Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów
January 16th, 2019
Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów określa rozpowszechnienie zmienności genetycznej na danej pozycji aminokwasu, znormalizowanej do zmienności genetycznej tła danej populacji. Pozwala to na identyfikację wariantowych "gorących punktów" w sekwencji białka (sygnału), która wzrasta powyżej częstości występowania rzadkich wariantów występujących w populacji (szum).
Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów zapewnia miarę prawdopodobieństwa, że wariant genetyczny jest związany ze stanem chorobowym lub jest częścią naturalnej zmienności genetycznej w populacji. Technika ta wykorzystuje dwa duże zasoby genetyczne, mutacje związane z chorobą, dostępne w literaturze lub w domenie publicznej z populacyjnymi badaniami eksomów i genomu, które identyfikują rzadką wariancję genetyczną. Aby zidentyfikować konkretny gen i izoformę splicingu, który Cię interesuje, otwórz stronę główną Ensembl i wybierz gatunek z menu rozwijanego.
Wprowadź akronim odpowiadający interesującemu Cię genowi i kliknij przycisk Przejdź. Wybierz linki odpowiadające interesującemu genowi i interesowi transkrypcyjnemu oraz identyfikatorowi zainteresowania z tabeli Transkrypt. Zanotuj specyficzny dla transkryptu transkryptu RNA i iloczyn białkowy numerów identyfikacyjnych transkryptu RNA w kolumnie sekwencji referencyjnej tabeli transkryptów do wykorzystania w przyszłości.
Wybierz link powiązany z produktem białkowym o numerze identyfikacyjnym transkryptu RNA, aby otworzyć nową stronę internetową z National Center for Biotechnology Information lub NCBI Protein Database, i przewiń w dół do sekcji Origin, aby uzyskać pierwotną sekwencję białka dla interesującego nas transkryptu genu. Następnie przewiń w górę do sekcji Cechy, aby uzyskać listę cech białka. Aby obliczyć częstość alleli podrzędnych dla każdej pozycji aminokwasu z wariantem kontrolnym, otwórz arkusz kalkulacyjny z możliwością tworzenia wykresów i utwórz kolumnę z pozycjami wszystkich wariantów eksperymentalnych.
Usuń teksty wariantów, aby pozostawić tylko pozycje wariantów i posortuj warianty według wartości rosnącej, aby określić, które pozycje mają więcej niż jeden skojarzony wariant. Uzyskaj sumę wszystkich częstości występowania alleli drugorzędnych dla danej pozycji, łącząc częstość alleli drugorzędnych dla każdego wariantu związanego z daną pozycją i oblicz częstość występowania alleli drugorzędnych dla każdej pozycji aminokwasu z wariantem eksperymentalnym. Następnie utwórz kolumnę pozycji aminokwasów, które mają warianty eksperymentalne, i oblicz częstość występowania alleli drugorzędnych wszystkich wariantów związanych z tą pozycją dla wszystkich pozycji wariantów.
Aby utworzyć średnią kroczącą częstości występowania alleli drugorzędnych zarówno dla wariantu eksperymentalnego, jak i kontrolnego, utwórz kolumnę zawierającą wszystkie pozycje aminokwasów w genie będącym przedmiotem zainteresowania i dodaj częstość alleli podrzędnych równą zero dla wszystkich pozycji, które nie mają wariantów zarówno dla zestawu danych kontrolnych, jak i eksperymentalnych. Aby utworzyć średnią kroczącą dla każdej kolumny rozpowszechnienia eksperymentalnego i kontrolnego, należy utworzyć kolumnę reprezentującą średnią kroczącą częstości występowania alleli podrzędnych zarówno dla zbiorów danych kontrolnych, jak i eksperymentalnych, a w kolumnie średniej kroczącej umieścić średnią odpowiedniej częstości występowania allelu podrzędnego dla pięciu pozycji wariantu N i C na każdej pozycji. Aby obliczyć minimalną częstość kohorty, podziel najniższy allel poboczny zidentyfikowany przez dwa i wprowadź tę wartość w dowolnej komórce z częstotliwością kontrolnego allelu pobocznego równą zero.
