Name: Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Poznaj izolację i modyfikację genową komórek CD34+ z kości szpiku naczelnych przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Ta metoda umożliwia przygotowanie terapeutycznego produktu do autologicznej infuzji w modelach przedklinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Helen Crawford za przygotowanie tego rękopisu, Jimowi Woolace'owi za projekt graficzny oraz Veronice Nelson i Devikha Chandrasekaran za udział w tworzeniu protokołu. Opracowanie tego protokołu było wspierane przez granty z NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI135953 i AI138329 do H.P.K.) oraz National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 i U19 HL129902 do H.P.K.), a także NIH P51 OD010425 oraz, częściowo za pośrednictwem NIH/NCI Cancer Center, Dotacja P30 CA015704. H.P.K. jest badaczem medycyny molekularnej Markey i otrzymał wsparcie jako pierwszy laureat Katedry Badań nad Rakiem im. José Carrerasa/E. Donnalla Thomasa oraz Katedry Terapii Komórkowej i Genowej im. Freda Hutcha.

<ol><li>Radtke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+hematopoietic+stem+cell+population+for+rapid+multilineage+engraftment+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates.</a> Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+human+hematopoietic+stem+cells+capable+of+long-term+multilineage+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment.</a> Science. 333 (6039), 218-221 (2011).</li>
<li>Hoggatt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mobilization+reveals+a+highly+engraftable+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell.</a> Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).</li>
<li>Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+promising+nonmyeloablative+conditioning+regimens+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates.</a> Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).</li>
<li>Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+transplantation+model+to+evaluate+hematopoietic+stem+cell+gene+editing+strategies+for+beta-hemoglobinopathies.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy.</a> Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+transplantation+on+peripheral+and+tissue-associated+viral+reservoirs%3A+Implications+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy.</a> PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).</li>
<li>Zhen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+function+of+hematopoietic+stem+cell-derived+chimeric+antigen+receptor+T+cells+in+a+nonhuman+primate+model+of+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS.</a> PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753(2017).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit-and-run+programming+of+therapeutic+cytoreagents+using+mRNA+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers.</a> Nature Communications. 8 (1), 389(2017).</li>
<li>Burtner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+injection+of+a+foamy+virus+vector+to+correct+canine+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1.</a> Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).</li>
<li>Evans, D. T., Silvestri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhuman+primate+models+in+AIDS+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Nonhuman primate models in AIDS research.</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).</li>
<li>Taraseviciute, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cell-mediated+neurotoxicity+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates.</a> Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).</li>
<li>McGary, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTLA-4%28%2B%29PD-1%28-%29+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+critically+contribute+to+viral+persistence+in+antiretroviral+therapy-suppressed%2C+SIV-infected+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques.</a> Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).</li>
<li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).</li>
<li>Zonari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ex+vivo+engineering+and+expansion+of+highly+purified+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+populations+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).</li>
<li>Doulatov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+map+of+the+human+progenitor+hierarchy+shows+the+origin+of+macrophages+and+dendritic+cells+in+early+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development.</a> Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+expansion+of+long-term+engrafting+marrow+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+multilineage+engraftment+of+autologous+genome-edited+hematopoietic+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates.</a> Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).</li>
<li>Peterson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+polyclonal+engraftment+of+Cal-1+gene-modified+cells+and+in+vivo+selection+after+SHIV+infection+in+a+nonhuman+primate+model+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007(2016).</li>
<li>Thompson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+in+patients+with+transfusion-dependent+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).</li>
<li>Eichler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem-cell+gene+therapy+for+cerebral+adrenoleukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).</li>
<li>Paul, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+enrichment+of+gene-modified+primary+T+cells+via+CCR5-targeted+integration+of+mutant+dihydrofolate+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).</li>
<li>Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+manufacturing+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Global manufacturing of CAR T cell therapy.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).</li>
