Name: Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę przesiewową inhibitorów sygnalizacji receptora limfocytów T przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia identyfikację małych cząsteczek modulujących aktywację limfocytów T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Rady Badań Medycznych Ministerstwa Zdrowia Singapuru, NMRC CBRG15may017, oraz Ministerstwa Edukacji Singapuru, 2014-T2-1-136 (dla N.R.J.G.).

<ol><li>Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+Signal+Strength+and+T+Cell+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">TCR Signal Strength and T Cell Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).</li>
<li>Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Launching+the+T-cell-lineage+developmental+programme%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Launching the T-cell-lineage developmental programme.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).</li>
<li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Rybakin, V., Gascoigne, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+assay+based+on+stimulation+of+T+cell+receptor+transgenic+thymocytes+with+peptide-MHC+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers.</a> PLoS One. 7 (8), e43191(2012).</li>
<li>Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+%26%2334%3Bself%26%2334%3B+in+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role for &#34;self&#34; in T-cell activation.</a> Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).</li>
<li>Nakayama, T., Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TCR-mediated+signaling+pathways+that+control+the+direction+of+helper+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation.</a> Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).</li>
<li>Hoerter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coreceptor+affinity+for+MHC+defines+peptide+specificity+requirements+for+TCR+interaction+with+coagonist+peptide-MHC%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC.</a> The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstimulatory+peptide-MHC+enhances+human+T-cell+antigen-specific+responses+by+amplifying+proximal+TCR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling.</a> Nature Communications. 9 (1), 2716(2018).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+T+cell+receptor+signaling+to+control+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development.</a> Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tespa1+is+involved+in+late+thymocyte+development+through+the+regulation+of+TCR-mediated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling.</a> Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Themis+sets+the+signal+threshold+for+positive+and+negative+selection+in+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development.</a> Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+human+autoimmunity%3A+current+practice+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).</li>
<li>Hebeisen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-1+phosphatase+activity+counteracts+increased+T+cell+receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).</li>
<li>Wang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunosuppressive+antibody-drug+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An immunosuppressive antibody-drug conjugate.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).</li>
<li>Borroto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-class+inhibitor+of+the+T+cell+receptor+for+the+treatment+of+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases.</a> Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).</li>
<li>Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screening+strategy+for+new+modulators+of+T+cell+receptor+signaling+and+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10046(2018).</li>
<li>Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+Lymphocyte+Assay+Suitable+for+High-throughput+Screening+of+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), e55199(2017).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+phenotypic+screen+of+cytotoxic+T+lymphocyte+lytic+granule+exocytosis+reveals+candidate+immunosuppressants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants.</a> Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).</li>
<li>Florian, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+enables+a+high-throughput+homogeneous+fluorescent+antibody-binding+assay+for+cytotoxic+T+cell+lytic+granule+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).</li>
<li>Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+single-cell+drug+screening+with+phosphospecific+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry.</a> Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).</li>
<li>Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+inhibitor+of+phosphatidylinositol+3-kinase%2C+2-%284-morpholinyl%29-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one+%28LY294002%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002).</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+SAR+of+novel+4-morpholinopyrrolopyrimidine+derivatives+as+potent+phosphatidylinositol+3-kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).</li>
<li>Ruegg, U. T., Burgess, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine%2C+K-252+and+UCN-01%3A+potent+but+nonspecific+inhibitors+of+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).</li>
<li>Davis, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein+kinase+C.+1.+2%2C3-Bisarylmaleimides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).</li>
<li>Komander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+LY333531+and+other+bisindolyl+maleimide+inhibitors+with+PDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1.</a> Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).</li>
<li>Gassel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+C+inhibitor+bisindolyl+maleimide+2+binds+with+reversed+orientations+to+different+conformations+of+protein+kinase+A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).</li>
<li>Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFaull%2C+A+%22Novel+compounds%22">Novel compounds</a>. , (2003).</li>
<li>Favata, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+inhibitor+of+mitogen-activated+protein+kinase+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).</li>
<li>Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxol-induced+mitotic+block+triggers+rapid+onset+of+a+p53-independent+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+%28Cambridge%2C+MA%29%22%5BJournal%5D)">Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway.</a> Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).</li>
<li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+necroptosis+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).</li>
<li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science Signaling. 3 (114), ra23(2010).</li>
<li>Chae, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+staurosporine-induced+apoptosis+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts.</a> Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).</li>
<li>Varas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+neonatal+thymus%3A+evidence+for+a+transient+thymic+involution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+%28Baltimore%2C+MD%3A1950%29%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution.</a> Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).</li>
<li>Verstichel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+for+agonist+selection+precedes+conventional+selection+in+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus.</a> Science Immunology. 2 (8), (2017).</li>
<li>Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+single-positive+fetal+thymocytes+in+vitro+into+IL-4-+and%2For+IFN-gamma-producing+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells.</a> International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).</li>
<li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+UK%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).</li>
<li>Cali, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+assays+for+ADMET%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent assays for ADMET.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).</li>
</ol>

Autor Chyan Ying Ke jest pracownikiem firmy Curiox Biosystems, która produkuje podkładkę do komórek DA i płytki do komórek DA używane w tym artykule.

Zaproponowana tutaj strategia badań przesiewowych ocenia zdolność małocząsteczkowych inhibitorów do tłumienia efektów apoptozy w tymocytach po stymulacji, oprócz bardziej konwencjonalnych markerów aktywacji komórek T-CD69 w górę i regulacji w dół TCR. Można również dołączyć dodatkowe markery, aby umożliwić analizę różnych podzbiorów tymocytów32. Interesującym aspektem obecnego testu jest fakt, że inhibitory, które utrudniają sygnalizację TCR, tłumią również indukcję apoptozy, co dodatkowo podkreśla różnicę niezależnych od TCR efektów, jakie inhibitory mogą mieć na indukowanie śmierci komórki. Co więcej, test oparty na cytometrii przepływowej pozwala na wykorzystanie wielu odczytów jako odrębnych markerów aktywacji, które mogą informować o wpływie inhibitorów na oddzielne poszczególne gałęzie sygnalizacji TCR. W przedstawionym przypadku były to inhibitory, które wykazywały zróżnicowane hamowanie aktywacji kaspazy-3 i regulacji w górę CD69. Ponieważ niektóre związki mogą wpływać na funkcje porządkowe, takie jak synteza białek lub transport pęcherzykowy, nie jest zaskakujące obserwowanie wpływu na regulację w górę markerów syntetyzowanych de novo (np. CD69), ale nie na modyfikacje potranslacyjne (np. proteolityczną aktywację kaspazy-3). 