Pozwoli to uniknąć dzielenia przez zero przy obliczaniu stosunku sygnału do szumu. Aby obliczyć stosunek sygnału do szumu na poziomie aminokwasów, podziel każdą eksperymentalną średnią kroczącą pozycji aminokwasu przez odpowiednią kontrolną średnią kroczącą i przedstaw ten stosunek w stosunku do pozycji aminokwasu. Aby zidentyfikować zgodne lokalizacje aminokwasów domen i cech funkcjonalnych lub obszary modyfikacji potranslacyjnej białka będącego przedmiotem zainteresowania, zidentyfikuj pozycje aminokwasów związane z domenami i cechami białka i otwórz stronę internetową NCBI.
Wprowadź produkt białkowy transkryptu RNA interesującego białka w polu wyszukiwania i zidentyfikuj znane domeny i cechy białka w obszarze Cechy. Zidentyfikuj i zanotuj nazwę i typ domeny oraz pozycje aminokwasów, a następnie wybierz link odpowiadający funkcji, aby zobrazować region w sekwencji pierwotnej białka będącego przedmiotem zainteresowania. Utwórz kolumnę obok kolumny sygnał-szum, aby można było odwoływać się do kolumny położenia aminokwasów, i zidentyfikuj komórki odpowiadające w końcowym aspekcie N lub C każdej domeny i funkcji.
Następnie umieść jedynkę w każdej komórce, utwórz wykres z tymi granicami na osi y i pozycją aminokwasów na osi x i nałóż ten wykres na wykres sygnału do szumu. Aby zmapować pozycje poszczególnych wariantów do nałożenia wykresów stosunku sygnału do szumu i topologii domeny białka, utwórz kolumnę obok kolumny cechy domeny tak, aby wiersze w kolumnie odpowiadały pozycjom aminokwasów, i umieść po jednym w każdej komórce w dodanym wierszu, odpowiadającą pozycji zawierającej odpowiedni wariant. Następnie utwórz wykres z tą kolumną jako osią y i pozycjami aminokwasów na osi x, a następnie nałóż ten wykres na wykresy topologii sygnału do szumu i białka.
W tym miejscu przedstawiono reprezentatywny wynik analizy sygnału do szumu na poziomie aminokwasów dla podrodziny Q kanału bramkowanego napięciem potasu w genie jeden. Wykazano rzadką wariancję zidentyfikowaną w kohorcie kontrolnej oraz eksperymentalnie przypadkowo zidentyfikowane sekwencjonowanie całych ekssome oraz warianty związane z zespołem długiego odstępu QT, które uważa się za prawdopodobnie związane z chorobą. Reprezentowane są również analizy sygnał-szum porównujące całe sekwencjonowanie ekssometyczne oraz częstość występowania wariantów kohorty zespołu długiego odstępu QT, znormalizowaną w stosunku do częstości występowania wariantów kohorty kontrolnej.
W tym eksperymencie warianty związane z zespołem długiego odstępu QT wykazały wysoki stosunek sygnału do szumu w domenach odpowiadających nalewaniu kanału, filtrowi selektywności i jednej domenie wiążącej podrodziny kanałów bramkowanych napięciem potasowym. Dla porównania, przypadkowo zidentyfikowane warianty w całej kohorcie sekwencjonowania exsome nie wykazały wyraźnie określonych regionów o wysokim wzroście sygnału do szumu, co sugeruje, że warianty te odzwierciedlają zmienność genetyczną tła. Metodologia ta może być stosowana do oceny wagi diagnostycznej wariantów o nieznanym znaczeniu, które pojawiają się podczas klinicznych badań genetycznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów zapewnia wgląd w częstość występowania zmienności genetycznej w określonych pozycjach aminokwasów, pomagając w identyfikacji hotspotów wariantów w sekwencjach białek. Ta metoda odróżnia związane z chorobą warianty genetyczne od naturalnej zmienności genetycznej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Bioinformatyka
- Neuronauki
Tło
- Analiza na poziomie aminokwasów jest kluczowa dla zrozumienia zmienności genetycznej.
