Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych

Protokół ten opisuje technikę platformy do izolowania komórek śródbłonka mikronaczyniowego z mięśni szkieletowych. Komórki te można wykorzystać na przykład do uzyskania dalszych informacji na temat funkcji bariery mięśniowej krwi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że możliwe jest wyizolowanie pierwotnych komórek śródbłonka mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Technika ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób mięśni o podłożu immunologicznym, takich jak interakcja między komórkami mięśniowymi i śródbłonka w zdrowiu i chorobie. Najpierw przygotuj wszystkie potrzebne roztwory i płytki sześciodołkowe zgodnie z opisem w protokole. Aby rozpocząć praktyczną procedurę, zaopatrz się w parę ostrych/nożyczek chirurgicznych, parę ostrych/ostrych nożyczek chirurgicznych oraz proste i zakrzywione kleszcze.

Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem. Umieść uśpionego dorosłego samca myszy na grzbiecie i zwilż nogi 70% etanolem. Za pomocą ostrych/nożyczek chirurgicznych odetnij każdą nogę, przecinając staw biodrowy.

Umieść kończyny w naczyniu do hodowli komórek zamkniętych. Przenieś naczynie do sterylnego okapu z przepływem laminarnym. Użyj ostrych nożyczek i zakrzywionych kleszczy, aby przeciąć skórę od biodra do czubka palca.

Użyj prostych kleszczy, aby przytrzymać palec u nogi lub podkładkę pod stopę, podczas gdy zakrzywionych kleszczy odklej skórę od palca u nogi do biodra. Aby wyizolować mięsień czworogłowy uda, przetnij ścięgno od kolana i przetnij mięsień wzdłuż kości udowej do biodra. Przeciąć ścięgno Achillesa, aby odizolować mięśnie trójgłowe mięśnia dwugłowego.

Następnie przetnij wzdłuż kości piszczelowej do dołu podkolanowego i usuń mięsień. Aby usunąć ścięgna, których nie można rozdzielić, przytrzymaj mięśnie zakrzywionymi kleszczami i odetnij każde odpowiednie ścięgno. Dodaj 2 445 mikrolitrów przygotowanego roztworu do wytrawiania do świeżego, oznakowanego naczynia do hodowli komórkowych i określ wagę.

Przełóż wszystkie kawałki mięśni do tego naczynia. Następnie określ wagę. Różnica obu zmierzonych wartości zapewnia suchą masę tkanki mięśniowej, która nie może przekraczać jednego grama.

Za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych pokrój całą tkankę mięśniową na małe kawałki. Zawiesinę tkankową inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 1,5 godziny, upewniając się, że zawiesinę dokładnie mieszasz z jednomililitrową strzykawką insulinową co 20 minut przez około pięć minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę do nylonowego sitka o średnicy 70 mikrometrów umieszczonego na 50-mililitrowej rurki z etykietą i zebrać przepływ.

Umyj sitko komórkowe ośmioma mililitrami DMEM i zbierz przepływ. Jeśli kawałki zatykają sitko, ponownie zawiesić zdysocjowany roztwór. Wyrzuć sitko do komórek i odwiruj zawiesinę przy 300-krotności grawitacji i w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w jednym mililitrze buforu lizującego chlorek amonu potasu w celu lizy czerwonych krwinek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund. Następnie dodaj dziewięć mililitrów DMEM zawierających 10% FCS, aby zatrzymać reakcję.

Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Następnie użyj komory do liczenia komórek Neubauera, aby określić liczbę komórek. Aby rozpocząć wyczerpywanie się komórek CD45-dodatnich, odwiruj zawiesinę pod ciśnieniem 300-krotności grawitacji i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 90 mikrolitrach buforu MCS. Dodaj 10 mikrolitrów mikrogranulek CD45 i wymieszaj zawiesinę. Inkubować w lodówce w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza przez 15 minut.

Następnie dodaj jeden mililitr buforu MCS. Wirować przy 300-krotności grawitacji i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu MCS.

Umieść dużą kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym separatora. Przepłukać zbiornik kolumny trzema mililitrami buforu MCS. Następnie umieść 15-mililitrową stożkową rurkę pod kolumną, aby zebrać przepływ.

Nałóż całą zawiesinę komórkową na kolumnę i pozwól jej całkowicie przepłynąć. Przemyć kolumnę trzy razy, dodając trzy mililitry buforu MCS do zbiornika na każdy etap płukania i czekając, aż zbiornik kolumny będzie pusty przed rozpoczęciem następnego etapu mycia. Zebrać nieoznakowane komórki przechodzące przez kolumnę w celu wykorzystania w dalszych etapach rozdzielania.

Aby rozpocząć akumulację komórek CD31-dodatnich, użyj komory do zliczania komórek Neubauera w celu określenia liczby komórek. Następnie odwiruj nieoznakowane komórki pod 300-krotnością grawitacji i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 90 mikrolitrach buforu MCS.