Ponieważ przedstawiony tutaj test mierzy apoptozę jako odczyt, konieczne jest, aby utajone działanie toksyczne inhibitorów nie przesłaniało wyników. Na przykład w badaniu przesiewowym nie rozcieńczyliśmy staurosporyny powyżej 1 nM, mimo że w tym stężeniu nadal była toksyczna dla komórek. Reprezentatywne wyniki są zgodne z tym, że staurosporyna jest inhibitorem kinazy promiskuitycznej i induktorem apoptozy33. Bez wystarczającego rozcieńczenia badanych związków do stężeń nietoksycznych możliwe jest przeoczenie potencjalnych trafień.
Opisana tutaj strategia badań przesiewowych byłaby trudna do zastosowania u ludzi ze względu na komplikacje związane z uzyskaniem wystarczającej liczby tymocytów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Możliwe jest jednak uzyskanie próbek grasicy ludzkiej z biopsji serca dziecięcego34,35 lub z płodów36,37. Niemniej jednak, ponieważ szlaki sygnałowe TCR i sekwencje aminokwasowe białek sygnałowych są w dużej mierze konserwatywne między myszami a ludźmi, test tymocytów stanowi przydatną wstępną strategię przesiewową, a wszelkie wyniki uzyskane za pomocą tego testu przy użyciu mysich tymocytów można następnie zweryfikować w pierwotnych ludzkich limfocytach.
Jednym z ograniczeń konwencjonalnego protokołu zależnego od wirowania jest perspektywa utraty komórek, którą można przypisać wieloetapowemu charakterowi procesu, który obejmuje takie etapy, jak przenikanie komórek i wirowanie. Każdy etap wirowania i ponownego zawieszania nieuchronnie prowadzi do utraty komórek. Chociaż takie straty mogą nie być krytyczne w przypadku badań obejmujących ograniczoną liczbę próbek, mogą stwarzać problemy w przypadku stosowania w badaniach przesiewowych o wyższej przepustowości, w szczególności w miarę postępu formatu testu od 96 do 384 do 1536 dołków. Jednym ze sposobów obejścia tego problemu jest zastosowanie przepuszczalnych dla komórek fluorescencyjnych czujników kaspazy38 , które umożliwiają wykrywanie aktywacji kaspazy przy jednoczesnym unikaniu powikłań związanych z przenikaniem komórek i wielokrotnym płukaniem5. Alternatywnie, możliwe jest również zastosowanie metody mycia komórek przez przepływ laminarny niezależnej od wirowania w celu zminimalizowania utraty komórek. Dzięki zautomatyzowanej stacji mycia płytek w połączeniu z płytą bezścienną, komórki są myte przez przepływ laminarny bez użycia wirówki. Wykładnicze rozcieńczenie odczynników pozwala na dokładne i wydajne płukanie komórek w czasie krótszym niż 3 minuty, co odpowiada rozcieńczeniu dwóm rundom płukania odśrodkowego. Bez naprężeń zewnętrznych spowodowanych wirowaniem komórki są bardziej żywotne, a straty komórek są zminimalizowane.
Zbadaliśmy również możliwość wykorzystania zautomatyzowanej stacji mycia płytek po wyhodowaniu tymocytów w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U, a także hodowli komórek bezpośrednio na płytkach bezściennych kompatybilnych z automatyczną stacją mycia płytek. Hodowla komórek na płytkach bez ścianek umożliwiła wyeliminowanie wszystkich etapów wirowania i zminimalizowanie utraty komórek poprzez wyeliminowanie potrzeby przenoszenia próbki między płytkami. Ogólnie rzecz biorąc, te trzy różne protokoły są porównywalne zarówno pod względem skuteczności stymulacji, jak i barwienia. Zautomatyzowana stacja mycia zapewnia korzyści w postaci automatyzacji, szybkości i wydajności, co ułatwia analizę o większej przepustowości. Co więcej, dzięki zwiększonej automatyzacji etapy mycia mogą być przeprowadzane szybciej, a eksperymenty lub eksperymentatorzy są bardziej spójne. Stacja mycia ma jednak pewne wady: do zalewania pralki potrzebne są duże ilości myjących (150 ml na zmianę bufora, z czego 50 ml zużywa się do mycia); należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z płytą, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego studzienek z powodu ograniczonej przegrody między studzienkami płytki o małej objętości; bufor resztkowy 25 μl w studzienkach po przepłukaniu wymaga użycia odczynników przygotowanych o stężeniu wyższym niż 1x. Aby rozwiązać problem objętości resztkowej i ograniczonej pojemności płytki, można dodać akcesorium zwiększające objętość inkubacji z 70 μl do 150 μl, co ułatwia przyjęcie konwencjonalnych protokołów. Chociaż obecnie dostępne są zautomatyzowane systemy obsługi płyt, zajmują one znaczną powierzchnię w porównaniu z systemem mycia laminarnego, który jest małą jednostką o powierzchni ~1 stopy sześciennej (~0,028 m3). Co więcej, integracja wirowania z automatycznymi systemami obsługi płytek stanowi wyzwanie, ograniczając ich zastosowanie w myciu komórek. O ile nam wiadomo, obecnie nie ma dostępnych innych przyrządów do mycia komórek niezależnych od wirówek.
Przedstawiona tutaj strategia badań przesiewowych jest w stanie zidentyfikować małe cząsteczki i ich rzekome kinazy docelowe, które wpływają na sygnalizację TCR i aktywację komórek T. Wykorzystana tu biblioteka składa się głównie z małocząsteczkowych inhibitorów kinaz i była w stanie wygenerować szereg potencjalnie interesujących trafień. Protokół może być również z łatwością stosowany do bibliotek inhibitorów innych klas enzymów lub do innych typów małych cząsteczek, a także do bibliotek innych związków (np. różnych makrocząsteczek). Protokół może być również stosowany do badań przesiewowych innych typów komórek, takich jak obwodowe limfocyty T lub unieśmiertelnione komórki, w tym te wyrażające transgeniczne TCR lub przenoszące systemy reporterowe. Identyfikacja i charakterystyka nowych mediatorów sygnalizacji limfocytów T może poszerzyć naszą wiedzę na temat szlaku sygnałowego, a także pomóc w opracowaniu terapii celowanej w chorobach immunologicznych 13,14,15,16. Podsumowując, badanie to rozszerza zakres dostępnych opcji wykrywania mediatorów sygnalizacji limfocytów T za pomocą wysokoprzepustowych testów przesiewowych.

