Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów

Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów zapewnia miarę prawdopodobieństwa, że wariant genetyczny jest związany ze stanem chorobowym lub jest częścią naturalnej zmienności genetycznej w populacji. Technika ta wykorzystuje dwa duże zasoby genetyczne, mutacje związane z chorobą, dostępne w literaturze lub w domenie publicznej z populacyjnymi badaniami eksomów i genomu, które identyfikują rzadką wariancję genetyczną. Aby zidentyfikować konkretny gen i izoformę splicingu, który Cię interesuje, otwórz stronę główną Ensembl i wybierz gatunek z menu rozwijanego.

Wprowadź akronim odpowiadający interesującemu Cię genowi i kliknij przycisk Przejdź. Wybierz linki odpowiadające interesującemu genowi i interesowi transkrypcyjnemu oraz identyfikatorowi zainteresowania z tabeli Transkrypt. Zanotuj specyficzny dla transkryptu transkryptu RNA i iloczyn białkowy numerów identyfikacyjnych transkryptu RNA w kolumnie sekwencji referencyjnej tabeli transkryptów do wykorzystania w przyszłości.

Wybierz link powiązany z produktem białkowym o numerze identyfikacyjnym transkryptu RNA, aby otworzyć nową stronę internetową z National Center for Biotechnology Information lub NCBI Protein Database, i przewiń w dół do sekcji Origin, aby uzyskać pierwotną sekwencję białka dla interesującego nas transkryptu genu. Następnie przewiń w górę do sekcji Cechy, aby uzyskać listę cech białka. Aby obliczyć częstość alleli podrzędnych dla każdej pozycji aminokwasu z wariantem kontrolnym, otwórz arkusz kalkulacyjny z możliwością tworzenia wykresów i utwórz kolumnę z pozycjami wszystkich wariantów eksperymentalnych.

Usuń teksty wariantów, aby pozostawić tylko pozycje wariantów i posortuj warianty według wartości rosnącej, aby określić, które pozycje mają więcej niż jeden skojarzony wariant. Uzyskaj sumę wszystkich częstości występowania alleli drugorzędnych dla danej pozycji, łącząc częstość alleli drugorzędnych dla każdego wariantu związanego z daną pozycją i oblicz częstość występowania alleli drugorzędnych dla każdej pozycji aminokwasu z wariantem eksperymentalnym. Następnie utwórz kolumnę pozycji aminokwasów, które mają warianty eksperymentalne, i oblicz częstość występowania alleli drugorzędnych wszystkich wariantów związanych z tą pozycją dla wszystkich pozycji wariantów.

Aby utworzyć średnią kroczącą częstości występowania alleli drugorzędnych zarówno dla wariantu eksperymentalnego, jak i kontrolnego, utwórz kolumnę zawierającą wszystkie pozycje aminokwasów w genie będącym przedmiotem zainteresowania i dodaj częstość alleli podrzędnych równą zero dla wszystkich pozycji, które nie mają wariantów zarówno dla zestawu danych kontrolnych, jak i eksperymentalnych. Aby utworzyć średnią kroczącą dla każdej kolumny rozpowszechnienia eksperymentalnego i kontrolnego, należy utworzyć kolumnę reprezentującą średnią kroczącą częstości występowania alleli podrzędnych zarówno dla zbiorów danych kontrolnych, jak i eksperymentalnych, a w kolumnie średniej kroczącej umieścić średnią odpowiedniej częstości występowania allelu podrzędnego dla pięciu pozycji wariantu N i C na każdej pozycji. Aby obliczyć minimalną częstość kohorty, podziel najniższy allel poboczny zidentyfikowany przez dwa i wprowadź tę wartość w dowolnej komórce z częstotliwością kontrolnego allelu pobocznego równą zero.

Pozwoli to uniknąć dzielenia przez zero przy obliczaniu stosunku sygnału do szumu. Aby obliczyć stosunek sygnału do szumu na poziomie aminokwasów, podziel każdą eksperymentalną średnią kroczącą pozycji aminokwasu przez odpowiednią kontrolną średnią kroczącą i przedstaw ten stosunek w stosunku do pozycji aminokwasu. Aby zidentyfikować zgodne lokalizacje aminokwasów domen i cech funkcjonalnych lub obszary modyfikacji potranslacyjnej białka będącego przedmiotem zainteresowania, zidentyfikuj pozycje aminokwasów związane z domenami i cechami białka i otwórz stronę internetową NCBI.

Wprowadź produkt białkowy transkryptu RNA interesującego białka w polu wyszukiwania i zidentyfikuj znane domeny i cechy białka w obszarze Cechy. Zidentyfikuj i zanotuj nazwę i typ domeny oraz pozycje aminokwasów, a następnie wybierz link odpowiadający funkcji, aby zobrazować region w sekwencji pierwotnej białka będącego przedmiotem zainteresowania. Utwórz kolumnę obok kolumny sygnał-szum, aby można było odwoływać się do kolumny położenia aminokwasów, i zidentyfikuj komórki odpowiadające w końcowym aspekcie N lub C każdej domeny i funkcji.

Następnie umieść jedynkę w każdej komórce, utwórz wykres z tymi granicami na osi y i pozycją aminokwasów na osi x i nałóż ten wykres na wykres sygnału do szumu. Aby zmapować pozycje poszczególnych wariantów do nałożenia wykresów stosunku sygnału do szumu i topologii domeny białka, utwórz kolumnę obok kolumny cechy domeny tak, aby wiersze w kolumnie odpowiadały pozycjom aminokwasów, i umieść po jednym w każdej komórce w dodanym wierszu, odpowiadającą pozycji zawierającej odpowiedni wariant. Następnie utwórz wykres z tą kolumną jako osią y i pozycjami aminokwasów na osi x, a następnie nałóż ten wykres na wykresy topologii sygnału do szumu i białka.

W tym miejscu przedstawiono reprezentatywny wynik analizy sygnału do szumu na poziomie aminokwasów dla podrodziny Q kanału bramkowanego napięciem potasu w genie jeden. Wykazano rzadką wariancję zidentyfikowaną w kohorcie kontrolnej oraz eksperymentalnie przypadkowo zidentyfikowane sekwencjonowanie całych ekssome oraz warianty związane z zespołem długiego odstępu QT, które uważa się za prawdopodobnie związane z chorobą. Reprezentowane są również analizy sygnał-szum porównujące całe sekwencjonowanie ekssometyczne oraz częstość występowania wariantów kohorty zespołu długiego odstępu QT, znormalizowaną w stosunku do częstości występowania wariantów kohorty kontrolnej.

W tym eksperymencie warianty związane z zespołem długiego odstępu QT wykazały wysoki stosunek sygnału do szumu w domenach odpowiadających nalewaniu kanału, filtrowi selektywności i jednej domenie wiążącej podrodziny kanałów bramkowanych napięciem potasowym. Dla porównania, przypadkowo zidentyfikowane warianty w całej kohorcie sekwencjonowania exsome nie wykazały wyraźnie określonych regionów o wysokim wzroście sygnału do szumu, co sugeruje, że warianty te odzwierciedlają zmienność genetyczną tła. Metodologia ta może być stosowana do oceny wagi diagnostycznej wariantów o nieznanym znaczeniu, które pojawiają się podczas klinicznych badań genetycznych.