- Identyfikowanie hotspotów może pomóc w badaniach nad związkami z chorobami.
- Wykorzystuje duże zasoby genetyczne do kompleksowej analizy.
- Opierają się zarówno na literaturze, jak i danych z domeny publicznej.
Cel badania
- Zmierzyć prawdopodobieństwo, że warianty genetyczne są związane z chorobą.
- Rozróżnić rzadkie warianty genetyczne od powszechnych różnic w populacji.
- Zastąpić ramy do analizy określonych genów i izoform przecinających się.
Zastosowane metody
- Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów.
- Wykorzystanie mutacji związanych z chorobą z literatury.
- Integracja badań eksomowych i genomowych opartych na populacji.
- Dostęp do Ensembl do identyfikacji genów i transkryptów.
Główne wyniki
- Identyfikacja hotspotów wariantów w sekwencjach białek.
- Wyraźne rozróżnienie między wariantami związanymi z chorobą a naturalnymi wariantami.
- Lepsze zrozumienie zmienności genetycznej w populacjach.
- Ustanowienie ram dla przyszłych badań genetycznych.
Wnioski
- Analiza na poziomie aminokwasów jest potężnym narzędziem w genetyce.
- Pomaga w identyfikacji potencjalnych wariantów związanych z chorobą.
- Dostarcza metodę dla badaczy do eksploracji zmienności genetycznej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Signal-to-noise analysis at the amino acid level enables biopharma R&D teams to prioritize variants of unknown significance by identifying pathogenic hotspots within protein sequences. This approach enhances target validation confidence by distinguishing disease-associated variation from population background noise. It supports mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, residue-level insights for variant interpretation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies amino acid residue hotspots with elevated pathogenic signal relative to background variation.
- Operational Value: Leverages public disease mutation databases and population sequencing data for scalable variant assessment.
- Predictive Value: Refines diagnostic weight of VUSs from clinical sequencing by highlighting functionally critical domains.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of variant frequency profiles aligned with protein topology for downstream functional screening.
- Operational Value: Standardizes variant prioritization using rolling average signal-to-noise ratios across sequence windows.
- Assay Readiness: Generates quantitative outputs that support reproducible compound effect evaluation in mutant backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects genetic variant likelihood to protein domain function, supporting disease-relevant model selection.
- Mechanistic De-risking: Highlights regions such as ion channel pores or selectivity filters where variants are more likely to disrupt function.
- Preclinical Alignment: Informs variant choice for in vitro and in vivo validation based on signal-to-noise elevation in key domains.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing a bioinformatics layer for variant interpretation prior to functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying variant enrichment at specific amino acid positions using disease and control cohort data.
- Screening: Delivers standardized, reproducible metrics for variant ranking that enable scalable assay design.
- Analytics: Produces signal-to-noise ratios and domain-overlay visualizations that help compare variant impact across genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects variant likelihood to known protein features such as binding domains or post-translational modification sites.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable framework for variant prioritization applicable across genes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in variant pathogenicity through residue-level signal-to-noise discrimination.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled minor allele frequency averaging and zero-avoidance adjustments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in VUS interpretation during target selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by focusing resources on variants with high signal in functionally validated domains.
Implementation Considerations
- Requires bioinformatics expertise in genetic variant handling and protein sequence analysis.
- Dependent on access to population genetic databases and disease-associated variant literature.
- Necessitates standardization of minor allele frequency calculation and rolling window parameters across teams.
- Involves adaptation considerations when applying to proteins with varying domain architectures or splice isoforms.
- Limited by the quality and depth of control cohort data, which affects background noise modeling accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Gene and Specific Splice Isoform Identification
1:37
Amino Acid Level Signal-to-Noise Calculation and Mapping
3:55
Protein Domain Topology and Variant Position Overlay
5:42
Results: Representative Amino Acid-Level Signal-to-Noise Analysis of KCNQ1-Encoded KCNQ1 (Kv7.1)
6:56
Conclusion
