Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Aby ocenić skuteczność i bezpieczeństwo obiecujących i nowatorskich podejść do terapii genowej, kluczowe znaczenie ma kompleksowe testowanie komórek zmodyfikowanych genowo w zwalidowanych przedklinicznych modelach in vivo. Zachowanie odpowiednich markerów powierzchniowych komórek, reaktywność krzyżowa odczynników oraz zdolność do stosowania tych samych terapii wspomagających, które są podawane pacjentom wraz z modelami naczelnych innych niż ludzie, w celu ścisłego naśladowania parametrów klinicznych. Procedurę zademonstruje mi Anai Perez, technik badawczy z laboratorium dr Hansa-Petera Kiem.

Zacznij od dodania od 10 do 12 mililitrów podwielokrotności szpiku kostnego wyizolowanego od zdrowego dawcy naczelnych do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Zwiększ objętość probówki do 50 mililitrów za pomocą buforu hemolitycznego i inkubuj komórki do siedmiu minut w temperaturze pokojowej. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie i odessać wszystkie oprócz ostatnich dwóch do pięciu mililitrów supernatantu.

Ponownie zawiesić osad w pozostałej objętości supernatantu, przesuwając probówkę, a zawiesiny szpiku kostnego przenieść do nowej 50-mililitrowej probówki za pomocą sitka do komórek porowych o średnicy 70 mikrometrów w celu usunięcia wszelkich skrzepów krwi. Dodaj świeży bufor hemolityczny, aby zwiększyć objętość do 50 mililitrów i inkubuj komórki przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej przed ich zebraniem przez odwirowanie. Odessać cały supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach maksymalnego buforu.

Przed przefiltrowaniem zawiesiny komórek przez kolejne sitko o porach 70 mikrometrów, przepłucz probówkę 40 mililitrami świeżego buforu i połącz płukanie z zawiesiną komórkową. Po wzbogaceniu na komórki CD34-dodatnie zgodnie ze standardowymi protokołami sortowania komórek wspomaganym magnetycznie, umyj izolowane komórki kulek w ilości do 50 mililitrów świeżego buforu max i ponownie zawieś osad w pożywce HSPC. Następnie umieść 10 do 20 mililitrów komórek w wentylowanych, poddanych hodowli tkankowej kolbach T75 w celu ich nocnej hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Aby ocenić czystość próbek komórek szpiku kostnego przed i po wzbogaceniu, należy utworzyć protokół cytometrii przepływowej z odpowiednimi wykresami i hierarchią populacji pokazującą wszystkie bramki dla wszystkich zdarzeń: rozproszenie, CD34 dodatnie, hematopoetyczne komórki macierzyste, multipotencjalne przodki szpiku an-erythro i limfo-mieloidalne komórki progenitorowe. Następnie uruchom niebarwioną, wstępnie wzbogaconą próbkę białych krwinek, aby dostosować napięcia dla parametrów rozpraszania do przodu i bocznego oraz wszystkich kanałów fluorescencyjnych, a następnie pojedynczych barwionych kulek kompensacyjnych, aby dostosować kompensację między sąsiednimi kanałami. Następnie uruchom wszystkie pozostałe niebarwione i barwione próbki za pomocą dostosowanego i skompensowanego protokołu, aby udokumentować skuteczność wzbogacania CD34.

Po ustawieniu wszystkich kompensacji skonfiguruj sortownik komórek do sortowania podzbiorów CD34 do testów komórek tworzących kolonie i załaduj barwioną probówkę z próbką wzbogaconą w CD34 na cytometr. Następnie nagraj od 2000 do 3000 zdarzeń i precyzyjnie dostosuj bramki sortowania do siły sygnału i populacji docelowych. Po zakończeniu konfiguracji należy pobrać komórki, dostosowując natężenie przepływu do 500 do 1000 komórek na sekundę i sortując od 800 do 1200 komórek od rozproszonego, CD34-dodatniego, hematopoetycznego komórki macierzystej, multipotencjalnego przodka szpiku an-erythro i progenitora limfy szpikowej do oddzielnych probówek zawierających 3,6 mililitra pożywki komórkowej tworzącej kolonię na probówkę.

