Name: Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Odkryj metodę oceny integralności szczelin ścisłych w modelu ludzkiej bariery krew-mózg z wykorzystaniem Lucifer Yellow. Szybki test fluorescencyjny pozwala obliczyć współczynnik przepuszczalności Papp w komórkach hCMEC/D3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe z 2017 New Investigator Award od American Association of Pharmacy, nagrody Hunkele Dreaded Disease od Duquesne University oraz funduszy na rozpoczęcie działalności przez School of Pharmacy dla laboratorium Manickam. Chcielibyśmy podziękować laboratorium Leak (Uniwersytet Duquesne) za pomoc w Western blotting i umożliwienie korzystania z ich 16-bitowego imagera Odyssey. Chcielibyśmy również dołączyć specjalną notatkę z podziękowaniami dla Kandarp Dave (laboratorium Manickam) za pomoc w leczeniu western blottingu.

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Camos, S., Mallolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+assaying+microvascular+endothelial+cell+pathophysiology+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Experimental models for assaying microvascular endothelial cell pathophysiology in stroke.</a> Molecules. 15 (12), 9104-9134 (2010).</li>
<li>Cucullo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+human+brain+endothelial+cells+and+flow-based+vascular+modeling%3A+a+marriage+of+convenience+for+rational+neurovascular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).</li>
<li>Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Blood-Brain+Barrier+Models-An+Overview+of+Established+Models+and+New+Microfluidic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (9), 2727-2746 (2015).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Ohtsuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+targeted+absolute+proteomic+analysis+of+transporters%2C+receptors+and+junction+proteins+for+validation+of+human+cerebral+microvascular+endothelial+cell+line+hCMEC%2FD3+as+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model.</a> Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).</li>
<li>Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+and+Drug+Delivery--In+vitro+Models+of+the+Ischemic+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stroke and Drug Delivery--In vitro Models of the Ischemic Blood-Brain Barrier.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (2), 398-405 (2016).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Llombart, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+secretomes+from+a+human+blood+brain+barrier+endothelial+cells+in-vitro+model+after+ischemia+by+stable+isotope+labeling+with+aminoacids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of secretomes from a human blood brain barrier endothelial cells in-vitro model after ischemia by stable isotope labeling with aminoacids in cell culture (SILAC).</a> Journal of Proteomics. 133, 100-112 (2016).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Avdeef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+well+can+in+vitro+brain+microcapillary+endothelial+cell+models+predict+rodent+in+vivo+blood-brain+barrier+permeability%3F%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">How well can in vitro brain microcapillary endothelial cell models predict rodent in vivo blood-brain barrier permeability?</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 43 (3), 109-124 (2011).</li>
<li>Rahman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+endothelial+cell+lines+for+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review.</a> Brain Research. 1642, 532-545 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733(2014).</li>
<li>Shao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+blood-brain+barrier+model+in+a+membrane-based+microchip+for+characterization+of+drug+permeability+and+cytotoxicity+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a blood-brain barrier model in a membrane-based microchip for characterization of drug permeability and cytotoxicity for drug screening.</a> Analytica Chimica Acta. 934, 186-193 (2016).</li>
<li>Walter, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+lab-on-a-chip+tool+for+modeling+biological+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+for+evaluating+drug+transport+across+the+blood%E2%80%93brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro model for evaluating drug transport across the blood–brain barrier.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 36, (1999).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood%E2%80%93brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood–brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature reviews Drug discovery. 6 (8), 650(2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReichel%2C+A+%22The+Blood-Brain+Barrier%22">The Blood-Brain Barrier</a>. , Springer. 307-324 (2003).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+Studies+on+In+vitro+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+Models%3A+Physiology%2C+Pathology%2C+and+Pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability Studies on In vitro Blood–Brain Barrier Models: Physiology, Pathology, and Pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Ren, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+General+Method+To+Increase+Stokes+Shift+by+Introducing+Alternating+Vibronic+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A General Method To Increase Stokes Shift by Introducing Alternating Vibronic Structures.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (24), 7716-7722 (2018).</li>
