpuścić proszek alginianu w sterylnym PBS do uzyskania stężenia 1,5%. Sterylizować preparat poprzez przepuszczenie przez filtr 0,22 µm. Przygotować 400 µL na jednego biorcę. 
		UWAGA: Można zastosować dowolny rodzaj hydrożelu o lepkości odpowiedniej do wstrzykiwania przez igłę 21 G.</li>
		<li>Wyizolować wyspy z zdrowych szczurów linii Lewis (200-250 g) zgodnie z wcześniejszym opisem12.</li>
		<li>Policzyć liczbę wysp w ekwiwalentach wysp (IEQ) (jeden IEQ uznaje się za równoważny wyspie trzustkowej o średnicy 150 µm)13.</li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować w probówce 1,5 mL alikwoty zawierające 7660 ekwiwalentów wysp (IEQ).</li>
		<li>Przemyć alikwoty wysp 500 µL medium CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) bez płodowej surowicy bydlęcej.</li>
		<li>Osadzić wyspy poprzez wirowanie (2 min przy 500 x g w temperaturze 4 °C). Odrzucić nadsącz.</li>
		<li>Dodać 150 µL nośnika z hydrożelu alginianowego na wyspy, dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie umieścić mieszaninę w lodu.</li>
		<li>Przygotować atraumatyczną igłę 21 G i strzykawkę 1 mL bez przestrzeni martwej, ładując do strzykawki 150 µL pustego alginianu.</li>
		<li>Wypełnić strzykawkę mieszaniną wysp i alginianu (150 µL, objętość całkowita 300 µL). Przechowywać strzykawkę w lodu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura chirurgiczna
	<ol>
		<li>Sterylizować narzędzia chirurgiczne metodą sterylizacji na zimno (2% Steranios przez 20 min).</li>
		<li>Zznieczulić szczura przy użyciu izofluranu i ułożyć go w pozycji brzusznej.</li>
		<li>Ogolić obszar szyi za pomocą żyletki i zdezynfekować miejsce povidone-jodem. Pozostawić jod na 3 min.</li>
		<li>Wyonać nacięcie skalpelem i usunąć pęlety insulinowe 1,5 za pomocą pęsety. Zamknąć skórę jednym lub dwoma pojedynczymi szwami. Nie wybudzać szczura z narkozy. 
		UWAGA: Po 1 miesiącu pęlet może być kruchy, ponieważ mogą go otaczać tkanki włókniste; użyć nożyczek, aby go odpowiednio wypreparować.</li>
		<li>Ułożyć szczura w pozycji grzbietnej. Ogolić i zdezynfekować (povidone-jodem) obszar otrzewnej. Pozostawić jod na 3 min.</li>
		<li>Wykonać laparotomię o długości 1,5 cm tuż pod mostkiem za pomocą skalpela. Umieścić sterylną wilgotną gazę wokół naciętego obszaru.</li>
		<li>Zidentyfikować sieciówkę, która jest poduszką tłuszczową zlokalizowaną obok żołądka. Używając pęsety, ostrożnie chwycić sieciówkę, delikatnie wyciągnąć ją z jamy otrzewnej i rozłożyć na gazie. 
		UWAGA: Tkanka sieciówki rozciąga się od śledziony do dwunastnicy i w połowie swojej długości przyczepia się do żołądka. Normalna sieciówka szczurów cukrzycowych otrzymujących terapię insulinową ma powierzchnię około 2 cm² po rozłożeniu na gazie.</li>
		<li>Dobrze nawodnić tkankę sieciówki za pomocą 2 mL wstępnie ogrzanej do 37 °C sterylnej soli fizjologicznej. Użyć małej zakrzywionej pęsety do manipulowania tkanką i wprowadzić igłę między warstwy sieciówki, przebijając jej krawędź. Wprowadzić igłę całkowicie.</li>
		<li>Rozpocząć powolne wstrzykiwanie preparatu wysp i ostrożnie przesuwać igłę do tyłu, aby wstrzyknąć wyspy w kilku miejscach (w formie linii). Przed wycofaniem igły upewnić się, że hydrożel przestał wypływać z igły, aby uniknąć utraty rozproszonych wysp.</li>
		<li>Powtarzać tę czynność w razie potrzeby, aby wstrzyknąć całą zawartość strzykawki, używając różnych punktów wejścia w celu rozprzestrzenienia wysp w całej tkance sieciówki. 
		UWAGA: U szczurów zazwyczaj wymaganych jest od czterech do pięciu wstrzyknięć.</li>
		<li>Sprawdzić, czy pod koniec wstrzyknięć w strzawce nie pozostały skupiska wysp. 
		UWAGA: Jeśli niektóre wyspy są nadal widoczne, można wyciągnąć igłę ze strzykawki, napełnić strzykawkę bezpośrednio 100 µL pustego hydrożelu i ponownie podłączyć igłę. Można przeprowadzić drugą rundę wstrzyknięcia, aby wypłukać pozostałe wyspy.</li>
		<li>Ponownie użyć sterylnej soli fizjologicznej do nawodnienia tkanki sieciówki i ściany laparotomii. Użyć pęsety, aby ostrożnie umieścić sieciówkę z powrotem w jamie brzusznej.</li>
		<li>Wstrzyknąć 2 mL wstępnie ogrzanej sterylnej soli fizjologicznej do jamy brzusznej w celu rehydratacji szczura.</li>
