Name: Proces formowania żelatyny na mokro do regeneracji tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj technikę mokrego przędzenia żelatyny do inżynierii tkankowej i regeneracyjnej medycyny. Ta prosta metoda umożliwia tworzenie biomateriałów bez syntetycznych polimerów dla zastosowań medycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Ministerstwo Obrony Narodowej (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), Ministerstwo Nauki i Technologii (MOST 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, Tajwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041) oraz Szpital Ogólny Cheng-Hsin i Centrum Medyczne Obrony Narodowej (CH-NDMC-107-8).

Tkanki tłuszczowe zostały uzyskane z operacji ortopedycznych, co zostało potwierdzone przez Institutional Review Board of Tri-Service General Hospital, Taipei, Taiwan, R.O.C. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami w National Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C.).
1. Proces przędzenia na mokro
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5 g żelatyny w proszku w 100 ml podwójnie destylowanej wody, aby uzyskać 5% (w/v) stężenie roztworu.</li>
		<li>Mieszaninę mieszać powoli w temperaturze 60 - 70 °C przez noc, aby uzyskać całkowicie jednorodną dyspersję bez pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przędzenie na mokro
	<ol>
		<li>Tworzenie włókien 
		nuta: Schemat metody jest pokazany w Rysunek 1A. Zestaw wirujący jest wyposażony w pompę perystaltyczną (patrz tabela materiałów), która zapewnia wysoką precyzję prędkości i kontroluje płynne dostarczanie przepływu.
		<ol>
			<li>Podłącz strzykawkę 26 G x 1/2 cala (0,45 mm x 12 mm) jako wstrzykiwacz roztworu do przezroczystej rurki winylowej.</li>
			<li>Przygotować 100 ml 99,5% roztworu acetonu w szklance zlewki, która ma być użyta jako kąpiel krzepiąca.</li>
			<li>Uruchom pompę perystaltyczną przy 21 obr./min (3,25 ml/min) i pozostaw roztwór żelatyny na kilka sekund w roztworze acetonu przed zwinięciem.</li>
			<li>Wyjmij włókna żelatyny z roztworu acetonu i zanurz je w 2,5% (m/v) roztworze polikaprolaktonu/dichlorometanu (PCL/DCM) w proporcji 1:20 (w/w).</li>
			<li>Pozostaw włókna żelatynowe w roztworze PCL/DCM do wyschnięcia przez noc, pod kapturem w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Formowanie rury 
		nuta: Schemat metody jest pokazany w Rysunek 1B.
		<ol>
			<li>Użyj cewnika do żył obwodowych o wymiarach 24 G x 3/4 cala (0.7 mm x 19 mm) jako formy do probówek.</li>
			<li>Załaduj cewnik do roztworu żelatyny i przytrzymaj go tam przez 3 sekundy.</li>
			<li>Załaduj cewnik do roztworu acetonu i przytrzymaj przez 1 minutę.</li>
			<li>Ponownie załaduj cewnik do roztworu żelatyny i przytrzymaj go tam przez 3 sekundy.</li>
			<li>Powtórz tę alternatywną procedurę 20 razy.</li>
			<li>Wyjmij cewnik z roztworu acetonu i pozostaw uformowaną rurkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
			<li>Delikatnie wyjąć probówkę żelatynową z cewnika za pomocą hemostatu i ostrożnie przenieść probówkę żelatynową do szklanej pipety Pasteura zanurzonej w 2,5% (w/v) roztworu PCL/DCM.</li>
			<li>Pozostaw pipetę Pasteura zawierającą probówkę żelatynową i roztwór PCL/DCM do wyschnięcia przez noc, pod pokrywą w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Morfologia probówki żelatynowej
<ol>
	<li>Zamontuj kawałek wysuszonej rurki żelatynowej na klocku węglowym.</li>
	<li>Umieścić próbkę w maszynie do powlekania jonowego (patrz Tabela Materiałów) i pokryć próbkę złotem przez 60 s; następnie obserwować jej morfologię za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
3. Hodowla ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Umieść tkanki tłuszczowe (uzyskane z jamy ustnej tkanki tłuszczowej metodą chirurgii klinicznej) na szalce Petriego zawierającej 10 ml roztworu do przenoszenia składającego się z 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 0,1% glukozy.</li>
	<li>Pokrój chusteczki na małe kawałki (mniej niż 1 mm2) za pomocą ostrza skalpela.</li>
	<li>Przenieść tkanki do plastikowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i inkubować osad w plastikowej probówce zawierającej 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM, składającej się z 4 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu i 15 mg/l czerwieni fenolowej) z 0,1% kolagenazą w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 , na 1 dzień.</li>
	<li>Odwirować plastikową probówkę o sile 500 x g przez 5 minut, ostrożnie wyrzucić supernatant (nie dotykać osadu), a następnie delikatnie zawiesić osad, dodając 10 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i odstawić na 1 dzień w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 .</li>