<li>Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymers+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymers for gene delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).</li>
<li>Oupický, D., Konák, C., Ulbrich, K., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+delivery+systems+based+on+complexes+of+DNA+with+synthetic+polycations+and+their+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DNA delivery systems based on complexes of DNA with synthetic polycations and their copolymers.</a> Journal of Controlled Release. 65, (2000).</li>
<li>Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCouraud%2C+PO+%22The+hCMEC%2FD3+CELL+LINE%3A+IMMORTALIZED+HUMAN+CEREBRAL+MICROVASCULAR+ENDOTHELIAL+CELLS+As+a+model+of+human+Blood-Brain+Barrier%22">The hCMEC/D3 CELL LINE: IMMORTALIZED HUMAN CEREBRAL MICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS As a model of human Blood-Brain Barrier</a>. , Institut Cochin, INSERM U1016. France. (2012).</li>
<li>Youdim, K. ureshA., A, A. A. aN. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+trans-monolayer+permeability+calculations%3A+often+forgotten+assumptions%5BTitle%5D)+AND+%22research+focus+reviews%22%5BJournal%5D)">In vitro trans-monolayer permeability calculations: often forgotten assumptions.</a> research focus reviews. 8, (2003).</li>
<li>Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluid+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluid and Barriers of the CNS. 10 (33), (2013).</li>
<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
<li>Balda, M. S., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+tight+junctions+are+revealed+by+ZO-1+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Physiological+Society%22%5BJournal%5D)">Two classes of tight junctions are revealed by ZO-1 isoforms.</a> The American Physiological Society. , (1992).</li>
<li>Brown, R. C., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Modulation+of+Adherens+and+Tight+Junction+Function%3A+A+Potential+Mechanism+for+Blood-Brain+Barrier+Disruption+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Calcium Modulation of Adherens and Tight Junction Function: A Potential Mechanism for Blood-Brain Barrier Disruption After Stroke.</a> Stroke. 33 (6), 1706-1711 (2002).</li>
<li>Gorodeski, G., Jin, W., Hopfer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca2%2B+directly+regulates+tight+junctional+permeability+in+the+human+cervical+cell+line+CaSki%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca2+ directly regulates tight junctional permeability in the human cervical cell line CaSki.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 272 (2), C511-C524 (1997).</li>
<li>Stuart, R. O., Sun, A., Panichas, M., Hebert, S. C., Brenner, B. M., Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Role+for+lntracellular+Calcium+in+Tight+Junction+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Critical Role for lntracellular Calcium in Tight Junction Biogenesis.</a> Journal of Cellular Physiology. 159, (1994).</li>
<li>Tobey, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. , (2004).</li>
<li>Tobey, N. A., Argote, C. M., Hosseini, S. S., Orlando, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-switch+technique+and+junctional+permeability+in+native+rabbit+esophageal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium-switch technique and junctional permeability in native rabbit esophageal epithelium.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 286, (2004).</li>
<li>Posimo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+assays+for+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viability assays for cells in culture.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (83), e50645(2014).</li>
<li>Cipolla, M. J., Crete, R., Vitullo, L., Rix, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+transport+as+a+mechanism+of+blood-brain+barrier+disruption+during+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Transcellular transport as a mechanism of blood-brain barrier disruption during stroke.</a> Frontiers in Bioscience. 9 (3), 777-785 (2004).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+surface+properties+on+nanoparticle-mediated+transport+of+drugs+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+nanoscience+and+nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Influence of the surface properties on nanoparticle-mediated transport of drugs to the brain.</a> Journal of nanoscience and nanotechnology. 4 (5), 484-488 (2004).</li>
<li>Markoutsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+permeability+studies+of+BBB-targeting+immunoliposomes+using+the+hCMEC%2FD3+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Uptake and permeability studies of BBB-targeting immunoliposomes using the hCMEC/D3 cell line.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (2), 265-274 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczową rolą bariery krew-mózg jest zapobieganie wymianie nieistotnych jonów i substancji toksycznych między krążeniem ogólnoustrojowym a mózgiem w celu utrzymania hemostazy mikrośrodowiska nerwowego. Jedną z charakterystycznych cech bariery krew-mózg jest zdolność komórek śródbłonka naczyń włosowatych do tworzenia ścisłych połączeń (TJ), które skutecznie uszczelniają parakomórkową drogę transportu. Zademonstrowaliśmy testaplikacji LY P jako metodę ilościową do określenia pozornej kinetyki tworzenia bariery T...