<li>Masiuk, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+gene+therapy+efficiency+through+the+enrichment+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).</li>
<li>Trobridge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pigtailed+macaque+hematopoietic+repopulating+cells+with+HIV-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors.</a> Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).</li>
<li>Beard, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+MGMT-mediated+selection+of+long-term+repopulating+stem+cells+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).</li>
<li>Horn, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+gene+transfer+to+canine+repopulating+cells+using+an+overnight+transduction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol.</a> Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).</li>
<li>Adair, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+closed+system+manufacturing+of+lentivirus+gene-modified+haematopoietic+stem+cells+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy.</a> Nature Communications. 7, 13173(2016).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> BMC Biotechnology. 6, 34(2006).</li>
<li>Kiem, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gene+transfer+into+baboon+marrow+repopulating+cells+using+recombinant+human+fibronectin+fragment+CH-296+in+combination+with+interleukin-6%2C+stem+cell+factor%2C+FLT-3+ligand%2C+and+megakaryocyte+growth+and+development+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor.</a> Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).</li>
<li>Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chronic+restraint+of+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Veterinary+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).</li>
<li>Noser, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporine+increases+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector+transduction+of+primary+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells.</a> Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).</li>
<li>Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+human+hematopoietic+repopulating+cells+with+a+chimeric+HIV1-based+vector+including+SIV+capsid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid.</a> Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).</li>
<li>Goerner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+granulocyte+colony-stimulating+factor+during+retroviral+transduction+on+fibronectin+fragment+CH-296+enhances+gene+transfer+into+hematopoietic+repopulating+cells+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs.</a> Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).</li>
<li>Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+fibronectin+maintains+regenerative+capacity+during+ex+vivo+culture+and+transduction+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+enhances+human+cord+blood+stem+cell+xenotransplants+and+shows+long-term+safety+in+preclinical+nonhuman+primate+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).</li>
<li>Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+immunodeficiency+through+HSC+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treating immunodeficiency through HSC gene therapy.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).</li>
<li>Humbert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immune+reconstitution+of+SCID-X1+canines+after+G-CSF%2FAMD3100+mobilization+and+in+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy.</a> Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Inżynieria wektorów niskiego napięcia jest najlepiej scharakteryzowaną metodą modyfikacji genów typów komórek, takich jak HSPC CD34+, w celu późniejszego przeszczepu in vivo. Opisany tutaj protokół ma na celu maksymalizację liczby zmodyfikowanych genowo HSPC, które utrzymują się przez długi czas in vivo i zapewniają korzyści kliniczne pacjentom z różnymi chorobami złośliwymi, zakaźnymi i genetycznymi. Chociaż strategie edycji genów pojawiły się w ciągu ostatniej dekady, komórki zmodyfikowane LV są najlepiej ba...

Terapia genowa komórkami macierzystymi jest skutecznym sposobem na rozwiązanie szerokiego zakresu ludzkich patologii. Terapia genowa HSPC jest szczególnie atrakcyjnym podejściem ze względu na i) względną łatwość pobierania tych komórek od pacjentów, ii) bogactwo dostępnej wiedzy na temat fenotypów powierzchni komórek i parametrów hodowli ex vivo, a wraz z rozwojem tej dziedziny, ponieważ iii) daje naukowcom stale rosnący zestaw narzędzi strategii modyfikacji genów dostosowanych do różnych chorób będących przedmiotem zainteresowania. Aktywnie badamy podejścia do terapii genowej HSPC z wielu perspektyw, w tym z zakresu biologii HSPC, wszczepiania zmodyfikowanych genowo HSPC w przedklinicznych modelach in vivo oraz zastosowania w odpowiednich populacjach pacjentów. My i inni scharakteryzowaliśmy fenotyp powierzchni komórki funkcjonalnie odrębnych podzbiorów HSPC1,2,3, schematy mobilizacji i kondycjonowania, które maksymalizują wydajność i wszczepienie HSPC, jednocześnie minimalizując toksyczność4,5oraz strategie modyfikacji i edycji genów dostosowane do szerokiego zakresu chorób złośliwych, genetycznych i zakaźnych6,7,8,9,10. Funkcję i wszczepianie zmodyfikowanych genowo HSPC można ocenić w wielu modelach małych i dużych zwierząt, w tym myszy, psów i NHP. W szczególności modele NHP są korzystne, ponieważ wiele odczynników, na przykład przeciwciała specyficzne dla białek powierzchniowych komórek HSPC, takich jak CD34 i CD90, może być stosowanych zamiennie w komórkach ludzkich i NHP. Ponadto, w przeciwieństwie do myszy, duże zwierzęta, takie jak NHP, pozwalają na bliższe przybliżenie skali modyfikacji genów niezbędnej do skuteczności klinicznej. Wreszcie, NHP są złotym standardem w modelowaniu ludzkich patologii, takich jak zakażenie HIV-111 i są wyłaniającym się systemem modelowym dla potencjalnych immunoterapii przeciwnowotworowych i anty-HIV12,13.
