Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Komórki plazmatyczne to rzadkie komórki, w których występuje 30 etapów różnicowania w lokalizacjach anatomicznych, które upośledzają pełną charakterystykę biologiczną, szczególnie u człowieka. Nasz model różnicowania komórek plazmatycznych B2 in vitro odtwarza sekwencyjne różnicowanie i dojrzewanie komórek zachodzące w różnych narządach in vivo. Ten model in vitro podsumowuje skoordynowane zmiany transkrypcyjne i fenotyp różnych etapów komórek plazmatycznych B2, które można wykryć in vivo.

Zbudowaliśmy również ogólnodostępne narzędzia bioinformatyczne do analizy najważniejszych informacji pochodzących z danych eksploracyjnych związanych z różnicowaniem komórek plazmatycznych. Procedurę zademonstruje Hugues de Boussac, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek pobierz komórki krwi obwodowej od zdrowych ochotników w celu oczyszczenia komórek B pamięci.

Rozcieńczyć 7,5 mililitra krwi 24,5 mililitrami pożywki RPMI 1640. Następnie dodaj 12,5 mililitra gradientu gęstości w temperaturze pokojowej do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Delikatnie nałożyć gradient gęstości na 32 mililitry rozcieńczonej krwi, upewniając się, że minimalizujesz mieszanie się dwóch faz.

Wirować przez 20 minut przy 500-krotności grawitacji przy wyłączonym hamulcu. Zebrać jednojądrzaste komórki krwi obwodowej z rozcieńczonego pasma gradientu osocza i gęstości. Przenieś komórki do sterylnej 50-mililitrowej probówki i napełnij probówkę do 45 mililitrów zrównoważonym roztworem soli Hanka.

Wirować przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad. Następnie dodaj 45 mililitrów pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% FCS.

Wirować przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad. Dodaj 30 mililitrów PBS, uzupełnionych 2% FCS.

Użyj kulek magnetycznych anty-CD, aby usunąć komórki CD2-dodatnie, dodając cztery koraliki do jednej komórki docelowej. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą magnesu do separacji komórek oddziel komórki związane koralikami od komórek niezwiązanych.

Zebrać niezwiązane komórki i inkubować je z przeciwciałami anty-CD19 APC i anty-CD27 PE przez piętnaście minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki dwukrotnie w PBS zawierającym 10% koziej surowicy. Następnie użyj sortera komórek, aby oczyścić komórki B pamięci do czystości 95%.

Następnie dodaj rozpuszczalny ligand CD40 i przeciwciało monoklonalne przeciwko polihistydynie w celu aktywacji komórek B pamięci. Umieść oczyszczone komórki B pamięci na sześciodołkowych płytkach hodowlanych przez cztery dni z interleukiną-2, interleukiną-10 i interleukiną-15. Do profilowania ekspresji genów użyj sortera komórek, aby oczyścić CD38-ujemne CD20-ujemne preplazmablasty w czwartym dniu.

Czwartego dnia policz komórki i umieść je na 12-dołkowych płytkach hodowlanych o gęstości komórek 250 000 komórek na mililitr, dodając dwa mililitry zawiesiny komórek do każdej studzienki. Aby wywołać różnicowanie, należy usunąć oligonukleotydy CPG i rozpuszczalny ligand CD40 i dodać nową pożywkę hodowlaną zawierającą nowy koktajl cytokin, w tym interleukinę-2, interleukinę-6, interleukinę-10 i interleukinę-15. Hoduj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Do profilowania ekspresji genów użyj sortera komórek, aby oczyścić plazmablasty CD38-dodatnie, CD20-ujemne w siódmym dniu. Siódmego dnia policz komórki. Umieść komórki na 12-dołkowych płytkach hodowlanych o gęstości komórek 500 000 komórek na studzienkę, dodając dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.

Różnicować plazmablasty we wczesne komórki plazmatyczne za pomocą świeżej pożywki hodowlanej zawierającej interleukinę-6, interleukinę-15 i interferon-alfa przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Do profilowania ekspresji genów użyj sortera komórek, aby oczyścić wczesne komórki plazmatyczne CD20-ujemne, CD38-dodatnie, CD138-dodatnie w dniu 10. Najpierw hoduj komórki zrębu przez pięć dni z pożywką hodowlaną.