		<li>Zamknąć ścianę mięśniową za pomocą szwu ciągłego. Następnie zszyć warstwę skórną pojedynczymi szwami (punkt po punkcie).</li>
		<li>Wstrzyknąć meloksykam (1,5 mg/kg) podskórnie jako lek przeciwbólowy przez 5 dni, raz dziennie.</li>
		<li>Umieścić szczura w klatce na poduszce grzewczej do czasu wybudzenia z narkozy. Powtórzyć procedurę u wszystkich szczurów biorców.</li>
		<li>Codziennie mierzyć poziom glukozy we krwi po transplantacji. Jeśli glikemia wynosi &gt;2 g/L, wstrzyknąć 6 U insuliny o długim działaniu podskórnie raz dziennie.</li>
		<li>Ocenić funkcję przeszczepu poprzez monitorowanie glikemii i c-peptydemii przez 1 lub 2 miesiące. 
		UWAGA: W przypadku udanej transplantacji glikemia powinna ustabilizować się w ciągu 2-5 dni po zabiegu, a szczury mogą zostać odstawione od insuliny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Eksplantacja przeszczepu sieci lędźwiowej
UWAGA: Niniejsza procedura pozwoli na potwierdzenie prawidłowego funkcjonowania przeszczepu. Po usunięciu funkcjonalnego przeszczepu szczury powinny powrócić do stanu cukrzycy. Krok ten wykonuje się po 1 lub 2 miesiącach obserwacji metabolicznej.
<ol>
	<li>Uśpij szczura za pomocą anestezji gazowej i ułóż go w pozycji na plecach.</li>
	<li>Ogól obszar otrzewny i sterylizuj go za pomocą jodyny przez 3 min.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię o długości 1,5 cm tuż pod mostkiem za pomocą skalpela. Wokół miejsca nacięcia umieść zwilżoną sterylną gazą.</li>
	<li>Zlokalizuj siecią, która znajduje się obok żołądka. Używając pęsety, ostrożnie rozłóż ją na gazie.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wyciśnij sieciówkę. Zacznij od części przylegającej do ogona trzustki (obok śledziony). W przypadku wystąpienia krwawienia użyj suchej sterylnej gazy, aby je zatrzymać.</li>
	<li>Kontynuuj wycinanie wzdłuż części przytwierdzonej do żołądka i pobierz sieciówkę. 
	UWAGA: W tym miejscu tętnice żołądkowo-sieciowe (Rycina 1) mogą spowodować obfite krwawienie w przypadku ich przypadkowego przecięcia. Przecięcia tętnic są nieuniknione podczas pobierania przeszczepu, ale krwawienie można opanować za pomocą pęsety i gazy. W razie przypadkowego przecięcia mocno dociśnij miejsce krwawienia suchą gazą i utrzymuj ucisk przez co najmniej 1 min. Krwawienie powinno ustać. Jeśli tak się nie stanie, użyj klipsów lub bisturka elektrycznego, aby przymykają naczynia.</li>
</ol>
<img alt="Schemat podwiązania tętnicy; przedstawia tętnice żołądkowe i krytyczny obszar interwencji chirurgicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Rozmieszczenie tętnicy sieciowej. W przypadku eksplantacji przeszczepu z sieci większej, krytyczny obszar obejmujący tętnice żołądkowo-sieciowe zaznaczono na niebiesko. Podczas resekcji tej części tkanki sieciowej należy zwrócić szczególną uwagę na odcinek prawej tętnicy żołądkowo-sieciowej. W celu ograniczenia krwawienia można zastosować ucisk, podwiązanie lub kauteryzację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="7">
	<li>Sprawdź, czy nie występuje dalsze krwawienie. Jeśli nie, wstrzyknij 2 mL uprzednio ogrzanej soli fizjologicznej, zamknij ranę szczura i kontynuuj procedurę zgodnie z wcześniejszym opisem. 
	  Zwierzęta po eksplantacji powracają do stanu cukrzycy. W celu zapewnienia dobrostanu zwierząt konieczne jest wówczas podawanie insuliny (6 U/SC/dzień).</li>
	<li>Uśmierć szczura od 10 do 12 dni po eksplantacji, stosując przedawkowanie pentobarbitalu (182,2 mg/kg).</li>
</ol>
4. Analiza histologiczna: barwienie hematoksyliną i eozyną
<ol>
	<li>Utrwal pobrane sieciy za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA), a następnie zalej je w parafinie.</li>
	<li>Wykonaj skrawki o grubości 4 µm i przeprowadź barwienie hematoksyliną i eozyną w celu oceny morfologicznej przeszczepu.</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Określ istotność statystyczną przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej oraz analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA) z testem Tukey’a jako testem post hoc. Wartości p przedstaw jako: *p &lt; 0.05; ** p &lt; 0.01; *** p &lt; 0.001.</li>
</ol>

