Technologia skanowania 3D łącząca mikroukłady i obrazy mózgu w makroskali w nowatorskim protokole osadzania nakładania się 3D
12 maja 2019
Ten artykuł przedstawia eksperymentalny protokół wykorzystujący technologię skanowania 3D, łączący dwie skale przestrzenne: makroskopową skalę przestrzenną anatomii całego mózgu obrazowaną przez MRI na >100 μm oraz mikroskopijną skalę przestrzenną rozkładów neuronalnych przy użyciu barwienia immunohistochemicznego i systemu wieloelektrodowego oraz innych metod (~10 μm).
Protokół ten jest pierwszym, który wprowadził technologię skanowania 3D w dziedzinie badań anatomicznych, a konkretnie neuroanatomicznych, i osiągnął bardzo dokładną wydajność nakładania się. Nakładanie się na siebie neuronów w 3D lub protokół neurologiczny 3D osadza sterylne oczodoły w skali mikro w obrazach mózgu w skali makro i płynnie łączy te różne skale przestrzenne. Musimy również zastosować protokół neurologiczny 3D do ludzkiego rezonansu magnetycznego i pośmiertnego mózgu.
Nakładanie się na siebie pozwala nam zidentyfikować znane wzorce kontrastu MRI związane z tym, disease. 3D systemy skanowania są wrażliwe na wodę otaczającą wyekstrahowany bioorganizm, dlatego bardzo ważne jest, aby bardzo dokładnie wycierać wodę. Ponadto zabieg musi być wykonany tak szybko, jak to możliwe.
Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania myszy, a także pobrania rezonansu magnetycznego i przygotowania sprzętu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Drugiego dnia przeciąć skórę głowy wcześniej poddanej eutanazji myszy wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą nożyczek chirurgicznych. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć czaszkę w kierunkach ukośnych od punktu lambda do punktu nieco przed bregmą.
Następnie delikatnie oderwij czaszkę od mózgu za pomocą zakrzywionej pęsety. Podnieś mózg szpatułką i przenieś go na szalkę Petriego z lodowatym roztworem do krojenia. Używając zewnętrznej bomby gazowej z kontrolowaną prędkością obrotową pompy, przepływa powietrze zawierające 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla, aby wytworzyć małe pęcherzyki w lodowatym roztworze do cięcia.
Po jednej do dwóch minut połóż mózg na ściereczce z mikrofibry, której powierzchnia jest lekko pokryta sitkiem do mąki. Delikatnie wytrzyj płyn z powierzchni mózgu za pomocą ściereczki z mikrofibry. Umieść mózg, grzbietową częścią do góry, na stojaku na próbki.
Następnie umieść stojak na próbki na środku automatycznego talerza obrotowego. Przyciemnij pomieszczenie podczas skanowania 3D i wykonaj skanowanie 3D na gramofonie. Aby sprawdzić, czy skanowanie 3D działa prawidłowo, kliknij opcję Skanowanie 3D, wybierając kąt między dwoma ujęciami jako 22,5, kąt początkowy jako zerowy, a kąt końcowy jako 360.
Przenieś mózg na szalkę Petriego i bąbelkuj mózg w roztworze tnącym przez około 10 sekund. Pokrój mózg na dwa bloki w środku płaszczyzny koronalnej za pomocą skalpela. Następnie delikatnie przesuń dwa bloki mózgowe na płaską powierzchnię za pomocą szpatułki chirurgicznej.
Przymocuj bloki mózgowe podstawy bloku mózgowego za pomocą kleju błyskawicznego. Delikatnie i ostrożnie wytrzyj płyn z powierzchni mózgu w ciągu jednej do dwóch minut za pomocą ściereczki z mikrofibry. Następnie ponownie wykonaj skanowanie 3D.