Użyj filtra o pojemności 0,2 mikrolitra, aby przefiltrować supernatant do hodowli komórek zrębu, aby uzyskać pożywkę kondycjonowaną komórkami zrębu i zamrozić, aż będzie gotowy do użycia. Następnie hoduj wczesne komórki plazmatyczne na 12-dołkowych płytkach hodowlanych, używając wcześniej uzyskanej pożywki z komórek zrębu z interleukiną-6 i APRIL przy gęstości komórek 500 000 komórek na studzienkę, dodając dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, co tydzień odnawiając pożywkę kondycjonowaną komórkami zrębu.

Następnie zmierz wydzielanie immunoglobuliny z komórek plazmatycznych posortowanych cytometrią przepływową. Hodować komórki plazmatyczne o gęstości miliona komórek na mililitr przez 24 godziny i zebrać supernatant hodowli. Korzystając z zestawu ELISA, zmierz immunoglobulinę G i immunoglobulinę A.Najpierw uruchom ogólnodostępne narzędzie internetowe bioinformatyczne GenomicScape.

W menu przeglądania danych wybierz zestaw danych o nazwie ludzkie komórki B do komórek plazmatycznych. Wizualizacja profilu ekspresji genów unikalnego genu lub listy genów jest dostępna za pomocą narzędzia Raport ekspresji/koekspresji w Narzędziach analizy. Następnie wybierz pozycję Narzędzia analizy webSAM, aby załadować narzędzie SAM.

Wybierz zestaw danych ludzkich komórek B do komórek plazmatycznych i wybierz grupę próbek do porównania. Użyj różnych dostępnych filtrów, aby zastosować interesujące Cię opcje filtrowania. Aby porównać profile ekspresji genów za pomocą narzędzia SAM, zmodyfikuj opcje filtrowania, w tym zmianę krotności, liczbę permutacji, współczynnik fałszywych odkryć i typ porównania.

Oprogramowanie obliczy analizę i dostarczy geny o zróżnicowanej ekspresji między wybranymi grupami. W niniejszym badaniu badane są zmiany ekspresji czynników epigenetycznych w prawidłowym różnicowaniu komórek plazmatycznych. Korzystając z wieloklasowej analizy SAM, zaobserwowano, że 71 genów ulega znaczącej zróżnicowanej ekspresji między komórkami B pamięci, preplazmablastami, plazmablastami, wczesnymi komórkami plazmatycznymi i komórkami plazmatycznymi szpiku kostnego ze wskaźnikiem fałszywych odkryć poniżej 5%Etap komórek B pamięci charakteryzuje się nadekspresją 23 epigenetycznych genów gracza, w tym 39,13% acetylotransferaz histonowych, 30,43% metylotransferaz histonowych, 21,74% demetylazy histonowych, 4,35% białek wiążących metyl i 4,35% deacetylaz histonowych.

14 epigenetycznych genów gracza ulega znacznej nadekspresji na etapie preplazmablastów, w tym 50% metylotransferaz histonowych, 14,28% metylotransferaz DNA, 21,43% deacetylaz histonowych, 7,14% demetylaz histonowych i 17,14% acetylotransferaz histonowych. Po tej procedurze można przeprowadzić kilka analiz w celu zidentyfikowania i zrozumienia zmian w strukturze i architekturze chromatyny podczas różnicowania komórek plazmatycznych B2. Ten model różnicowania in vitro pozwoli na wygenerowanie wystarczającej liczby komórek, aby ukończyć tę analizę molekularną, aby ujawnić zarówno szlaki zaangażowane w całe to modelowanie, jak i ich dalszy wpływ transkrypcyjny podczas różnicowania komórek plazmatycznych B2.

Wiedza uzyskana dzięki tym badaniom może dostarczyć informacji i wskazówek dotyczących strategii diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, nowotwór, na który nie ma ostatecznego lekarstwa, w przypadku którego niezwykle potrzebne jest lepsze rokowanie i ulepszone strategie terapeutyczne. Szczególnie interesujące będzie scharakteryzowanie i zrozumienie zmian strukturalnych i architektonicznych związanych z przebudową epigenetyczną, które wpływają na chromatynę podczas różnicowania komórek plazmatycznych B2. Można to zrobić za pomocą sekwencjonowania genów, ERRBS, sekwencjonowania ATAC, sekwencjonowania IC i RNA.

Umiarkowaną niejednorodność można zaobserwować w odsetku aktywowanych limfocytów B, preplazmablastów, plazmablastów i komórek plazmatycznych, w zależności od zdrowej krwi dawcy, wykorzystywanych do oczyszczania komórek B pamięci.