Celem tego protokołu jest nakreślenie metod oczyszczania, genetycznego modyfikowania i przygotowywania produktów infuzyjnych NHP HSPC. Chociaż wykracza to poza zakres tego protokołu, wcześniej wykazaliśmy, że produkty te wszczepiają się w autologicznych gospodarzy NHP, dają początek wszystkim liniom krwiotwórczym i zapewniają skuteczność terapeutyczną w szerokim zakresie modeli chorób1. Scharakteryzowaliśmy również klonalność wszczepiania HSPC i zbudowaliśmy platformę do śledzenia kinetyki, transportu i fenotypu poszczególnych HSPC i ich potomstwa, po autologicznym przeszczepie1,14. Przedstawione tutaj metody zostały opracowane w następujących celach: i) wyizolowanie wysoce czystych HSPC i długoterminowych podzbiorów HSC do szczepienia, ii) utrzymanie prymitywnych HSC podczas hodowli ex vivo oraz iii) skuteczna modyfikacja genów zarówno masowych HSPC, jak i długoterminowych podzbiorów HSC. Stosujemy sortowanie komórek wspomagane magnetycznie (MACS), a także sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), aby wyizolować fenotypowo/funkcjonalnie odrębne populacje HSPC, zgodnie z metodami wielu grup2,15,16. Utrzymanie prymitywnych HSC w hodowli (tj. minimalizowanie różnicowania się tych komórek w zaangażowanych progenitorów, które dają początek w pełni zróżnicowanym podzbiorom limfoidalnym i szpikowym) jest istotnym aspektem opisanego tutaj protokołu. Chociaż wcześniej scharakteryzowaliśmy podejścia do rozszerzania HSPC przy zachowaniu prymitywnego fenotypu17,18, tutaj opisujemy protokół, który koncentruje się na utrzymaniu HSC poprzez minimalną (48 godzin) i zdefiniowaną hodowlę ex vivo.
