Name: Badania szybkościomierzy obrazu cząstek w mezoskali, przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metody szybkościomierzy obrazu cząstek PIV w neurofantomach PDMS do badań przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro. Technika umożliwia charakterystykę hemodynamiki z wykorzystaniem standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają częściowe wsparcie dla tego projektu udzielone przez Collaborative Seed Grant z Biura Badań i Rozwoju Gospodarczego na UC Riverside.

1. Produkcja form ofiarnych na bazie ABS
<ol>
	<li>Zaprojektuj odwrotny model pożądanego fantomu tkankowego za pomocą oprogramowania CAD.</li>
	<li>Wydrukuj model za pomocą drukarki 3D z ABS jako materiałem budowlanym.</li>
</ol>
2. Fabrykacja fantomów naczyniowych oparta na PDMS
<ol>
	<li>mieszanie
	<ol>
		<li>Wymieszać bazę prepolimerową PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1; mieszanina 66 g zapewnia wystarczającą ilość materiału do wytwarzania fantomów o objętości do 50 cm3.</li>
		<li>Umieść mieszaninę w eksykatorze próżniowym na 60 minut w celu odgazowania i zminimalizowania uwięzienia pęcherzyków. Stosuj cykliczne zwiększanie ciśnienia/obniżanie ciśnienia, aby ułatwić pękanie pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>casting
	<ol>
		<li>Zamontuj wydrukowaną formę ABS na szklanym szkiełku za pomocą szpachli formierskiej, aby uszczelnić interfejs.</li>
		<li>Ostrożnie wlej mieszaninę PDMS do formy, starając się zminimalizować uwięzienie pęcherzyków. Utrzymujące się bąbelki można ręcznie rozbić za pomocą igły.</li>
		<li>Utwardzić odlewany fantom w temperaturze pokojowej (25 °C) przez co najmniej 24 godziny 
		UWAGA: W wyższych temperaturach proces ten można przyspieszyć22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmowanie z formy
	<ol>
		<li>Rozpuścić ABS zanurzając fantom w acetonie i dokonując sonikacji przez co najmniej 15 minut, używając mocy do 70 W. 
		UWAGA: Aceton ma wysoką prężność par w temperaturze pokojowej i niską temperaturę zapłonu. W związku z tym zawsze pracuj pod wyciągiem i z dala od potencjalnych źródeł zapłonu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (np. gogle lub osłonę twarzy, fartuch laboratoryjny, rękawice odporne na aceton).</li>
		<li>Dokładnie spłucz fantom alkoholem izopropylowym, a następnie wodą demineralizowaną, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. 
		UWAGA: PDMS pęcznieje pod wpływem acetonu; Jednak pęcznienie ustępuje, gdy fantom zostanie wystarczająco wypłukany i wysuszony23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie wierności fantomowej za pomocą mikroskopii optycznej
	<ol>
		<li>Korzystając z mikroskopu optycznego z dołączoną kamerą i oprogramowaniem do przechwytywania obrazu, uchwyć obraz krytycznej cechy fantomu pod powiększeniem, które maksymalizuje tę cechę w polu widzenia.</li>
		<li>Zrób obraz odpowiedniej siatki kalibracyjnej przy tym samym powiększeniu.</li>
		<li>Załaduj oba obrazy do ImageJ, przeciągając je na pasek narzędzi.</li>
		<li>Kliknij obraz siatki kalibracyjnej, aby ją uaktywnić, a następnie wybierz narzędzie Linia. Za pomocą myszy narysuj linię wzdłuż obiektu o znanej odległości i wybierz opcję Analizuj > Ustaw skalę z menu ImageJ. 
		UWAGA: W oknie >Ustaw skalę pole oznaczone jako Odległość w pikselach powinno być wstępnie wypełnione długością narysowanej linii w jednostkach pikseli.</li>
		<li>Wprowadź długość obiektu w polu oznaczonym etykietą Znana odległość, a jego jednostkę w polu oznaczonym etykietą Jednostka długości. Zaznacz pole wyboru Globalne, aby zastosować ten współczynnik kalibracji do wszystkich otwartych obrazów.</li>
		<li>Uaktywnij obraz obiektu krytycznego fantomu i użyj narzędzia Linia, aby narysować linię wzdłuż interesującego obiektu. Z menu ImageJ wybierz Analizuj > Zmierz (lub naciśnij Ctrl + M), aby zmierzyć długość linii.</li>
		<li>Porównaj oczekiwaną wartość z wartością w kolumnie oznaczonej jako Długość w oknie Wyniki, aby potwierdzić wierność fantomową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Preparat roztworu do symulacji krwi
<ol>
	<li>Wymieszaj wodę DI i glicerol w stosunku 60:40 (objętościowo). 
	UWAGA: Objętość 100 ml jest wystarczająca dla opisanego tutaj układu krążenia in vitro.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 2,5% w/v fluorescencyjnego roztworu kulek polistyrenowego (tj. cząstek znacznikowych) do imitowanego roztworu krwi.</li>
	<li>Homogenizować mieszaninę na mieszadle magnetycznym przy 400 obr./min przez 10 min.</li>
</ol>
4. Konfiguracja układu krążenia in vitro
<ol>
	<li>Konfiguracja pompy
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia do ściągania izolacji, aby odciąć wtyczkę końca DC od źródła zasilania zasilacza AC-DC.</li>
		<li>Zdejmij powłokę z przewodów zasilających i uziemiających i podłącz je do zacisku wejściowego regulatora napięcia modulacji szerokości impulsu (PWM).</li>
		<li>Podłącz przewody zasilające i uziemiające z silnika prądu stałego pompy do zacisku wyjściowego regulatora napięcia PWM. 
		UWAGA: Siedmiosegmentowy wyświetlacz PWM wyprowadza cykl pracy (0% - 100%) używany do uzyskania zmiennego napięcia do silnika prądu stałego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja pompy
	<ol>
		<li>Przygotować 200 ml imitowanego roztworu krwi (patrz punkt 3).</li>
		<li>Umieścić rurkę od wlotu pompy do zlewki zawierającej imitację roztworu krwi.</li>
		<li>Umieścić rurkę od wylotu pompy do pustej zlewki.</li>
		<li>Wybierz żądaną nastawę cyklu pracy (0% - 100%). Naciśnij przycisk Włącz i uruchom minutnik.</li>
		<li>Zatrzymaj stoper, gdy pompa przeniesie całą objętość imitowanego roztworu krwi. Wykorzystaj ten czas do obliczenia objętościowego natężenia przepływu.</li>
		<li>Powtórz kroki 4.2.1 - 4.2.5 dla co najmniej pięciu różnych nastaw cyklu pracy, aby wyznaczyć krzywą regresji metodą najmniejszych kwadratów. 
		UWAGA: Zalecane są co najmniej trzy punkty kontrprób na nastawę cyklu pracy. Zależność tę można wykorzystać do skorelowania pożądanego natężenia przepływu z wymaganym cyklem pracy PWM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kolekcja filmów
<ol>
	<li>Kalibracja obrazu
	<ol>
		<li>Określ współczynnik kalibracji dla obrazowania wideo (patrz rozdział 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie aparatury
	<ol>
		<li>Umieść fantom PDMS na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Podłącz fantom do pompy zębatej i wprowadź imitację roztworu krwi. 
		UWAGA: Opcjonalnie wstępnie napełnij model etanolem, aby ułatwić pełne zwilżenie; Następnie przepłucz i napełnij go sztucznym roztworem krwi. Może to być szczególnie korzystne w przypadku modeli z mniejszymi naczyniami i/lub ślepymi elementami.</li>
		<li>Ustawić sterownik silnika pompy dla żądanego natężenia przepływu w oparciu o krzywą kalibracji pompy.</li>
		<li>Uruchom pompę na 1 - 5 minut przed eksperymentem, aby zapewnić warunki w stanie ustalonym.</li>
		<li>Włącz zewnętrzną lampę, aby oświetlić pole widzenia. Wybierz odpowiedni filtr na podstawie długości fali wzbudzenia koralików fluorescencyjnych.</li>
		<li>Dostosuj płaszczyznę ogniskowej obrazowania do płaszczyzny środkowej naczynia. 
		UWAGA: Można to osiągnąć poprzez zastosowanie ogniskowej, która maksymalizuje obrazowany przekrój naczynia (np. w przypadku korzystania z fantomów o okrągłych przekrojach naczyń); i/lub indeksowanie funkcji fantomowej zaprojektowanej w celu ułatwienia identyfikacji statku w środku płaszczyzny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywanie wideo
	<ol>