Przymocuj ostrze do uchwytu ostrza wibratomu. Przymocuj czarną taśmę pokrywającą środek podstawy bloku mózgu do środka etapu cięcia, aby uzyskać wibratom. Wlej roztwór tnący do etapu cięcia i ustaw etap cięcia na wibratomie.
Dostosuj prędkość i amplitudę cięcia. Zrób od dwóch do pięciu plasterków koronalnych o grubości 300 mikronów z dwóch bloków mózgu. Jeśli to możliwe, utrzymuj roztwór w fazie cięcia, bulgocząc.
Zoptymalizuj prędkość cięcia, częstotliwość i amplitudę drgań systemu, ustawiając je na 12,7 milimetra na minutę dla prędkości, od 87 do 88 Hz dla częstotliwości i od 0,8 do 1,0 milimetra dla szerokości obrotu. Podczas cięcia wycinków mózgu zapisz pokrojoną współrzędną w formacie, w tym współrzędną przednią i tylną, półkulą i innymi warunkami. Delikatnie przenieś plastry mózgu do zlewki wypełnionej wstępnie podgrzanym ACSF za pomocą grubej plastikowej pipety.
Inkubuj plastry mózgu w zlewce w temperaturze około 34 stopni Celsjusza przez godzinę. W tym czasie wykonaj skan 3D pozostałych bloków mózgowych na etapie cięcia. Teraz ustaw matrycę wieloelektrodową lub układ MEA na jednostce nagrywającej.
Podłącz chip do pompy perystaltycznej za pomocą dwóch rurek. Użyj jednej rurki, aby wprowadzić ten sam ACSF do chipa MEA, a drugiej rurki, aby wyprowadzić ACSF z chipa MEA. Przymocuj dwie igły, połączone na końcach dwóch rurek, do górnej części ścianki chipa MEA.
Ustal ich pozycje za pomocą końcówek podążających za wewnętrzną ścianką chipa MEA. Ustaw natężenie przepływu ACSF na 4.1 obr./min. Wykonaj przetwarzanie danych MRI w celu wyodrębnienia objętości kory mózgowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby wykonać przetwarzanie obrazu MRI, pobierz bezpłatne oprogramowanie 3D Slicer. Otwórz obrazy MR wyekstrahowanych mózgów, które zostały wyprodukowane przy użyciu modułów renderowania objętości i edytora we fragmentatorze 3D. Zmień tryb z edytora na renderowanie objętości i kliknij przycisk docelowy, aby obraz mózgu znalazł się na środku ekranu.
Wybierz tryb mózgu MRT-2 i dostosuj progi, przesuwając pasek zmiany biegów. Następnie wróć z renderowania objętościowego do edytora i kliknij przycisk efektu progu. Zastosuj etykietę 41, kora mózgowa.
Następnie zapisz dane powierzchni mózgu jako plik STL, zmieniając format pliku z VTK na STL na liście kontrolnej formularza. Wykonaj automatyczną korejestrację między ośmioma lub 16 obrazami wykonanymi pod ośmioma lub szesnastami różnych kątów w sekwencji skanowania, aby skorygować małe niezgodności. Aby to zrobić, kliknij opcję Rejestracja globalna zawarta w opcji wyrównania i zintegruj obrazy.
Powtórz skany pod różnymi kątami, aby uzyskać całą powierzchnię mózgu. Jeśli integracja między obrazami zeskanowanymi pod różnymi kątami nie powiodła się, kliknij opcję Wyrównanie ręczne i wybierz parę obrazu stałego i obrazu ruchomego. Rozpocznij ręczne wyrównywanie obrazów, wybierając trzy lub cztery wspólne punkty na różnych obrazach.
Następnie kliknij przycisk OK. Algorytm optymalizacji jest iteracyjnym algorytmem najbliższego punktu i nie obejmuje odkształcenia nieliniowego. Utwórz siatkę ze wszystkich wyrównanych obrazów, zaznaczając wszystkie obrazy i klikając przycisk generowania siatki. Następnie wybierz opcję, mały obiekt artystyczny, aby uzyskać siatkę w najwyższej rozdzielczości.