<ol><li>Bakhshandeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3B+strategies%2C+tissues%2C+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+genetic+engineering+reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials.</a> Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li>
<li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in regenerative medicine.</a> Adv Mater. , 3307-3329 (2009).</li>
<li>Rice, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+regenerative+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+healthcare+materials%22%5BJournal%5D)">Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials.</a> Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogels+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogels for bone regeneration.</a> Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).</li>
<li>Allbright, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+adipose-derived+stem+cells+in+poloxamer+hydrogel+improves+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration.</a> Muscle Nerve. , (2018).</li>
<li>Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Choice+of+Anatomical+Site+for+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation.</a> Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).</li>
<li>Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+of+microcirculatory+structure+and+function.+III.+Microvascular+hemodynamics+of+cat+mesentery+and+rabbit+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum.</a> Circ Res. 41, 380-390 (1977).</li>
<li>Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+of+the+adolescent+girl%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Chir+Plast+Esthet%22%5BJournal%5D)">The breast of the adolescent girl.</a> Ann Chir Plast Esthet. 61, 629-639 (2016).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-Hepatic+Islet+Transplantation%3A+Validation+of+the+h-Omental+Matrix+Islet+filliNG+%28hOMING%29+Technique+on+a+Rodent+Model+Using+an+Alginate+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier.</a> Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+Type+of+Continuous+Insulin+Administration+on+Metabolism+in+a+Diabetic+Rat+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model.</a> Journal of diabetes research. 2016, 8310516(2016).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+an+autologous+oxygenating+matrix+culture+system+on+rat+islet+transplantation+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome.</a> Biomaterials. 52, 180-188 (2015).</li>
<li>Kissler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methodologies+for+quantifying+isolated+human+islets%3A+an+Islet+Cell+Resources+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+transplantation%22%5BJournal%5D)">Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study.</a> Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+islet+transplantation%3A+the+impact+of+the+liver+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+international+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment.</a> Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).</li>
<li>Leitao, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fat+accumulation+after+islet+transplantation+and+graft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival.</a> Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).</li>
<li>Narang, A. S., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+biomaterial+approaches+for+improved+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation.</a> Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).</li>
<li>Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+carriers+for+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as carriers for stem cell transplantation.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole można wyróżnić kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, osoba wykonująca operację i manipulująca tkankami musi być delikatna w stosunku do tkanki tłuszczowej, ponieważ jest ona delikatna. Należy unikać zgniecenia lub uszkodzenia sieci komórkowej. Sieć, jako tkanka obronna, jest wzbogacona w makrofagi i inne leukocyty. Te komórki odpornościowe mogą być aktywowane przez nadmierną manipulację i mogą negatywnie wpływać na przeszczep. Po drugie, krytyczne znaczenie ma również obciążenie przeszczepem (mieszaniną wysepki i hydrożelu). Osoba wykonująca zabieg musi unikać martwych objętości i musi załadować całą mieszaninę hydrożelu i wysepek do urządzenia iniekcyjnego. Bezpośrednio po tym kroku kolejnym krytycznym punktem jest samo wstrzyknięcie. Wstrzyknięcie należy wykonywać powoli, ostrożnie i delikatnie. Strzykawkę należy przepłukać pustym hydrożelem załadowanym początkowo w celu pobrania pozostałych wysepek. Po trzecie, szycie należy wykonać ostrożnie i w dwóch etapach. Plan mięśniowy należy najpierw zszyć, uważając, aby nie zszyć sieci mięśniem, a skórę należy zszyć osobno. Jeśli chodzi o procedurę eksplantacji do przeszczepu omentalnego, należy zwrócić szczególną uwagę na moment nacięcia tętnic w pobliżu żołądka (tętnic żołądkowo-epiploicznych). Ważne jest, aby zwracać uwagę na wszelkie występujące krwotoki i zatamować je przed zszyciem zwierzęcia, ponieważ każde uporczywe krwawienie prowadzi do śmierci zwierzęcia w ciągu kilku dni.
Może być konieczne rozwiązywanie problemów w odniesieniu do podłoża do przenoszenia wysepek; Wybór hydrożelu należy do eksperymentatora, o ile hydrożel można wstrzykiwać. Stosowanie różnych materiałów może skutkować zmienną funkcją przeszczepu (na przykład z suplementacją lub bez). Opisana tutaj metoda dowiodła swojej skuteczności w przypadku obojętnego materiału do współprzesadzania o stosunku wysepek wysepkowych wynoszącym 7660 IEQ/kg.
Obecna metoda może być ograniczona wielkością materiału i właściwościami hydrożelu. Aby zastosować model gryzonia z cukrzycą, insulinoterapia jest obowiązkowa przed implantacją wysp trzustkowych, aby zapewnić wystarczającą powierzchnię przeszczepu. Gryzonie z cukrzycą tracą dużo na wadze i masie tłuszczowej z powodu cukrzycy wywołanej przez STZ. Biorąc pod uwagę niewielką wagę zwierząt włączonych do tego badania, szczepienie na jeszcze mniejszym obszarze nie jest możliwe.
Zachowanie prawidłowej kontroli glikemii (przed przeszczepem za pomocą granulek, a następnie przy użyciu insuliny długodziałającej) jest obowiązkowe. W tym przypadku zdecydowaliśmy się zachować granulkę insuliny do dnia przeszczepu z kilku powodów. Po pierwsze, utrzymanie prawidłowej kontroli glikemii znacznie zmniejsza stres oksydacyjny wywołany cukrzycą w narządach biorcy, który może być szkodliwy dla przeszczepu wysp trzustkowych11 i umożliwia kontynuację intensywnej insulinoterapii i przygotowania biorcy obserwowanego w klinice12. Po drugie, chcieliśmy ograniczyć maksymalną liczbę zabiegów znieczulenia dla szczurów. Jeśli chodzi o wdrożenie insulinoterapii podczas obserwacji metabolicznej z użyciem insuliny długo działającej, zastosowany schemat pozwolił uniknąć poważnych powikłań spowodowanych glukotoksycznością (która może niszczyć przeszczepy) i zachować "prawdziwą" wartość glikemii.
Aby monitorować wydajność przeszczepu, glikemia nie jest istotnym parametrem w ciągu pierwszych kilku dni, jeśli szczury otrzymują insulinoterapię za pomocą granulek. Dlatego konieczne jest kilkukrotne sprawdzenie poziomu peptydu C przed przeszczepem. Czasy te obejmują początek badania, selekcję zwierząt po wstrzyknięciu STZ, a następnie tuż przed przeszczepem, aby upewnić się, że szczury pozostają cukrzycą, a regeneracja jest minimalna.
Nie bez znaczenia są również właściwości hydrożelowe. Płynny hydrożel będzie wyciekał z tkanki ustnej, a hydrożel o dużej lepkości nie będzie można wstrzykiwać. Lepkość hydrożelu i zdolność do wstrzykiwania muszą być testowane przed użyciem, ale wydaje się również niezbędne bezpośrednie przetestowanie materiału poprzez ocenę przeżywalności wysp trzustkowych lub innych komórek in vitro. W tym przypadku, ponieważ wysepki są bardzo wrażliwe na niedotlenienie, użycie nośnika o wysokiej lepkości może wpływać na dyfuzję tlenu.
Jeśli chodzi o znaczenie opisanej tutaj metody w odniesieniu do istniejących metod, ta technika przeszczepu wewnątrztkankowego ma zalety pod względem odtwarzalności. Jest również atraumatyczny dla tkanki, a ze względu na swoje pozanaczyniowe położenie pozwala uniknąć ryzyka krwawienia i zakrzepicy. Ponadto, rozważając przeszczep wysp trzustkowych, unika się natychmiastowej reakcji zapalnej za pośrednictwem krwi14. Co więcej, hOMING umożliwia przeszczepianie wysp trzustkowych do narządu, który nie jest istotny, w przeciwieństwie do przeszczepu do wątroby, który stwarza ryzyko pod względem funkcji wątroby15.
Aby uzyskać optymalną wydajność, hydrożel musi być dostosowany do komórek, które będzie przenosił. Stosowanie czynników wzrostu lub określonych białek może mieć pozytywny wpływ na przeszczepiane komórki16,17.
Podsumowując, technika ta może być wykorzystana do walidacji hydrożelu in vivo na różnych typach komórek, zwłaszcza gdy potrzebne jest aktywne środowisko metaboliczne, jak w przypadku wysp trzustkowych. Ponadto ta technika chirurgiczna ma zastosowanie w wielu zastosowaniach i może być w przyszłości szybko przenoszona na ludzi, ponieważ można ją łatwo wykonać za pomocą laparoskopii.