		<li>Wybierz parametry nagrywania wideo, aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu (SNR). Kluczowe parametry to czas ekspozycji, liczba klatek na sekundę i wzmocnienie. 
		UWAGA: W tym protokole używamy liczby klatek na sekundę 2,000 kl./s i wzmocnienia 1.0. Parametry te mogą się jednak różnić w zależności od aplikacji (więcej informacji można znaleźć w sekcji dyskusji).</li>
		<li>Zbierz wideo i zapisz je w formacie AVI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie fantomowe
	<ol>
		<li>Jeśli po eksperymencie zaobserwuje się przywieranie koralików, poddaj fantom sonikacji w wodnym roztworze detergentu o mocy do 70 W.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazów i analiza danych
<ol>
	<li>Wstępne przetwarzanie obrazu
	<ol>
		<li>Przeciągnij zapisany plik AVI do okna ImageJ, aby go zaimportować. Zaznacz pole Konwertuj na skalę szarości.</li>
		<li>Z menu ImageJ wybierz opcję Analizuj > Generuj histogram (lub naciśnij Ctrl + H), aby wygenerować histogram intensywności pikseli obrazu. Zwróć uwagę na średnią i odchylenie standardowe dla nieprzetworzonego obrazu. 
		UWAGA: Przy dużej liczbie klatek na sekundę nie jest niczym niezwykłym, że rozkład jest mocno nachylony w kierunku zera (tj. brak sygnału).</li>
		<li>Z menu ImageJ wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność i Kontrast (lub naciśnij Shift + Ctrl + H), aby zastosować filtr jasności/kontrastu.</li>
		<li>W menu Jasność i kontrast naciśnij przycisk Set, aby zdefiniować limity obrazu. Ustaw wartość minimalną jako wartość średnią plus jedno odchylenie standardowe, a wartość maksymalną jako maksymalną intensywność obrazu (obie na podstawie statystyk uzyskanych w kroku 6.1.2). 
		UWAGA: Zazwyczaj eliminuje to wszystkie intensywności pikseli z wyjątkiem górnych 10%. Liczba odchyleń standardowych może być zróżnicowana w zależności od pożądanego rozkładu intensywności pikseli. Niestandardowy skrypt makra do wykonywania operacji ograniczania intensywności znajduje się w materiałach dodatkowych.</li>
		<li>Z menu ImageJ wybierz opcję Process > Noise > Despeckle (Przetwarzaj szum usuwaj plamki), aby zmniejszyć liczbę nasyconych pikseli. 
		UWAGA: Ta operacja jest wymuszona ze względu na zwiększony potencjał nasycenia pikseli, który pojawia się podczas optymalizacji jasności i kontrastu, co może powodować powstawanie fałszywych wektorów podczas późniejszej korelacji krzyżowej.</li>
		<li>Z menu ImageJ wybierz opcję Process > Filters (Przetwarzaj filtry > Rozmycie gaussowskie o promieniu 1,5, aby zredukować artefakty powstające w wyniku sporadycznego usuwania podświetlonych pikseli w sąsiedztwie 3 x 3 przez wcześniejszą operację usuwania plam.</li>
		<li>Kliknij narzędzie Wielokąt, a następnie kliknij obraz, aby obrysować obszar zainteresowania (ROI).</li>
		<li>Z menu ImageJ wybierz opcję Edit > Clear Outside, aby usunąć szumy czujnika w miejscach, w których nie oczekuje się sygnału (np. obszary poza granicą ściany zbiornika), co może zmniejszyć ogólny SNR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie PIV 
	UWAGA: Ta część protokołu wykorzystuje wtyczkę PIV innej firmy dla ImageJ, która opiera się na dopasowaniu pików Gaussa, aby umożliwić oszacowanie przemieszczenia z dokładnością subpikselową.
	<ol>
		<li>Z menu ImageJ wybierz Wtyczki > Makra > Uruchom... i przejdź do zapisanego makra Kod uzupełniający 2.ijjm, aby skorelować krzyżowo kolejne pary obrazów. 
		UWAGA: Makro przebiega w następujący sposób. 1) Najpierw przeprowadza się korelację krzyżową pola natężenia w kolejnych obrazach w celu określenia lokalnego przemieszczenia adwekowanych cząstek znacznikowych (>tj. pierwsza para obrazów składa się z pierwszego i drugiego obrazu, druga para obrazów składa się z drugiego i trzeciego obrazu itd.). 2) Następnie przeprowadzana jest dwuetapowa ocena wieloprzebiegowa z początkowymi i końcowymi rozmiarami okna przesłuchania wynoszącymi odpowiednio 256 x 256 pikseli i 128 x 128 pikseli. Wreszcie, 3) makro wykonuje średnią czasową, aby jeszcze bardziej zmniejszyć pojawianie się fałszywych wektorów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizowany test mediany (NMT)
	<ol>
		<li>Z menu ImageJ wybierz Plugins > Macros > Run... i przejdź do zapisanego makra Supplemental Code 3.ijjm, aby sprawdzić poprawność pól dynamiki za pomocą znormalizowanego testu mediany. 
		UWAGA: Makro przebiega w następujący sposób. 1) Każdy wektor w chwilowym polu wektorowym jest najpierw porównywany z ośmioma najbliższymi sąsiadami w celu obliczenia wartości mediany. 2) Tablica błędów resztkowych jest następnie obliczana jako różnica między każdym sąsiednim wektorem a obliczoną medianą. 3) Różnica między badanym wektorem a medianą wartości sąsiedniego wektora jest następnie normalizowana przez medianę reszt. 4) Jest to następnie porównywane z wartością progową (zwykle 0,2 piksela), która może być zmieniana w oparciu >o wiedzę a priori na temat szumu podczas pozyskiwania obrazu. Na koniec, 5) w celu wytworzenia pola złożonego przeprowadzana jest średnia czasowa wszystkich zwalidowanych chwilowych pól wektorowych, ponieważ wykazano, że zwiększa to jakość pola wektorowego24.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grant, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+velocimetry%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+C%3A+Journal+of+Mechanical+Engineering+Science%22%5BJournal%5D)">Particle image velocimetry: A review.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).</li>
<li>Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-Particle+Image+Velocimetry+%28%C2%B5PIV%29%3A+Recent+developments%2C+applications%2C+and+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines.</a> Lab on a Chip. 9 (17), 2551(2009).</li>
<li>Hove, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracardiac+fluid+forces+are+an+essential+epigenetic+factor+for+embryonic+cardiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis.</a> Nature. 421, 172(2003).</li>
<li>Ando, J., Yamamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Vascular Mechanobiology.</a> Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).</li>
<li>Conway, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Shear+Stress+on+Endothelial+Cells+Modulates+Mechanical+Tension+across+VE-Cadherin+and+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1.</a> Current Biology. 23 (11), (2013).</li>
<li>Kuhlencordt, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Atherosclerosis%2C+Aortic+Aneurysm+Formation%2C+and+Ischemic+Heart+Disease+in+Apolipoprotein+E%2FEndothelial+Nitric+Oxide+Synthase+Double-Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice.</a> Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).</li>
<li>Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+hemodynamics+in+aneurysm+models+by+stenting%3A+Influence+of+stent+porosity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity.</a> Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).</li>
<li>Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Investigation+of+Secondary+Flow+Structures+Downstream+of+a+Model+Type+IV+Stent+Failure+in+a+180%C2%B0+Curved+Artery+Test+Section%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e51288(2016).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity+Capping%3A+a+simple+method+to+improve+cross-correlation+PIV+results%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results.</a> Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).</li>
<li>Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaffel%2C+M+%22Particle+Image+Velocimetry%3A+a+Practical+Guide%22">Particle Image Velocimetry: a Practical Guide</a>. , Springer. New York, NY. (2007).</li>
