Name: Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj fluorescencyjną symografię peptydową do wykrywania aktywności proteaz w badaniach biochemicznych. Ta modułowa metoda umożliwia łatwą modyfikację sekwencji peptydowych dla celów badawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez The Ohio State University College of Engineering, Wydział Inżynierii Biomedycznej oraz Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital i Richard J. Solove Research Institute.

1. Przygotowanie warstwy żelu rozdzielczego
<ol>
	<li>Przygotować 10% roztwór żelu rozdzielczego poliakryloamidu zgodnie z tabelą 1. Dodać tetrametyloetylenodiaminę (TEMED) i nadsiarczan amonu (APS) bezpośrednio przed wlaniem żelu, ponieważ ich dodanie inicjuje reakcję polimeryzacji.</li>
	<li>Napełnij pustą kasetę z miniżelem o średnicy 1,5 mm do połowy (5 ml) roztworem żelu o rozdzielczości 10%.</li>
	<li>Dodaj cienką warstwę izopropanolu (~500 μL) na wierzch żelu poliakrylamidowego, aby uzyskać płaski żel i zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona (~40 min).</li>
</ol>
2. Przygotowanie cząsteczki łącznika azydo-PEG3-maleimidu
<ol>
	<li>Podczas gdy pierwsza rozdzielcza warstwa żelu ulega polimeryzacji, wyjmij zestaw azido-PEG3-maleimid z magazynu w temperaturze -20 °C i pozwól składnikom osiągnąć temperaturę pokojową. W każdym zestawie znajdują się dwa elementy. Fiolka 1 zawiera ester maleimidu NHS, ciało stałe o barwie od białawej do szarej. Fiolka 2 zawiera azido-PEG3-aminę, lekko żółty olej. 
	UWAGA: Autorzy sugerują użycie zestawu 25 mg azido-PEG3-maleimid, ponieważ może on być przechowywany tylko przez krótki czas (1-2 godziny) w temperaturze -20 °C po przygotowaniu, zanim zacznie ulegać degradacji. 25 mg wystarcza do wyprodukowania 10 żeli peptydowych. Żele należy zużyć w ciągu 3 tygodni od przygotowania.</li>
	<li>Rozpuść składniki fiolki 2 w zalecanej przez producenta objętości dimetylosulfotlenku (DMSO) i wiruj przez 30 sekund, aby upewnić się, że płyny zostały dobrze wymieszane.</li>
	<li>Przenieść zawartość fiolki 1 do czystej, suchej kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml zawierającej mieszadło. 
	UWAGA: Przed użyciem przepłukać kolbę acetonem i całkowicie wysuszyć, aby zapobiec zakłóceniu reakcji przez wilgoć.</li>
	<li>Natychmiast włożyć do otworu kolby gumowy korek do przegrody z membraną, którą można przekłuć strzykawką. Pracuj szybko, aby zapobiec przedostawaniu się wilgoci do kolby.</li>
	<li>Włóż dwie igły strzykawki o rozmiarze 18 do membrany i podłącz jedną z nich do zbiornika z gazem obojętnym (np. argonem). Pozostawić gaz obojętny do napełnienia kolby przez 3 minuty. Składniki fiolek 1 i 2 należy zmieszać w atmosferze gazu obojętnego, aby zapobiec powstawaniu niepożądanych produktów reakcji. 
	UWAGA: Druga igła strzykawki ma za zadanie zapewnić odpowietrznik, umożliwiając w ten sposób przepływ powietrza atmosferycznego zawartego w kolbie z kolby podczas napełniania jej gazem obojętnym. Nie zapomnij dołączyć igły odpowietrzającej!</li>
	<li>Odciąć dopływ gazu obojętnego i odłączyć go od igły. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć całą zawartość fiolki 2 do kolby.</li>
	<li>Wyjmij obie igły i strzykawkę i pozwól składnikom mieszać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszając.</li>
	<li>Zdjąć gumowy korek do przegrody i przenieść zawartość do czystej probówki wirówkowej o pojemności 5 ml. Roztwór maleimidu azydo-PEG3 należy zużyć w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie warstwy żelu rozdzielczego peptydów
<ol>
	<li>Gdy pierwsza rozdzielcza warstwa żelu spolimeryzuje się, odlej warstwę izopropanolu. Opłucz górną część żelu, pipetując 1 ml wody dejonizowanej na wierzch żelu, a następnie odlej wodę.</li>
	<li>Pobrać funkcjonalizowany tiolem peptyd fluorescencyjny z magazynu w temperaturze -80 °C i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Peptyd funkcjonalizowany tiolem można przygotować zgodnie z wcześniejszym opisem11,12. Można również stosować dostępne w handlu peptydy, ale wymagają one dodania końcowej reszty cysteiny, aby umożliwić reakcję kliknięcia maleimid-tiol. Rozpuścić peptyd do stężenia podstawowego 10 mM i przechowywać go w temperaturze -80 °C w małych (30 μl) podwielokrotnościach w celu ograniczenia powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przygotować 10% rozdzielczy roztwór żelu zawierający cząsteczkę łącznika azydo-PEG3-maleimidu i peptyd fluorescencyjny zgodnie z tabelą 1. Dodać TEMED i APS bezpośrednio przed nalewaniem żelu, ponieważ ich dodanie inicjuje reakcję polimeryzacji.</li>
	<li>Napełnij połowę pozostałej części kasety z żelem (3 ml) roztworem żelu rozpuszczającego peptydy. 