Efektywna modyfikacja podzbiorów HSPC i HSC jest głównym celem tego protokołu. Spośród kilku opisanych przez nas podejść, dwa są zdecydowanie najlepiej zbadane w badaniach klinicznych: modyfikacja genów za pośrednictwem LV i edycja genów za pośrednictwem nukleazy1,6,19. Strategie edycji genów wykorzystują jedną z wielu platform nukleazy do specyficznej modyfikacji docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania, na przykład receptora chemokiny C-C typu 5 (CCR5) do leczenia zakażenia wirusem HIV7,19 lub Bcl11A do leczenia hemoglobinopatii6. Tutaj skupiamy się na modyfikacji genów za pośrednictwem LV, w której transgeniczne ładunki integrują się półlosowo z genomem1,8,20. Kluczową zaletą podejść LV jest możliwość dostarczania dużych ilości materiału genetycznego (do 8 lub 9 kilozasad). Chociaż opracowywane są strategie edycji genów w celu ukierunkowania transgenu będącego przedmiotem zainteresowania na integrację tylko w określonym locus za pomocą homologicznej rekombinacji dawcy (HDR), metody te wymagają dalszego rozwoju in vitro i na małych modelach zwierzęcych. W przeciwieństwie do tego, wektory LV były szeroko stosowane w NHP i u pacjentów21,22. Co ważne, opisany tutaj protokół, który wykorzystuje zagruntowany BM jako początkowe źródło HSPC, może być łatwo i szeroko zaadaptowany, na przykład do izolacji PBSC. Jak opisano powyżej, wykorzystujemy wysoki stopień podobieństwa genetycznego między NHP a ludźmi, aby użyć odczynników, które mają zastosowanie do obu gatunków. Wreszcie, podejście to zostało zaadaptowane do modyfikacji innych podzbiorów układu krwiotwórczego, a mianowicie limfocytów T12,23,24; pojawienie się skutecznych podejść do immunoterapii limfocytami T opierało się w dużej mierze na tej samej platformie LV, która jest wykorzystywana w tym protokole. Metody te są odpowiednie dla każdego badacza zainteresowanego biologią HSPC lub modyfikacją genów za pośrednictwem LV. Na przykład przedstawiony tutaj protokół oczyszczania HSPC może być użyty do scharakteryzowania nowych podzbiorów wzbogaconych w HSC, jak opisano wcześniej1,15,25. Podobnie, przedstawione tutaj metody transdukcji lewej komory mogą być podobnie stosowane i dalej rozwijane w odniesieniu do wielu innych typów komórek i pytań eksperymentalnych, zarówno w modelach in vitro, jak i in vivo.
Podsumowując, prezentujemy metody izolacji i genetycznej modyfikacji NHP HSPC. Metody te można łatwo dostosować do innych gatunków i innych źródeł HSPC. Ten dokładnie sprawdzony protokół jest bardzo obiecujący w modelowaniu skutecznych terapii wielu chorób u ludzi.

<table><tbody><tr><td>Stemspam SFEM II ("HSPC") Media</td><td>StemCell</td><td>09655</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sulfotlenek dimetylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Decon labs</td><td>M18027161M</td><td></td></tr><tr><td>Cyclosporine</td><td>Sigma</td><td>30024-25MG</td><td></td></tr><tr><td>500 mM EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PS-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>CH-296/ Retronektyna (2,5 ml, 1 &mikro; g/&mikro; L)</td> <td>TaKaRA</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7906-100g</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H9897</td><td></td></tr><tr><td>Szczurze anty-mysie kulki magnetyczne</td><td>IgM Miltenyi Biotec</td><td>130-047-301</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)</td> <td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka trombopoetyna (TPO)</td> <td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka kinaza tyrozynowa podobna do FMS 3 (FLT-3)</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma</td><td>P-4505</td><td></td></tr><tr><td>14 ml polipropylenowa rurka z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Colony Gel 1402</td><td>ReachBio</td><td>1402</td><td></td></tr><tr><td>Separatory QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MACS L25</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>10 mM PGE2</td><td></td><td>Kolby</td><td></td></tr><tr><td>T-75 poddane działaniu TC</td><td>Bioexpress</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr> Termostrzykawki <tr><td>T-75 bez TC</td><td>Thermo-Fisher</td><td>13680-57</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Igły 16,5 G</td><td>BD Precyzyjna</td><td></td> nasadka do strzykawki 305198 <td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>305819</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Solution</td><td>Epicentre</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>8-probówkowe probówki do PCR z nasadką paskową</td><td>USA scientific</td><td>1402-2708</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Filtry wstępnej separacji</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>sitko, komórka; BD