<li>Kerl, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Pipeline+Flow-Diverting+Stents+Reduces+Aneurysm+Inflow+Without+Relevantly+Affecting+Static+Intra-aneurysmal+Pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure.</a> Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).</li>
<li>Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Image+Velocimetry+Assessment+of+Stent+Design+Influence+on+Intra-Aneurysmal+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow.</a> Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).</li>
<li>Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+time-resolved+PIV+comparison+of+the+effect+of+stent+design+on+wall+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress.</a> Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).</li>
<li>Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscosity+of+normal+human+blood+under+normothermic+and+hypothermic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions.</a> Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).</li>
<li>Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuous+high-precision+measurement+of+the+density+of+flowing+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood.</a> Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).</li>
<li>Hoyt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Table+of+the+Refractive+Index+of+Pure+Glycerol+at+20%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C.</a> Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).</li>
<li>Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fabrication+method+for+all-PDMS+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">A new fabrication method for all-PDMS waveguides.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).</li>
<li>Bouillot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+imaging+velocimetry+evaluation+of+intracranial+stents+in+sidewall+aneurysm%3A+hemodynamic+transition+related+to+the+stent+design%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design.</a> PloS ONE. 9 (12), 113762(2014).</li>
<li>Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+hemodynamic+performance+of+new+flow+diverters+for+bypass+of+brain+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505(2012).</li>
<li>Clauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Plasma-Based+Fluid+for+Particle+Image+Velocimetry+%28PIV%29%3A+In-Vitro+Feasibility+Study+of+Flow+Diverter+Effects+in+Aneurysm+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model.</a> Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li>
<li>Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PIV+Algorithm+for+Estimating+Time-Averaged+Velocity+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluids+Engineering%22%5BJournal%5D)">A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields.</a> Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285(2000).</li>
<li>Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Particle+Image+Velocimetry+of+Natural+and+Mixed+Convection%5BTitle%5D)+AND+%2213th+Int+Symp+on+Applications+of+Laser+Techniques+to+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection.</a> 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).</li>
<li>Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIV+measurements+of+a+microchannel+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">PIV measurements of a microchannel flow.</a> Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).</li>
<li>Lima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+blood+flow+in+a+rectangular+PDMS+microchannel%3A+experimental+observations+using+a+confocal+micro-PIV+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system.</a> Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).</li>
<li>Kuo, C. -C., Mao, R. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Precision+Surface+Polishing+System+for+Parts+Fabricated+by+Fused+Deposition+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+and+Manufacturing+Processes%22%5BJournal%5D)">Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling.</a> Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).</li>
<li>Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+truly+3D+microfluidic+channel+using+3D-printed+soluble+mold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold.</a> Biomicrofluidics. 12 (1), 014105(2018).</li>
<li>Prasad, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Image+Velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Particle Image Velocimetry.</a> Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).</li>
<li>Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast-enhancement+techniques+for+particle-image+velocimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry.</a> Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).</li>
<li>Cowen, E. A., Monismith, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+digital+particle+tracking+velocimetry+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Fluids%22%5BJournal%5D)">A hybrid digital particle tracking velocimetry technique.</a> Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).</li>
<li>Gruen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+least+squares+correlation%3A+a+powerful+image+matching+technique%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Photogrammetry%2C+Remote+Sensing+and+Cartography%22%5BJournal%5D)">Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique.</a> South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).</li>
<li>Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+validation%2C+false+vectors+correction+and+derived+magnitudes+calculation+on+PIV+data%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data.</a> Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).</li>
<li>Loudon, C., Tordesillas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+the+Dimensionless+Womersley+Number+to+Characterize+the+Unsteady+Nature+of+Internal+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow.</a> Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).</li>
<li>Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arduino+control+of+a+pulsatile+flow+rig%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+and+Physics%22%5BJournal%5D)">Arduino control of a pulsatile flow rig.</a> Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).</li>
<li>Tsai, W., Savaş, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+pumping+system+for+physiological+waveforms%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Flow pumping system for physiological waveforms.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).</li>
<li>Kato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast-enhanced+2D+cine+phase+MR+angiography+for+measurement+of+basilar+artery+blood+flow+in+posterior+circulation+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Neuroradiology%22%5BJournal%5D)">Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia.</a> American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół przedstawia uproszczoną metodę przeprowadzania badań PIV w celu wizualizacji przepływów naczyniowo-nerwowych w warunkach przepływu i wymiarach istotnych fizjologicznie in vitro. W ten sposób stanowi on uzupełnienie protokołów opisanych przez innych autorów, którzy również skupiali się na uproszczeniu ilościowego wyznaczania pól wektorowych, lecz w zupełnie innych kontekstach, wymagających uwzględnienia znacznie większych skal długości25 lub niższyc...