	UWAGA: Wielowarstwowe podejście do żelu rozdzielczego zmniejsza ilość peptydu i łącznika niezbędnego dla każdego żelu. Rozmiar warstwy żelu rozdzielczego peptydów można dostosować, aby w razie potrzeby dostosować się do większego zakresu mas cząsteczkowych.</li>
	<li>Odpipetować cienką warstwę izopropanolu (~500 μl) do górnej części żelu poliakrylamidowego, aby uzyskać równy żel i zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona (~40 min). 
	UWAGA: Peptyd fluorescencyjny jest wrażliwy na światło. Żele należy przykryć folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu podczas przygotowywania żelu, elektroforezy, mycia i wywoływania.</li>
	<li>Odleć warstwę izopropanolu i spłukać górną część żelu rozpuszczającego peptydy wodą dejonizowaną, jak w kroku 3.1.</li>
	<li>W przypadku natychmiastowego użycia żeli należy przejść do kroku 4, w przeciwnym razie należy zanurzyć przygotowane żele w 100 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C w plastikowym pudełku, aby zapobiec wysychaniu żeli. Owiń pudełko folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu. Żele można przechowywać w PBS do 3 tygodni przed użyciem.</li>
</ol>
4. Przygotowanie żelu do układania
<ol>
	<li>Przygotować 5% roztwór żelu do układania w stosy zgodnie z tabelą 1. Dodać TEMED i APS bezpośrednio przed nalewaniem żelu, ponieważ ich dodanie inicjuje reakcję polimeryzacji.</li>
	<li>Napełnij pozostałą pustą część kasety z żelem (~2 ml) roztworem żelu do układania w stosy.</li>
	<li>Szybko włóż grzebień żelowy o średnicy 1,5 mm do warstwy żelu do układania w stosy, upewniając się, że pod studzienkami nie pozostały żadne pęcherzyki. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona (~10 min).</li>
	<li>Delikatnie wyjmij grzebień i taśmę z tyłu kasety z żelem.</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbek biologicznych do elektroforezy
<ol>
	<li>Przygotuj kondycjonowane pożywki komórkowe, lizaty komórkowe, homogenaty tkankowe i wzorce MMP zgodnie z opisem w innym miejscu w warunkach nieredukcyjnych2. Nie podgrzewaj próbek.</li>
	<li>Na przykład przygotuj kondycjonowane podłoże komórkowe w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Płytka 40 000 komórek/cm,2 komórki na 6-dołkowej płytce w 10% pożywce hodowlanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki w wilgotnej komorze (5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez 24 godziny i pozwolić im osiągnąć 70-80% konfluencji. 
		UWAGA: Jeśli komórki nie osiągną pożądanej konfluencji po 24 godzinach, pozwól im rosnąć w 10% pożywce hodowlanej FBS przez dodatkowe 24 godziny.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj 2 ml pożywki hodowlanej bez surowicy. Inkubować komórki w wilgotnej komorze (5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez dodatkowe 24 godziny.</li>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej zebrać kondycjonowane podłoże z każdej studzienki. Wirować pożywkę z prędkością 1200 obr./min przez 3 minuty, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Pobrać supernatant i stężyć za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o pojemności 15 ml i masie cząsteczkowej 10 kDa. Odwirować jednostki filtrujące przy 4.000 x g przez 15 min w wirniku wahliwym lub 5.000 x g przez 15 min w wirniku o stałym kącie. 
		UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale może zwiększyć intensywność prążków proteolitycznych w żelach peptydowych zymografii.</li>
		<li>Przenieść skoncentrowany filtrat do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Porcjować i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C przez maksymalnie trzy cykle zamrażania i rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo zawartość białka za pomocą standardowego testu ilościowego białka (np. BCA, test Bradforda itp.).</li>
</ol>
6. Elektroforeza próbek biologicznych w żelach peptydowych
<ol>
	<li>Próbki rozpuścić w konwencjonalnym buforze do próbek zymografii (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glicerol, 4% SDS, 0,01% błękit bromofenolowy). W przypadku próbek komórek i tkanek zaleca się ~30 μg całkowitego białka na studzienkę i 50-100 ng białka w przypadku wzorców MMP.</li>
	<li>Dodaj 400 ml 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer do aparatu żelowego. Załadować do 35 μl próbki na studzienkę. Badać próbki pod napięciem 120 V w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny lub do momentu, gdy wzorce masy cząsteczkowej wykażą, że interesujące proteazy znajdują się w warstwie żelu rozdzielającego peptydy (która ma widoczny pomarańczowy kolor). 