Bariera krew-mózg (BBB) jest barierą ochronną ograniczającą napływ składników osocza do tkanki mózgowej i składa się z komórek śródbłonka mózgu wraz z komórkami wspierającymi, takimi jak perycyty. Główną rolą BBB jest służenie jako bariera, która uszczelnia przestrzeń między krwią obwodową a ośrodkowym układem nerwowym (OUN) w celu utrzymania hemostazy mikrośrodowiska nerwowego neuronów1,2. Komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu skutecznie uszczelniają szlak parakomórkowy poprzez tworzenie międzykomórkowych połączeń ścisłych (TJ)1. Ta bariera ochronna umożliwia glukozie i wybranym składnikom odżywczym przedostanie się do mózgu, jednocześnie zapobiegając przechodzeniu większości jonów, substancji toksycznych i leków przez tę szczelną barierę. Oprócz roli ochronnej, naturalna funkcja barierowa bariery mózgowej (BBB) stanowi poważne wyzwanie w rozwoju systemów dostarczania leków ukierunkowanych na OUN.
Modele hodowli komórkowych BBB in vitro są pomocnymi narzędziami do badania jego biologii i zrozumienia wpływu leczenia farmakologicznego na integralność bariery TJ. Użyliśmy ludzkiej linii komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (hCMEC/D3) jako modelu in vitro, ponieważ jest to akceptowany model śródbłonka ludzkiego mózgu3 i podsumowuje wiele funkcji ludzkiego BBB. hCMEC/D3 jest jedną z najczęściej używanych linii komórkowych do modelowania BBB in vitro4,5,6,7,8,9. Pomimo stosunkowo niskich wartości przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER), miary szczelności bariery, ta linia komórkowa zachowuje większość właściwości morfologicznych i funkcjonalnych komórek śródbłonka mózgu, nawet jako monokultura przy braku kokulturowanych komórek glejowych6,7. Linia komórkowa hCMEC/D3 wykazuje ekspresję wielu markerów BBB, w tym aktywnych transporterów i receptorów, do około 35 pasażu bez poddawania dedyferencjacji do niestabilnych fenotypów6,7,9,10,11. Najbardziej uderzającą cechą linii komórkowej hCMEC/D3 jako modelu BBB in vitro jest jej zdolność do tworzenia TJs5,9,11,12. Należy zauważyć, że chociaż modele BBB pochodzące z komórek macierzystych wykazały wyższą przepuszczalność w wielu badaniach w porównaniu z linią komórkową hCMEC/D3 i wyrażają niektóre markery BBB, nie wyewoluowały jeszcze jako najpowszechniejszy model komórkowy BBB13. Co ważne, modele BBB pochodzące z komórek macierzystych muszą być scharakteryzowane pod kątem maksymalnej liczby pasaży, która pozwala komórkom utrzymać stabilne fenotypy BBB14.