PIV jest szeroko stosowany w eksperymentalnej mechanice płynów do wizualizacji przepływu i ilościowych badań ruchu płynów, które różnią się skalą długości od przepływów atmosferycznych do mikrokrążenia1,2,3. Chociaż specyfika jego implementacji może się różnić tak bardzo, jak jego zastosowania, jednym z aspektów wspólnych dla prawie wszystkich badań PIV jest wykorzystanie obrazowania wideo cząstek znacznikowych zasianych w płynie roboczym, a następnie analiza parami kolejnych klatek obrazu w celu wyodrębnienia pożądanych charakterystyk przepływu. Zazwyczaj osiąga się to poprzez najpierw podzielenie każdej klatki obrazu na mniejsze obszary zwane oknami przesłuchań. W wyniku losowego położenia rozproszonych cząstek, każde okno przesłuchania zawiera unikalny rozkład intensywności pikseli. Jeśli rozmiar okna i szybkość akwizycji danych zostaną odpowiednio dobrane, korelacja krzyżowa sygnału intensywności w każdym oknie może być wykorzystana do oszacowania średniego przemieszczenia w tym obszarze. Wreszcie, biorąc pod uwagę, że powiększenie i liczba klatek na sekundę są znanymi parametrami eksperymentalnymi, można łatwo obliczyć chwilowe pole wektora prędkości.
Główną przewagą PIV nad jednopunktowymi technikami pomiarowymi jest jego zdolność do mapowania pól wektorowych w dwu- lub trójwymiarowej domenie. Z tej możliwości skorzystały w szczególności zastosowania hemodynamiczne, ponieważ pozwala ona na dokładne badanie lokalnych przepływów, o których wiadomo, że odgrywają znaczącą rolę w chorobach naczyniowych lub przebudowach (np. miażdżyca, angiogeneza)4,5,6. Dotyczy to również oceny przepływów nerwowo-naczyniowych i ich interakcji z urządzeniami wewnątrznaczyniowymi (np. rozdzielaczami przepływu, stentami, cewkami wewnątrzworkowymi), ponieważ odpowiednie skale długości w takich zastosowaniach mogą często obejmować jeden lub więcej rzędów wielkości (np. od mikrometra do milimetra), a geometria i rozmieszczenie urządzenia mogą znacząco wpływać na lokalną mechanikę płynów7.
Większość grup przeprowadzających badania hemodynamiczne oparte na PIV polegała na eksperymentalnych ustawieniach, które ściśle naśladują niektóre z najwcześniejszych badań wpływu stentu na przepływ naczyniowy7,8. Zazwyczaj należą do nich: a) lasery impulsowe i szybkie kamery do rejestrowania przepływów o dużej prędkości; b) synchronizatory, aby zapobiec aliasowaniu między częstotliwością impulsów lasera a liczbą klatek na sekundę akwizycji kamery; c) optyka cylindryczna, tworząca arkusz światła, a tym samym minimalizująca fluorescencję tła od cząstek znacznikowych powyżej i poniżej płaszczyzny badania; d) w przypadku komercyjnych systemów "pod klucz", autorskie pakiety oprogramowania, w celu przeprowadzenia analiz korelacji krzyżowych. Jednak podczas gdy niektóre aplikacje wymagają wydajności i/lub wszechstronności, które łącznie zapewniają te komponenty, wiele innych tego nie robi. Co więcej, wysoki koszt komercyjnie pozyskiwanych fantomów tkankowych, które rekapitulują pożądane struktury naczyniowe, może również okazać się ograniczający dla wielu badań in vitro, szczególnie dla fantomów o cechach łączących reżim mezoskalowy (> 500 USD/fantom). W niniejszym artykule informujemy o opracowaniu uproszczonego protokołu wdrażania PIV do wizualizacji in vitro przepływów nerwowo-naczyniowych, które zazwyczaj leżą zarówno przestrzennie, jak i czasowo w reżimie mezoskalowym (tj. skale długości od submilimetra do milimetra i prędkości do kilkudziesięciu milimetrów / sekundę). Protokół ma na celu wykorzystanie zasobów, którymi już dysponuje wielu badaczy zajmujących się bioinżynierią, obniżając w ten sposób barierę wejścia dla osób niebędących ekspertami.
Pierwszy element tego protokołu polega na użyciu techniki odlewania metodą traconego wosku, która umożliwia wewnętrzną produkcję przezroczystych, opartych na polidimetylosiloksanie (PDMS) fantomów tkankowych z wydrukowanych w 3D form ofiarnych. Wykorzystując rosnącą dostępność drukarek 3D w ostatnich latach, szczególnie tych w obiektach współdzielonych/wieloosobowych (np. obiektach instytucjonalnych lub publicznych przestrzeniach produkcyjnych), metodologia ta znacznie obniża koszty (np. < 100 USD/fantom w przedstawionym tutaj przypadku), umożliwiając jednocześnie szybki zwrot w zakresie produkcji szerokiej gamy wzorów i geometrii. W obecnym protokole stosuje się system modelowania osadzania topionego z akrylonitryl-butadien-styrenem (ABS) jako materiałem budowlanym, a wydrukowana część służy jako forma protektorowa do późniejszego odlewania fantomowego. Nasze doświadczenie pokazuje, że ABS dobrze nadaje się do takiego zastosowania, ponieważ jest rozpuszczalny w popularnych rozpuszczalnikach (np. acetonie) i ma wystarczającą wytrzymałość i sztywność, aby zachować integralność formy po usunięciu materiału nośnego (np. Aby zapobiec deformacji lub pękaniu drobnych cech formy). W obecnym protokole integralność formy jest dodatkowo zapewniona za pomocą solidnych drukowanych modeli, chociaż odbywa się to kosztem wydłużonego czasu rozpuszczania. W niektórych przypadkach możliwe może być również zastosowanie pustych modeli w celu zwiększenia dostępu rozpuszczalnika, a tym samym skrócenia czasu rozpuszczania. Należy jednak dokładnie rozważyć wpływ, jaki może to mieć na integralność pleśni. Wreszcie, podczas gdy fantomy wytworzone w niniejszym dokumencie są oparte na wyidealizowanych reprezentacjach struktur nerwowo-naczyniowych wygenerowanych przy użyciu powszechnego pakietu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), oczekuje się, że protokół będzie również podatny na wytwarzanie bardziej złożonych, specyficznych dla pacjenta geometrii (np. poprzez wykorzystanie plików modelowych generowanych przez konwersję danych obrazowania klinicznego do . Format pliku STL używany przez większość drukarek 3D). Dalsze szczegóły dotyczące procesu wytwarzania fantomów znajdują się w sekcji 2 protokołu.