	UWAGA: Większość MMP i ich wariantów mieści się w zakresie 35-100 kDa. Gdy wzorce masy cząsteczkowej wskazują, że masy te znajdują się w warstwie żelu rozdzielczego peptydów, elektroforezę można zatrzymać. Tę samą zasadę można zastosować do innych klas proteaz o znanych masach cząsteczkowych. Jeśli istnieje zainteresowanie wykrywaniem wielu proteaz w większym zakresie mas cząsteczkowych, należy zmniejszyć rozmiar warstwy żelu rozdzielczego i zwiększyć rozmiar warstwy żelu rozdzielczego peptydów.</li>
	<li>Po elektroforezie wyjąć żele z plastikowej kasety i myć żele trzy razy przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem w buforze renaturyzacyjnym zawierającym 2,5% Triton X-100, 1 μM ZnCl2 i 5 mM CaCl2 w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.</li>
	<li>Przenieść żele do rozwijającego się roztworu buforowego zawierającego 1% Triton X-100, 1 μM ZnCl2 i 5 mM CaCl2 w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 przez 15 min. Zastąpić świeżym roztworem buforowym do wywoływania i inkubować żele w temperaturze 37 °C pod delikatnym mieszaniem przez 24 godziny, upewniając się, że żele są całkowicie zanurzone w roztworze.</li>
</ol>
7. Obrazowanie żeli peptydowych
<ol>
	<li>Po 24 godzinach zobrazuj żele za pomocą skanera/imagera z żelem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji. Na przykład żele peptydowe pokazane w reprezentatywnych wynikach są sprzężone z fluoresceiną i zostały zobrazowane przy użyciu filtra wzbudzającego o długości fali 488 nm i filtra emisyjnego o długości fali 521 nm. Stosowanie odpowiednich filtrów dla Twojego fluoroforu zmaksymalizuje wykrywanie aktywności proteolitycznej. 
	UWAGA: Obrazy można również wykonywać za pomocą aparatu do obrazowania żelowego wyposażonego w transiluminator UV, często używanego do obrazowania żeli DNA barwionych bromkiem etydyny. Zobrazuj żele za pomocą ustawienia transiluminatora UV (365 nm) i filtra emisyjnego 590 nm.</li>
	<li>Przeprowadź densytometryczną ocenę natężeń pasma za pomocą ImageJ, jak opisano w innym miejscu13.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
<li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).</li>
<li>Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+zymography+as+a+sensitive+and+specific+technique+for+the+determination+of+subpicogram+levels+of+interstitial+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase.</a> Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).</li>
<li>Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+collagen+zymography+approach+for+evaluating+the+collagenases+MMP-1%2C+MMP-8%2C+and+MMP-13%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13.</a> BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).</li>
<li>Perera, H. K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Aspartic+Proteinase+Activities+Using+Gel+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Zymography%22%5BJournal%5D)">Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography.</a> Zymography. , 43-52 (2017).</li>
<li>van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).</li>
<li>Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOliver%2C+GW+%22Proteolytic+Enzymes.+Springer+Lab+Manual%22">Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).</li>
<li>Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+covalent+tethering+of+fluorogenic+substrates+in+zymogram+gels%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels.</a> BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).</li>
<li>Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proteolytic+activity+by+fluorescent+zymogram+in-gel+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays.</a> BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).</li>
<li>Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+3D+cellular+microenvironments+using+a+fluorogenic+peptide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate.</a> Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).</li>
<li>Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+bioscaffolds+for+3D+culture+of+melanoma+cells+reveal+increased+MMP+activity+and+migration+with+BRAF+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).</li>
<li>Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+as+a+Research+Tool+in+the+Study+of+Matrix+Metalloproteinase+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).</li>
<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecne techniki zymograficzne polegają na wprowadzaniu natywnych substratów do żeli poliakrylamidowych w celu wykrycia proteolizy. Chociaż techniki te zyskały szerokie zastosowanie, nadal mają ograniczoną liczbę proteaz, które mogą wykryć. W tym miejscu opisano protokół, w którym fluorescencyjne, degradowalne przez proteazę peptydy są włączane do żelu rozdzielczego poliakrylamidu. Sprzężenie kowalencyjne za pomocą cząsteczki łącznika azydo-PEG3-maleimidu umożliwia separację i wykrywanie szerszej gamy proteaz niż jest to ...