	<li>Odwirować probówkę z tworzywa sztucznego o stężeniu 500 x g przez 5 minut i ostrożnie wyrzucić supernatant; następnie dodać 1 ml pożywki z komórek macierzystych (składającej się z pożywki wolnej od keratynocytów (K-SFM), 5% FBS, N-acetylo-L-cysteiny, kwasu askorbinowego-2-fosforanu, streptomycyny i amfoterycyny) w celu zawiesiny osadu, przenieść go do kolby hodowlanej T25 zawierającej 4 ml pożywki z komórek macierzystych, i odstawić na 3 dni w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 .</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad, dodać 1 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%CO2 przez 3,5 minuty, w celu oderwania komórek od dna kolby hodowlanej.</li>
	<li>Dodać 1 ml FBS, zawiesić mieszaninę i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 3,5 minuty, zawiesić osad w 1 ml pożywki z komórek macierzystych i przenieść ją do kolby hodowlanej zawierającej 5 ml pożywki z komórek macierzystych, a następnie utrzymywać ją w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%CO2.</li>
	<li>Utrzymuj subkulturę, zmieniając pożywkę z komórek macierzystych co 3 dni.</li>
</ol>
4. Hodowla komórek na probówce żelatynowej
<ol>
	<li>Sterylizuj probówkę żelatynową światłem UV przez 2 godziny, a następnie zanurz ją w 75% (v/v) etanolu i umyj 2x pożywką z komórek macierzystych, aby usunąć resztki etanolu.</li>
	<li>Pobrać ludzkie tłuszczowe komórki macierzyste (hASC) z kolby hodowlanej.
	<ol>
		<li>Wyjąć pożywkę z kolby hodowlanej.</li>
		<li>Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 przez 3,5 minuty, w celu odłączenia hASC od dna kolby hodowlanej.</li>
		<li>Dodać 1 ml FBS, zawiesić mieszaninę i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Odwirować probówkę do mikrowirówek o stężeniu 500 x g przez 3,5 minuty, następnie ostrożnie wyrzucić supernatant i zawiesić osad na 1 ml pożywki z komórek macierzystych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić probówkę żelatynową w 6-dołkowej płytce zawierającej 3 ml pożywki z komórek macierzystych i zasiać 4 x 104 hASC do probówki; inkubować je przez 2 tygodnie w temperaturze 37 °C, w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5%CO2.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę z komórkami macierzystymi co 3 dni, aby zapewnić wystarczającą ilość składników odżywczych do wzrostu komórek.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Usuń pożywkę z komórek macierzystych i umyj studzienkę PBS.</li>
	<li>Zamocuj probówkę z komórkami z 0,1% kwasem octowym lodowatym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj studzienkę 2x za pomocą PBS.</li>
	<li>Dodać środek powierzchniowo czynny (NP-40, 0,05%) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj studzienkę 3x za pomocą PBS.</li>
	<li>Dodać 2% normalnej surowicy koziej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Zdekantować roztwór, dodać gniazdynę przeciwciała pierwszorzędowego (marker progenitorowych komórek progenitorowych) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj studzienkę 3x za pomocą PBS.</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe przeciwko izotiocyjanianowi fluoresceiny u osła (FITC) i trzymać próbkę w ciemności przez 2 godziny.</li>
	<li>Umyj studzienkę 3x za pomocą PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml Hoechst 33342 do wybarwienia jąder i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie umyj studnię i obserwuj ją pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
6. Test biokompatybilności in vivo
UWAGA: Szczury o wadze od 201 do 225 g zostały pomyślnie przetestowane przy użyciu tego protokołu.
<ol>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>Wywołać i utrzymać znieczulenie; najlepiej znieczulić szczura (8-tygodniowego szczura Sprague Dawley, samicę) poprzez domięśniowe wstrzyknięcie tiletaminy i zolazepamu (odpowiednio 25 mg/kg + 25 mg/kg) i ksylazyny (5 mg/kg). Wykonaj test stymulacji bólu, naciskając palce szczura, aby potwierdzić znieczulenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sterylizacja miejsca operowanego
	<ol>
		<li>Ogolić i oczyścić skórę w okolicy mięśnia czworobocznego szczura (na karku) i przetrzeć ją balsamem powidonowo-jodowym, aby przygotować aseptyczny stan skóry (100 mg/ml).</li>
		<li>Przykryj szczura sterylnymi obłożami chirurgicznymi, aby ograniczyć przenoszenie bakterii i późniejsze zanieczyszczenie miejsca operowanego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja rurki żelatynowej
	<ol>
		<li>Delikatnie przeciąć skórę w okolicy czworobocznego szczura nożyczkami chirurgicznymi.</li>
		<li>Utwórz ranę o długości 2 cm i umieść rurkę żelatynową bezpośrednio na warstwie między powięzią a mięśniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chirurgia poimplantacyjna
	<ol>
		<li>Zamknąć ranę nylonowym szwem i przetrzeć ją roztworem jodu powidonu (100 mg/ml).</li>
		<li>Indukować szczura poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketoprofenu (2,5 mg/kg) i cefazoliny (15 mg/kg).</li>
		<li>Trzymaj szczura w warunkach aseptycznych przez 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>eutanazja
	<ol>