Pod koniec sortowania należy odwirować probówki zbiorcze i dodać jeden mililitr zawiesiny komórkowej do trzech sterylnych 3,5-centymetrowych, niepoddanych hodowli tkankowej szalek Petriego, umieszczonych na indywidualnych 15-centymetrowych szalkach Petriego na populację komórek na ich 10-14-dniową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka użyj 10-mililitrowej pipety, aby delikatnie przepłukać przylegające komórki z dna każdej kolby sterylnym HBSS i zbierz zebrane komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w podłożu transdukcyjnym w stężeniu od 1 x 10 do 6 komórek na mililitr

I dodaj jeden mililitr komórek do próbnej kontroli w jednym dołku rekombinowanego fragmentu fibronektyny pokrytej 12-dołkową płytką do całonocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie dodać 10 mililitrów podwielokrotności pozostałych komórek do kolb T75 pokrytych rekombinowanym fragmentem fibronektyny na 30-minutową inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych z odpowietrzonymi nakrętkami. Podczas inkubacji rozmrozić próbki pożywki kondycjonowanej przez wirusa i obliczyć ilość wirusa, która ma zostać dodana, na podstawie miana i liczby zakaźnych jednostek komórek na mililitr.

Wyjąć kolbę z inkubatora i dodać odpowiednią objętość pożywki kondycjonowanej wirusem do każdej kolby przed przywróceniem komórek do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka przenieś komórki z kolby do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów. Umyj komórki w ilości do 50 mililitrów HBSS na pranie i powtórz ten krok do trzech razy, aby usunąć resztki wirusa.

Inkubować komórki przez dwie godziny w pożywce HSPC uzupełnionej prostaglandyną E2. Następnie umyj komórki i ponownie zawieś je w 10 mililitrach HBSS uzupełnionych 2% surowicą autologiczną na probówkę. Następnie odessać zawiesiny komórek za pomocą 20-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 16,5. Umyć wnętrze probówki świeżym HBSS plus 2% surowicy autologicznej i odessać do strzykawki.

Ostrożnie zakryć strzykawkę nasadką igły przed umieszczeniem roztworu komórkowego na lodzie do momentu jego infuzji do żywiciela autologicznego. Aby określić skuteczność modyfikacji genów transdukowanych komórek, należy umieścić płytki 1 x 10 do 6. zarezerwowanych komórek próbnych lub transdukowanych na mililitr pożywki HSPC na płytki poddane działaniu kultur nietkankowych. W drugim, piątym i dwunastym dniu po transdukcji zbierz i policz komórki.

W drugim i piątym dniu ponownie pokryj 33% komórek w świeżej pożywce HSPC w stężeniu 1 x 10 do 6 na mililitr. W drugim, piątym i dwunastym dniu zamroź 33% komórek w buforze do ekstrakcji DNA w celu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i przeanalizuj końcowe 33% komórek za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami w celu oceny składu fenotypowego krwiotwórczego potomstwa. Aby określić ilościowo ekspresję transgenu za pomocą cytometrii przepływowej, dodaj trzy dodatkowe wykresy rozproszenia bocznego w funkcji

transgenu; i Gate pierwszy wykres na hematopoetycznych komórkach macierzystych, drugi wykres na multipotencjalnych przodkach szpiku an-erythro, a trzeci wykres na przodkach limfy szpikowej, wszystkie przeciwko transgenowi. Następnie nagraj od 2000 do 3000 zdarzeń i precyzyjnie dostosuj bramki sortowania, aby dopasować je do siły sygnału i populacji docelowych.

Korzystając z tego protokołu, liczba wzbogaconych HSPC z CD34 dodatnimi wartościami CD34 u naczelnych jest zazwyczaj proporcjonalna do wejściowej całkowitej liczby białych krwinek. Ponieważ poprzednie odkrycia wykazały, że całkowity produkt HSPC z dodatnim CD34 obejmuje komórki, które nie są prawdziwymi długoterminowymi i przeszczepiającymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi, te techniki oparte na cytometrii przepływowej i komórkach tworzących kolonie można wykorzystać do wiarygodnej identyfikacji i różnicowania podzbiorów wzbogaconych o długoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste od zaangażowanych komórek progenitorowych. Komórki wzbogacone w ludzkie komórki macierzyste CD34 mogą być skutecznie modyfikowane genowo za pomocą wektorów lentiwirusowych.

Komórki zawierające niezintegrowaną kopię wektora rozcieńczają się w ciągu 12-dniowego okresu oznaczania płynnej hodowli, podczas gdy stabilnie zintegrowane wektory w genomie są przekazywane całemu potomstwu. Potwierdza to ekspresja wektora w testach komórek tworzących kolonie. Ta metoda przedkliniczna może być stosowana do izolowania genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych o kontrolowanej jakości do terapii genowej.

Metodę tę można łatwo dostosować do innych gatunków, źródeł hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, narzędzi terapii genowej i chorób. Ten dokładnie sprawdzony protokół jest bardzo obiecujący dla modelowania skutecznych terapii wielu chorób u ludzi. Należy pamiętać, że praca z tkankami naczelnych wymaga zwiększonych środków bezpieczeństwa, w tym środków ochrony osobistej.