Żelowa zymografia to technika biologiczna używana do pomiaru aktywności proteolitycznej w próbkach biologicznych, takich jak płyny ustrojowe lub pożywki do hodowli komórkowych1,2,3. Próbki są rozdzielane według ich mas cząsteczkowych za pomocą elektroforezy przez żel poliakrylamidowy osadzony w degradowalnym podłożu. Typowe substraty ulegające degradacji obejmują żelatynę, kazeinę, kolagen i elastynę, które zostały wykorzystane do pomiaru aktywności metaloproteinaz macierzy (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 i -11, a także różnych katepsyn1,2,4,5,6,7,8. Po elektroforezie enzymy są renaturyzowane i mogą degradować białko w żelu. W tradycyjnej symografii żelowej żel jest barwiony barwnikiem białkowym, takim jak Coomassie Blue, a aktywność proteazy jest wykrywana jako utrata sygnału, tj. białe pasma (degradacja białka) na ciemnoniebieskim tle.
Tutaj opisujemy protokół alternatywnej metody żelowej zymografii, w której degradowalnym substratem jest krótki, fluorogenny peptyd kowalencyjnie włączony do żelu poliakrylamidowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Zastąpienie syntetycznych peptydów jako degradowalnych substratów umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz w porównaniu z tradycyjną zymografią żelową z natywnymi białkami9. Wiązanie kowalencyjne peptydu fluorogenicznego zapobiega dyfuzji i migracji peptydu podczas elektroforezy żelowej obserwowanej poprzednimi metodami9,10. Co więcej, zastosowanie substratu fluorogennego umożliwia bezpośrednie wykrycie aktywności proteazy bez dodatkowych etapów barwienia i odbarwiania. Ogólnym celem tej metody jest wykrycie aktywności proteazy w próbkach biologicznych poprzez kowalencyjne włączenie peptydów fluorogennych do żeli zymogramowych.

<table><tbody><tr><td>Puste kasety na żel 1,5 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mm, 10-dołkowe puste grzebienie kasetowe żelowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x Bufor do próbek symografii</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (w/v) Akrylamid/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw azydo-PEG3-Maleimid</td><td>Kliknij Chemia Narzędzia</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Igły podskórne PrecisionGlide</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna (100 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr> Korek <tr><td>gumowy do przegrody</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka z końcówką ślizgową (1 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Obrazowanie molekularne</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Celem tej metody jest pomiar aktywności proteolitycznej złożonych próbek biologicznych. Próbki rozdziela się według masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy za pomocą żelu rozdzielczego osadzonego w degradowalnym podłożu. Metoda ta różni się od tradycyjnej zymografii żelowej tym, że wygaszony peptyd fluorogenny jest kowalencyjnie włączany do żelu rozdzielczego zamiast białek o pełnej długości, takich jak żelatyna lub kazeina. Zastosowanie peptydów fluorogennych umożliwia bezpośrednie wykrycie aktywności proteolitycznej bez dodatkowych etapów barwienia. Enzymy w próbkach biologicznych rozszczepiają wygaszony peptyd fluorogenny, powodując wzrost fluorescencji. Sygnał fluorescencyjny w żelach jest następnie obrazowany za pomocą standardowego skanera żelu fluorescencyjnego i określany ilościowo za pomocą densytometrii. Zastosowanie peptydów jako degradowalnego substratu znacznie rozszerza możliwe proteazy wykrywalne za pomocą technik zymograficznych.

Stosując opisaną tutaj metodę, do żeli poliakrylamidowych włączono dwa fluorescencyjne peptydy degradowalne przez proteazy: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (w tekście i na rysunkach oznaczony skrótem QGIW) oraz GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2C (w tekście i na rysunkach oznaczony skrótem LACW). Symbol ↓ wskazuje miejsce rozszczepienia. QGIW jest sekwencją pochodzącą z kolagenu typu I, zaprojektowaną do wykrywania komórkowych kolagenaz14. LACW jest sekwen...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Obecne techniki zymograficzne wykrywają ograniczoną liczbę proteaz. Fluorescencyjna zymografia peptydowa wykorzystuje peptydy fluorescencyjne jako degradowalny substrat, umożliwiając pomiar większego zakresu proteaz. Główną zaletą tej metody jest jej modułowa budowa.Sekwencja peptydu fluorescencyjnego określa, które proteazy są wykrywane, a peptyd fluorescencyjny można łatwo zamienić na peptyd o innej sekwencji, co daje możliwość wykrywania innych proteaz. Technika ta może pomóc w projektowaniu zastosowań peptydów jako degradowalnych środków sieciujących w biomateriałach inżynieryjnych, takich jak te używane do dostarczania leków lub zastosowań w inżynierii tkankowej. Włączenie tego peptydu do tej techniki może zidentyfikować proteazy wydzielane przez tkanki, które są odpowiedzialne za degradację biomateriału.Demonstracja tej techniki jest ważna w celu zobrazowania wielowarstwowego podejścia, które jest unikalne w porównaniu z innymi technikami zymografii. Tę technikę zademonstruje Ameya Deshmukh, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować 10% roztwór żelu rozdzielczego poliakrylamidu, zgodnie z tabelą pierwszą protokołu tekstowego.Bezpośrednio przed nalewaniem żelu należy dodać TEMED i APS. Następnie napełnij i opróżnij 1,5-milimetrową mini kasetę żelową do połowy roztworem żelu rozdzielczego. Dodaj cienką warstwę izopropanolu na wierzch żelu poliakrylamidowego, aby uzyskać równy żel i zapobiec powstawaniu pęcherzyków.Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Gdy poliakrylamid w probówce całkowicie zastygnie, reakcja jest zakończona. Podczas gdy pierwsza rozdzielcza warstwa żelu ulega polimeryzacji, wyjmij zestaw Azido-PEG3-Maleimide z magazynu w temperaturze 20 stopni Celsjusza i pozwól składnikom osiągnąć temperaturę pokojową.Następnie rozpuść składniki fiolki drugiej w zalecanej przez producenta objętości DMSO. I wiruj przez 30 sekund, aby upewnić się, że płyny są dobrze wymieszane. Przenieść zawartość fiolki pierwszej do czystej, suchej kolby okrągłodennej o pojemności 100 mililetów, która zawiera mieszadło.Natychmiast włożyć do otworu kolby gumowy korek do przegrody z membraną, którą można przekłuć strzykawką. Następnie włóż dwie igły strzykawkowe o rozmiarze 18 do membrany. Podłączyć jedną z igieł strzykawki do zbiornika z gazem obojętnym i pozwolić, aby gaz wypełnił kolbę okrągłodenną przez trzy minuty.Następnie odciąć dopływ gazu obojętnego i odłączyć go od igły. Za pomocą strzykawki wstrzyknąć całą zawartość fiolki numer dwa do kolby. Wyjąć obie igły i strzykawkę.Pozostaw składniki do wymieszania przez 30 minut w temperaturze pokojowej, mieszając. Następnie usuń gumowy korek do przegrody i przenieś zawartość do czystej, pięciomililitrowej probówki wirówkowej. Gdy pierwsza rozdzielcza warstwa żelu spolimeryzuje się, odlej warstwę izopropanolu.Odpipeuj jeden mililitr wody dejonizowanej na żel, a następnie wylej wodę, aby spłukać żel. Pobrać funkcjonalizowany tiolem peptyd fluorescencyjny z magazynu w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.Przygotować 10% rozdzielczy roztwór żelu zawierający cząsteczkę łącznika Azido-PEG3-Maleimid i peptyd fluorescencyjny, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Bezpośrednio przed nalewaniem żelu dodaj TMED i APS. Następnie napełnij połowę pozostałej części kasety żelowej roztworem żelu rozpuszczającego peptydy.Dodaj cienką warstwę izopropanolu na wierzch żelu poliakrylamidowego, aby uzyskać równy żel i zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Po zakończeniu reakcji odlej warstwę izopropanolu.Odpipeuj jeden mililitr wody dejonizowanej na żel, a następnie wylej wodę, aby spłukać żel. Jeśli nie użyjesz żeli od razu, przechowuj je, zanurzając je w plastikowym pudełku wypełnionym 100 mililitrami 1x PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Owiń pudełko folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu.Najpierw przygotuj 5% roztwór żelu do układania w stosy, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Bezpośrednio przed nalewaniem żelu dodaj TMED i APS. Napełnij pozostałą pustą część kasety z żelem roztworem żelu do układania w stosy.Szybko włóż 1,5-milimetrowy grzebień żelowy do warstwy żelu do układania w stosy, upewniając się, że żadne pęcherzyki nie pozostały uwięzione pod studzienkami. Użyj pozostałego roztworu poliakrylamidu, aby śledzić postęp reakcji polimeryzacji. Po zakończeniu reakcji delikatnie usuń grzebień i taśmę z tyłu kasety z żelem.Aby rozpocząć, rozpuść próbki w konwencjonalnym buforze próbek zymografii. Dodaj 400 mililitrów os 1X tris glicen SDS bufor do biegania do aparatu żelowego. Załaduj do 35 mikrolitrów próbki na studzienkę.Badaj próbki pod napięciem 120 woltów w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez półtorej godziny lub do momentu, gdy wzorce masy cząsteczkowej wskażą, że interesujące proteazy znajdują się w warstwie żelu rozdzielczego peptydów. Następnie wyjmij żele z plastikowej kasety. Umyć żele trzykrotnie w buforze do ponownego naturowania w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.Z każdym praniem trwającym 10 minut. Przenieść żele do rozwijającego się roztworu buforowego na 15 minut. Następnie zastąp roztwór świeżym buforem do rozwijania i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem przez 24 godziny.Następnie należy użyć skanera żelu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji, aby zobrazować żele. W tym badaniu do proteazy fluorescencyjnej peptydy ulegające degradacji są włączane do żeli poliakrylamidowych. QGIW to sekwencja pochodna kolagenu przeznaczona do wykrywania kolagenezy komórkowej, podczas gdy LACW to sekwencja, która została zoptymalizowana pod kątem wykrywania MMP-14 i MMP-11.Obrazowanie fluorescencyjne ujawnia liczne prążki w żelach peptydowych LACW, podczas gdy w żelach QGIW widać tylko jedno pasmo. W porównaniu z zymografią żelatyny, żele LACW są w stanie wykryć więcej prążków proteolitycznych, co świadczy o zdolności symografii peptydowej do wykrywania szerszego zakresu proteaz obecnych w próbkach biologicznych niż tradycyjne metody wykorzystujące natywne substraty. Komórki zymografii peptydowej są następnie inkubowane w buforze rozwojowym zawierającym GM6001, inhibitor MMP o szerokim spektrum działania, lub E64, ogólny inhibitor katepsyny.Traktowanie żeli peptydowych LACW GM6001 zmniejsza intensywność pasm. Podczas gdy leczenie E64 nie daje zauważalnego efektu. Leczenie żelami peptydowymi QGIQ GM6001 skutkuje całkowitą ablacją wcześniej obserwowanych prążków.Podczas gdy E64 nie ma żadnego wpływu. Zymografia żelatynowa jest przeprowadzana przy użyciu oczyszczonego, aktywowanego MMP-9 w celu porównania czułości zymografii peptydowej z obecnym złotym standardem. Żele LACW są w stanie wykryć najmniejsze stężenia MMP-9.Proteazy wymagają określonych warunków, aby ponownie się naturować i uaktywnić. Ostrożnie przygotuj roztwory buforowe, aby upewnić się, że skład i PH są prawidłowe. Metoda ta może być uzupełniona o istniejące techniki weryfikacji tożsamości i przeprowadzenia dalszej analizy mierzonych proteaz.Obejmuje to western blotting, PCR w czasie rzeczywistym i spektrometrię mas. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z poliakrylamidem. Niespolimeryzowany roztwór jest uważany za silną neurotoksynę i podczas obchodzenia się z nim należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