		<li>Szczur jest poddawany eutanazji poprzez uduszenie CO2 zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji. Potwierdź śmierć szczura poprzez uszczypnięcie palca u nogi i ogona, a następnie dotknięcie klatki piersiowej, aby zapewnić bicie serca.</li>
		<li>Delikatnie przetnij szczura ostrzem skalpela, usuń wszczepioną tkankę i zrób zdjęcia do obserwacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+fixation+surgery+for+acute+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725(2008).</li>
<li>Fehlings, M. G., Perrin, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+timing+of+early+decompression+for+cervical+spinal+cord+injury%3A+update+with+a+review+of+recent+clinical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence.</a> Injury. 36, Suppl 2 13-26 (2005).</li>
<li>Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+model+of+post-traumatic+syringomyelia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat.</a> Spine. 26, 1842-1849 (2001).</li>
<li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+faces+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+in+spinal+cord+repair%3A+a+role+in+microglia%2Fmacrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation.</a> PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).</li>
<li>Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulphate+proteoglycans+in+the+central+nervous+system%3A+changes+and+synthesis+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).</li>
<li>Fawcett, J. W., Asher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+scar+and+central+nervous+system+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The glial scar and central nervous system repair.</a> Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).</li>
<li>Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chitosan%2Fcollagen+substrates+on+the+behavior+of+rat+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells.</a> Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).</li>
<li>Chawla, K. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChawla%2C+KK+%22Fibrous+Materials%22">Fibrous Materials</a>. , Cambridge University Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+developments+in+natural+fibre+composites+and+their+mechanical+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Composites+Part+A-Applied+Science+and+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance.</a> Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).</li>
<li>Lundgren, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+fibers+made+from+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthetic fibers made from proteins.</a> Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).</li>
<li>Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+mechanism+in+wet+spinning+of+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Fibre+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Coagulation mechanism in wet spinning of fibres.</a> Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).</li>
<li>Yannas, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+and+gelatin+in+the+solid+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Macromolecular+Science+Part+C+Polymer+Reviews%22%5BJournal%5D)">Collagen and gelatin in the solid state.</a> Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).</li>
<li>Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+structure+of+collagen+composite+Systems%3A+lessons+from+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+and+Applied+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology.</a> Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).</li>
<li>Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrington%2C+WF+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22">Advances in Protein Chemistry</a>. 16, 1-138 (1961).</li>
<li>Veis, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVeis%2C+A+%22The+Macromolecular+Chemistry+of+Gelatin%22">The Macromolecular Chemistry of Gelatin</a>. , Academic Press. New York, NY. (1994).</li>
<li>Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+materials+as+porous+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering.</a> Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).</li>
<li>Michalczyk, K., Ziman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin+structure+and+predicted+function+in+cellular+cytoskeletal+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization.</a> Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaprezentowaliśmy rozwój biomateriałów na bazie żelatyny przy użyciu prostej techniki przędzenia na mokro, która może być stosowana w badaniach nad naturalnymi polimerami do regeneracji tkanek. Praca ta wykazała możliwość wytwarzania żelatyny jako doskonałego źródła białka bez dodawania innych źródeł, w celu optymalizacji właściwości samej żelatyny. Opracowanie biomateriałów na bazie żelatyny przeprowadzono w całości w temperaturze pokojowej (22 - 26 °C). Delikatne przygotowanie roztworu jest krytycznym krokiem w ramach ...