Drugi element protokołu polega na użyciu wtyczki open-source dla ImageJ do przeprowadzania analiz korelacji krzyżowych9. Jest to połączone z implementacją prostego schematu progowania statystycznego (tj. ograniczanie intensywności)10 w celu poprawy sygnału obrazu przed korelacją krzyżową, a także schematu walidacji wektora po korelacji, znormalizowanego testu mediany (NMT), w celu wyeliminowania fałszywych wektorów poprzez porównanie każdego z jego najbliższymi sąsiadami11. Łącznie pozwala to na obrazowanie przy użyciu sprzętu powszechnie spotykanego w wielu laboratoriach bioinżynieryjnych, eliminując w ten sposób potrzebę zakupu wielu kosztownych komponentów typowych systemów PIV (np. lasera impulsowego, synchronizatora, cylindrycznej optyki i zastrzeżonego oprogramowania). Więcej szczegółów na temat gromadzenia nagrań wideo, przetwarzania obrazu i analizy danych znajduje się w sekcjach 5 i 6 protokołu.
Rysunek 1 ilustruje konfigurację PIV używaną w tym protokole, która opiera się na mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w szybką kamerę do obrazowania, a także na zewnętrznym, ciągłym źródle światła białego (np. lampa metalohalogenkowa) do oświetlania objętościowego przez obiektyw. Pompa zębata o zmiennej prędkości służy do narzucania recyrkulacyjnego przepływu przezroczystego imitującego roztworu krwi przez fantomy tkanki nerwowo-naczyniowej. Roztwór składa się z mieszaniny wody dejonizowanej (DI) i glicerolu w proporcji 60:40, która jest powszechnym substytutem krwi w badaniach hemodynamicznych12,13,14, ze względu na a) podobną gęstość i lepkość (tj. 1,080 kg/m3 i 3,5 cP vs. 1,050 kg/m3 i 3 - 5 cP dla krwi)15,16; b) jego przezroczystość w zakresie widzialnym; c) jego podobny współczynnik załamania światła jak PDMS (1,38 vs. 1,42 dla PDMS)17,18,19,20, co minimalizuje zniekształcenia optyczne; d) łatwość, z jaką można wprowadzić zachowanie nienewtonowskie, jeśli zajdzie taka potrzeba, poprzez dodanie xanthane21. Wreszcie, fluorescencyjne kulki polistyrenowe są używane jako cząstki znacznikowe (średnica 10,3 μm; wzbudzenie/emisja 480 nm/501 nm). Podczas gdy pożądane są kulki o neutralnej wyporności, pozyskiwanie cząstek znacznikowych o optymalnych właściwościach mechanicznych płynu (np. gęstości, rozmiarze, składzie) i długości fali emisji może okazać się wyzwaniem. Na przykład kulki użyte w tym artykule są nieco mniej gęste niż roztwór glicerolu (1 050 kg/m3 vs. 1 080 kg/m3). Efekty hydrodynamiczne są jednak znikome, biorąc pod uwagę, że czas trwania typowego eksperymentu jest znacznie krótszy niż skala czasowa związana z efektami wyporu (tj. odpowiednio 5 minut i 20 minut). Dalsze informacje na temat preparatu imitacji roztworu krwi i konfiguracji układu krążenia in vitro znajdują się w sekcjach 3 i 4 protokołu.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie CAD Solidworks 2015</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Zestaw</td><td>Ellsworth Klej</td><td>184 SIL ELAST KIT 3,9 KG</td><td>Zestaw PDMS</td></tr><tr><td>Stratasys Dimension Elite</td><td>Stratasys</td><td>9180-00105</td><td>Drukarka 3D</td></tr><tr><td>P430 Model Materiał Wkład</td><td>Stratasys</td><td>340-21202</td><td>Materiał budowlany ABS&nbsp;</td></tr><tr><td>P400 SR Rozpuszczalny wkład z materiałem podporowym</td><td>Stratasys</td><td>340-30200</td><td>Materiał nośny</td></tr><tr><td>CleanStation DT3</td><td>PM3 Technologie</td><td>00-00300R</td><td>Wanna podstawowa</td></tr><tr><td>Piec skrzynkowy LGO Lindberg Blue M&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>LB305745M</td><td>Piekarnik</td></tr><tr><td>21G BD Igła PrecisionGlide</td><td>Betcon Dickenson</td><td>BD 305167</td><td>Rozgałęziony segment formy perforatora</td></tr><tr><td>Eksykator (próżnia)</td><td>Polylab</td><td>55205</td><td>Eksykator</td></tr><tr><td>Branson 1800 Utrasonic Czyszczenie</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td>Sonikator</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Chemical</td><td>A9494</td><td>Aceton</td></tr><tr><td>Alkohol izopropolowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A4514</td><td>Alkohol izopropolowy</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Chemical</td><td>GW33500</td><td>Glicerol</td></tr><tr><td>10um Polistyren Żółto-zielone Cząstki fluorescencyjne Magsphere</td><td></td><td>PSF-010UM</td><td>Koraliki fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Phantom Miro&nbsp;</td><td>Vision Research</td><td>Miro M310</td><td>Kamera szybkotnąca</td></tr><tr><td>Mikropompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>81101</td><td>Pompa recyrkulacyjna</td></tr><tr><td>Leica DM2000</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2000</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Leica 10X Obiektyw</td><td>Leica Microsystems</td><td>506259</td><td>Obiektyw</td></tr><tr><td>Leica 2.5X Obiektyw</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506083</td><td>Obiektyw worek tętniaka</td></tr><tr><td>Leica Blue Filter Cube L5</td><td>Leica Microsystems</td><td>513840</td><td>Niebieska kostka filtracyjna</td></tr><tr><td>Leica EL6000</td><td>Leica Microsystems</td><td>11504115</td><td>Źródło światła</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc</td><td>1104-1</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu Open source https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Particle Image Velocimetry Wtyczka PIV</td><td>Qingson Tseng</td><td>N/A</td><td>https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv</td></tr></tbody></table>