Zapisz obraz w formacie binarnym STL lub ASCII. Teraz otwórz powierzchnię MRI i połącz ją z powierzchnią skanu 3D za pomocą oprogramowania do obróbki powierzchni. Wykonaj proces ręcznego wyrównywania jak poprzednio.
Następnie ponownie zapisz te współzarejestrowane obrazy powierzchni. W razie potrzeby wyczyść poszczególne dane powierzchniowe, usuwając drobne szumy otaczające obszar mózgu, szczególnie w przypadku danych MRI, oraz wypełniając wszelkie, zwłaszcza w przypadku danych skanowania 3D. Na koniec otwórz dane powierzchni za pomocą oprogramowania do analizy danych, takiego jak MATLAB.
Wygeneruj i oceń histogramy minimalnych odległości między dwiema powierzchniami. Oceniano odległości między powierzchniami korowymi wytworzonymi przez zmniejszenie objętości MRI a powierzchniami uzyskanymi ze skanów 3D pobranych mózgów. Wartości trybu histogramu odległości wynoszą tylko 55 mikronów.
Dodatkowo, podczas akumulacji histogramu od punktu, w którym odległość jest równa zero, skumulowana wartość osiąga 90% całkowitej liczby próbek przy około 300 mikronach. Końcowy histogram odległości między dwiema powierzchniami pokazał typowy pik około 50 mikronów. Z makroskopowego punktu widzenia ta wartość modu odpowiada ograniczeniu geometrycznemu, które wynosiło 100 mikronów od wielkości woksela w rezonansie magnetycznym.
Ten punkt pośrednio sugeruje, że nakładający się algorytm między MRI a skanem 3D działał znakomicie, a poziomy szumów zarówno MRI, jak i skanowania 3D zostały stłumione jako niska wartość. Protokół ten jest pierwszym, który pojawił się dzięki technologii skanowania do bioorganizmów. Technologia ta była pierwotnie wykorzystywana do celów czysto inżynieryjnych.
Zastosowanie tej technologii w medycynie może odpowiedzieć na nowe pytania. Po skanowaniu 3D możemy wykorzystać zapisy gramów plastrów ścian z obrazowaniem wapnia, aby uzyskać wiedzę uzupełniającą w zakresie rozdzielczości czasowej i przestrzennej oraz możliwej do zapisania liczby komórek. Bardzo dokładna wydajność nakładania się, jaką zapewnia ten protokół, sprawi, że bezproblemowe powiązanie anatomicznej skali przestrzennej z zerową skalą przestrzenną będzie bardziej realistyczne niż wcześniej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowy eksperymentalny protokół wykorzystujący technologię skanowania 3D, która integruje zarówno anatomię mózgu w skali makro obrazowaną za pomocą rezonansu magnetycznego (>100 μm), jak i dystrybucje neuronowe w skali mikro za pomocą immunohistochemii i tablic wieloelektrodowych (~10 μm). Takie podejście umożliwia precyzyjne mapowanie struktur nerwowych i ich odpowiednich funkcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuroanatomia
- Wizoryzacja w naukach o umyśle
- Elektrofizjologia
Tło
- Badanie koncentruje się na rozwiązaniu wyzwania łączenia skal makroskopowych i mikroskopowych w badaniach neuroanatomicznych.
- Badanie dotyczy wiarygodności i dokładności technologii skanowania 3D w mapowaniu struktur mózgu.
- Ta metoda umożliwia szczegółowe badanie znanych wzorców kontrastu MRI związanych z chorobą.
- Istniejące protokoły są rozszerzone o włączenie zarówno żywych organizmów, jak i próbek pośmiertnych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu 3D, który osadzi informacje w skali mikro w obrazach anatomicznych w skali makro.
- Ułatwienie identyfikacji patologii związanych z określonymi strukturami mózgu.