Sokół; Sterylny; Siatka nylonowa; Rozmiar oczek: 70um; Kolor: biały; 50/CS</td><td>fisher scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Defeoraliki Ultracomp</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr> 3 <tr><td>mL Strzykawki Luer-Lock</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430196</tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 150 mm x 25 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Kolby niepoddane działaniu TC</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja DNA Qiagen</td><td>Qiagen 51104</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-Human CD90 (Thy1) Klon: 5E10</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mysz Anti-Human CD34 Klon: 563</td><td>BD horyzont</td><td>562449</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC-H7 Klon CD45RA anty-ludzki: 5H9</td><td>BD Pharmingen</td><td>561212</td><td></td></tr><tr><td>V450 Mysz anty-NHP CD45 Klon: d058-1283</td><td>BD Biosciences</td><td>561291</td><td></td></tr><tr><td>Surowica autologiczna</td><td>pobrana od autologicznego gospodarza i kriokonserwowana przed mobilizacją i pobraniem CD34+ HSPC</td><td>Nie dotyczy</td><td>Broda, B. C. i wsp. Wydajna i stabilna selekcja długoterminowych komórek macierzystych z udziałem naczelnych za pośrednictwem MGMT. Dziennik badań klinicznych. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Pożywki kondycjonowane wirusem (VCM)</td><td>Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)</td><td>N/A</td><td>Beard, BC i wsp. Efektywna i stabilna selekcja długoterminowych komórek macierzystych zasiedlających za pośrednictwem MGMT u naczelnych innych niż ludzie. Dziennik badań klinicznych. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD34, klon 12,8</td><td>Kiem Lab</td><td>N/A</td><td>Beard, BC i wsp. Wydajna i stabilna selekcja długoterminowych komórek macierzystych zasiedlających za pośrednictwem MGMT u naczelnych innych niż ludzie. Dziennik badań klinicznych. 120 (7), 2345-2354, (2010).</td></tr><tr><td>Starter Lenti F: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>N/A</td><td>Peterson, CW i wsp. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Starter Lenti R: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>N/A</td><td>Peterson, CW i in. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Starter aktyny F: TCCTGTGGCACTCACGAAACT</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy</td><td>Peterson, CW i wsp. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr><tr><td>Starter Actin R: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>N/A</td><td>Peterson, CW i wsp. Wieloliniowe poliklonalne wszczepienie komórek zmodyfikowanych genem Cal-1 i selekcja in vivo po zakażeniu SHIV w modelu AIDS u naczelnych innych niż człowiek. Metody mol terowe Clin Dev. 3 16007, (2016).</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Przeszczep hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) jest podstawą terapii białaczki i innych nowotworów od prawie pół wieku, leży u podstaw jedynego znanego lekarstwa na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV-1) i jest niezwykle obiecujący w leczeniu chorób genetycznych, takich jak beta-talasemia. Nasza grupa opracowała protokół modelowania terapii genowej HSPC u naczelnych (NHP), co pozwala naukowcom zoptymalizować wiele z tych samych odczynników i technik, które są stosowane w klinice. W tym miejscu opisujemy metody oczyszczania HSPC CD34 + i długotrwale utrzymujących się podzbiorów hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) z przygotowanego szpiku kostnego (BM). Identyczne techniki można zastosować do oczyszczania innych źródeł HSPC (np. zmobilizowanych komórek macierzystych krwi obwodowej [PBSC]). Przedstawiono 2-dniowy protokół, w którym komórki są oczyszczane, hodowane, modyfikowane lentiwirusem (LV) i przygotowywane do infuzji z powrotem do autologicznego gospodarza. Kluczowe wnioski o sukcesie obejmują czystość populacji HSPC CD34+, zdolność oczyszczonych HSPC do tworzenia morfologicznie odrębnych kolonii w pożywkach półstałych oraz, co najważniejsze, skuteczność modyfikacji genów. Kluczową zaletą terapii genowej HSPC jest zdolność do zapewnienia źródła długowiecznych komórek, które dają początek wszystkim typom komórek krwiotwórczych. W związku z tym metody te zostały wykorzystane do modelowania terapii raka, chorób genetycznych i chorób zakaźnych. W każdym przypadku skuteczność terapeutyczną ustala się poprzez wzmocnienie funkcji odrębnego potomstwa HSPC, w tym czerwonych krwinek, limfocytów T, limfocytów B i/lub podzbiorów szpiku. Metody izolacji, modyfikacji i przygotowania produktów HSPC mają bezpośrednie zastosowanie i można je przełożyć na wiele chorób u ludzi.