badania szybkościomierzy obrazu cząstek w mezoskali, przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Prędkość obrazowania cząstek (PIV) jest używana w wielu różnych dziedzinach, ze względu na możliwość precyzyjnej wizualizacji i kwantyfikacji przepływów w szerokim zakresie czasoprzestrzennym. Jednak jego implementacja zazwyczaj wymaga użycia drogiego i specjalistycznego oprzyrządowania, co ogranicza jego szerszą użyteczność. Co więcej, w dziedzinie bioinżynierii badania nad wizualizacją przepływu in vitro są często dodatkowo ograniczone przez wysokie koszty komercyjnie pozyskiwanych fantomów tkankowych, które podsumowują pożądane struktury anatomiczne, szczególnie w przypadku tych, które obejmują reżim mezoskalowy (tj. skale długości od submilimetra do milimetra). W niniejszym artykule przedstawiamy uproszczony protokół eksperymentalny opracowany w celu rozwiązania tych ograniczeń, którego kluczowe elementy obejmują 1) stosunkowo tanią metodę wytwarzania mezoskalowych fantomów tkanek przy użyciu druku 3D i odlewania silikonowego oraz 2) ramy analizy i przetwarzania obrazów typu open source, które zmniejszają zapotrzebowanie na oprzyrządowanie do pomiaru przepływów mezoskalowych (tj., prędkości do kilkudziesięciu milimetrów na sekundę). Łącznie obniża to barierę wejścia dla osób niebędących ekspertami, wykorzystując zasoby, którymi już dysponuje wielu badaczy zajmujących się bioinżynierią. Wykazujemy możliwość zastosowania tego protokołu w kontekście charakterystyki przepływu nerwowo-naczyniowego; Oczekuje się jednak, że będzie on miał znaczenie dla szerszego zakresu zastosowań mezoskalowych w bioinżynierii i poza nią.