Terapia komórkowa to gorący temat, ponieważ ma na celu leczenie chorób w oparciu o medycynę regeneracyjną. W ostatnich latach coraz częściej bada się terapie komórkowe wspomagane materiałem biologicznym, zwłaszcza dlatego, że implantacja komórek często wymaga nośnika do przeniesienia komórek z naczynia hodowlanego do biorcy. Rusztowania z biomateriałów są potencjalnie cennymi nośnikami komórek, które spełniają kilka ról1. Kompetentny nosiciel powinien chronić komórki przed naprężeniami mechanicznymi i zapewniać korzystne warunki wzrostu, takie jak niezbędne czynniki wzrostu, wydalanie produktów przemiany materii, wymiana substancji odżywczych i tlen2.
Wśród różnych rodzajów biomateriałów stosowanych w terapii komórkowej, hydrożele mają wiele zalet. Są biokompatybilne, biodegradowalne, łatwe w obsłudze i ułatwiają dyfuzję tlenu3. Co więcej, obecna technologia pozwala na stosowanie hydrożeli, które pomagają komórkom przetrwać i wszczepiać się, na przykład poprzez suplementację czynnikami wzrostu lub białkami macierzy zewnątrzkomórkowej4.
Hydrożelowe nośniki zawierające komórki macierzyste mogą być wstrzykiwane jako leczenie, np. regeneracja kości5 i choroby układu nerwowego6. Konieczne jest wszczepienie komórek aktywnych metabolicznie. Chociaż walidacja tego podejścia metodą in vitro jest możliwa, narzędzia i techniki do walidacji in vivo wymagają jeszcze udoskonalenia.
Przeszczep komórek i hydrożelu można łatwo przeprowadzić przez wstrzyknięcie podskórne, gdy przeprowadzane są testy biokompatybilności. Jednakże, gdy przeszczepione komórki mają regulować czynniki ogólnoustrojowe poprzez ich działanie metaboliczne, ta lokalizacja podskórna nie jest optymalna, zasadniczo pod względem drenażu żylnego7. W związku z tym nie ma obecnie narzędzi, które pozwoliłyby szybko, bezpiecznie i skutecznie ocenić korzystne działanie hydrożelu. Na przykładzie przeszczepu wysp trzustkowych, który wymaga, aby hormony były uwalniane do krwiobiegu z przeszczepu w odpowiedzi na poziom glukozy we krwi, opracowaliśmy nową metodę implantacji komórek/hydrożelu in vivo.
Pierwszym krokiem było zidentyfikowanie miejsca przeszczepu akceptora, które może przyjąć hydrożel z komórkami. Sieć oferuje dużą przestrzeń do implantacji, jest wysoce plastyczna, a jej gęste unaczynienie w połączeniu z ustawieniem wewnątrzotrzewnowym jest interesujące do badania komórek o wysokiej aktywności metabolicznej8. Następnie musieliśmy opracować technikę chirurgiczną pozwalającą na przeniesienie komórek i hydrożelu do sieci komórkowej. Zainspirowani lipofillingiem stosowanym w chirurgii plastycznej9, opracowaliśmy metodę h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING). Wyspy trzustkowe zatopione w hydrożelu są wstrzykiwane do wnętrza tkanki omentalnej. Technika ta miała również na celu zapewnienie maksymalnego wszczepienia poprzez wykorzystanie wielokrotnego osadzania mieszaniny komórek i hydrożelu w tkance omentalnej, gdzie duża liczba naczyń krwionośnych poprawia również natlenienie przeszczepu.
W niniejszym badaniu opisujemy prostą i innowacyjną technikę implantacji wysp trzustkowych pomiędzy arkuszami omentalnymi, wewnątrz tkanki tłuszczowej znajdującej się najbliżej naczyń krwionośnych. Polega ona na mikroinwazyjnej operacji, która może być zakończona pod laparoskopią, polegającą na wstrzyknięciu w tkankę tłuszczową wysp trzustkowych zawartych w hydrożelu. Technikę tę można łatwo zastosować do wszystkich kombinacji hydrożelu i komórek, które muszą być testowane w metabolicznie funkcjonalnym środowisku.

<table><tbody><tr><td>Alginian (PRONOVA UP LMV)</td><td>Novamatrix</td><td>4200206</td><td>Nośnik hydrożelowy</td></tr><tr><td>Igła atraumatyczna ()</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>CMRL bez FBS</td><td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>zestaw ELISA z peptydem C</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>Szew chirurgiczny</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>Granulki insuliny</td><td>Linshin</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Centravet</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>Lantus (Insulin-Glargin)</td><td>Sanofi Adventis</td><td>Lantus SoloStar</td><td>Insulina długodziałająca</td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>MET019</td><td>Lek przeciwzapalny</td></tr><tr><td>NaCl (do soli fizjologicznej 0,9%)</td><td>Sigma</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G</td><td>TERUMO</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>Tlen</td><td>Linde</td><td>2010152</td><td>Do stosowania izofluranu</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal</td><td>Do eutanazji</td></tr><tr><td>Steranios 2%</td><td>Anios</td><td>11764046</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocyna</td><td>Santa-Cruz</td><td>SC-200719A</td> Strzykawka <td></td></tr><tr><td>&ndash; Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Trocar & stylet (linshin)</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>Do wprowadzania peletów</td></tr></tbody></table>

przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-omental matrix islet filling (homing)

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Medycyna regeneracyjna oparta na terapii komórkowej stanowi nową nadzieję na leczenie chorób. Do obecnych przeszkód należy właściwa walidacja in vivo skuteczności terapii. W celu przeniesienia do organizmu biorcy komórki często muszą być połączone z biomateriałami, zwłaszcza hydrożelami. Jednak walidacja skuteczności takiego przeszczepu wymaga odpowiedniego środowiska, odpowiedniego hydrożelu i odpowiedniego miejsca biorczego. Sieć może być takim miejscem. Na przykładzie przeszczepu wysp trzustkowych opracowaliśmy technikę hOMING (h-Omental Matrix Islet filliNG), która polega na wstrzyknięciu przeszczepu do wnętrza tkanki, pomiędzy warstwy omentalne, w celu poprawy implantacji i przeżywalności wysp trzustkowych. Aby to osiągnąć, wysepki muszą być zatopione w hydrożelu o lepkości umożliwiającej jego wstrzyknięcie za pomocą atraumatycznej igły. Strzykawki są wypełnione kombinacją hydrożelu i wysepek. Wykonuje się kilka wstrzyknięć do wnętrza tkanki jajowej w różnych punktach wejścia, a osadzanie mieszaniny wysepki i hydrożelu odbywa się wzdłuż linii. Przetestowaliśmy wykonalność tego innowacyjnego podejścia przy użyciu kulek dekstranu. Koraliki były dobrze rozsiane po całej tkance omentalnej, w bliskiej odległości od naczyń krwionośnych. Aby przetestować skuteczność przeszczepu, przeszczepiliśmy wyspy trzustkowe szczurom z cukrzycą i przeprowadziliśmy obserwację metaboliczną przez dwa miesiące. Przeszczepione wyspy wykazywały wysoki wskaźnik rewaskularyzacji wokół i wewnątrz wysp oraz odwracały cukrzycę. Technika hOMING może mieć zastosowanie w innych rodzajach hydrożelu lub terapii komórkowej dla komórek o wysokiej aktywności metabolicznej.