Najnowsze osiągnięcie w regeneracji tkanek obejmuje zastosowanie inżynierii tkankowej, co stanowi wyzwanie dla ulepszenia nowych strategii terapeutycznych w leczeniu medycznym. Na przykład ograniczony potencjał regeneracji układu nerwowego po urazie lub chorobie stanowi poważny problem zdrowotny na całym świecie. Ze względu na złożoność procesów patofizjologicznych związanych z układem nerwowym, wykazano, że zastosowanie tradycyjnego autoprzeszczepu lub wdrożenie operacji stabilizacyjnej przynosi korzyści w wynikach funkcjonalnych, ale nie ma mocnych dowodów na efekty operacji stabilizacji kręgosłupa1,2. Tkanka w uszkodzonym obszarze jest tracona i zastępowana przez hipertroficznie indukowane astrocyty3, ostatecznie tworząc gęstą bliznę glejową4,5. Ta matryca działa jak bariera, która blokuje odzyskiwanie funkcji nerwowej6,7 i dlatego znacznie utrudnia regenerację. Dlatego oczekuje się, że odpowiedni materiał wypełniający szczelinę zapobiegnie utracie tkanki i zmniejszy tworzenie się tkanki łącznej związanej z bliznami poprzez utrzymanie integralności uszkodzonego obszaru, a także poprzez bezpośrednią wymianę komórek nerwowych i obwodów w celu promowania regeneracji aksonów.
Biomateriały polimerowe były preferowane jako rusztowania do terapii regeneracji tkanek, opartej na regulacji zachowania komórek lub aksonów i postępu tkanek poprzez wsparcie naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Format światłowodu jest powszechnie uważany za element budulcowy dla różnych materiałów, ze względu na swoją jednowymiarową strukturę8. Włókna można na ogół uzyskać przez wytłaczanie ze stopu lub metodę przędzenia na mokro; Jednak duży rozmiar i koszt sprzętu oraz trudność w wykonaniu tych metod są wyzwaniem. Ponadto większość prac związanych z włóknami polimerowymi koncentrowała się na materiałach syntetycznych lub kompozytowych. Naturalne polimery jako źródło biomateriału oferują lepsze właściwości biokompatybilności dla organizmu ludzkiego. Niemniej jednak, uzyskanie wyrównania naturalnych włókien polimerowych jest stosunkowo trudniejsze niż w przypadku syntetycznych źródeł polimerowych9. W związku z tym przekształcenie naturalnego polimeru jako bogatego źródła białka we włókna biomateriału jest ważną strategią — nie tylko włókna biomateriału można bezpośrednio wyizolować z surowca, unikając w ten sposób niepotrzebnej transformacji w monomery, ale włókna białkowe mają również dobry wygląd i korzystne właściwości10.
W związku z tym, opisujemy tanią metodę przetwarzania do produkcji naturalnych włókien polimerowych poprzez podstawową koncepcję przędzenia na mokro, która może być zaimplementowana na skalę laboratoryjną dla inżynierii tkankowej. Przędzenie na mokro odbywa się poprzez wytłaczanie i koagulację roztworu polimeru do odpowiedniego rozpuszczalnika polimerowego. Odpowiedni, lepki roztwór domieszkowany w podłożu krzepliwym powoduje rozpuszczenie cząsteczek polimeru. Poprzez przemianę fazową włókna tracą wtedy swoją rozpuszczalność i są wytrącane w postaci stałej fazy polimerowej 11. Odnosząc się do tej koncepcji, następnie rozszerzyliśmy rozwój żelatyny do postaci rurki poprzez proces formowania, który jest uważany za właściwy do zastosowania w regeneracji tkanek. Ponadto, z natury rzeczy, możemy również opracować dowolny kształt materiału z włókien żelatynowych (np. przewód żelatynowy zwinięty z kilku włókien żelatynowych) do innych pożądanych zastosowań.
Żelatyna, biodegradowalny naturalny polimer, powstaje z denaturowanego i hydrolizowanego kolagenu, w tym z dowolnego półkrystalicznego, amorficznego lub potrójnej helisy kolagenu12. Powszechnie wiadomo, że kolagen jest niezbędnym białkiem strukturalnym we wszystkich tkankach łącznych kręgowców i bezkręgowców13,14, co jest podobne do struktury białka głównego ECM, który indukuje wzrost nerwów i jednocześnie zastępuje dużą ilość glikozaminoglikanu wydzielanego podczas urazów rdzenia kręgowego. Dlatego zastosowanie żelatyny jako źródła byłoby doskonałym wyborem dla każdego pojazdu medycznego. Oprócz tego, że jest niedrogim źródłem, żelatyna jest również biodegradowalna i cytokompatybilna, a klinicznie udowodniono, że jest tymczasowym wypełniaczem defektów15. Opisane tutaj testy in vitro i in vivo, opracowane w formie tuby, wykazują, że żelatyna ma doskonałą biokompatybilność i przydatność do przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej. Rurki żelatynowe, hodowane z ludzkimi komórkami macierzystymi tkanki tłuszczowej, poprawiają różnicowanie komórek w neuronalne komórki progenitorowe poprzez wykorzystanie dodatniego barwienia gniazd jako markera komórek nerwowych. Co więcej, oczekuje się, że żelatyna jako materiał wypełniający lukę, wytwarzana metodą ustaloną w tym badaniu, będzie łatwa do opanowania i bezpieczna oraz przyniesie ogromne korzyści inżynierom tkankowym, którzy obecnie opracowują korelacyjne polimery naturalne w celu poprawy strategii regeneracji tkanek.