- Poprawa ram metodologicznych dla badań neuroanatomicznych.
Zastosowane metody
- Główna platforma obejmuje technologię skanowania 3D zintegrowaną z obrazowaniem MRI.
- Kluczowym modelem biologicznym są pośmiertne mózgi myszy, za pomocą MRI i immunohistochemii.
- Kluczowe kroki obejmują staranne obchodzenie się z mózgiem, aby uniknąć skażenia, oraz dokładne protokoły skanowania.
- Wymaga określonych warunków temperaturowych i roztworów podczas przygotowania próbek.
- Do przetwarzania obrazów i scalania danych powierzchniowych wykorzystywane jest oprogramowanie 3D Slicer.
Główne wyniki
- Protokół osiąga wysoką precyzję w korelacji danych anatomicznych i elektrofizjologicznych.
- Potwierdza metody identyfikacji regionów mózgu zaangażowanych w zaburzenia neurologiczne.
- Zostają zauważone znaczne poprawki w rozdzielczości przestrzennej przy scalaniu technik obrazowania makro i mikro.
- Dzięki tej metodologii wzbogaca się wgląd w łączność nerwową i funkcjonalne regiony.
Wnioski
- To badanie wykazuje wykonalność wykorzystania zaawansowanej technologii skanowania 3D w badaniach neuroanatomicznych.
- Integracja różnych skal przestrzennych oferuje nowe wglądy w mechanizmy nerwowe i modele chorobowe.
- Ogólnie rzecz biorąc, metoda poprawia zrozumienie relacji struktura-funkcja mózgu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol bridges macroscopic and microscopic brain imaging scales, enabling precise spatial correlation of neural structures. By integrating 3D scanning with MRI and electrophysiology, it supports target validation through improved anatomical fidelity in disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models by reducing mechanistic ambiguity in multiscale brain mapping.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating micro-scale neuronal activity with macro-scale anatomical landmarks.
- Operational Value: Supports biological de-risking through accurate embedding of microconnectomes into whole-brain maps.
- Predictive Value: Improves target confidence by validating disease-associated MRI contrast patterns with microscopic resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving natural spiking in living brain cells during scanning.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise coregistration of MRI and 3D scan surfaces.
- Scalability: Highlights platform reuse potential via stable performance across individual mice and adaptability to human post-mortem tissue.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by enabling identification of known MRI contrast patterns relating to pathology.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation via multimodal data fusion.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports mechanistic de-risking by linking anatomical scales to functional electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from early target validation to preclinical mechanistic studies, supported by its ability to integrate structural and functional data across scales.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification through spatial correlation of micro- and macro-scale data.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via quantitative distance histograms showing 50 μm mode error between modalities.
- Analytics: Highlights measurements and statistical outputs such as minimum distance histograms and accumulated frequency thresholds that enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through disease-related MRI pattern detection in validated anatomical maps.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multi-modal brain mapping across species and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in multiscale neuroanatomical mapping.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability demonstrated through stable performance across individual mice.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via improved target-to-mechanism linkage.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions enabled by anatomically precise functional mapping.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroanatomy, 3D imaging, and electrophysiology.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 3D scanners, MRI systems, vibratomes, and surface processing software.
- Cross-team standardization requirements for sample handling, scanning speed, and environmental control to prevent tissue degradation.
- Adaptation considerations across model systems, including transition from mouse to human post-mortem brains.
- Practical limitations supported by source material: sensitivity to water contamination and necessity for rapid processing to maintain sample integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:09
Brain Surface Scan, Slicing, and Multi-electrode Array Recording
5:23
MRI Image Processing to Stripe Cortical Surfaces
6:32
Preprocessing for 3D Scan Data and Coregistration of the MRI Surface and the 3D Scan Surface
8:18
Results: Overlapping Accuracy Between MRIs and 3D Scans
9:17
Conclusion