Trzy podstawowe metody są powszechnie używane do określenia integralności bariery TJ, w tym pomiar TEER, pomiar współczynnika pozornej przepuszczalności (Papp) małych hydrofilowych cząsteczek znacznikowych, takich jak sacharoza, inulina, Lucyfer Yellow, itp. oraz barwienie immunologiczne znanych markerów molekularnych TJ, takich jak klaudyna-5, ZO-1, okludyna, itp.5. TEER jest stosunkowo prostą i ilościową metodą, która mierzy opór elektryczny w monowarstwach komórek hodowanych na porowatym podłożu membranowym5. Na wartości TEER mogą jednak mieć wpływ zmienne eksperymentalne, takie jak skład pożywki hodowlanej i rodzaj przyrządu pomiarowego. Prawdopodobna kombinacja tych czynników prowadzi do szerokiego rozkładu wartości TEER w zakresie od 2 do 1150 Ωcm2 w linii komórkowej hCMEC/D3 hodowanej przez 2-21 dni13. Barwienie immunologiczne to wizualna metoda określania obecności białek TJ poprzez znakowanie docelowego białka za pomocą przeciwciał. Jednak barwienie immunologiczne obejmuje szereg etapów eksperymentalnych, w tym konieczność naprawy/przepuszczalności komórek, co może skutkować artefaktami eksperymentalnymi, a sygnały fluorescencyjne mogą z czasem zanikać. Powyższe czynniki mogą prowadzić do subiektywnych błędów wpływających na jakość danych.
Głównym celem tej pracy jest przedstawienie opartego na LY testu pozornej przepuszczalności, określającego kinetykę konfluentnego tworzenia monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC/D3. Chociaż inne zaawansowane systemy BBB in vitro, takie jak systemy kohodowli, systemy mikroprzepływowe, są fizjologicznie bardziej odpowiednimi naśladowcami ze znacznie poprawioną funkcją bariery15,16,17, konfiguracja transwell hCMEC/D3 jest prostym i wiarygodnym modelem do oszacowania kinetyki powstawania TJ i szybkiego badania przesiewowego wpływu różnych preparatów leków na funkcję bariery. Ogólnie rzecz biorąc, wartościP app są spójne dla różnych substancji rozpuszczonych hydrofilowych w monowarstwach hCMEC/D3. Na przykład podane wartości Papp dla różnych substancji rozpuszczonych o niskiej masie cząsteczkowej (takich jak sacharoza, mannitol, LY itp.) w różnych modelach BBB in vitro są rzędu 10-4 cm/min5,18,19,20. W naszej konfiguracji eksperymentalnej komórki śródbłonka mózgu są umieszczane na pokrytej kolagenem mikroporowatej błonie w celu przyłączenia komórek i tworzenia monowarstwy, aby naśladować barierę in vivo. Oczekuje się, że LY dodany po stronie wierzchołkowej będzie przechodził przez ciasne połączenia międzykomórkowe i gromadził się po stronie podstawno-bocznej. Większe stężenia LY po stronie podstawno-bocznej wskazują na niedojrzałą, nie w pełni funkcjonalną barierę, podczas gdy niższe stężenia odzwierciedlają ograniczony transport ze względu na obecność funkcjonalnych TJ, co prowadzi do dojrzałej bariery.
LY jest hydrofilowym barwnikiem z wyraźnymi pikami wzbudzenia/emisji i pozwala uniknąć konieczności radioznakowania cząsteczek znacznikowych, takich jak sacharoza, mannitol czy inulina. W ten sposób wartości fluorescencji LY można wykorzystać do bezpośredniego obliczenia jego przepuszczalności parakomórkowej w monowarstwach BBB. Ponadto, w porównaniu z wieloma dostępnymi na rynku barwnikami stosowanymi w dziedzinach biomedycznych, które cierpią z powodu małych przesunięć Stokesa, takich jak fluoresceina21, przesunięcie Stokesa LY wynosi około 108 nm przy wystarczającej separacji widmowej, co pozwala na uzyskanie danych o fluorescencji LY jako solidny odczyt w celu określenia przepuszczalności parakomórkowej. Zastosowaliśmy Western blotting jako technikę ortogonalną, aby zademonstrować zmiany w ekspresji białka markerowego połączenia ścisłego, ZO-1, w czasie hodowli. Ekspresja ZO-1 wykryta za pomocą Western blotting jest wykorzystywana do uzupełnienia danychaplikacji LY P i w połączeniu dane te sugerują, że obserwowane zmiany wartościaplikacji LY P odzwierciedlają tworzenie się monowarstwy ze stopniowym wzrostem ekspresji markera połączenia ścisłego, ZO-1.