<table><tbody><tr><td>< mocny> Przygotowanie roztworu: < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Żelatyna typu B (świnia)</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 10733</td><td>500 g fiolka</td></tr> <tr><td>< mocny>Proces wirowania na mokro: </mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Model M312</td><td>Minipuls*3</td></tr><tr><td>Łącznik rurki z tworzywa sztucznego</td><td>World Precision Instruments</td><td>14011</td><td>1 pudełko</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Sterican</td><td>5A06258541</td><td>26Gx1/2"(0,45 x 12mm)</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 00010</td><td>2,5 L fiolka</td></tr><tr><td>Polikaprolakton CAPA 6500</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4-Dichlorometan</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Scharlau</td><td>CL03421000</td><td>1 L fiolka</td></tr><tr><td>Szklana pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A-Hemostat</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Instrumenty Shinetec</td><td>ST-B021-Cewnik</td><td></td></tr> <tr><td>do żył obwodowych (Introcan Certo)</td> <td>B. Braun</td><td>1B03258241</td><td>24Gx3/4 "(0,7 x 19 mm)</td></tr><tr><td><silny>Morfologia rurki żelatynowej < / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do powlekania jonowego&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>e1010-Skaningowa</td><td></td></tr> <tr><td>mikroskopia elektronowa</td><td>Hitachi</td><td>S-3000N</td><td>-</td></tr><tr><td>Hodowla komórek na probówce żelatynowej </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fiolka Gibco</td><td>488625</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>923119</td><td>fiolka 500 ml</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Keratynocyt-SFM Pożywka</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>500 ml fiolka</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana T25</td><td>TPP</td><td>90025</td><td>VENT</td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>1209938</td><td>-</td></tr><tr><td><silny>Immunocytochemia: < / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>654471</td><td>Fiolka 500 ml</td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 00697</td><td>Fiolka 500 ml</td></tr><tr><td>Środek powierzchniowo czynny NP-40 (roztwór Tergitolu)</td><td>Sigma</td><td>056K0151</td><td>Fiolka 500 ml</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>20 ml fiolka, koncentrat</td></tr><tr><td>Nestin (przeciwciało pierwotne)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-23927-Izotiocyjanian</td><td></td></tr> <tr><td>fluoresceiny przeciw myszom osła ( przeciwciało wtórne)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2099-Hoechst</td><td></td></tr> <tr><td>33342</td><td>Anaspec</td><td>AS-83218</td><td>5 mL fiolka</td></tr> <tr><td>Test biokompatybilności in vivo:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiletamine+zolazepam&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>BC91</td><td>5 ml fiolka</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer korea</td><td>KR03227</td><td>10 ml fiolka</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Astar</td><td>1406232</td><td>2 ml Fiolka 2 ml</td></tr><tr><td>Roztwór jodu powidonu</td><td>Everstar</td><td>HA161202</td><td>4 L beczka</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Chiny Chemical & Farmaceutyczny</td><td>18P909</td><td>Fiolka 1 g</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Instrumenty Shinetec</td><td>ST-B021-Nożyczki</td><td></td></tr> <tr><td>chirurgiczne</td><td>Instrumenty Shinetec</td><td>ST-B021</td><td>-</td></tr></tbody></table>