Dodaj 10 mikrolitrów mikrogranulek CD31 i wymieszaj całą zawiesinę. Inkubować w lodówce w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj jeden mililitr buforu MCS i odwiruj przy 300-krotności grawitacji i w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu MCS. Umieść średnią kolumnę magnetyczną w polu magnetycznym separatora. Przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu MCS.

Następnie umieść 15-mililitrową stożkową rurkę pod kolumną, aby zebrać przepływ. Nałóż całą zawiesinę komórek na kolumnę i pozwól jej całkowicie przepłynąć. Umyj kolumnę trzy razy, dodając 500 mikrolitrów buforu MCS do zbiornika na każdy etap płukania i poczekaj, aż zbiornik kolumny będzie pusty przed rozpoczęciem następnego etapu mycia.

Nieoznakowane komórki przechodzące przez kolumnę reprezentują frakcję CD45-ujemną, CD31-ujemną. Przechowuj je do dalszych kontroli jakości. Następnie wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej.

Odpipetować dwa mililitry buforu MCS na kolumnę. Natychmiast wepchnij tłok do kolumny, aby przepłukać komórki znakowane magnetycznie. Ta frakcja CD45-ujemna, CD31-dodatnia reprezentuje wzbogacone pierwotne mysie EC EC.

Odwirować zawiesinę komórek przy 350-krotności grawitacji i w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pięć minut. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki komórek śródbłonka. Przenieść komórki do pojedynczego dołka powlekanej sześciodołkowej płytki hodowlanej zawierającej jeden mililitr pożywki z komórek śródbłonka.

Do hodowli inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w sterylnym inkubatorze, pamiętając o odświeżaniu podłoża co dwa do trzech dni. Gdy komórki osiągną zbieżność od 80 do 90%, przepłucz każdą studzienkę zawierającą komórki dwukrotnie dwoma mililitrami PBS w dwóch kolejnych etapach mycia. Następnie dodaj 800 mikrolitrów roztworu trypsyny EDTA do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w sterylnym inkubatorze przez trzy do pięciu minut.

Następnie dodaj 1 200 mikrolitrów DMEM zawierających co najmniej 10% FCS, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną. Wirować przy 350-krotności grawitacji i w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zgromadź komórki CD31 zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zwiększyć czystość.

Użyj mikroskopu konstrukcyjnego jasnego pola lub standardowego mikroskopu fazowego z 20% powiększeniem i aperturą numeryczną 0,35 soczewki, aby obserwować zbieg komórek. W tym badaniu izoluje się pierwotne mysie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mięśni szkieletowych. Jednego dnia po izolacji pierwotne mysie MMEC i pozostałe inne komórki tworzą konglomeraty i przylegają do dna szalek hodowlanych.

Od siódmego dnia można zaobserwować płaskie i wydłużone komórki, jednak nadal widoczne jest zanieczyszczenie innych, głównie sferoidalnych komórek. W związku z tym wymagany jest kolejny cykl selekcji CD31-dodatniej za pomocą MCS. Następnie pierwotne mysie MMEC rozmnażają się do gęstości około 80 do 90% Po konfluencji zwykle tworzą nienakładającą się monowarstwę podłużnie wyrównanych komórek.

Proliferacja zatrzymuje się po konfluencji z powodu zahamowania kontaktu. Kontrola jakości za pomocą cytometrii przepływowej pokazuje wartości zarówno żywotności, jak i czystości w zakresie około 70% dla komórek bezpośrednio po izolacji. Komórki hodowane po kolejnej selekcji CD31-dodatniej za pomocą MCS wykazują zadowalające wartości czystości, a także żywotności, sięgające 95% każda.

Uzyskane komórki są następnie badane pod kątem ekspresji genów markera komórek satelity mięśniowego, sparowanych genów białka pudełkowego 7 i M-kadheryny na poziomie mRNA za pomocą ilościowej reakcji PCR. Zgodnie z oczekiwaniami, tylko frakcja CD45-ujemna, CD31-ujemna, a także zróżnicowane pierwotne mysie komórki mięśniowe wykazywały ekspresję białka pudełkowego 7 i M-kadheryny, podczas gdy CD45-ujemne, CD31-dodatnie i pierwotne mysie MMEC są ujemne dla tych markerów. Po drugim etapie CD31 MCS, qPCR stosuje się do oceny ekspresji białek ścisłego połączenia w zbiegających się pierwotnych mysich MMEC.

Obserwuje się, że pierwotne mysie MMEC wyrażają wysokie poziomy klaudyny-5, okludyny i zonuli occludens-1, podczas gdy pmMC wykazują tylko niską ekspresję zonula occludens-1. Tę technikę można wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin. Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić inne metody, takie jak testy migracji lub eksperymenty z naprężeniami przy niskim ścinaniu, aby uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego z mięśni szkieletowych poprzez mechaniczną i enzymatyczną dysocjację oraz magnetyczne sortowanie komórek.