Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

Protokół ten jest solidną techniką określania funkcjonalnej integralności ścisłych połączeń międzykomórkowych w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg. Jest to prosty i dość niedrogi protokół, który pozwala obliczyć pozorną przepuszczalność w krótszym czasie zamiast przeprowadzać dłuższy test kinetyczny. Metoda ta może być również stosowana do określania integralności funkcjonalnej połączeń ścisłych w komórkach śródbłonka mózgu transfekowanych nanocząstkami polimerowego DNA.

Aby rozpocząć posiewanie komórek, umieść wkładki do hodowli tkankowych z mikroporowatymi błonami w 24-dołkowej płytce hodowlanej. Dodaj 400 mikrolitrów kolagenu typu 1 o grubości 0,15 miligrama na mililitr do każdej wkładki do hodowli tkankowej. Następnie inkubuj przez godzinę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Delikatnie kołysz 24-dołkową płytką, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie roztworu kolagenu po mikroporowatej błonie we wkładkach do hodowli tkankowych. Po godzinie usuń roztwór kolagenu i delikatnie przemyj mikroporowatą błonę 0,4 mililitra buforu 1X PBS. Teraz umieść komórki hCMEC / D3 o gęstości 50 000 komórek na centymetr kwadratowy we wstawkach komórek.

Umieścić 24-dołkową płytkę z zestawem do hodowli tkankowej w inkubatorze, aby umożliwić przyczepienie i proliferację komórek. Inkubuj płytkę przez siedem dni, aby komórki osiągnęły 100% zbieżności. Usuwaj pożywkę wzrostową co drugi dzień i przenieś 0,5 mililitra wstępnie podgrzanej świeżej pożywki do wkładek do kultur tkankowych.

Powtórz procedurę posiewu dla Western blot w celu określenia zmian w ekspresji ZO-1 dla transfekcji nanocząstek DNA oraz dla testu ATP w celu określenia żywotności komórek w transfekowanych komórkach. W celu określenia pozornej przepuszczalności Lucifer Yellow, każdego dnia po wysiewie usuń pożywkę wzrostową i dodaj 1,5 mililitra wstępnie podgrzanego buforu transportowego do podstawno-bocznej strony studzienki. Teraz dodaj 58,3 mikrolitra 20-mikromolowego roztworu Lucifer Yellow do wierzchołkowej strony każdej wkładki trans-well.

Zaoszczędź 50 mikrolitrów roztworu do pomiarów fluorescencji. Po całkowitym usunięciu resztkowego buforu PBS od strony wierzchołkowej, dodaj roztwór Lucifer Yellow tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć wysuszenia komórek. Upewnij się, że dokładne objętości roztworu Lucifer Yellow znajdują się po stronie wierzchołkowej.

Upewnij się, że dodałeś taką samą i dokładną objętość roztworu Lucifer Yellow we wszystkich wkładkach. Pracuj szybko, aby uniknąć wysuszenia komórek. Inkubować komórki w wytrząsarce z obrotową płytką przy 100 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez 60 minut.

Następnie usuń 30 mikrolitrów próbki Lucifer Yellow z każdej komory wierzchołkowej. Przenieś 20-mikromolowy roztwór Lucifer Yellow i wierzchołkowe próbki boczne do wstępnie znakowanych probówek. Teraz rozcieńczyć próbkę dziesięciokrotnie za pomocą buforu transportowego.

Usunąć 500 mikrolitrów z każdej komory podstawno-bocznej i przenieść próbkę do wstępnie oznakowanych probówek. Przygotuj serię wzorców Lucyfera Żółtego dla krzywej standardowej. Dodać 100 mikrolitrów każdej wzorcowej próbki wierzchołkowej i podstawno-bocznej do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki w dwóch egzemplarzach.

Użyj czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, aby zmierzyć intensywność fluorescencji Lucyfera Yellow i obliczyć pozorną przepuszczalność, zgodnie z opisem w tekście rękopisu. Wpływ czasu hodowli na przepuszczalność żółcieni lucyfera wykorzystano do określenia pozornej kinetyki tworzenia się ciasnych połączeń. Pozorne wartości przepuszczalności znacznie spadły siódmego dnia w porównaniu z pierwszym dniem, co sugeruje, że bariera stała się ciaśniejsza.

Pozorne wartości przepuszczalności ustabilizowały się następnie do 10 dnia. Sugerowało to, że tworzenie bariery było kompletne i funkcjonalne, co skutkowało zmniejszonym transportem parakomórkowym Lucyfera Żółtego. Western blot zastosowano do wykrycia zmian w ekspresji białka ścisłego połączenia ZO-1 w czasie.

Te dwa pasma reprezentują dwie izoformy ZO-1. Analiza densytometryczna wykazała, że wartość pikseli ZO-1 wzrosła od trzeciego do siódmego dnia po wysiewie, co sugeruje, że białko ścisłego połączenia ZO-1 tworzyło się nieprzerwanie od trzeciego do siódmego dnia. Po leczeniu niedoborem wapnia w siódmym dniu po wysiewie, prążek ZO-1 był prawie niewykrywalny, co wskazuje, że ZO-1 nie był w stanie się uformować przy braku jonów wapnia.

Jak wykazano w wynikach, Western blot białka ZO-1 można przeprowadzić w celu określenia zmian w poziomie ekspresji białek o ścisłym połączeniu, uzupełniając dane dotyczące aktywności funkcjonalnej oparte na Lucifer Yellow. Odkryliśmy również, że transfekcja nanocząstek DNA nie miała wpływu na aktywność funkcjonalną połączeń ścisłych w komórkach śródbłonka ludzkiego mózgu.