Opisany powyżej protokół służy do izolacji i modyfikacji genetycznej komórek CD34 pochodzących od nie-ludzkich naczelnych (NHP).+ HSPC, które mogą być następnie przetoczone z powrotem do autologicznego gospodarza (Rysunek 1 i Rysunek 2). Stosując ten protokół, zazwyczaj otrzymujemy do 8 x 109 całkowitą liczbę leukocytów z przygotowanego szpiku kostnego makaków pigtailed oraz niekiedy dwukrotność tej ilości z...

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Aby ocenić skuteczność i bezpieczeństwo obiecujących i nowatorskich podejść do terapii genowej, kluczowe znaczenie ma kompleksowe testowanie komórek zmodyfikowanych genowo w zwalidowanych przedklinicznych modelach in vivo. Zachowanie odpowiednich markerów powierzchniowych komórek, reaktywność krzyżowa odczynników oraz zdolność do stosowania tych samych terapii wspomagających, które są podawane pacjentom wraz z modelami naczelnych innych niż ludzie, w celu ścisłego naśladowania parametrów klinicznych. Procedurę zademonstruje mi Anai Perez, technik badawczy z laboratorium dr Hansa-Petera Kiem.Zacznij od dodania od 10 do 12 mililitrów podwielokrotności szpiku kostnego wyizolowanego od zdrowego dawcy naczelnych do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Zwiększ objętość probówki do 50 mililitrów za pomocą buforu hemolitycznego i inkubuj komórki do siedmiu minut w temperaturze pokojowej. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie i odessać wszystkie oprócz ostatnich dwóch do pięciu mililitrów supernatantu.Ponownie zawiesić osad w pozostałej objętości supernatantu, przesuwając probówkę, a zawiesiny szpiku kostnego przenieść do nowej 50-mililitrowej probówki za pomocą sitka do komórek porowych o średnicy 70 mikrometrów w celu usunięcia wszelkich skrzepów krwi. Dodaj świeży bufor hemolityczny, aby zwiększyć objętość do 50 mililitrów i inkubuj komórki przez kolejne pięć minut w temperaturze pokojowej przed ich zebraniem przez odwirowanie. Odessać cały supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach maksymalnego buforu.Przed przefiltrowaniem zawiesiny komórek przez kolejne sitko o porach 70 mikrometrów, przepłucz probówkę 40 mililitrami świeżego buforu i połącz płukanie z zawiesiną komórkową. Po wzbogaceniu na komórki CD34-dodatnie zgodnie ze standardowymi protokołami sortowania komórek wspomaganym magnetycznie, umyj izolowane komórki kulek w ilości do 50 mililitrów świeżego buforu max i ponownie zawieś osad w pożywce HSPC. Następnie umieść 10 do 20 mililitrów komórek w wentylowanych, poddanych hodowli tkankowej kolbach T75 w celu ich nocnej hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Aby ocenić czystość próbek komórek szpiku kostnego przed i po wzbogaceniu, należy utworzyć protokół cytometrii przepływowej z odpowiednimi wykresami i hierarchią populacji pokazującą wszystkie bramki dla wszystkich zdarzeń: rozproszenie, CD34 dodatnie, hematopoetyczne komórki macierzyste, multipotencjalne przodki szpiku an-erythro i limfo-mieloidalne komórki progenitorowe. Następnie uruchom niebarwioną, wstępnie wzbogaconą próbkę białych krwinek, aby dostosować napięcia dla parametrów rozpraszania do przodu i bocznego oraz wszystkich kanałów fluorescencyjnych, a następnie pojedynczych barwionych kulek kompensacyjnych, aby dostosować kompensację między sąsiednimi kanałami. Następnie uruchom wszystkie pozostałe niebarwione i barwione próbki za pomocą dostosowanego i skompensowanego protokołu, aby udokumentować skuteczność wzbogacania CD34.Po ustawieniu wszystkich kompensacji skonfiguruj