Limfocyty T to linia limfocytów, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu odporności adaptacyjnej. Wyrażają TCR, co umożliwia im rozpoznawanie ich ligandów, kompleksów składających się z cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) ze związanym peptydem, które znajdują się na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Wyzwolenie szlaku sygnałowego TCR poprzez interakcję TCR/MHC ma kluczowe znaczenie dla aktywacji i rozwoju limfocytów T1.
W rozwoju limfocytów T, hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) pochodzące ze szpiku kostnego migrują do grasicy, gdzie ulegają różnicowaniu i przechodzą przez etapy progresji linii limfocytów T2. Podwójnie dodatnie (DP) tymocyty, wyrażające zarówno koreceptory CD4, jak i CD8, angażują się z autopeptydem/MHC na APC. Tymocyty o umiarkowanym powinowactwie do ligandów autopeptydowych / MHC dojrzewają, aby stać się jednododatnimi (SP) tymocytami CD4 lub CD8, proces określany jako selekcja pozytywna. I odwrotnie, tymocyty, które otrzymują nadmierną stymulację TCR przez autopeptyd/MHC, ulegają apoptozie poprzez selekcję negatywną3,4. Ten proces indukowanej stymulacją, zależnej od kaspazy apoptozy może być naśladowany in vitro poprzez stymulację tymocytów, na przykład za pomocą kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD3/285. Dojrzałe limfocyty T, które przechodzą proces selekcji, są aktywowane przez ligandy niebędące samopeptydami/MHC z APC na obrzeżach. Samopeptyd/MHC są nadal istotne dla obwodowych limfocytów T, w kontekście sygnalizacji tonicznej dla przeżycia i proliferacji homeostazy, różnicowania limfocytów T pomocniczych oraz wzmacniania odpowiedzi komórek T na nie-peptydowe/MHC poprzez koagonizm6,7,8,9. Wiązanie TCR o wysokim powinowactwie do liganda peptydu/MHC aktywuje kilka dalszych szlaków sygnałowych, które obejmują wiele cząsteczek sygnałowych tworzących złożoną sieć sygnalizacyjną TCR10. Szlaki sygnałowe TCR są badane od kilkudziesięciu lat, a mimo to odkrycie nowych mediatorów szlaku nie wykazuje oznak słabnięcia11,12. Modulacja szlaków sygnałowych TCR ma znaczenie kliniczne i może obejmować nasilanie odpowiedzi komórek T w zastosowaniach immunoterapeutycznych lub hamowanie odpowiedzi komórek T w celu kontroli autoimmunizacji13. Strategie modulacji odpowiedzi limfocytów T zależą głównie od zakłócenia aktywności kinazy lub fosfatazy14,15,16.
Opisujemy zastosowanie testu opartego na cytometrii przepływowej do badania przesiewowego małych związków chemicznych pod kątem ich zdolności do modulacji sygnalizacji TCR i aktywacji limfocytów T17. Test opiera się na zjawisku tymocytów aktywujących szlak apoptozy pod wpływem silnych sygnałów TCR. Test jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować zmiany w sile stymulacji; inkubacja tymocytów eksprymujących transgeniczny TCR z tetramerami peptydowymi/MHC o rosnącym powinowactwie skutkowała odpowiednim wzrostem aktywacji kaspazy - używanym jako miara odpowiedzi apoptotycznej5. Do badań przesiewowych wykorzystaliśmy bibliotekę inhibitorów kinaz i oceniliśmy ich zdolność do modulowania odpowiedzi tymocytów na silne sygnały TCR.
Opisano kilka strategii opartych na cytometrii przepływowej lub reporterach fluorescencyjnych dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych asortymentu fenotypów aktywacji obwodowej w różnych podzbiorach limfocytów T. Strategie te obejmują wykorzystanie genetycznych reporterów fluorescencyjnych do oceny czasu i wielkości aktywacji komórek T18, wykorzystanie degranulacji jako odczytu aktywności cytotoksycznych komórek T19,20, oraz analiza fosforylacji różnych białek zaangażowanych w sygnalizację komórkową21.
Prezentowany tutaj test przesiewowy jest w stanie skutecznie zidentyfikować związki, które hamują kanoniczne cząsteczki szlaku sygnałowego TCR, a także potencjalne, nowe związki o hamującym wpływie na sygnalizację TCR. Na przykład zidentyfikowaliśmy inhibitory GSK3β i Hsp90 jako nowe związki wpływające na odpowiedzi limfocytów T17. Test jest w stanie odróżnić inhibitory, które zakłócają transdukcję sygnału, ze względu na zmniejszenie odpowiedzi apoptotycznej, od niezależnego od TCR wpływu inhibitorów na toksyczność komórkową. Oprócz indukcji apoptozy mierzymy również regulację w górę CD69 i regulację w dół TCR jako markery aktywacji. Ponieważ sieci sygnalizacyjne TCR są złożone, zastosowanie wielu odczytów może zwiększyć szanse na odkrycie cząsteczek o określonym wpływie na pojedynczy szlak. W tym miejscu wprowadzamy również zastosowanie protokołu niezależnego od wirowania jako wysokoprzepustowej alternatywy dla oryginalnego protokołu podczas barwienia komórek w ramach przygotowań do analizy cytometrii przepływowej. Test opisany w tym artykule wykorzystuje niewielką bibliotekę związków inhibitorów kinaz, ale zasadniczo można go wykorzystać do badań przesiewowych o wyższej przepustowości. Wybrana biblioteka może również zawierać różne inhibitory lub inne cząsteczki.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>HyClone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>HyClone</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>HyClone</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>516732&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Vivantis</td><td>PB0344 &ndash; 1L</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka badań przesiewowych kinazy (96-Well)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10505</td><td>Dokładna zawartość biblioteki może się różnić</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki anty-CD3/CD28</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>FITC Zestaw do apoptozy aktywnej kaspazy-3</td><td>BD Pharmingen</td><td>550480</td><td>Zawiera bufor do utrwalania/przepuszczalności, bufor 10X Perm/Wash i przeciwciało anty-kaspazowe 3</td></tr><tr><td>Myjka DA-Cell</td><td>CURIOX</td><td>HT1000</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka DA-Cell</td><td>CURIOX</td><td>96-DC-CL-05</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BioLegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>TCRb</td><td>BD Biosciences</td><td>553174</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>740007</td><td></td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>CD69</td><td>eBioscience</td><td>25-0699-42</td><td></td></tr><tr><td><silne>inhibitory</silne> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TG003</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PKC 412</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>Doramapimod</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Paklitaksel</td><td>Kajman</td> <td>chemiczny-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>Kajman Chemiczny</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Nekrostyna-5</td><td>Substancja chemiczna Kajmanów-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>NVP-BEZ235</td><td>Substancja chemiczna Kajmanów-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Phtalazynonpirazol</td><td>Kajman chemiczny-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>AG-879</td><td>Substancja chemiczna Kajmanów-Z</td><td></td><td> Biblioteka badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>1-NA-PP1</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Torin 1</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Bisindolylmaleimid II</td><td>Kajman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>BIBF 1120</td><td>Kajmany</td> <td>chemiczne-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>SMI-4a</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td>,</tr><tr><td>bisindolylmaleimide XI (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td>,</tr><tr><td>CAY10657</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td>,</tr><tr><td>AS-703026</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td>,</tr><tr><td>Chlorek chelerytryny</td>, <td>Cayman Chemical</td><td>-</td><td>Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>Tunikamycyna</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>GSK 1059615</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>Nekrostyna-1</td><td>Kajman Chemiczna-Z</td><td></td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>SB 505124</td><td>Kajmany Chemiczne</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>INK128</td><td>Kajmany Chemiczne</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>Kanertynib (chlorowodorek)</td> <td>Kajmany Chemiczne</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Kajmany -</td><td></td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PD 173074</td><td>Kajmany Chemiczny</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>Kwas walproinowy (sól sodowa)</td> <td>Chemia Kajmana</td> <td>-</td> <td>Z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Kajmany Chemiczna</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>SB 203580</td><td>Chemia Kajmanów</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>VX-702</td><td>Substancja chemiczna Kajmanów</td> <td>-</td> <td>z kinazy Biblioteka badań przesiewowych</td></tr><tr><td>Emodin</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>BIO</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>imatynib (mesylan)</td> <td>Chemical Cayman -</td><td></td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Jabłczan</td> <td>sunitynibuChemia Kajmanów-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Gefitynib</td><td>Kajman Chemiczny-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>PP2</td><td>Kajman Chemiczny-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>3-Metyladenina</td><td>Kajman Chemiczna-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Bisindolylmaleimid I</td><td>Kajman Chemiczny-Z</td><td></td> <td>kinazy Biblioteka przesiewowa</td></tr><tr><td>Bisindolilomaleimid IV</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Bisindolylmaleimid V</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>NSC 663284</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>D 4476</td><td>Kajmany chemiczne</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>NU 7026</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>H-9 (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>Indirubina-3'-monoxime</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening</td>Library</tr><tr><td>KN-62</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>KN-93</td><td>Cayman Chemical</td><td>- </td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>CGP 57380</td><td>Kajman</td><td></td> <td>chemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>Izo-Olomoucina</td><td>Kajman</td><td></td> <td>chemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr> (<tr><td>S)-Glicyl-H-1152 (chlorowodorek)</td><td>Substancja chemiczna Kajmanów-Z</td><td></td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Bisindolilomaleimid VIII (octan)</td><td>Kajman Chemiczny</td><td>-</td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>ST638</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>SU 6656</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>LY364947</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>SB 203580 (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki</td></tr> <tr><td>badań przesiewowych kinazyCAY10621</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>YM-201636</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>ZM 447439</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>AS-041164</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>NVP-AEW541 (chlorowodorek)</td><td>Cayman Chemical</td><td>- </td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PP242</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>ABT-869</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>CAY10622</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>17&beta;-hydroxy Wortmannin</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>CAY10626</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>SU 6668</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>CAY10572</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylsphingosine</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Cayman Chemical</td><td>-</td><td>Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>U-0126</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>KN-92 (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>AS-605240 (sól potasowa)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>kinazy Biblioteka przesiewowa</td></tr><tr><td>O-1918</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>Y-27632 (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>Leelamine</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>PD 98059</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>PD 169316</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>TGX-221</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>(S)-H-1152 (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>AS-605240</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>D-erythro-Sphingozyna C-18</td><td>Cayman Chemical</td><td>- </td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>OSU03012</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>JNJ-10198409</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Leelamine (chlorowodorek)</td><td>Kajman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Kwas arachidonowy Leelamide</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>kinazy Biblioteka badań przesiewowych</td></tr><tr><td>Kwas laurynowy Leelamide</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>AS-252424</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CAY10505</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PI-103</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PIK-75 ( chlorowodorek)</td> <td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy sfingozynowej 2</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Piceatannol</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>SC-1</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr> <tr><td>(R) - Roscovitine</td><td>Cayman Chemical</td><td>-</td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>BAY-43-9006</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CAY10561</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>AS-604850</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PI3-kinaza &alpha; Inhibitor 2</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>ML-9</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Triciribine</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Analog erbstatyny</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Kenpaullone</td><td>Cayman Chemical</td><td>-</td><td>Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>Olomoucyna</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>AG-494</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>AG-825</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>AG-1478</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>SB 216763</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>AG-17</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>H-8 (chlorowodorek)</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>LFM-A13</td><td>Cayman Chemical-From</td> the Kinase Screening <td>Library-From</td> <td>the Kinase Screening Library-From the Kinase Screening Library Biblioteka</td></tr><tr><td>SC-514</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Apigenin</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>AG-18</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>CAY10554</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>DRB</td><td>Cayman Chemical</td><td>-</td><td>Z Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>RG-13022</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>RG-14620</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinaz</td></tr><tr><td>AG-490</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>AG-82</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>Biblioteki Badań Przesiewowych Kinazy</td></tr><tr><td>AG-99</td><td>Cayman Chemiczny</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>AG-213</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>AG-183</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Lavendustin C</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>ZM 336372</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>5-Iodotubercidin</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>CAY10571</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase</td></tr><tr><td></td><td>Screening</td> <td>Library-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>SP 600125</td><td>Cayman Chemical</td><td>- </td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>L-treo-sfingozyna C-18</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>H-89</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinaz</td></tr><tr><td>HA-1077 (chlorowodorek)</td><td>Kajman</td><td></td> <td>chemiczny-Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>AG-370</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>AG-1296</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>KT 5823</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>Janex 1</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-From</td> <td>the Kinase Screening Library</td></tr><tr><td>CAY10574</td><td>Cayman Chemical</td><td>-</td><td>Z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CAY10575</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CAY10576</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>NH125</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>TWS119</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>NSC 210902</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CAY10577</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CAY10578</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>PD 184161</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr><tr><td>CCT018159</td><td>Cayman</td> <td>Chemical-Z</td> <td>badania przesiewowego kinazy-Z badania przesiewowego kinazy Biblioteka</td></tr><tr><td>Myricetin</td><td>Cayman Chemical</td> <td>-</td> <td>z biblioteki badań przesiewowych kinazy</td></tr></tbody></table>

identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów t poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Szlak sygnałowy receptora limfocytów T (TCR) składa się z wielu mediatorów, które przekazują sygnały po aktywacji TCR. Zaproponowano i wdrożono różne strategie identyfikacji nowych mediatorów sygnalizacji TCR, co przyczyniłoby się do lepszego zrozumienia procesów zachodzących w komórkach T, w tym aktywacji i selekcji grasicy. Opisujemy test przesiewowy, który umożliwia identyfikację cząsteczek wpływających na sygnalizację TCR w oparciu o aktywację rozwijających się tymocytów. Silne sygnały TCR powodują, że rozwijające się tymocyty aktywują maszynerię apoptotyczną w procesie znanym jako selekcja negatywna. Dzięki zastosowaniu inhibitorów kinaz, te, których cele wpływają na sygnalizację TCR, są w stanie zastąpić proces selekcji negatywnej. Metoda opisana w tym artykule może być wykorzystana do identyfikacji inhibitorów kinaz kanonicznych o ustalonych rolach w szlakach sygnałowych TCR, a także inhibitorów nowych kinaz, które nie zostały jeszcze ustalone w szlakach sygnałowych TCR. Strategia badań przesiewowych może być zastosowana do badań przesiewowych o wyższej przepustowości w celu identyfikacji nowych celów lekowych w sygnalizacji TCR.

Podejście do testu przesiewowego przedstawiono podsumowująco na Rysunku 1A. Inhibitory kinazy poddano najpierw badaniu pod kątem ich utajnionych efektów na żywotność tymocytów. Jako kontrolę pozytywną dla apoptozy wykorzystano deksametazon jako czynnik proapoptotyczny. Bramkowanie dla populacji żywych komórek określono na podstawie nieleczonych kontroli negatywnych oraz kontroli pozytywnych traktowanych deksametazonem (Rysunek 1B). Inhibitory testowano najpierw w stężeniu 10 µM na tymocytach, a odsetek żywych komórek mierzono po 18 h inkubacji. Przyjęto 20-procentowy zakres śmierci komórkowej, tak aby związki indukujące utratę więcej niż 20% komórek w bramce komórek żywych w porównaniu z próbkami traktowanymi DMSO były testowane w niższych stężeniach (Rysunek 1B). Przedstawiono reprezentatywne wykresy FACS wybranych próbek traktowanych inhibitorami w celu zilustrowania testu żywotności. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), inhibitor PI3K22, nie zwiększył znacząco śmierci komórek przy 10 µM i inhibitor ten zastosowano w stężeniu 10 µM w kolejnych testach. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), dualny inhibitor PI3Kα/mTOR23, indukował wysoki poziom śmierci komórkowej przy 10 µM i 1 µM, ale nie przy 0,1 µM, w związku z czym uznano 0,1 µM za odpowiednie stężenie do zastosowania w dalszych testach. Staurosporyna (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), pan-inhibitor białkowej kinazy C o udowodnionej zdolności do indukcji apoptozy24, wywołała znaczną śmierć komórek we wszystkich testowanych stężeniach, nawet przy 0,1 µM. Została ona wykorzystana w kolejnych badaniach w stężeniu 0,1 µM jako dodatkowa kontrola pozytywna.
Końcowe stężenia inhibitorów wybrano na podstawie najwyższych stężeń, przy których nie zwiększały one śmierci komórek o więcej niż 20% w porównaniu do próbek traktowanych DMSO. Po ustaleniu końcowych stężeń inhibitorów przygotowano płytkę zapasową, w której wszystkie inhibitory znajdowały się w stężeniu 500-krotnie wyższym niż stężenie stosowane w kontakcie z komórkami. Rysunek 1C przedstawia układ płytek na płycie zapasowej wraz z końcowymi stężeniami inhibitorów. W alternatywnym protokole inkubacji komórek bezpośrednio w płytkach o małej objętości dla testu płukania w przepływie laminarnym, zastosowanie małych objętości wymagało dalszego rozcieńczenia inhibitorów. Aby upewnić się, że zawartość DMSO w kulturach po dodaniu inhibitorów nie będzie zbyt wysoka dla komórek, inhibitory dodatkowo rozcieńczono w pełnym medium RPMI z czynnikiem rozcieńczenia 5, tak aby ich stężenie było 100-krotnie wyższe od stężenia docelowego podczas aplikacji do komórek.
Inhibitory, rozcieńczone do nietoksycznych stężeń, wykorzystano w analizie apoptozy indukowanej stymulacją TCR w tymocytach5,17. Stymulację przeprowadzono przy użyciu kulek anti-CD3/CD28 przez 18 h, a następnie komórki barwiono w celu oceny aktywacji kaspazy-3 w populacji podwójnie dodatnich (DP) tymocytów CD4+ i CD8+ (Rysunek 2). W próbkach stymulowanych anti-CD3/CD28 oraz w próbkach stymulowanych anti-CD3/28 i traktowanych DMSO (jako kontrolą) zaobserwowano wzrost aktywacji kaspazy-3 i ekspresji CD69, a także obniżenie poziomu TCR w porównaniu do próbek niestymulowanych. Próbki traktowane deksametazonem wykazały wzrost aktywacji kaspazy-3 niezależny od upregulacji CD69, co jest zgodne z oczekiwanym efektem indukowania apoptozy niezależnie od stymulacji TCR.
Rysunek 3A podsumowuje wyniki badania przesiewowego biblioteki dla wybranych inhibitorów. Zarówno aktywacja kaspazy-3, jak i CD69 mogą być wykorzystane do identyfikacji potencjalnych inhibitorów ze względu na supresję ekspresji. Zgodnie z oczekiwaniami, inhibitory kanonicznych mediatorów sygnalizacji TCR pojawiły się jako pozytywne wyniki w badaniach przesiewowych. Takie inhibitory, wykazujące różny stopień mocy hamowania, obejmowały inhibitory o szerokim spektrum działania, celujące w wiele kinaz, a także inhibitory bardziej specyficzne. Niektóre inhibitory były w stanie supresować zarówno aktywację kaspazy-3, jak i nadekspresję CD69 (Rysunek 3B, górny rząd, lewe panele). Jednym z takich inhibitorów jest bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), który hamuje wszystkie izoformy kinazy białkowej C, a ponadto kinazę białkową A oraz PDK125,26,27. Innym inhibitorem w tej kategorii jest CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), proponowany inhibitor IKK228.
Zidentyfikowano związki, które hamowały zwiększenie ekspresji CD69, ale nie upośledzały aktywacji kaspazy-3 (Rysunek 3B, górny rząd, panele po prawej). Wśród zidentyfikowanych inhibitorów znajdowały się CAY10626, inhibitor PI3Kα i mTOR23, oraz U-0126 (2,3-bis[amino[(2-aminophenyl)thio]methylene]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), inhibitor MEK29. Wyniki pokazują, że różne inhibitory celujące w różne kinazy z określonych gałęzi szlaku sygnalizacyjnego TCR, zwłaszcza te celujące w kinazy późnego etapu, mogą prowadzić do selektywnego upośledzenia zjawisk aktywacji limfocytów T.
Istniały również inhibitory, które nie hamowały jednocześnie zwiększenia ekspresji CD69 oraz aktywacji kaspazy-3 (Rycyna 3B, dolny rząd, lewe panele). Dwiema zidentyfikowanymi substancjami należącymi do tej kategorii są paklitaksel (βS-(benzoylamino)-αR-hydroxy-benzenepropanoic acid, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7,11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), który zaburza dynamikę mikrotubul30, oraz nekrostatyna-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), będąca inhibitorem kinazy RIP131. W przypadkach, w których zwiększenie ekspresji CD69 i aktywacja kaspazy-3 nie zostały upośledzone, może to wynikać z faktu, że inhibitory te nie oddziaływały na odpowiednią kinazę w szlaku sygnałowym TCR.
Jak wspomniano wcześniej, w badaniach przesiewowych zastosowano staurosporynę w stężeniu, które nadal indukowało apoptozę w tymocytach. Zgodnie z oczekiwaniami, próbka traktowana staurosporyną wykazała wysoki poziom aktywacji kaspazy-3 (Rycyna 3B, dolny rząd, prawa kolumna). Niski poziom ekspresji CD69 można przypisać zapośrednicznemu przez staurosporynę hamowaniu PKC, ponieważ bisindolylmaleimid II, inny inhibitor pan-PKC, również tłumił ekspresję CD69. Alternatywnie, staurosporyna mogła wywołać apoptozę w komórkach, zanim były one w stanie zwiększyć ekspresję CD69.
W celu zwiększenia przepustowości i automatyzacji protokołu przygotowano procedury równoległe, które obejmowały zastosowanie zautomatyzowanego systemu mycia płytek poprzez przepływ laminarny. Przetestowano i porównano dwa oddzielne protokoły z wykorzystaniem tego zautomatyzowanego urządzenia do mycia płytek z konwencjonalną metodą hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych i barwienia komórek w protokole zależnym od wirowania. Jedna metoda polegała na hodowli komórek na płytkach 96-dołkowych zgodnie ze standardową procedurą, a następnie przeniesieniu komórek na płytki kompatybilne z automatyczną myjką do płytek w celu przeprowadzenia etapów barwienia (Rycina 4, próbki DA-Washing). Druga metoda polegała na hodowli komórek bezpośrednio na płytkach kompatybilnych z myjką i kontynuowaniu protokołu barwienia na tej samej płytce (Rycina 4, próbki DA-Culture). Protokoły niezależne od wirowania nie wykazują wielu zauważalnych różnic w barwieniu aktywnej kaspazy-3, CD69 lub TCRβ w różnych testowanych próbkach w porównaniu do konwencjonalnego protokołu zależnego od wirowania (Rycina 4). Różnice w intensywności barwienia można przypisać zastosowaniu przeciwciał w nieco innych stężeniach podczas etapów barwienia.
<img alt="Przesiewanie inhibitorów kinaz; dane z cytometrii przepływowej; schemat układu eksperymentalnego; analiza stężeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Żywotność tymocytów po traktowaniu inhibitorami. (A) Schemat głównych etapów testu przesiewowego. Zaproponowano trzy metody stymulacji i barwienia tymocytów wykorzystywanych w teście aktywacji, mianowicie (1) hodowlę tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych, a następnie barwienie zgodnie z konwencjonalnym protokołem opartym na wirowaniu, (2) hodowlę tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych, a następnie barwienie zgodnie z protokołem płukania niezależnym od wirowania oraz (3) hodowlę tymocytów w płytkach o małej objętości, a następnie barwienie w tych samych płytkach zgodnie z protokołem płukania niezależnym od wirowania. (B) Strategie bramkowania zastosowane w testach żywotności. Bramka dla żywych komórek została wyznaczona na podstawie wykresów rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC), jak opisano wcześniej17. Inhibitory uznane za zbyt toksyczne w badanym stężeniu poddano dalszym testom żywotności przy stężeniach 10-krotnie niższych. Przedstawiono reprezentatywne próbki traktowane inhibitorami. Należy zwrócić uwagę na wspólną kontrolę (traktowaną DMSO [DMSO]) zastosowaną dla próbek 1 µM i 0,1 µM. (C) Układ płytek z rozcieńczonymi inhibitorami. Schematyczne przedstawienie płytek z inhibitorami rozcieńczonymi w DMSO do stężenia 500-krotnie większego niż zamierzone stężenie końcowe. Każdy dołek reprezentuje jeden unikalny inhibitor; szare dołki są puste. Przedstawione stężenia to stężenia końcowe po dodaniu do kultur komórkowych, mianowicie 10 µM (ciemnoczerwony), 1 µM (fuksja) i 0,1 µM (niebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Eksperyment na płytce ELISA; wyniki cytometrii przepływowej dla ekspresji CD4/CD8, CD69, ActCasp3, efekty inhibitorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Układ płytki w teście aktywacji tymocytów. (Góra) Kolumny 1 i 12 są zarezerwowane dla kontroli, natomiast kolumny od 2 do 11 zawierają próbki traktowane inhibitorem (beżowe). Kontrola negatywna (niestymulowane [NS]; szare) zajmuje dołki od A1 do D1, a kontrola pozytywna śmierci komórek (traktowane deksametazonem [DEX]; fioletowe) zajmuje dołki od E1 do H1. Kolumny od 2 do 12 zawierają tymocyty stymulowane kuleczkami anti-CD3/CD28. Kontrola pozytywna aktywacji tymocytów (próbki stymulowane [α-CD3/CD28]; zielone) zajmuje dołki od A12 do D12, a kontrola nośnika (stymulowane i traktowane DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]; czerwone) zajmuje dołki od E12 do H12. (Dół) Wykresy cytometrii przepływowej dla barwień aktywnej kaspazy-3 (ActCasp3), CD69 oraz TCRβ tymocytów wyselekcjonowanych w bramce komórek podwójnie pozytywnych (DP). Przedstawiono reprezentatywne wykresy dla różnych kontroli. NS = niestymulowane; DEX = próbki traktowane deksametazonem; α-CD3/CD28 + DMSO = próbki stymulowane kuleczkami powlekanymi CD3/CD28 i traktowane DMSO; α-CD3/CD28 = próbki stymulowane kuleczkami powlekanymi CD3/CD28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagramy analizy cytometrii przepływowej ekspresji markerów CD69 i ActCasp3 w komórkach poddanych działaniu inhibitorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przesiewowa analiza biblioteki inhibitorów pod kątem aktywacji tymocytów. (A) Podsumowanie danych z testu aktywacji. Są to wyniki reprezentatywnego eksperymentu przedstawiające znormalizowane wartości komórek z aktywną kaspazą-3 oraz ekspresją CD69 dla wybranych inhibitorów. Normalizacja została przeprowadzona poprzez porównanie procentu komórek w bramce dla kaspazy-3-dodatnich lub CD69-dodatnich do wartości kontroli traktowanej DMSO, która na wykresie została przyjęta jako wartość względna 0. (B) Wybrane wykresy FACS. Wykresy cytometrii przepływowej dla inhibitorów, które hamowały zarówno aktywację kaspazy-3, jak i zwiększenie ekspresji CD69 (lewa góra), hamowały wyłącznie zwiększenie ekspresji CD69 (prawa góra) lub nie wywarły wpływu na aktywację kaspazy-3 i ekspresję CD69 (lewa dół). Wykresy próbki traktowanej staurosporyną pokazano w celu zilustrowania efektów zastosowania inhibitora w stężeniach toksycznych (prawa dół). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, TCRβ vs ActCasp3 oraz CD69, przedstawiająca wyniki apoptozy i aktywacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58946/58946fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Porównanie różnych protokołów analizy. Wykresy cytometrii przepływowej dla aktywności kaspazy-3 (ActCasp3), CD69 oraz TCRβ w barwieniu tymocytów DP po zastosowaniu trzech różnych protokołów analizy. Przebadano cztery różne warunki: kontrolę negatywną (niestymulowane [NS]), kontrolę pozytywną śmierci komórkowej (traktowane deksametazonem [DEX]), kontrolę nośnika (stymulowane i traktowane DMSO [α-CD3/CD28 + DMSO]) oraz próbkę traktowaną inhibitorem (stymulowane i traktowane PIK-75 [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Conventional = hodowla tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych i barwienie zgodnie z konwencjonalnym protokołem opartym na wirowaniu; DA-Washing = hodowla tymocytów w standardowych płytkach 96-dołkowych i barwienie przy użyciu protokołu płukania w przepływie laminarnym; DA-Culture = hodowla tymocytów w płytkach o małej objętości i barwienie w tych samych płytkach przy użyciu protokołu płukania w przepływie laminarnym.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58946/58946fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Nasz wysokoprzepustowy test uzupełnia dostępne metody identyfikacji małych cząsteczek i ich celów, które modulują sygnalizację TCR i aktywację limfocytów T. Nasz test ma aspekt autokorekcyjny poprzez odfiltrowanie toksycznych związków i identyfikację inhibitorów sygnalizacji TCR i apoptozy wywołanej stymulacją. Identyfikacja mediatorów sygnalizacji TCR może pomóc w opracowaniu terapii chorób immunologicznych.Dostarczyliśmy silny bodziec dla tymocytów pochodzących od myszy poliklonalnych TCR. Możliwe jest wykorzystanie myszy transgenicznych TCR i stymulowanie ich innymi tetramerami ligandów peptydowych w celu słabszej stymulacji. Test ten polega na użyciu małych objętości i płytek o małej objętości do hodowli komórek.Wymaga to ostrożnego obchodzenia się z płytkami i ich zawartością. W bibliotece inhibitorów kinaz znajduje się wiele związków, które są uważane za niebezpieczne. Ze względów bezpieczeństwa należy traktować wszystkie związki jako jednakowo niebezpieczne i przestrzegać zalecanych przez dostawcę środków ostrożności.Aby rozpocząć leczenie tymocytów inhibitorami kinaz, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 40 mikrolitrów tymocytów na studzienkę do płytki o małej objętości. Połóż talerz na lodzie. Następnie odpipetować jedną część inhibitorów kinazy, DMSO i deksametazonu oraz cztery części kompletnej pożywki RPMI do 96-dołkowej płytki.Oznaczyć osiem studzienek płytki o małej objętości do niepoddanych działaniu substancji kontrolnych, cztery studzienki do kontrol dodatnich poddanych działaniu deksametazonu w celu śmierci komórek poprzez dodanie rozcieńczonego deksametazonu w stężeniu pięciu mikromoli oraz cztery studzienki do kontrolnych poddanych działaniu nośnika, przez dodanie 0,5 mikrolitra rozcieńczonego DMSO. Następnie, z odpowiednich dołków płytki inhibitora, dodaj 0,5 mikrolitra każdego rozcieńczonego inhibitora do płytki 96-dołkowej. Aby rozpocząć stymulację tymocytów, najpierw upewnij się, że kulki anty-CD-3 i CD-28 są równomiernie ponownie zawieszone.Następnie umyj jeden mililitr kulek dwoma mililitrami buforu PBS. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu i odessać roztwór. Następnie ponownie zawieś koraliki w jednym mililitrze całego nośnika RPMI.Dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę zawiesiny kulek do każdej próbki poddanej działaniu inhibitora, czterech próbek poddanych działaniu DMSO i czterech z ośmiu próbek niepoddanych działaniu inhibitora. Dodaj 10 mikrolitrów pełnego RPMI do pozostałych czterech nieuzdatnionych studzienek. Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę.Następnie inkubuj tymocyty w środowisku o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 17 do 20 godzin lub przez noc. Zalać automatyczną myjkę płytową z przepływem laminarnym, najpierw 150 mililitrami roztworu etanolu Tween, następnie wodą dejonizowaną uzupełnioną 1%Tween 20, a na koniec buforem myjącym FACS. Pod koniec inkubacji przy użyciu systemu myjki płytkowej umyć płytkę buforem myjącym FACS, stosując dziewięciokrotny cykl mycia.Każde płukanie dodaje i usuwa 55 mikrolitrów buforu płuczącego przez przepływ laminarny, co powoduje wykładnicze rozcieńczenie odczynników w studzienkach. Aby zabarwić antygeny powierzchniowe, najpierw rozcieńczyć jedną jednostkę objętości przeciwciał anty-CD-3, anty-CD-4, anty-CD-8 i anty-CD-69 w 100-jednostkowych objętościach buforu płuczącego FACS. Następnie ponownie zawiesić komórki w 25 mikrolitrach mieszaniny przeciwciał barwiących.Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę, a następnie pozostaw płytkę na lodzie na 30 minut. Aby utrwalić komórki, najpierw umyj płytkę 55 mikrolitrami buforu do płukania FACS, stosując dziewięciokrotny cykl mycia, jak opisano powyżej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu utrwalająco-nieprzepuszczalnego do każdej studzienki.Dobrze wymieszaj i inkubuj talerz na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji przygotuj jednorazową trwałą ondulację i bufor do mycia, rozcieńczając 25 mililitrów dostarczonego bulionu 10X w 225 mililitrach wody ultraczystej. Zalać myjkę do płytek buforem one-X i umyć płytkę 55 mikrolitrami buforu one-X, stosując dziewięciokrotny cykl mycia, jak opisano powyżej.Na początek wymieszaj jeden mililitr przeciwciała anty-kaspazy 3 z dwoma mililitrami trwałej ondulacji one-X i przepłucz bufor. Dodaj 25 mikrolitrów mieszaniny na studzienkę do utrwalonych komórek. Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę.Pozostaw talerz na lodzie na godzinę. Pod koniec inkubacji powtórzyć etap płukania dziewięć razy z trwałą ondulacją one-X i buforem do płukania. Następnie dodaj 25 mikrolitrów buforu myjącego FACS do wszystkich dołków płytki.Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać roztwór. Na koniec przenieś zmieszane próbki do probówek do mikromiareczkowania. Uzupełnij probówki buforem płuczącym FACS do całkowitej objętości 200 mikrolitrów i przystąp do analizy cytometrii przepływowej.Po stymulacji anty-CD-3, CD-28 zaobserwowano wzrost aktywacji kaspazy-3 i regulację w dół TCR zarówno w próbkach nieleczonych, jak i pozorowanych DMSO. Zaobserwowano również wzrost ekspresji CD-69 w obu stymulowanych próbkach. Próbki poddane działaniu deksametazonu wykazały wzrost aktywacji kaspazy-3 niezależnie od regulacji w górę CD-69, zgodnie z oczekiwaniami w przypadku niezależnego efektu indukującego apoptozę i stymulacji TCR.Selektywne upośledzenie zjawisk aktywacji limfocytów T wykazano za pomocą różnych inhibitorów, które albo hamowały zarówno aktywację kaspazy-3, jak i regulację w górę CD-69, albo hamowały regulację w górę CD-69, ale nie upośledzały aktywacji kaspazy-3. Istniały również inhibitory, które nie były ukierunkowane na odpowiednią kinazę szlaku sygnałowego TCR, a zatem nie hamowały zarówno regulacji w górę CD-69, jak i aktywacji kaspazy-3. Wynik badania przesiewowego staurosporyny, kontroli pozytywnej apoptozy, wykazał wysoki poziom aktywacji kaspazy-3, zgodnie z oczekiwaniami.Jednak wynik wykazał również niski poziom ekspresji CD-69, który można przypisać albo hamowaniu kinazy białkowej C, albo indukowanej apoptozie przed ekspresją CD-69. Porównanie różnych protokołów testów nie wykazało różnic w barwieniu aktywną kaspazą-3, CD-69 i TCR kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej śmierci komórki, kontroli nośnika i próbki traktowanej inhibitorem. Etapy preinkubacji mają na celu ułatwienie wykorzystania płytki o małej objętości do hodowli komórek.W manuskrypcie znajduje się również standardowy protokół zależny od wirówki. Potencjalnie interesujące inhibitory lub cele mogą być weryfikowane przy użyciu różnych typów komórek, a także u różnych gatunków, takich jak limfocyty pagoferyjne myszy lub ludzkie komórki pierwotne. Późniejsza charakterystyka zidentyfikowanych cząsteczek i celów może pomóc w lepszym zrozumieniu biologii limfocytów T i rozszerzeniu możliwych celów immunomodulacji.

identification-mediators-t-cell-receptor-signaling-via-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

W tym filmie opisujemy metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów kinaz, które modulują apoptozę podwójnie dodatnich niedojrzałych tymocytów samoreaktywnych CD4+CD8+. Apoptoza jest indukowana w podwójnie dodatnich tymocytach poprzez aktywację ich za pomocą kulek magnetycznych pokrytych anty-CD3 i anty-CD28; Następnie przeprowadza się leczenie inhibitorami małocząsteczkowymi i analizę cytometrii przepływowej w celu wykrycia, czy inhibitory modulują ekspresję markera apoptotycznego.

Identyfikacja inhibitorów kinaz, które modulują odpowiedź tymocytów na silne sygnały TCR

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Ten film demonstruje test oparty na komórkach reporterowych do badania potencjalnych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację receptora Toll-podobnego (TLR). Test polega na wprowadzeniu lipopolisacharydów (LPS) zmieszanych z hybrydami nanocząstek peptydu i złota do makrofagów reporterowych eksprymujących białka reporterowe - wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) i lucyferazę. Redukcja sygnału TLR indukowanego przez LPS, w którym pośredniczą hybrydy, jest określana przez...

Test do badań przesiewowych bioaktywnych nanocząstek pod kątem hamowania sygnalizacji receptora toll-podobnego

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Poznaj metodę przesiewową inhibitorów sygnalizacji receptora limfocytów T przy użyciu cytometrii przepływowej. Ta technika umożliwia identyfikację małych cząsteczek modulujących aktywację limfocytów T.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Przeglądaj więcej filmów