Metoda hOMING pozwala uniknąć implantacji doewnątrznaczyniowej i ograniczenia wysp w obrębie narządu. Cała procedura implantacji wysp, wliczając znieczulenie, wymaga maksymalnie 8-10 min, co stanowi ramy czasowe porównywalne z klasycznym przeszczepem wątroby.
Aby zbadać sposób rozmieszczenia wysepek w obrębie tkanki sieciowej, za pomocą metody hOMING przeszczepiono kuleksy dekstranowe (Ryc. 2). Jeden dzień po implantacji uśpiono szczury i pobrano tkankę sieciową do analizy histologicznej. Barwienie hematoksyliną i eozyną wykazało równomierne rozmieszczenie kuleks w całej tkance (Ryc. 2, prawy dolny róg). Kuleksy bardzo często znajdowały się w pobliżu naczyń krwionośnych i były dobrze wszczepione w tkankę tłuszczową. Bezpośrednio po implantacji wokół kuleks występuje reakcja zapalna, prowadząca do przebudowy tkanki w celu zakotwiczenia wysepek w tkance.
<img alt="Eksperyment wstrzykiwania kulek hydrożelowych; odsłonięcie sieci; histologiczna analiza mikroskopowa; badanie naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Opis techniki hOMING i rozkład kulek w tkance sieciowej jeden dzień po implantacji. (A) Ilustracja techniki hOMING. Po odsłonięciu narządu (A, lewo), mieszaninę wysepek z hydrożelem (zastąpioną tutaj niebieskimi kulkami dekstranowymi dla lepszej wizualizacji) ostrożnie wstrzyknięto do tkanki za pomocą igły atraumatycznej (A, środek). Widoczne są kulki zaimplantowane w tkance (A, prawo). (B) Barwienie hematoksyliną i eosiną sieci wyjętej 1 dzień po wstrzyknięciu kulek. Kulki znajdują się w tkance z jednolitym rozkładem. Pasek skali = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Aby zwalidować tę technikę, przeprowadziliśmy badania izogeniczne z wykorzystaniem szczurów linii Lewis (n=8). Szczury cukrzycowe, którym przeszczepiono wysepki w dawce 7660 równoważników wysepek (IEQ) na kg masy ciała szczura przy użyciu hOMING, były monitorowane pod kątem glikemii i C-peptydemii przez dwa miesiące. Glikemię kontrolowano poprzez implantację granulatu insuliny (co potwierdza pierwszy spadek glikemii zaobserwowany na Rysunku 3A). Funkcjonowanie przeszczepu odzwierciedlała glikemia na poziomie około 2 g/L oraz C-peptydemia &gt;500 pM. Przed transplantacją szczury były w stanie cukrzycowym (glikemia &gt;5 g/L i C-peptydemia &lt;200 pM). Po transplantacji i usunięciu granulatu insuliny, utrzymanie i normalizacja glikemii zostały zaobserwowane już 3 dni po transplantacji hOMING i utrzymywały się do momentu usunięcia przeszczepu (p &lt; 0,05 w porównaniu z poziomami przed transplantacją). Po eksplantacji sieci, glikemia ponownie wzrosła do poziomu sprzed transplantacji, co potwierdza funkcjonalność wysepek przeszczepionych za pomocą hOMING (Rysunek 3A). Wzorzec C-peptydemii był dokładnie odwrotny: poziomy były niskie lub niewykrywalne przed przeszczepem, następnie nastąpił wzrost i utrzymanie tego podwyższonego poziomu przez cały okres badania (p &lt;0,05), a po eksplantacji sieci nastąpił spadek do poziomów przed transplantacją (Rysunek 3B). Analiza histologiczna eksplantowanej sieci wykazała silnie unaczynione wysepki, najprawdopodobniej w wyniku ich bliskości do naczyń krwionośnych (Rysunek 3C).
<img alt="Wpływ transplantacji na glikemię i poziomy C-peptydu; obrazy mikroskopowe zmian komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Dwumiesięczna obserwacja metaboliczna szczurów otrzymujących hOMING oraz ocena przeszczepu. (A) Pomiar glikemii oraz (B) ocena poziomu C-peptydu po hOMING z wykorzystaniem alginianu jako nośnika wysepek (Tx: transplantacja i usunięcie granulki insulinowej; Explantation: eksplantacja sieci ownetralnej). Przeszczepy są funkcjonalne, co wykazuje utrzymanie normoglikemii po usunięciu granulki insulinowej oraz wzrost poziomu C-peptydu w surowicy po implantacji wysepek. Obszary zacienione na szaro reprezentują minimalne i maksymalne wartości zarejestrowane w każdym punkcie czasowym. (C) Barwienie hematoksyliną i eozyną przekroju sieci oraz omentum po transplantacji wysepek metodą hOMING. Wysepki są dobrze zintegrowane z tkanką dwa miesiące po implantacji, bez obecności otaczającej tkanki włóknistej. Naczynia krwionośne wrosły wokół i do wnętrza wysepek, co wskazują strzałki, całkowicie przywracając ich funkcję. Morfologia wysepek również wydaje się być dobrze zachowana. Paski skali = 50 µm. (n = 8) (*p &lt; 0,05; ** p &lt; 0,01; *** p &lt; 0,001 wyznaczone przy użyciu analizy wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami oraz testu Tukey'a jako testu post hoc). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół walidacji in vivo terapii komórkowej opartej na hydrożelu, zilustrowany przykładem przeszczepu wysp trzustkowych. Implantacja h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) pozwala na implantację mieszaniny komórkowo-hydrożelowej między warstwami omentalnymi, w pobliżu naczyń krwionośnych, aby zmaksymalizować wszczepienie w odpowiednim środowisku metabolicznym.

Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie terapii komórkowej, takie jak: czy przeszczep wysp trzustkowych można zoptymalizować za pomocą techniki chirurgicznej hOMING? Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i możliwa do dostrojenia, a walidacja biomateriału jest również bardzo szybka. Wizualna demonstracja umieszczenia igły ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego wstrzyknięcia przeszczepu do sieci komórkowej, ponieważ nieprawidłowo umieszczona igła może spowodować nieszczelność wysp trzustkowych.Aby wywołać cukrzycę, wstrzyknij 75 miligramów na kilogram streptozotocyny dootrzewnowo każdemu sześciotygodniowemu szczurowi o wadze od 150 do 190 gramów Lewisa i sprawdzaj stan cukrzycy za pomocą codziennego pomiaru stężenia glukozy we krwi przez pierwsze cztery dni po wstrzyknięciu. Kiedy szczury wykazują glikemię powyżej dwóch gramów na litr, wstrzyknij podskórnie sześć jednostek insuliny długodziałającej dziennie, aby zapobiec powikłaniom cukrzycy i utracie wagi. Włącz szczury do kohorty eksperymentalnej, gdy dwa pomiary poziomu glukozy we krwi w żyłach ogonowych są większe niż cztery do pięciu gramów na litr przez dwa kolejne dni, przy poziomie peptydu C poniżej 200 pikomolarów.W przypadku implantacji granulek należy potwierdzić brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego biorcy z cukrzycą i oczyścić szyję jodem powidonu. Ogolić obszar implantacji i oczyścić odsłoniętą skórę dodatkowym jodem powidonu. Po trzech minutach wysterylizuj jedną 1/2 granulki insuliny w roztworze jodu od jednego do pięciu powidonów i użyj trokaru o rozmiarze 16, aby przekłuć odsłoniętą skórę szyi.Następnie za pomocą prowadnicy i sztyletu włóż granulki i zszyj otwór jednym punktem. Oczyść ścieg większą ilością jodu powidonu i pozwól szczurowi dojść do siebie w klatce z monitorowaniem i jedzeniem, aby uniknąć hipoglikemii. Aby zmierzyć skuteczność granulek, należy mierzyć spadek glikemii co tydzień przez miesiąc po implantacji, w tym szczurów w kohorcie eksperymentalnej, gdy pomiar poziomu peptydu C we krwi żyły ogonowej utrzymuje się poniżej 200 pikomolarów po miesiącu po implantacji granulek insuliny.W celu wypełnienia wysp trzustkowych z matrycą wewnątrzomentalną należy policzyć liczbę wysepek wyizolowanych od zdrowych szczurów dawców w ekwiwalentach wysp trzustkowych i przygotować jeden ekwiwalent 7 660 wysepek na kilogram biorcy w pojedynczych probówkach o pojemności 1,5 mililitra. Przemyć każdą podwielokrotność 500 mikrolitrami pożywki CMRL bez płodowej surowicy bydlęcej i ponownie zawiesić osady wysepek w 150 mikrolitrach świeżo przygotowanego nośnika hydrożelu alginianowego na probówkę, starannie mieszając przed umieszczeniem probówek na lodzie. Następnie załaduj jednomililitrowe strzykawki wyposażone w atraumatyczną igłę o rozmiarze 21 ze 150 mikrolitrami pustego alginianu bez martwej objętości, a następnie 150 mikrolitrów alginianu plus wysepki.Umieścić strzykawki na lodzie i przygotować szyję pierwszego biorcy, jak pokazano poniżej. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie nad starą raną i użyj kleszczy, aby usunąć granulki. Zamknij ścieg jednym lub dwoma pojedynczymi punktami ściegu i umieść szczura w pozycji leżącej.Wysterylizuj obszar otrzewnej i ogol się. Użyj skalpela, aby wykonać laparotomię o długości jednego 1/2 centymetra tuż pod mostkiem. Umieść mokrą wysterylizowaną gazę wokół nacięcia i zidentyfikuj omentalną poduszkę tłuszczową znajdującą się obok brzucha.Za pomocą kleszczy delikatnie wyciągnij poduszeczkę tłuszczową z jamy otrzewnej, rozprowadzając ją na gazie. Dobrze nawodnij tkankę jajową dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej, sterylnej soli fizjologicznej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i, trzymając tkankę małymi zakrzywionymi kleszczami w jednej ręce, przebij krawędź omentalną między warstwami omentalnymi igłą strzykawki z wysepką drugiej. Podczas wprowadzania igły należy upewnić się, że jest ona otoczona cienką warstwą tkanki jajowej przed rozpoczęciem wstrzykiwania.Wprowadzić igłę całkowicie i powoli rozpocząć wstrzykiwanie preparatu na wyspę trzustkową, jednocześnie chowając igłę, aby umożliwić rozprowadzenie wstrzykniętych wysp trzustkowych w tkance. Podczas wstrzyknięcia należy cofnąć igłę do krawędzi tkanek, przerywając wstrzyknięcie, gdy igła jest prawie wyjęta. Następnie należy odczekać pięć sekund przed rozpoczęciem nowego wstrzyknięcia w następnym miejscu.I wstrzyknąć kolejne trzy do czterech porcji, jak pokazano. Po dozowaniu całego hydrożelu należy ostrożnie wyjąć igłę, aby uniknąć utraty wstrzykniętych wysp trzustkowych, sprawdzając, czy wysepki nie są skupione w strzykawce pod koniec wstrzyknięcia. Po dostarczeniu wszystkich wysp trzustkowych należy nawodnić sieć i ścianę laparotomii, a następnie ostrożnie przywrócić tkankę jajową do jamy brzusznej.Wstrzyknij dwa mililitry wstępnie podgrzanej sterylnej soli fizjologicznej do jamy brzusznej, aby nawodnić szczura. Następnie zamknij ścianę mięśniową ciągłym szwem nici i zszyj warstwę skórną pojedynczym punktem szwu. Po jednym do dwóch miesięcy obserwacji metabolicznej otwórz nacięcie chirurgiczne każdego biorcy, jak pokazano, i użyj kleszczy, aby ostrożnie rozprowadzić omentę na nasączonych solą fizjologiczną kawałkach gazy ułożonych obok nacięć.Zaczynając od obszaru przylegającego do ogona trzustki, użyj nożyczek, aby wyciąć tkankę omentalną i wstrzyknąć dwa mililitry wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej przed zamknięciem każdego zwierzęcia, jak pokazano. Odzyskaną omentę utrwalić w 4% paraformaldehydzie przed zatopieniem w parafinie. Następnie należy pobrać skrawki tkanek o grubości czterech mikrometrów na mikrotomie i zastosować barwienie hematoksyliną i eozyną do oceny morfologicznej przeszczepów.Kulki dekstranu przeszczepione metodą hOMING, jak wykazano, były często obserwowane w pobliżu naczyń krwionośnych i były dobrze zagnieżdżone w tkance tłuszczowej. W tym reprezentatywnym badaniu izogenicznym glikemię najpierw kontrolowano przez wszczepienie jednej 1/2 granulki insuliny, jak wykazano, a następnie przez wszczepienie wysp trzustkowych, co wykazano przez glikemię około dwóch gramów na litr i peptydemię C większą niż 500 pikomolarów u zwierząt biorców. Ponadto analiza histologiczna eksplantowanych omentów wykazała silnie unaczynione wysepki, najprawdopodobniej w wyniku ich bliskości do naczyń krwionośnych.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkową do badania bioinżynieryjnego mikrośrodowiska komórkowego w modelach przedklinicznych.

intra-omental-islet-transplantation-using-h-omental-matrix-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Ten film opisuje protokół szczepienia ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu monitorowania rewaskularyzacji ludzkich przeszczepów wysp trzustkowych in vivo. Pomaga również zrozumieć udział komórek biorcy i dawcy w promowaniu enkapsulacji i unaczynienia przeszczepu.

Szczepienie wysp trzustkowych: metoda wszczepiania wysp trzustkowych do przedniej komory oka myszy w celu obrazowania in vivo

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Wprowadzono metodę przeszczepiania wysp trzustkowych u myszy. Wyizolowane wysepki miesza się z hydrożelem, a mieszaninę umieszcza się w woreczku omentalnym myszy z cukrzycą. Następnie monitorowany jest poziom glukozy we krwi i wykonywana jest analiza immunohistochemiczna.

Metoda przeszczepu wysp trzustkowych do sieci u myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Celem tego protokołu jest ciągłe monitorowanie dynamiki procesu wszczepiania ludzkich wysp trzustkowych oraz komórek gospodarza i dawcy. Osiąga się to poprzez przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych do przedniej komory oka (ACE) NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mysz, a następnie wielokrotne obrazowanie 2-fotonowe.

Podłużne obrazowanie in vivo i kwantyfikacja przeszczepu ludzkich wysp trzustkowych i komórek gospodarza w przedniej komorze oka

Ta metoda przeszczepiania wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem jest odpowiednia do wykrywania wszczepionych wysp trzustkowych w jamie wewnątrzotrzewnowej. Co ważne, nie wymaga stosowania środków wiążących biologicznie ani szycia.

Przeszczep wysp trzustkowych pokrytych tłuszczem z wykorzystaniem białej tkanki tłuszczowej najądrza

Tutaj prezentujemy wyrafinowane procedury chirurgiczne dotyczące skutecznego przeprowadzenia przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrz portalu, klinicznie istotnej, ale technicznie trudnej procedury chirurgicznej u myszy.

Minimalizacja krwawienia z żyły wrotnej po infuzji podczas przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzwątrobowych u myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj technikę hOMING do przeszczepu wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych u szczurów. Ta metoda wykorzystuje hydrogel alginianowy, aby zoptymalizować wszczepienie komórek i poprawić kontrolę glikemii.

Przeszczep wysp trzustkowych wewnątrzomentalnych za pomocą h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Przeglądaj więcej filmów