sortownik komórek do sortowania podzbiorów CD34 do testów komórek tworzących kolonie i załaduj barwioną probówkę z próbką wzbogaconą w CD34 na cytometr. Następnie nagraj od 2000 do 3000 zdarzeń i precyzyjnie dostosuj bramki sortowania do siły sygnału i populacji docelowych. Po zakończeniu konfiguracji należy pobrać komórki, dostosowując natężenie przepływu do 500 do 1000 komórek na sekundę i sortując od 800 do 1200 komórek od rozproszonego, CD34-dodatniego, hematopoetycznego komórki macierzystej, multipotencjalnego przodka szpiku an-erythro i progenitora limfy szpikowej do oddzielnych probówek zawierających 3,6 mililitra pożywki komórkowej tworzącej kolonię na probówkę.Pod koniec sortowania należy odwirować probówki zbiorcze i dodać jeden mililitr zawiesiny komórkowej do trzech sterylnych 3,5-centymetrowych, niepoddanych hodowli tkankowej szalek Petriego, umieszczonych na indywidualnych 15-centymetrowych szalkach Petriego na populację komórek na ich 10-14-dniową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka użyj 10-mililitrowej pipety, aby delikatnie przepłukać przylegające komórki z dna każdej kolby sterylnym HBSS i zbierz zebrane komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w podłożu transdukcyjnym w stężeniu od 1 x 10 do 6 komórek na mililitr.I dodaj jeden mililitr komórek do próbnej kontroli w jednym dołku rekombinowanego fragmentu fibronektyny pokrytej 12-dołkową płytką do całonocnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnie dodać 10 mililitrów podwielokrotności pozostałych komórek do kolb T75 pokrytych rekombinowanym fragmentem fibronektyny na 30-minutową inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych z odpowietrzonymi nakrętkami. Podczas inkubacji rozmrozić próbki pożywki kondycjonowanej przez wirusa i obliczyć ilość wirusa, która ma zostać dodana, na podstawie miana i liczby zakaźnych jednostek komórek na mililitr.Wyjąć kolbę z inkubatora i dodać odpowiednią objętość pożywki kondycjonowanej wirusem do każdej kolby przed przywróceniem komórek do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego ranka przenieś komórki z kolby do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów. Umyj komórki w ilości do 50 mililitrów HBSS na pranie i powtórz ten krok do trzech razy, aby usunąć resztki wirusa.Inkubować komórki przez dwie godziny w pożywce HSPC uzupełnionej prostaglandyną E2. Następnie umyj komórki i ponownie zawieś je w 10 mililitrach HBSS uzupełnionych 2% surowicą autologiczną na probówkę. Następnie odessać zawiesiny komórek za pomocą 20-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 16,5. Umyć wnętrze probówki świeżym HBSS plus 2% surowicy autologicznej i odessać do strzykawki.Ostrożnie zakryć strzykawkę nasadką igły przed umieszczeniem roztworu komórkowego na lodzie do momentu jego infuzji do żywiciela autologicznego. Aby określić skuteczność modyfikacji genów transdukowanych komórek, należy umieścić płytki 1 x 10 do 6. zarezerwowanych komórek próbnych lub transdukowanych na mililitr pożywki HSPC na płytki poddane działaniu kultur nietkankowych. W drugim, piątym i dwunastym dniu po transdukcji zbierz i policz komórki.W drugim i piątym dniu ponownie pokryj 33% komórek w świeżej pożywce HSPC w stężeniu 1 x 10 do 6 na mililitr. W drugim, piątym i dwunastym dniu zamroź 33% komórek w buforze do ekstrakcji DNA w celu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i przeanalizuj końcowe 33% komórek za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami w celu oceny składu fenotypowego krwiotwórczego potomstwa. Aby określić ilościowo ekspresję transgenu za pomocą cytometrii przepływowej, dodaj trzy dodatkowe wykresy rozproszenia bocznego w funkcji transgenu; i Gate pierwszy wykres na hematopoetycznych komórkach macierzystych, drugi wykres na multipotencjalnych przodkach szpiku an-erythro, a trzeci wykres na przodkach limfy szpikowej, wszystkie przeciwko transgenowi. Następnie nagraj od 2000 do 3000 zdarzeń i precyzyjnie dostosuj bramki sortowania, aby dopasować je do siły sygnału i populacji docelowych.Korzystając z tego protokołu, liczba wzbogaconych HSPC z CD34 dodatnimi wartościami CD34 u naczelnych jest zazwyczaj proporcjonalna do wejściowej całkowitej liczby białych krwinek. Ponieważ poprzednie odkrycia wykazały, że całkowity produkt HSPC z dodatnim CD34 obejmuje komórki, które nie są prawdziwymi długoterminowymi i przeszczepiającymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi, te techniki oparte na cytometrii przepływowej i komórkach tworzących kolonie można wykorzystać do wiarygodnej identyfikacji i różnicowania podzbiorów wzbogaconych o długoterminowe hematopoetyczne komórki macierzyste od zaangażowanych komórek progenitorowych. Komórki wzbogacone w ludzkie komórki macierzyste CD34 mogą być skutecznie modyfikowane genowo za pomocą wektorów lentiwirusowych.Komórki zawierające niezintegrowaną kopię wektora rozcieńczają się w ciągu 12-dniowego okresu oznaczania płynnej hodowli, podczas gdy stabilnie zintegrowane wektory w genomie są przekazywane całemu potomstwu. Potwierdza to ekspresja wektora w testach komórek tworzących kolonie. Ta metoda przedkliniczna może być stosowana do izolowania genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych o kontrolowanej jakości do terapii genowej.Metodę tę można łatwo dostosować do innych gatunków, źródeł hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych, narzędzi terapii genowej i chorób. Ten dokładnie sprawdzony protokół jest bardzo obiecujący dla modelowania skutecznych terapii wielu chorób u ludzi. Należy pamiętać, że praca z tkankami naczelnych wymaga zwiększonych środków bezpieczeństwa, w tym środków ochrony osobistej.

preparation-gene-modification-nonhuman-primate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Tutaj opisujemy ekspansję ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej leczonej kombinacją koktajlu cytokin i VPA. Metoda ta prowadzi do znacznego stopnia ekspansji ex vivo prymitywnych HSC do zastosowań klinicznych lub laboratoryjnych.

Ekspansja ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej przy użyciu kwasu walproinowego

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Prezentujemy metodę hodowli i edycji genów pierwotnych komórek B makaków rezusów przy użyciu CRISPR/Cas9 i rekombinowanego adenowirusa serotypu 6 do badania terapii komórkami B.

Edycja genów pierwotnych komórek B makaka rezusa

Obecny protokół opisuje metodę izolacji, ekspansji i przeprogramowania ludzkich i nieludzkich komórek pochodzących z moczu naczelnych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), a także instrukcje dotyczące konserwacji nowo wygenerowanych iPSC bez konieczności dostarczania pokarmu.

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Poznaj izolację i modyfikację genową komórek CD34+ z kości szpiku naczelnych przy użyciu wektorów lentiwirusowych. Ta metoda umożliwia przygotowanie terapeutycznego produktu do autologicznej infuzji w modelach przedklinicznych.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Przeglądaj więcej filmów