proces formowania żelatyny na mokro do regeneracji tkanek

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Ten artykuł przedstawia tanią metodę wytwarzania żelatyny, jako naturalnego polimeru, na włókna monofilamentowe lub inne odpowiednie formy. Dzięki metodzie przędzenia na mokro włókna żelatyny są wytwarzane przez płynne wytłaczanie w odpowiednim podłożu koagulacyjnym. Aby zwiększyć powierzchnię funkcjonalną tych włókien żelatynowych i ich zdolność do naśladowania cech tkanek, żelatynę można formować w formę tuby, odwołując się do tej koncepcji. Badane za pomocą testów in vitro i in vivo probówki żelatynowe wykazują ogromny potencjał zastosowania w inżynierii tkankowej. Działając jako odpowiedni materiał wypełniający szczelinę, rurki żelatynowe mogą być używane do substytucji tkanki w uszkodzonym obszarze (np. w układzie nerwowym lub sercowo-naczyniowym), a także do wspomagania regeneracji poprzez bezpośrednią wymianę komórek macierzystych i obwodów nerwowych. Protokół ten zapewnia szczegółową procedurę tworzenia biomateriału na bazie naturalnego polimeru, a jego wdrożenie ma przynieść ogromne korzyści w rozwoju korelacyjnych polimerów naturalnych, które pomagają realizować strategie regeneracji tkanek.