Rycina 2 przedstawia proces wytwarzania fantomu tkankowego z PDMS. Omawiane fantomy zostały zaprojektowane do badania przepływu w modelowych szerokoszyjkowych, workowatych aneurysmach wewnątrzczaszkowych oraz w przylegających tętnicach perforujących. Ważne dodatkowe cechy projektu obejmują: 1) wspólny zbiornik, do którego odpływają wszystkie naczynia, zapewniający swobodny odpływ cieczy z fantomu – w przeciwnym razie może dochodzić do tworzenia kropel na wyjś...

Tutaj prezentujemy uproszczone metody wytwarzania przezroczystych fantomów nerwowo-naczyniowych i charakteryzowania przepływu w nich. Zwracamy uwagę na kilka ważnych parametrów i pokazujemy ich związek z dokładnością pola.

Badania szybkościomierzy obrazu cząstek w mezoskali, przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu bioinżynierii, w szczególności te dotyczące hemodynamiki i jej interakcji z urządzeniami międzynaczyniowymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona sprzęt, który można już znaleźć w większości laboratoriów bioinżynieryjnych, co może pomóc w zmniejszeniu bariery wejścia dla osób niebędących ekspertami. Wymieszaj bazę prepolimerową PDMS z utwardzaczem w stosunku wagowym 10 do jednego.Mieszanina o wadze 66 gramów zapewnia wystarczającą ilość materiału do wytwarzania fantomów o objętości do 50 centymetrów sześciennych. Umieść mieszaninę w eksykatorze próżniowym na 60 minut w celu odgazowania i zminimalizowania uwięzienia pęcherzyków. Stosuj cykliczne zmniejszanie ciśnienia, aby ułatwić pękanie pęcherzyków.Aby wykonać odlew, zamontuj wydrukowaną formę ABS na szkiełku za pomocą szpachli formierskiej w celu uszczelnienia interfejsu. Ostrożnie wlej mieszaninę PDMS do formy, starając się zminimalizować uwięzienie pęcherzyków. Utrzymujące się bąbelki można ręcznie rozbić za pomocą igły.Utwardź fantom odlewu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny. Można użyć pojemnika, aby upewnić się, że kurz nie osadza się na fantomie podczas utwardzania. Aby wykonać wyjmowanie z formy, rozpuść ABS, zanurzając fantom w acetonie.Sonikuj przez co najmniej 15 minut, używając mocy do 70 watów. Dokładnie spłucz fantom alkoholem izopropylowym, a następnie wodą dejonizowaną, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika. Korzystając z mikroskopu optycznego z dołączoną kamerą w oprogramowaniu do przechwytywania obrazu, uchwyć obraz krytycznej cechy fantomu pod powiększeniem, które maksymalizuje tę cechę w polu widzenia.Zrób obraz odpowiedniej siatki kalibracyjnej przy tym samym powiększeniu. Załaduj oba obrazy do ImageJ, przeciągając je na pasek narzędzi. Kliknij obraz siatki kalibracyjnej, aby ją uaktywnić, a następnie wybierz narzędzie linii.Za pomocą myszy narysuj linię wzdłuż obiektu o znanej odległości i wybierz opcję Analizuj. Ustaw skalę z menu ImageJ. Wprowadź długość obiektu w polu oznaczonym jako znana odległość i jego jednostkę w polu oznaczonym jako jednostka długości.Zaznacz pole oznaczone jako globalne, aby zastosować ten współczynnik kalibracji do wszystkich otwartych obrazów. Uaktywnij obraz funkcji krytycznej fantomu i użyj narzędzia Linia, aby narysować linię wzdłuż interesującego obiektu. Z menu ImageJ wybierz Analizuj, zmierz, aby zmierzyć długość linii.Porównaj oczekiwaną wartość z wartością w kolumnie oznaczonej długością w oknie wyników, aby potwierdzić wierność fantomową. Aby przygotować imitację roztworu krwi, wymieszaj dejonizowaną wodę i glicerol w stosunku 60 do 40 objętości. Dodaj jeden mililitr 2,5% fluorescencyjnego roztworu kulek polistyrenowych do imitacji roztworu krwi, a następnie homogenizuj mieszaninę na magnetycznej płytce mieszającej z prędkością 400 obr./min przez 10 minut.Wykonaj konfigurację układu krążenia in vitro zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Określ współczynnik kalibracji dla obrazowania wideo, tak jak poprzednio. Przed umieszczeniem fantomu PDMS na stoliku mikroskopu można umieścić arkusz akrylowy, aby chronić mikroskop przed niezamierzonym rozlaniem.Aby ustawić aparaturę, umieść fantom PDMS na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Podłącz fantom do pompy zębatej i wprowadź imitację roztworu krwi. Ustawić sterownik silnika pompy dla żądanego natężenia przepływu w oparciu o krzywą kalibracji pompy.Uruchom pompę na jedną do pięciu minut przed eksperymentem, aby zapewnić warunki w stanie ustalonym. Jeśli po eksperymencie zaobserwuje się przywieranie kulek, poddaj fantom sonikacją w wodnym roztworze detergentu o mocy do 70 watów. Czystość modelu ma również kluczowe znaczenie dla wierności pola wektorowego, ponieważ koraliki przyklejone do powierzchni fantomu spowodują okna przesłuchań z zerowym przemieszczeniem.Aby przeprowadzić przetwarzanie obrazu, przeciągnij plik zapisu AVI do okna ImageJ, aby go zaimportować. Zaznacz pole Konwertuj na skalę szarości. Z menu ImageJ wybierz opcję Analizuj, generuj histogram, aby wygenerować histogram intensywności pikseli obrazu.Zwróć uwagę na średnią i odchylenie standardowe dla nieprzetworzonego obrazu. Z menu ImageJ wybierz obraz, dostosuj jasność i kontrast, aby zastosować filtr kontrastu jasności. W menu jasności i kontrastu kliknij przycisk ustawiania, aby zdefiniować limity obrazu.Ustaw wartość minimalną jako wartość średnią plus jedno odchylenie standardowe, a wartość maksymalną jako maksymalną intensywność obrazu. Z menu ImageJ wybierz opcję proces, szum, usuwanie plamek, aby zmniejszyć liczbę nasyconych pikseli. Następnie wybierz proces, filtry, rozmycie gaussowskie o promieniu 1,5.Zmniejszy to liczbę artefaktów powstających w wyniku sporadycznego usuwania podświetlonych pikseli w sąsiedztwie 3x3 przez wcześniejszą operację usuwania plamek. Kliknij narzędzie wielokąta, a następnie kliknij obraz, aby obrysować obszar zainteresowania. Z menu ImageJ wybierz opcję edytuj, wyczyść na zewnątrz, aby usunąć szumy czujnika w miejscach, w których nie oczekuje się żadnego sygnału, co może zmniejszyć ogólny stosunek sygnału do szumu.Przejdź do analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pokazany jest tutaj ukończony fantom z zaznaczonymi wymiarami, a także prędkościomierzem obrazu cząstek lub obszarem zainteresowania PIV. Ten rysunek przedstawia wykresy konturowe intensywności obrazu i wykresy powierzchniowe wynikające z koralików fluorescencyjnych w tętnicy perforatora podczas przechwytywania wideo.Świadczy to o poprawie stosunku sygnału do szumu po wykonaniu ograniczenia intensywności. Poniżej przedstawiono wynikowe pola wektorowe uzyskane na surowym wideo, po ograniczeniu intensywności, a następnie ponownie po walidacji pola wektorowego o ograniczonej intensywności za pomocą znormalizowanego testu mediany. Wraz ze stosowaniem technik przetwarzania końcowego i walidacji wektorów, pole wektorowe staje się bardziej jednolite i bardziej przypomina oczekiwany profil przepływu w kanale kołowym.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby skupić się na zminimalizowaniu szumów w samym pozyskanym sygnale. Chociaż protokół ten określa techniki oparte na oprogramowaniu w celu złagodzenia tych aberracji, należy zachować ostrożność na każdym kroku, aby ograniczyć ich występowanie. Nie zapominaj, że praca z acetonem może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ochrony osobistej, a także pracować pod wyciągiem, z dala od źródeł zapłonu.