Jak wspomniano wcześniej, głównym celem tej pracy jest zademonstrowanie testu LY jako prostej techniki monitorowania tworzenia się zlewającej się monowarstwy z funkcjonalnymi ścisłymi połączeniami. Jednak, aby zademonstrować dodatkową użyteczność opracowanego testu, zmierzyliśmyaplikację LY P w monowarstwach hCMEC/D3 transfekowanych nanocząstkami DNA. Kwasy nukleinowe mogą być kondensowane do nanocząstek polielektrolitu o średnicy 100-200 nm poprzez oddziaływanie elektrostatyczne między dodatnio naładowanymi grupami polimerów a ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi kwasów nukleinowych22,23. W naszej pracy nazywamy te kompleksy nanocząstkami DNA (NP DNA). Chociaż naszym zamiarem jest transfekcja komórek i ekspresja pożądanego białka, musimy zapewnić, że właściwości barierowe monowarstw hCMEC/D3 nie zostaną naruszone. Nasze dane sugerują, że standardowy 4-godzinny reżim transfekcji genu lucyferazy nie zmienia mierzalnie przepuszczalności LY, co pokazuje użyteczność testuaplikacji LY P do określania zmian w integralności bariery TJ.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa hCMEC/D3</td><td>Cedarlane Laboratories</td><td>102114.3C-P25</td><td>ludzka linia komórkowa śródbłonka mikronaczyniowego mózgu&nbsp;</td></tr><tr><td>gWizLuc</td><td>Aldevron&nbsp;</td><td>5000-5001</td><td>Plazmidowe DNA kodujące gen lucyferazy</td></tr><tr><td>lucyfer żółty CH sól dilitu&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>155267</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki Transwell z membranami trawionymi z politereftalanu etylenu (PET)</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowy płaski dno&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Czarne 96-dołkowe płytki immunologiczne&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>437111</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM 1X</td><td>Gibco</td><td>1951695</td><td>Spinner-minimum niezbędne podłoże (S-MEM)</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Clonetics</td><td>CC-3156</td><td>Podłoże podstawne komórek śródbłonka-2(EBM-2)&nbsp;</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1X</td><td>Hyklon</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I&nbsp;</td><td>Laboratorium odkrywcze, Inc.</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do lizy hodowli komórkowych 5X&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferyna chrząszcza, sól potasowa&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3&nbsp;</td>Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne ZO-1&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>61-7300</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-GAPDH</td><td>abcam</td><td>ab8245</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor680-sprzężony AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>128817</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowy, płaskodenny</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RIPA (5X)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62524</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2503-10</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>do skanowania błon Western blot</td></tr></tbody></table>

lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Bariera krew-mózg BBB składa się z komórek śródbłonka, które tworzą barierę między krążeniem ogólnoustrojowym a mózgiem, aby zapobiec wymianie nieistotnych jonów i substancji toksycznych. Połączenia ścisłe (TJ) skutecznie uszczelniają przestrzeń parakomórkową w monowarstwach, tworząc nienaruszoną barierę. W tym badaniu opisano test fluorescencji oparty na LY, który może być wykorzystany do określenia jego współczynnika przenikalności pozornej (Papp), a z kolei może być wykorzystany do określenia kinetyki powstawania zlewających się monowarstw i wynikającej z tego integralności bariery ciasnego połączenia w monowarstwach hCMEC / D3. Ponadto wykazujemy dodatkową użyteczność tego testu do określania integralności funkcjonalnej TJ w transfekowanych komórkach. Nasze dane z testuaplikacji LY P pokazują, że komórki hCMEC / D3 wysiane w układzie transwell skutecznie ograniczają transport parakomórkowy LY 7 dni po hodowli. Jako dodatkową użyteczność prezentowanego testu wykazaliśmy również, że transfekcja nanocząstek DNA nie zmienia transportu parakomórkowego LY w monowarstwach hCMEC/D3.

W pierwszej kolejności określono wpływ czasu hodowli na przepuszczalność LY, aby zbadać pozorną kinetykę tworzenia się TJ. Średnie wartości Papp dla LY od 1. do 10. dnia po wysiewaniu przedstawiono na Ryc. 2a. W 1. dniu średnia wartość Papp wynosiła 4,25 x 10-4 cm/min i nieznacznie spadła do 3,32 x 10-4 cm/min w 2. dniu. Średnia wartość Papp lekko wzrosła do 3,93 x 10-4 cm/min w 3. dniu i ulega...

Prezentujemy test fluorescencyjny, aby wykazać, że Lucyfer Żółty (LY) jest solidnym markerem do określenia pozornej przepuszczalności parakomórkowej monowarstw komórek hCMEC/D3, modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Użyliśmy tego testu do określenia kinetyki konfluentnego tworzenia się monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC / D3.

Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Protokół ten jest solidną techniką określania funkcjonalnej integralności ścisłych połączeń międzykomórkowych w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg. Jest to prosty i dość niedrogi protokół, który pozwala obliczyć pozorną przepuszczalność w krótszym czasie zamiast przeprowadzać dłuższy test kinetyczny. Metoda ta może być również stosowana do określania integralności funkcjonalnej połączeń ścisłych w komórkach śródbłonka mózgu transfekowanych nanocząstkami polimerowego DNA.Aby rozpocząć posiewanie komórek, umieść wkładki do hodowli tkankowych z mikroporowatymi błonami w 24-dołkowej płytce hodowlanej. Dodaj 400 mikrolitrów kolagenu typu 1 o grubości 0,15 miligrama na mililitr do każdej wkładki do hodowli tkankowej. Następnie inkubuj przez godzinę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Delikatnie kołysz 24-dołkową płytką, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie roztworu kolagenu po mikroporowatej błonie we wkładkach do hodowli tkankowych. Po godzinie usuń roztwór kolagenu i delikatnie przemyj mikroporowatą błonę 0,4 mililitra buforu 1X PBS. Teraz umieść komórki hCMEC / D3 o gęstości 50 000 komórek na centymetr kwadratowy we wstawkach komórek.Umieścić 24-dołkową płytkę z zestawem do hodowli tkankowej w inkubatorze, aby umożliwić przyczepienie i proliferację komórek. Inkubuj płytkę przez siedem dni, aby komórki osiągnęły 100% zbieżności. Usuwaj pożywkę wzrostową co drugi dzień i przenieś 0,5 mililitra wstępnie podgrzanej świeżej pożywki do wkładek do kultur tkankowych.Powtórz procedurę posiewu dla Western blot w celu określenia zmian w ekspresji ZO-1 dla transfekcji nanocząstek DNA oraz dla testu ATP w celu określenia żywotności komórek w transfekowanych komórkach. W celu określenia pozornej przepuszczalności Lucifer Yellow, każdego dnia po wysiewie usuń pożywkę wzrostową i dodaj 1,5 mililitra wstępnie podgrzanego buforu transportowego do podstawno-bocznej strony studzienki. Teraz dodaj 58,3 mikrolitra 20-mikromolowego roztworu Lucifer Yellow do wierzchołkowej strony każdej wkładki trans-well.Zaoszczędź 50 mikrolitrów roztworu do pomiarów fluorescencji. Po całkowitym usunięciu resztkowego buforu PBS od strony wierzchołkowej, dodaj roztwór Lucifer Yellow tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć wysuszenia komórek. Upewnij się, że dokładne objętości roztworu Lucifer Yellow znajdują się po stronie wierzchołkowej.Upewnij się, że dodałeś taką samą i dokładną objętość roztworu Lucifer Yellow we wszystkich wkładkach. Pracuj szybko, aby uniknąć wysuszenia komórek. Inkubować komórki w wytrząsarce z obrotową płytką przy 100 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez 60 minut.Następnie usuń 30 mikrolitrów próbki Lucifer Yellow z każdej komory wierzchołkowej. Przenieś 20-mikromolowy roztwór Lucifer Yellow i wierzchołkowe próbki boczne do wstępnie znakowanych probówek. Teraz rozcieńczyć próbkę dziesięciokrotnie za pomocą buforu transportowego.Usunąć 500 mikrolitrów z każdej komory podstawno-bocznej i przenieść próbkę do wstępnie oznakowanych probówek. Przygotuj serię wzorców Lucyfera Żółtego dla krzywej standardowej. Dodać 100 mikrolitrów każdej wzorcowej próbki wierzchołkowej i podstawno-bocznej do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach.Użyj czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, aby zmierzyć intensywność fluorescencji Lucyfera Yellow i obliczyć pozorną przepuszczalność, zgodnie z opisem w tekście rękopisu. Wpływ czasu hodowli na przepuszczalność żółcieni lucyfera wykorzystano do określenia pozornej kinetyki tworzenia się ciasnych połączeń. Pozorne wartości przepuszczalności znacznie spadły siódmego dnia w porównaniu z pierwszym dniem, co sugeruje, że bariera stała się ciaśniejsza.Pozorne wartości przepuszczalności ustabilizowały się następnie do 10 dnia. Sugerowało to, że tworzenie bariery było kompletne i funkcjonalne, co skutkowało zmniejszonym transportem parakomórkowym Lucyfera Żółtego. Western blot zastosowano do wykrycia zmian w ekspresji białka ścisłego połączenia ZO-1 w czasie.Te dwa pasma reprezentują dwie izoformy ZO-1. Analiza densytometryczna wykazała, że wartość pikseli ZO-1 wzrosła od trzeciego do siódmego dnia po wysiewie, co sugeruje, że białko ścisłego połączenia ZO-1 tworzyło się nieprzerwanie od trzeciego do siódmego dnia. Po leczeniu niedoborem wapnia w siódmym dniu po wysiewie, prążek ZO-1 był prawie niewykrywalny, co wskazuje, że ZO-1 nie był w stanie się uformować przy braku jonów wapnia.Jak wykazano w wynikach, Western blot białka ZO-1 można przeprowadzić w celu określenia zmian w poziomie ekspresji białek o ścisłym połączeniu, uzupełniając dane dotyczące aktywności funkcjonalnej oparte na Lucifer Yellow. Odkryliśmy również, że transfekcja nanocząstek DNA nie miała wpływu na aktywność funkcjonalną połączeń ścisłych w komórkach śródbłonka ludzkiego mózgu.

lucifer-yellow-robust-paracellular-permeability-marker-cell-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Obecny protokół przedstawia metodę, która wykorzystuje żółć lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym do określenia przepuszczalności jelit. Metodę tę można zastosować do określenia przepuszczalności parakomórkowej w enteroidach, które modelują choroby zapalne jelit, takie jak martwicze zapalenie jelit.

Określanie przepuszczalności jelit za pomocą żółcieni Lucyfera w modelu enteroidalnym wierzchołkowym

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Odkryj metodę oceny integralności szczelin ścisłych w modelu ludzkiej bariery krew-mózg z wykorzystaniem Lucifer Yellow. Szybki test fluorescencyjny pozwala obliczyć współczynnik przepuszczalności Papp w komórkach hCMEC/D3.

Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów