Name: Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj model in vitro różnicowania ludzkich komórek B pamięci do komórek plazmatycznych z wykorzystaniem wieloetapowych systemów hodowlanych. Ta metoda pozwala badać zmiany transkrypcyjne i fenotypowe w immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z francuskiego Instytutu INCA (Institut National du Cancer) (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) i ITMO Cancer (MM&TT).

Protokół jest zgodny z wytycznymi, zgodnie z Deklaracją Helsińską i zgodą Centrum Zasobów Biologicznych Szpitala Uniwersyteckiego w Montpellier.
1. Model normalnego różnicowania komórek plazmatycznych in vitro
UWAGA: Komputery są generowane przez czteroetapową kulturę11,12,13.
<ol>
	<li>Amplifikacja i różnicowanie limfocytów B
	<ol>
		<li>Użyj komórek krwi obwodowej od zdrowych ochotników do oczyszczenia komórek B pamięci.</li>
		<li>Rozcieńczyć 7,5 ml krwi w 24,5 ml pożywki RPMI 1640.</li>
		<li>Dodaj 12,5 ml gradientu gęstości w temperaturze pokojowej (np. Ficoll) do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie nałożyć gradient gęstości na 32 ml rozcieńczonej krwi. Zminimalizuj mieszanie dwóch faz.</li>
		<li>Wirować przez 20 minut przy 500 x g przy wyłączonym hamulcu. Zebrać PBMC z rozcieńczonego interfejsu osocza/gradientu gęstości i umieścić komórki w sterylnej probówce o pojemności 50 ml i uzupełnić do 45 ml zrównoważonym roztworem soli Hanka.</li>
		<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 500 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad.</li>
		<li>Dodać 45 ml RPMI1640/10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i odwirować 5 minut przy 500 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad. Dodać 30 ml PBS/2% FCS.</li>
		<li>Usuń komórki CD2 + za pomocą kulek magnetycznych anty-CD2. Dodaj 4 koraliki do jednej komórki docelowej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
		<ol>
			<li>Oddziel komórki związane koralikami od komórek niezwiązanych za pomocą magnesu do separacji komórek. Zebrać niezwiązane komórki i inkubować osad komórkowy z przeciwciałami anty CD19 APC i anty CD27 PE przez 15 minut w temperaturze 4 °C (2 μl przeciwciała na10-6 komórek).</li>
			<li>Umyć dwukrotnie w PBS/10% koziej surowicy.</li>
			<li>Usuń zdarzenia zanieczyszczające zarówno na powierzchniach FSC, jak i SSC. Wykreśl pojedyncze elementy na poletkach FSC-A vs FSC-H i SSC-A vs SSC-H, aby usunąć szczątki i wybrać całkowitą populację leukocytów. Wybierz komórki B pamięci na CD19/CD27 i CD19+CD27+.</li>
			<li>Oczyść MBC za pomocą sortera komórek o czystości 95%.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj wszystkie etapy hodowli przy użyciu IMDM i 10% FCS, uzupełnionych 50 mg/ml ludzkiej transferyny i 5 mg/ml ludzkiej insuliny.</li>
		<li>Oczyszczone MBC na płytkach z sześciodołkowymi płytkami hodowlanymi (1,5 x 105 MBCs/ml w 5 ml / dołku) przez 4 dni z IL-2 (20 U/ml), IL-10 (50 ng / ml) i IL-15 (10 ng / ml).
		<ol>
			<li>Dodaj fosforonian CpG ODN 2006, rekombinowany rozpuszczalny w człowieku CD40L znakowany histydyną (sCD40L; 50 ng / ml) i mAb anty-polihistydyny (5 mg / ml) w celu aktywacji MBC (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Aktywacja przez sCD40L lub ODN tylko tym samym koktajlem cytokin daje niższą amplifikację12. Opisana tutaj kombinacja sygnałów aktywacji doprowadziła do maksymalnej liczby aktywowanych limfocytów B i PrePBs11,12 (Rysunek 1).</li>
			<li>W celu profilowania ekspresji genów należy oczyścić CD38-/CD20- PrePB w 4. dniu za pomocą sortera komórek (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie komórek plazmablastycznych
	<ol>
		<li>W 4 dniu policz komórki.</li>
		<li>Komórki płytki w 12-dołkowych płytkach hodowlanych w proporcjach 2,5 x 105/ml w 2 ml/dołku.</li>
		<li>Indukuj różnicowanie poprzez usunięcie oligonukleotydów CpG i sCD40L oraz dodanie nowej pożywki hodowlanej z nowym koktajlem cytokin, w tym IL-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) i IL-15 (10 ng/mL) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Hodowla komórek przez 3 dni (od dnia 4 do dnia 7) w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W celu profilowania ekspresji genów należy oczyścić PB CD38 + / CD20-PB w 7 dniu za pomocą sortera komórek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wczesne wytwarzanie komórek plazmatycznych
	<ol>
		<li>W 7 dniu policz komórki.</li>
		<li>Komórki płytki w 12-dołkowych płytkach hodowlanych w formacie 5 x 105/ml w 2 ml/dołku.</li>
		<li>Różnicować PB we wczesnych komputerach PC przy użyciu świeżej pożywki hodowlanej z IL-6 (50 ng/ml), IL-15 (10 ng/ml) i IFN-α (500 U/ml) przez 3 dni w temperaturze 37 °C. W celu profilowania ekspresji genów oczyść wczesne PC CD20-/CD38+/CD138+ w dniu 10 za pomocą sortera komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Długowieczne wytwarzanie komórek plazmatycznych
	<ol>
		<li>Zróżnicuj wczesne BG na długowieczne BG poprzez zmianę warunków hodowli.</li>
		<li>Hodować komórki na 12-dołkowych płytkach hodowlanych w temperaturze 5 x 105/ml w 2 ml/baseniku lub na 24-dołkowych płytkach hodowlanych w 1 ml/baseniku w temperaturze 37 °C, używając IL-6 i pożywki kondycjonowanej komórkami zrębu i APRIL (200 ng/ml).</li>
		<li>Uzyskać pożywkę kondycjonowaną komórkami zrębu przez hodowlę komórek zrębu przez 5 dni za pomocą pożywki hodowlanej. Przefiltrować supernatant do hodowli komórek zrębu (0,2 μm) i zamrozić.</li>
		<li>Dodaj 50% pożywek kondycjonowanych komórkami zrębu do kultur PC z odnawianiem co tydzień. Wygenerowane długotrwałe komputery mogą być utrzymywane przez miesiące13. Długoterminowe przeżycie PC można było uzyskać tylko z IL-6 i APRIL, jak podano13.</li>
		<li>Zmierz wydzielanie Ig z komputerów posortowanych metodą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Hodowla PC w 10-6 komórkach/ml przez 24 godziny i zbiór supernatantu kultury. Zmierz IgG i IgA za pomocą zestawów do testów immunoenzymatycznych (ELISA) dla ludzi11,12,13. Mediana wydzielania IgG wahała się od 10 pg/komórkę/dzień w 10. dniu do 17 pg/komórkę/dzień w dniu 6013.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Atlas molekularny różnicowania B do PC
UWAGA: Zbudowaliśmy wygodne i otwarte narzędzia bioinformatyczne do wyodrębniania i wizualizacji najważniejszych informacji z danych GEP Affymetrix związanych z różnicowaniem komputerów PC (GenomicScape)15. GEP są publicznie dostępne w bazie danych ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), w tym oczyszczonych MBC, PrePBs, PB i EPC: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 i E-MEXP-3034 oraz BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape jest ogólnodostępnym narzędziem internetowym.
<ol>
	<li>Wybór zestawu danych B do PC
	<ol>
		<li>Wybierz zestaw danych B do komputera w menu Przeglądaj dane w otwartym narzędziu bioinformatycznym (http://www.genomicscape.com) GenomicScape o nazwie Ludzkie komórki B do komórek plazmatycznych. Wizualizacja profilu ekspresji genów unikalnego genu lub listy genów jest dostępna za pomocą narzędzia Raport ekspresji-koekspresji w Narzędziach Analitycznych dostępnych na stronie głównej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza nadzorowana i analiza głównych składowych (PCA)
	<ol>
		<li>Wybierz Narzędzia analizy | webSAM, aby załadować narzędzie SAM.</li>
		<li>Wybierz zestaw danych Ludzkie komórki B do komórek plazmatycznych i wybierz grupy próbek do porównania.</li>
		<li>Użyj różnych dostępnych filtrów, aby zastosować interesujące Cię opcje filtrowania.</li>
		<li>Aby porównać profile ekspresji genów za pomocą narzędzia SAM, zmodyfikuj opcje filtrowania, w tym zmianę krotności, liczbę permutacji, współczynnik fałszywych odkryć i typ porównania. GenomicScape przeprowadzi analizę i dostarczy geny o zróżnicowanej ekspresji między wybranymi grupami.</li>
		<li>Uruchom analizę składowych głównych, wybierając opcję Analiza składowych głównych w menu Narzędzia analizy.</li>
		<li>Wybierz zestaw danych Ludzkie komórki B do komórek plazmatycznych i wybierz grupy zainteresowania.</li>
		<li>Wklej listę interesujących Cię genów lub wybierz geny zgodnie z wariancją. Aby wkleić listę genów, wybierz Aby przeanalizować listę genów/ncRNA, kliknij tutaj.... Genomicscape obliczy PCA, które będzie można zwizualizować i pobrać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
<li>Ramachandrareddy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL6+promoter+interacts+with+far+upstream+sequences+with+greatly+enhanced+activating+histone+modifications+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).</li>
<li>Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+BCL6-interacting+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).</li>
<li>McManus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax5+regulates+its+target+genes+by+recruiting+chromatin-modifying+proteins+in+committed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells.</a> The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).</li>
<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

U człowieka PC są rzadkimi komórkami, których etapy różnicowania zachodzą w miejscach anatomicznych, które utrudniają pełną charakterystykę biologiczną. Opracowaliśmy model różnicowania in vitro B do PC przy użyciu wieloetapowych systemów hodowli, w których następnie stosuje się różne kombinacje cząsteczek aktywacyjnych i cytokin w celu odtworzenia sekwencyjnego różnicowania komórek zachodzącego w różnych narządach/tkankach in vivo 11,12,13.<sup class=...

Różnicowanie komórek B do komórek plazmatycznych (PC) jest niezbędne dla odporności humoralnej i ochrony gospodarza przed infekcjami1. Różnicowanie B do PC wiąże się z poważnymi zmianami w zdolności transkrypcyjnej i metabolizmie w celu dostosowania się do wydzielania przeciwciał. Czynniki transkrypcyjne, które kontrolują różnicowanie B do PC, zostały szeroko zbadane i ujawniły ekskluzywne sieci, w tym czynniki transkrypcyjne specyficzne dla B i PC (TF)2. W komórkach B TF PAX5, BCL6 i BACH2 są strażnikami tożsamości komórek B2,3. Indukcja IRF4, PRDM1 kodujących BLIMP1 i XBP1 PC TF wygaśnie geny komórek B i wywoła skoordynowany program transkrypcyjny komórek wydzielających przeciwciała3,4,5. Te skoordynowane zmiany transkrypcyjne są związane z aktywacją transkrypcji genów Ig wraz z przejściem z formy związanej z błoną na wydzielaną formę łańcucha ciężkiego immunoglobuliny2,3,4. Różnicowanie B do PC jest związane z indukcją genów zaangażowanych w retikulum endoplazmatyczne i funkcje aparatu Golgiego wraz z aktywacją odpowiedzi na niesfałdowane białko (UPR), o której wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w PC poprzez adaptację syntezy wydzielanych immunoglobulin6,7. TF XBP1 odgrywa główną rolę w tej adaptacji komórkowej8,9,10.
B komórki i komputery są kluczowymi graczami odporności humoralnej. Zrozumienie procesów biologicznych, które kontrolują produkcję i przeżycie normalnych komórek plazmatycznych, ma kluczowe znaczenie w interwencjach terapeutycznych, które muszą zapewnić skuteczną odpowiedź immunologiczną i zapobiec autoimmunizacji lub niedoborowi odporności. PC to rzadkie komórki, których wczesne etapy różnicowania zachodzą w lokalizacjach anatomicznych, które utrudniają pełną charakterystykę biologiczną, szczególnie u człowieka. Korzystając z wieloetapowych systemów hodowli, opisaliśmy model różnicowania in vitro B do PC. Model ten odtwarza sekwencyjne różnicowanie i dojrzewanie komórek zachodzące w różnych narządach in vivo11,12,13. W pierwszym etapie komórki B pamięci są najpierw aktywowane przez cztery dni przez ligand CD40, oligodeoksynukleotydy i kombinację cytokin i różnicują się w preplazmablasty (PrePB). W drugim etapie preplazmablasty są indukowane do różnicowania się w plazmablasty (PB) poprzez usunięcie stymulacji CD40L i oligodeoksynukleotydów oraz zmianę kombinacji cytokin. W trzecim etapie plazmblasty są indukowane do różnicowania się we wczesne PC poprzez zmianę kombinacji cytokin11,12. Wprowadzono czwarty krok, aby uzyskać w pełni dojrzałe PC poprzez hodowlę tych wczesnych PC za pomocą komórek zrębu szpiku kostnego kondycjonowanych pożywką lub wybranymi czynnikami wzrostu13. Te dojrzałe bakterie mogą przetrwać kilka miesięcy in vitro i wydzielać duże ilości immunoglobuliny (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Co ciekawe, nasz model in vitro podsumowuje skoordynowane zmiany transkrypcyjne i fenotyp różnych etapów od B do PC, które można wykryć in vivo11,12,13,14,15. PC są rzadkimi komórkami, a nasz model różnicowania in vitro pozwala na badanie różnicowania ludzi B i PC.

<table><tbody><tr><td>Koraliki magnetyczne anty-CD2</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>Lek przeciwhistydynowy</td><td>R& D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>Sigma</td><td></td><td>T*C*G*T*C*G*T*T*C* G*T*T*T*T*T*G*T*T*T*T*T</td></tr><tr><td>transfer człowieka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Recombinan Human CD40L-hi</td><td>R& D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek KWIECIEŃ</td><td>R& D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek IL-10</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-Rekombinowane</td><td></td></tr> <tr><td>ludzkie białko IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-Rekombinowany</td><td></td></tr> <tr><td>ludzki IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

model różnicowania in vitro ludzkich komórek b normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Komórki plazmatyczne (PC) wydzielają duże ilości przeciwciał i rozwijają się z komórek B, które zostały aktywowane. PC są rzadkimi komórkami znajdującymi się w szpiku kostnym lub błonie śluzowej i zapewniają odporność humoralną. Ze względu na ich niską częstotliwość i lokalizację, badanie komputerów PC jest trudne u ludzi. Przedstawiliśmy model różnicowania B do PC in vitro przy użyciu wybranych kombinacji cytokin i cząsteczek aktywacyjnych, które pozwalają odtworzyć sekwencyjne różnicowanie komórek zachodzące in vivo. W tym modelu in vitro limfocyty B pamięci (MBC) będą różnicować się w preplazmablasty (prePB), plazmablasty (PB), wczesne PC i wreszcie w długożyciowe PC, z fenotypem zbliżonym do ich odpowiedników u zdrowych osób. Zbudowaliśmy również ogólnodostępne narzędzia bioinformatyczne do analizy najważniejszych informacji z danych GEP związanych z różnicowaniem PC. Zasoby te można wykorzystać do badania różnicowania ludzkiego B do PC, a w obecnym badaniu badaliśmy regulację ekspresji genów czynników epigenetycznych podczas różnicowania człowieka B do PC.

Całkowita procedura różnicowania prawidłowych komórek plazmatycznych (PC) in vitro przedstawiona jest na Rysunku 1. Stosując przedstawiony tutaj protokół, udało nam się wygenerować odpowiednią ilość komórek, której nie można było uzyskać z ludzkich próbek ex vivo. Mimo że zbadano rolę złożonej sieci czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w różnicowanie PC, mechanizmy regulujące kluczowe sieci transkrypcyjne różnicowania PC pozostają słabo znane. Różnicowan...

Korzystając z wieloetapowych systemów hodowli, raportujemy in vitro model różnicowania komórek B do komórek plazmatycznych.

Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Komórki plazmatyczne to rzadkie komórki, w których występuje 30 etapów różnicowania w lokalizacjach anatomicznych, które upośledzają pełną charakterystykę biologiczną, szczególnie u człowieka. Nasz model różnicowania komórek plazmatycznych B2 in vitro odtwarza sekwencyjne różnicowanie i dojrzewanie komórek zachodzące w różnych narządach in vivo. Ten model in vitro podsumowuje skoordynowane zmiany transkrypcyjne i fenotyp różnych etapów komórek plazmatycznych B2, które można wykryć in vivo.Zbudowaliśmy również ogólnodostępne narzędzia bioinformatyczne do analizy najważniejszych informacji pochodzących z danych eksploracyjnych związanych z różnicowaniem komórek plazmatycznych. Procedurę zademonstruje Hugues de Boussac, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek pobierz komórki krwi obwodowej od zdrowych ochotników w celu oczyszczenia komórek B pamięci.Rozcieńczyć 7,5 mililitra krwi 24,5 mililitrami pożywki RPMI 1640. Następnie dodaj 12,5 mililitra gradientu gęstości w temperaturze pokojowej do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Delikatnie nałożyć gradient gęstości na 32 mililitry rozcieńczonej krwi, upewniając się, że minimalizujesz mieszanie się dwóch faz.Wirować przez 20 minut przy 500-krotności grawitacji przy wyłączonym hamulcu. Zebrać jednojądrzaste komórki krwi obwodowej z rozcieńczonego pasma gradientu osocza i gęstości. Przenieś komórki do sterylnej 50-mililitrowej probówki i napełnij probówkę do 45 mililitrów zrównoważonym roztworem soli Hanka.Wirować przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad. Następnie dodaj 45 mililitrów pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% FCS.Wirować przy 500-krotności grawitacji przez pięć minut. Ostrożnie usunąć supernatant i zachować osad. Dodaj 30 mililitrów PBS, uzupełnionych 2% FCS.Użyj kulek magnetycznych anty-CD, aby usunąć komórki CD2-dodatnie, dodając cztery koraliki do jednej komórki docelowej. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Za pomocą magnesu do separacji komórek oddziel komórki związane koralikami od komórek niezwiązanych.Zebrać niezwiązane komórki i inkubować je z przeciwciałami anty-CD19 APC i anty-CD27 PE przez piętnaście minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki dwukrotnie w PBS zawierającym 10% koziej surowicy. Następnie użyj sortera komórek, aby oczyścić komórki B pamięci do czystości 95%.Następnie dodaj rozpuszczalny ligand CD40 i przeciwciało monoklonalne przeciwko polihistydynie w celu aktywacji komórek B pamięci. Umieść oczyszczone komórki B pamięci na sześciodołkowych płytkach hodowlanych przez cztery dni z interleukiną-2, interleukiną-10 i interleukiną-15. Do profilowania ekspresji genów użyj sortera komórek, aby oczyścić CD38-ujemne CD20-ujemne preplazmablasty w czwartym dniu.Czwartego dnia policz komórki i umieść je na 12-dołkowych płytkach hodowlanych o gęstości komórek 250 000 komórek na mililitr, dodając dwa mililitry zawiesiny komórek do każdej studzienki. Aby wywołać różnicowanie, należy usunąć oligonukleotydy CPG i rozpuszczalny ligand CD40 i dodać nową pożywkę hodowlaną zawierającą nowy koktajl cytokin, w tym interleukinę-2, interleukinę-6, interleukinę-10 i interleukinę-15. Hoduj komórki przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Do profilowania ekspresji genów użyj sortera komórek, aby oczyścić plazmablasty CD38-dodatnie, CD20-ujemne w siódmym dniu. Siódmego dnia policz komórki. Umieść komórki na 12-dołkowych płytkach hodowlanych o gęstości komórek 500 000 komórek na studzienkę, dodając dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.Różnicować plazmablasty we wczesne komórki plazmatyczne za pomocą świeżej pożywki hodowlanej zawierającej interleukinę-6, interleukinę-15 i interferon-alfa przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Do profilowania ekspresji genów użyj sortera komórek, aby oczyścić wczesne komórki plazmatyczne CD20-ujemne, CD38-dodatnie, CD138-dodatnie w dniu 10. Najpierw hoduj komórki zrębu przez pięć dni z pożywką hodowlaną.Użyj filtra o pojemności 0,2 mikrolitra, aby przefiltrować supernatant do hodowli komórek zrębu, aby uzyskać pożywkę kondycjonowaną komórkami zrębu i zamrozić, aż będzie gotowy do użycia. Następnie hoduj wczesne komórki plazmatyczne na 12-dołkowych płytkach hodowlanych, używając wcześniej uzyskanej pożywki z komórek zrębu z interleukiną-6 i APRIL przy gęstości komórek 500 000 komórek na studzienkę, dodając dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, co tydzień odnawiając pożywkę kondycjonowaną komórkami zrębu.Następnie zmierz wydzielanie immunoglobuliny z komórek plazmatycznych