detection-of-protease-activity-by-fluorescent-peptide-zymography

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Zestaw do fluorescencyjnego wykrywania proteaz został opracowany do pomiaru aktywności proteaz metodą fluorometrii. Nadaje się on również do wykrywania śladowych ilości zanieczyszczeń proteazami. Metoda opiera się na proteolitycznej hydrolizie opatentowanej formulacji substratu kazeinowego znakowanego FITC.

Zastosowanie zestawu do fluorescencyjnego wykrywania proteaz w celu oznaczenia aktywności proteazy

Niniejszy protokół opisuje test oparty na aktywności enzymatycznej do wykrywania metaloproteinaz macierzy w nadsączach z kultur komórkowych lub płynach ustrojowych.

Wykrywanie funkcjonalnych metaloproteinaz macierzy metodą zymografii

W tym filmie wykonujemy zymografię, technikę elektroforetyczną, aby przeanalizować aktywność proteolityczną w próbkach biologicznych.

Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Ten film demonstruje technikę elektroforezy żelowej zymografii do oceny aktywności metaloproteinaz macierzy (MMP) obecnych w supernatancie hodowli komórkowej. Aktywne MMP degradują specyficzny dla MMP substrat osadzony w żelu poliakrylamidowym, który po barwieniu pojawia się jako przezroczyste pasma na ciemnym zabarwionym tle.

Elektroforeza żelowa zymografii: technika elektroforetyczna do wykrywania metaloproteinaz macierzy poprzez ocenę aktywności enzymatycznej

Ten film demonstruje test do badania proteolitycznego aktywności proteaz za pomocą peptydów fluorogennych. Proteaza rozpoznaje miejsce jego rozszczepienia na peptydzie, rozszczepiając go i oddzielając wygaszacz od fluoroforu, umożliwiając jego emisję fluorescencyjną. Sygnał fluorescencyjny jest wykrywany i analizowany w celu sprawdzenia wydajności rozszczepienia różnych wariantów peptydów.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Opisujemy prosty, ilościowy test kolorymetryczny, który konkretnie mierzy aktywność proteolityczną ludzkiego, mysiego lub szczurzego Granzyme B (GzmB). Protokół ten można łatwo dostosować do określania aktywności proteazy innych granulowanych proteaz serynowych poprzez hydrolizę innych syntetycznych substratów peptydowych z odpowiednią sekwencją rozpoznawania.

Test kolorymetryczny, który specyficznie mierzy aktywność proteolityczną Granzyme B: hydroliza Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Tutaj prezentujemy protokół do określenia orientacji i topologii integralnych białek błonowych w żywych komórkach. Ten prosty protokół opiera się na selektywnej wrażliwości chimer na proteazę między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a GFP.

Określanie topologii białek błonowych za pomocą ochrony proteazy fluorescencyjnej (FPP)

Tutaj prezentujemy protokół do określania specyficzności proteazy w surowych ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii MALDI-TOF.

Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

Tutaj prezentujemy szczegółową procedurę niedawno opracowanej platformy do testowania proteazy, wykorzystującej N-końcowe białko wiążące heksahistydynę/maltozę oraz rekombinowane substraty z fluorescencyjną fuzją białek przyczepione do powierzchni magnetycznych kulek agarozy kwasu niklowo-nitrylotrioctowego. Przedstawiono również późniejszą analizę w żelu próbek testowych oddzielonych elektroforezą w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu.

Zastosowanie rekombinowanych białek fuzyjnych w fluorescencyjnej platformie testowej proteazy i ich renaturacja w żelu

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

Proteinazy są niezbędne dla patogenezy bakterii, umożliwiając inwazję i unikanie odporności. Jednoetapowa ekstrakcja białek cytoplazmatycznych i błonowych bakterii w ich aktywnej postaci jest wstrząsająca. Ten artykuł wideo przedstawia ekstrakcję całych białek komórkowych Leptospira do analizy zymografii w celu wykrycia i scharakteryzowania żelatynaz.

Jednoetapowa ekstrakcja i analiza zymograficzna żelatynaz bakteryjnych

Poznaj fluorescencyjną symografię peptydową do wykrywania aktywności proteaz w badaniach biochemicznych. Ta modułowa metoda umożliwia łatwą modyfikację sekwencji peptydowych dla celów badawczych.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Przeglądaj więcej filmów