W niniejszym badaniu z powodzeniem przekształciliśmy żelatynę w włókna (Rysunek 2A) oraz rurki (Rysunek 2B,C) za pomocą przystępnej koncepcji przędzenia na mokro. Te materiały na bazie żelatyny mogą być wykorzystywane jako dowolne narzędzia medyczne, w zależności od ich kształtu. Biorąc pod uwagę, że funkcjonalna powierzchnia i struktura takich materiałów są bardziej odpowiednie do regeneracji tk...

Opracowaliśmy i opisaliśmy protokół oparty na koncepcji mokrego przędzenia, do budowy biomateriałów na bazie żelatyny wykorzystywanych do zastosowań inżynierii tkankowej.

Proces formowania żelatyny na mokro do regeneracji tkanek

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Protokół ten ulepsza podstawową koncepcję przędzenia na mokro w celu opracowania materiału z pojedynczego paska włókna w różne paski, które można wykorzystać do dowolnego preferowanego zastosowania medycznego. Ta technika jest prosta, niedroga i nie wymaga dodawania syntetycznych polimerów w celu dostosowania naturalnych polimerów do zasobu białka dla materiałów będących przedmiotem zainteresowania. Technika ta może być rozszerzona na rozwój biomateriału do zabijania terapii zimna, takiej jak leczenie ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego, wymiana naczyń krwionośnych lub bezpośrednia rekonstrukcja dróg moczowych.Metoda ta jest przeznaczona do zastosowań medycznych, w tym jako strategia neuralizacji tkanek lub medycyny regeneracyjnej. Ta technika może być łatwo wdrożona przez początkujących. Należy pamiętać, że po kilku powtórzeniach formowania należy zawsze sprawdzić jakość roztworu, aby utrzymać optymalną formację.Aby uformować mokrą rurkę wirową, najpierw zanurz cewnik do żył obwodowych o wymiarach 24 na trzy czwarte cala w świeżo przygotowanym roztworze żelatyny na trzy sekundy, a następnie zanurz w świeżo przygotowanym roztworze acetonu na jedną minutę. Powtórz te kroki 20 razy. Po ostatnim zanurzeniu w acetonie pozostaw uformowaną probówkę do wyschnięcia na pięć minut w temperaturze pokojowej i za pomocą hemostatu ostrożnie przenieś rurkę żelatynową z cewnika do szklanej pipety Pasteura z 2,5% roztworem dichlorometanu polikaprolaktonu do inkubacji przez noc pod maską w temperaturze pokojowej.Następnego ranka sterylizuj żelatynę przez dwie godziny w świetle ultrafioletowym, a następnie na krótko zanurz probówkę w 75% etanolu. Następnie umyj probówkę dwa razy pożywką z komórek macierzystych, aby usunąć resztki etanolu. Aby wyhodować probówkę żelatynową z hodowlą komórkową, zastąp supinacyjny koniec ludzkich tłuszczowych komórek macierzystych z kolby hodowlanej jednym mililitrem 0,25% trypsyny-EDTA na 3,5 minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję jednym mililitrem płodowej surowicy bydlęcej i przenieś zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki z komórek macierzystych. Następnie umieść probówkę żelatynową w jednym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej trzy mililitry pożywki z komórek macierzystych.Po zliczeniu komórek, wysiew cztery razy 10 do jednej czwartej ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej do probówki na dwutygodniową inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u ośmiotygodniowej samicy szczura Sprague Dawley, należy zgolić włosy w okolicy mięśnia czworobocznego i wysterylizować odsłoniętą skórę roztworem jodu powidonu. Przykryj szczura sterylnymi obłożami chirurgicznymi, aby zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne pola operacyjnego i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać płytkie, dwucentymetrowe nacięcie skóry.Umieść rurkę żelatynową bezpośrednio w warstwie między powięzią a mięśniem i użyj nylonowego szwu, aby zamknąć ranę. Następnie wysterylizuj nacięcie roztworem jodu powidonu. Wywołać u szczura poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketoprofenu i cefazoliny i utrzymywać zwierzę w warunkach aseptycznych przez siedem dni.Ta przyjazna dla użytkownika koncepcja przędzenia na mokro może być wykorzystana do przekształcania żelatyny we włókna i rurki. Obserwacje morfologiczne probówki żelatynowej za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ujawniają niezbyt gładką powierzchnię o średnicy wewnętrznej większej niż 200 mikrometrów i grubości około 20 mikrometrów. Barwienie probówki żelatynowej z hodowli ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej w celu ekspresji markera komórek nerwowych wykazuje dodatnie barwienie markera wraz z wieloma wykrytymi jądrami, co sugeruje, że komórki mogą przenikać i przylegać do rurki żelatynowej oraz różnicować się w neuronalne komórki progenitorowe.Implantacja rurki żelatynowej w warstwie powięzi potwierdza jej bezpieczeństwo i biozgodność, ponieważ w obrębie miejscowej tkanki nie obserwuje się żadnych oznak zaczerwienienia, obrzęku lub innych objawów zapalnych, a rurka jest otoczona dobrze rozwiniętą tkanką łączną. Próbując tej procedury dwupunktowej, bardzo ważne jest zapewnienie zanurzenia formy w określonym czasie powlekania w każdym roztworze, aby zbudować precyzyjną formę rury. Zgodnie z tą procedurą, nasze eksperymenty wykorzystują zwierzęcy model choroby ludzkiej, aby dokładnie zbadać wynik biomateriałów do strategii regeneracji tkanek.Po opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do opracowania prostych, skorelowanych polimerów o naturze w dowolny rodzaj materiału do decydującego zastosowania medycznego. W normalnych warunkach użytkowania uważa się, że roztwór dichlorometanu polikaprolaktonu stanowi minimalne zagrożenie dla środowiska, ale nie zapomnij wykonać żadnych czynności z tą substancją chemiczną w odpowiedniej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

wet-spinning-based-molding-process-of-gelatin-for-tissue-regeneration

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Przedstawiono protokół mikroprzepływowego przędzenia i charakterystyki mikrostruktury regenerowanego jedwabnego włókna fibroinowego.

Mikroprzepływowe przędzenie na sucho i charakterystyka regenerowanych włókien fibroiny jedwabiu

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

Ten artykuł opisuje protokoły wysokoprzepustowej produkcji mikrożelu żelowego z żelatyny metakryloylowej za pomocą urządzeń mikroprzepływowych, przekształcania mikrożeli w proszek do resuspensable (mikroaerożele), chemicznego łączenia mikrożeli w celu utworzenia granulowanych rusztowań hydrożelowych oraz opracowywania granulowanych biotuszy hydrożelowych o zachowanej mikroporowatości do biodruku 3D.

Rusztowania hydrożelowe żelatynowo-metakryloilowe granulowane: wysokoprzepustowa produkcja mikrożeli, liofilizacja, montaż chemiczny i biodruk 3D

To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.

Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej

Poznaj technikę mokrego przędzenia żelatyny do inżynierii tkankowej i regeneracyjnej medycyny. Ta prosta metoda umożliwia tworzenie biomateriałów bez syntetycznych polimerów dla zastosowań medycznych.

Proces formowania żelatyny na mokro do regeneracji tkanek

Przeglądaj więcej filmów