posortowanych cytometrią przepływową. Hodować komórki plazmatyczne o gęstości miliona komórek na mililitr przez 24 godziny i zebrać supernatant hodowli. Korzystając z zestawu ELISA, zmierz immunoglobulinę G i immunoglobulinę A.Najpierw uruchom ogólnodostępne narzędzie internetowe bioinformatyczne GenomicScape.W menu przeglądania danych wybierz zestaw danych o nazwie ludzkie komórki B do komórek plazmatycznych. Wizualizacja profilu ekspresji genów unikalnego genu lub listy genów jest dostępna za pomocą narzędzia Raport ekspresji/koekspresji w Narzędziach analizy. Następnie wybierz pozycję Narzędzia analizy webSAM, aby załadować narzędzie SAM.Wybierz zestaw danych ludzkich komórek B do komórek plazmatycznych i wybierz grupę próbek do porównania. Użyj różnych dostępnych filtrów, aby zastosować interesujące Cię opcje filtrowania. Aby porównać profile ekspresji genów za pomocą narzędzia SAM, zmodyfikuj opcje filtrowania, w tym zmianę krotności, liczbę permutacji, współczynnik fałszywych odkryć i typ porównania.Oprogramowanie obliczy analizę i dostarczy geny o zróżnicowanej ekspresji między wybranymi grupami. W niniejszym badaniu badane są zmiany ekspresji czynników epigenetycznych w prawidłowym różnicowaniu komórek plazmatycznych. Korzystając z wieloklasowej analizy SAM, zaobserwowano, że 71 genów ulega znaczącej zróżnicowanej ekspresji między komórkami B pamięci, preplazmablastami, plazmablastami, wczesnymi komórkami plazmatycznymi i komórkami plazmatycznymi szpiku kostnego ze wskaźnikiem fałszywych odkryć poniżej 5%Etap komórek B pamięci charakteryzuje się nadekspresją 23 epigenetycznych genów gracza, w tym 39,13% acetylotransferaz histonowych, 30,43% metylotransferaz histonowych, 21,74% demetylazy histonowych, 4,35% białek wiążących metyl i 4,35% deacetylaz histonowych.14 epigenetycznych genów gracza ulega znacznej nadekspresji na etapie preplazmablastów, w tym 50% metylotransferaz histonowych, 14,28% metylotransferaz DNA, 21,43% deacetylaz histonowych, 7,14% demetylaz histonowych i 17,14% acetylotransferaz histonowych. Po tej procedurze można przeprowadzić kilka analiz w celu zidentyfikowania i zrozumienia zmian w strukturze i architekturze chromatyny podczas różnicowania komórek plazmatycznych B2. Ten model różnicowania in vitro pozwoli na wygenerowanie wystarczającej liczby komórek, aby ukończyć tę analizę molekularną, aby ujawnić zarówno szlaki zaangażowane w całe to modelowanie, jak i ich dalszy wpływ transkrypcyjny podczas różnicowania komórek plazmatycznych B2.Wiedza uzyskana dzięki tym badaniom może dostarczyć informacji i wskazówek dotyczących strategii diagnostycznych i terapeutycznych w chorobach komórek plazmatycznych, takich jak szpiczak mnogi, nowotwór, na który nie ma ostatecznego lekarstwa, w przypadku którego niezwykle potrzebne jest lepsze rokowanie i ulepszone strategie terapeutyczne. Szczególnie interesujące będzie scharakteryzowanie i zrozumienie zmian strukturalnych i architektonicznych związanych z przebudową epigenetyczną, które wpływają na chromatynę podczas różnicowania komórek plazmatycznych B2. Można to zrobić za pomocą sekwencjonowania genów, ERRBS, sekwencjonowania ATAC, sekwencjonowania IC i RNA.Umiarkowaną niejednorodność można zaobserwować w odsetku aktywowanych limfocytów B, preplazmablastów, plazmablastów i komórek plazmatycznych, w zależności od zdrowej krwi dawcy, wykorzystywanych do oczyszczania komórek B pamięci.

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę generowania przekształconych linii komórek B z wykorzystaniem wirusa Epstein-Barr. Przedstawiamy również nowatorski test, który pozwala zidentyfikować komórki B przeznaczone do transformacji już trzy dni po infekcji.

Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Prosta metoda lizy czerwonych krwinek do tworzenia B-LCL została opracowana z wysoką efektywnością nieśmiertelności, wymagając niewielkiej ilości krwi i oszczędzając czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

Aby badać różnicowanie i funkcjonowanie komórek T CD8 in vitro, komórki T CD8 można wyizolować z myszy i długoterminowo współhodować z wcześniej zakażonymi nabłonkami nabłonka pochwy myszy. Tutaj opisujemy ten proces i oceniamy nabycie rezydentnych markerów komórek T pamięci podczas współhodowli.

In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

Poznaj model in vitro różnicowania ludzkich komórek B pamięci do komórek plazmatycznych z wykorzystaniem wieloetapowych systemów hodowlanych. Ta metoda pozwala badać zmiany transkrypcyjne i fenotypowe w immunologii.

Model różnicowania in vitro ludzkich komórek B normalnej pamięci do długowiecznych komórek plazmatycznych

Przeglądaj więcej filmów