meso-scale-particle-image-velocimetry-studies-neurovascular-flows

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Prędkość obrazowania mikrocząstek (μPIV) służy do wizualizacji sparowanych obrazów mikrocząstek zasianych w przepływie krwi, które są skorelowane krzyżowo, aby uzyskać dokładny profil prędkości.  Na podstawie tych pomiarów można uzyskać szybkość ścinania, prędkość maksymalną, kształt profilu prędkości i natężenie przepływu, z których każdy ma zastosowania kliniczne.

Obrazowa prędkość mikrocząstek do pomiarów profilu prędkości mikroprzepływów krwi

Mikroskopia przyżyciowe może być używana u zwierząt do wizualizacji i pomiaru średnic naczyń krwionośnych siatkówki, prędkości przepływu krwi i całkowitego przepływu krwi w siatkówce.

Przyżyciowe pomiary wideomikroskopii przepływu krwi w siatkówce u myszy

Prezentowany jest graficzny interfejs użytkownika do eksploracji i udostępniania bazy danych optogenetycznie indukowanych reakcji naczyniowych w korze somatosensorycznej myszy in vivo, mierzonych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Umożliwia przeglądanie danych, selekcję opartą na kryteriach, uśrednianie, lokalizację pomiarów w obrębie objętości 3D unaczynienia oraz eksport danych.

Neurovascular Network Explorer 2.0: proste narzędzie do eksploracji i udostępniania bazy danych optogenetycznie wywołanej wazomotorii w korze myszy in vivo

Aby określić ilościowo przepływ mikronaczyniowy na podstawie sekwencji obrazów przepływu kapilarnego o dużej prędkości, opracowaliśmy oprogramowanie STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Na całym polu obrazu i w czasie STAFF ocenia prędkości przepływu i generuje sekwencję oznaczonych kolorami map przestrzennych do wizualizacji i tabelarycznych danych wyjściowych do analiz ilościowych.

Przestrzenna analiza czasowa przepływu w terenie w mikrokrążeniu

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Prezentujemy nieinwazyjną technikę ultradźwiękową do generowania trójwymiarowych angiografii w oku bez użycia środków kontrastowych.

Głębokie obrazowanie naczyń krwionośnych w oku za pomocą ultradźwięków o zwiększonym przepływie

Obecny protokół opisuje pomiary prędkości obrazu cząstek (PIV) wykonywane w celu zbadania przepływu zatokowego przez układ in vitro przezcewnikowej zastawki aortalnej (TAV). Określane są również parametry hemodynamiczne na podstawie prędkości.

Badanie hemodynamiki za pomocą wizji obrazu cząstek za pomocą fantomu aorty

Aby badać regulację przepływu krwi w mózgu in vivo, tradycyjne metody farmakologiczne są inwazyjne, często uszkadzając czaszkę, oponę twardą i opony mózgowo-rdzeniowe. W ramach tej pracy opracowaliśmy minimalnie inwazyjną technikę, która łączy wstrzykiwanie intracisternal magna (ICM) pod kontrolą nanoiniektora z laserowym obrazowaniem kontrastowym, zachowując integralność czaszki i opon mózgowo-rdzeniowych.

Sparowany test obrazowania Cisterna Magna Nanoinjection i laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym w celu zbadania regulacji przepływu krwi w mózgu in vivo

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj metody szybkościomierzy obrazu cząstek PIV w neurofantomach PDMS do badań przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro. Technika umożliwia charakterystykę hemodynamiki z wykorzystaniem standardowego wyposażenia laboratoryjnego.

Badania szybkościomierzy obrazu cząstek w mezoskali, przepływów nerwowo-naczyniowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów