Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek
18 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.
Jest to metoda polegająca na zastosowaniu stymulacji elektromechanicznej na komórkach. Ma wiele zastosowań do badania jego wpływu na populację komórek, wstępnego treningu do dostarczania in vivo i dojrzewania komórek. Zaletą jest to, że bodźce elektryczne i mechaniczne mogą być stosowane za pomocą tego samego urządzenia pojedynczo lub jednocześnie, zachowując nienaruszoną sterylność wirusa.
Ta technika jest pośrednim podejściem do naszej terapii. Uważa się, że terapia komórkowa jest stymulowana elektromechanicznie, komórki mogą być interesującą populacją komórek do leczenia mięśnia sercowego. Ta metoda ogólnie należy do dziedziny sercowo-naczyniowej, ale może być również stosowana do układu nerwowego.
Jest to łatwa technika, która wymaga cierpliwości. Najtrudniejszą częścią będzie praca z małymi kawałkami i utrzymanie sterylności przez cały czas. Są drobne szczegóły manipulacji, które są trudne do wyjaśnienia, więc wizualna demonstracja jest naprawdę pomocna.
Zacznij od przeniesienia 12 oczyszczonych konstruktów PDMS na sterylne 10-centymetrowe płytki. Aby zapewnić całkowitą sterylizację, wystawiaj płytki na działanie światła UV przez pięć minut. Następnie przenieś każdy konstrukt na oddzielną 35-milimetrową płytkę do hodowli komórkowej lub 6-dołkową płytkę w celu natychmiastowego wysiewu komórek.
Aby rozpocząć wysiewanie komórek, najpierw umyj zlewającą się kolbę T75 sercowych ATDPC pięcioma mililitrami 1x PBS. Aby odłączyć komórki, dodaj jeden mililitr 0,05% trypsyny-EDTA. I inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki, aby dezaktywować trypsynę-EDTA. Zbierz wszystkie odłączone komórki w 15-mililitrowej probówce. Umyj szkło komórkowe dwukrotnie pięcioma mililitrami PBS, aby zebrać pozostałe komórki i dodaj je do 15-mililitrowej probówki.
Wirować przy 230 g przez pięć minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach kompletnego podłoża i policz je za pomocą hemocytometru. Wysiewaj 200 mikrolitrów sercowych ATDPC do każdej płytki za pomocą konstruktów PDMS, aby uzyskać około 80% powierzchni wysiewu pokrytej komórkami następnego dnia.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Delikatnie dodać 2 mililitry wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża na płytkę. Inkubuj komórki z konstruktami w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez noc.
Przed rozpoczęciem tej procedury przypisz sześć z 12 konstruktów do stymulacji elektromechanicznej i zachowaj sześć dla niestymulowanych kontroli. Użyj 70% etanolu do czyszczenia jednostki stymulującej. Umieść jednostkę stymulującą, sterylne elektrody i pęsetę w komorze przepływowej.
Aby łatwo manipulować elektrodami i konstrukcjami, należy usunąć 90% pożywki z każdej płytki do hodowli komórek. Umieść konstrukcje PDMS we właściwej pozycji w kierunku magnesu, aby zapewnić przyciąganie magnetyczne zarówno między magnesami stałymi, jak i ruchomymi. Te dwa poprzednie kroki, w których manipulujesz konstruktami PDMS komórki i elektrodami, zachowując sterylność przez cały proces, są najbardziej krytyczne.
Następnie podłącz przewód platynowy do złączy elektrod. Ustaw część elektrod z PTFE w wyznaczonych miejscach w konstrukcjach PDMS. Dodaj 2,5 mililitra świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki do każdej konstrukcji.
Po umieszczeniu wszystkich konstrukcji PDMS i podłączeniu ich elektrycznie do platformy, umieść platformę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnie podłącz źródło elektryczne i mechaniczne. Aby skonfigurować program stymulacji, należy określić reżimy stymulacji elektrycznej i mechanicznej za pomocą interfejsów użytkownika stymulatora elektrycznego i aplikacji, która steruje stymulacją mechaniczną.
Aby ustawić synchronizację, włącz stymulator elektryczny i poczekaj, aż na wyświetlaczu pojawi się menu główne. Następnie wybierz opcję drugą, edytuj sekwencję i Enter. Aby edytować menu sekwencji, użyj zakładki tryb, aby wybrać bieżącą"klikając plus" i naciskając Enter "Na okres wybierz 1000" z plusem / minusem i naciśnij Enter "A dla zakładki trybu wyzwalania wybierz zewnętrzne przez oprogramowanie i naciśnij Enter" Dla zakładki amplitudy wybierz 1 "z plusem / minusem i naciśnij Enter" Następnie wróć do menu głównego, wybierz opcję 4, a następnie wygeneruj sekwencję i naciśnij Enter"W sekcji stymulacji mechanicznej panelu aplikacji sterowania najpierw napisz 1000"w kontrolce tekstu z kropką plus.
Następnie napisz 500 "w kontrolce tekstowej czasu włączenia, aby ustawić czas trwania impulsu mechanicznego. Na koniec napisz 2000" w kontrolce tekstu wychylenia, aby uzyskać wydłużenie konstrukcji o 10%. Zmieniaj nośnik komórkowy dwa razy w tygodniu, najpierw usuwając stary nośnik, a następnie dodając ciepły, świeży nośnik po bokach wspornika PDMS.
Siódmego dnia, pod koniec eksperymentu, zbierz próbki zgodnie z opisem w rękopisie. Elektromechanicznie stymulowane ATDPC serca zwiększyły ich potencjał kardiomiogenny. Wskazał na to PCR w czasie rzeczywistym, który wykazał zwiększoną ekspresję wczesnych i późnych genów sercowych, w szczególności czynnika transkrypcyjnego serca GATA-4, markera strukturalnego łańcucha ciężkiego beta-miozyny i genu związanego z wapniem Connexin43.
Barwienie falloidyną na tle włókien aktyny wykazało, że większość komórek ustawiła się zgodnie z pionowym wzorem. Dystrybucja Connexin43 odbywała się głównie w cytoplazmie i błonie komórkowej, przyczyniając się do komunikacji wewnątrzkomórkowej poprzez połączenia szczelinowe. Czynniki transkrypcyjne MEF2 i GATA-4 zlokalizowano w jądrach sercowych ATDPC.
Ale GATA-4 nie został wykryty w podskórnych ATDPC. Markery cytoplazmatyczne SERCA2 i alfa-aktynina sarkomerowa nie wykazywały dojrzałej organizacji sarkomerowej typowej dla kardiomiocytów. Bicia nie obserwowano w kontrolnych i stymulowanych populacjach komórek.
Kluczowe znaczenie ma zdrowa monowarstwa komórek na początku tego protokołu i utrzymanie sterylności przez cały czas trwania zabiegu. Po pobraniu próbki można przeprowadzić standardowe techniki ekspresji białek genomu. Technika ta pomaga lepiej zrozumieć wpływ bodźców elektrycznych i/lub mechanicznych komórek.
Do niedawna niemożliwe było używanie tego samego urządzenia do obu stymulacji, co utrudniało porównywanie wyników.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę stosowania stymulacji elektromechanicznej dla komórek, poprawiającą ich potencjał kardiogeniczny. Technika ta ma zastosowanie w terapii komórkowej, modelowaniu chorób i przesiewowaniu leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad układem krążenia
- Terapia komórkowa
- Zastosowania w neurobiologii
Tło
- Stymulacji elektromechaniczna może poprawić dojrzewanie komórek.
- Ta metoda pozwala na jednoczesne stosowanie stymulacji elektrycznej i mechanicznej.
- Technika utrzymuje sterylne warunki dla integralności wirusów.
- Jest istotna zarówno dla badań nad układem krążenia, jak i układem nerwowym.
Cel badania
- Poprawić potencjał kardiogeniczny populacji komórek.
- Zbadać wpływ stymulacji elektromechanicznej na komórki.
- Zapewnienie metody pre-treningowej dla dostarczenia in vivo.
Stosowane metody
- Stosowane stymulacje elektryczne
- Stosowane stymulacje mechaniczne
- Techniki jednoczesnej stymulacji
- Utrzymywanie warunków sterylnych
Główne wyniki
- Poprawa dojrzewania traktowanych komórek.
- Potencjał dla efektywnych zastosowań terapii komórkowej.
- Wszechstronność w zastosowaniach w różnych dziedzinach.
- Wskazania do dalszych badań w modelowaniu chorób.
Wnioski
- Stymulacji elektromechaniczna jest obiecującą strategią dla terapii komórkowej.
- Ta metoda może prowadzić do postępów w przesiewowaniu leków.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać jej pełny potencjał.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Electromechanical stimulation addresses a key limitation in cardiac cell therapy: the immature phenotype of stem cell-derived cardiomyocytes. By recapitulating physiological electrical and mechanical cues, this method enhances cardiomyogenic potential, improving predictive confidence in preclinical models. This supports de-risking of cell-based therapies and disease modeling platforms prior to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac lineage commitment through upregulation of early (GATA-4), structural (beta-myosin heavy chain), and calcium-regulating (Connexin43) genes.
- Operational Value: Provides a standardized stimulus platform to compare electrical, mechanical, or combined conditioning effects on cell populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates electrically and mechanically conditioned cells with aligned actin fibers and membrane-localized Connexin43, supporting functional assay readiness.
- Operational Value: Allows consistent pre-conditioning of cell batches for reproducible drug response profiling in high-throughput formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by maturing cells toward an adult-like phenotype, reducing mechanistic ambiguity in engraftment studies.
- Operational Value: Supports scalable production of stimulated cell populations for dose-response and toxicity screening in cardiovascular disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling conditioned cell generation after progenitor expansion and prior to functional validation or compound testing.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that biophysical cues drive cardiomyogenic differentiation, supporting target validation via marker expression.
- Screening: Produces stimulation-primed cells with enhanced structural and electrical coupling, improving assay sensitivity to cardiotropic compounds.
- Analytics: Delivers quantitative PCR and imaging readouts (e.g., gene expression, actin alignment, gap junction distribution) for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Advances cells from progenitor state to a more mature cardiac phenotype, supporting preclinical continuity in disease modeling.
- Enterprise Reuse: The stimulation platform is reusable across cell lines and stimulus regimens, promoting standardization across discovery teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in cardiac lineage specification through multi-parametric maturation readouts.
- Operational Value: Sterile, simultaneous electrical and mechanical stimulation reduces variability and manual handling.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by de-risking mechanistic uncertainty in cell therapy mechanisms of action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell candidates based on stimulation-responsive maturation potential.
Implementation Considerations
- Expertise in cell culture, sterile technique, and stimulation device operation.
- Access to electrical and mechanical stimulators with synchronized control software.
- Standardized protocols for construct seeding, medium exchange, and stimulus parameter configuration.
- Adaptation considerations for different cell types, matrix materials, and stimulation waveforms.
- Limitation: Maturation assessed via marker expression; functional metrics like contractility were not observed in this study.
