Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Nasz wysokoprzepustowy test uzupełnia dostępne metody identyfikacji małych cząsteczek i ich celów, które modulują sygnalizację TCR i aktywację limfocytów T. Nasz test ma aspekt autokorekcyjny poprzez odfiltrowanie toksycznych związków i identyfikację inhibitorów sygnalizacji TCR i apoptozy wywołanej stymulacją. Identyfikacja mediatorów sygnalizacji TCR może pomóc w opracowaniu terapii chorób immunologicznych.

Dostarczyliśmy silny bodziec dla tymocytów pochodzących od myszy poliklonalnych TCR. Możliwe jest wykorzystanie myszy transgenicznych TCR i stymulowanie ich innymi tetramerami ligandów peptydowych w celu słabszej stymulacji. Test ten polega na użyciu małych objętości i płytek o małej objętości do hodowli komórek.

Wymaga to ostrożnego obchodzenia się z płytkami i ich zawartością. W bibliotece inhibitorów kinaz znajduje się wiele związków, które są uważane za niebezpieczne. Ze względów bezpieczeństwa należy traktować wszystkie związki jako jednakowo niebezpieczne i przestrzegać zalecanych przez dostawcę środków ostrożności.

Aby rozpocząć leczenie tymocytów inhibitorami kinaz, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 40 mikrolitrów tymocytów na studzienkę do płytki o małej objętości. Połóż talerz na lodzie. Następnie odpipetować jedną część inhibitorów kinazy, DMSO i deksametazonu oraz cztery części kompletnej pożywki RPMI do 96-dołkowej płytki.

Oznaczyć osiem studzienek płytki o małej objętości do niepoddanych działaniu substancji kontrolnych, cztery studzienki do kontrol dodatnich poddanych działaniu deksametazonu w celu śmierci komórek poprzez dodanie rozcieńczonego deksametazonu w stężeniu pięciu mikromoli oraz cztery studzienki do kontrolnych poddanych działaniu nośnika, przez dodanie 0,5 mikrolitra rozcieńczonego DMSO. Następnie, z odpowiednich dołków płytki inhibitora, dodaj 0,5 mikrolitra każdego rozcieńczonego inhibitora do płytki 96-dołkowej. Aby rozpocząć stymulację tymocytów, najpierw upewnij się, że kulki anty-CD-3 i CD-28 są równomiernie ponownie zawieszone.

Następnie umyj jeden mililitr kulek dwoma mililitrami buforu PBS. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu i odessać roztwór. Następnie ponownie zawieś koraliki w jednym mililitrze całego nośnika RPMI.

Dodaj 10 mikrolitrów na studzienkę zawiesiny kulek do każdej próbki poddanej działaniu inhibitora, czterech próbek poddanych działaniu DMSO i czterech z ośmiu próbek niepoddanych działaniu inhibitora. Dodaj 10 mikrolitrów pełnego RPMI do pozostałych czterech nieuzdatnionych studzienek. Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę.

Następnie inkubuj tymocyty w środowisku o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 17 do 20 godzin lub przez noc. Zalać automatyczną myjkę płytową z przepływem laminarnym, najpierw 150 mililitrami roztworu etanolu Tween, następnie wodą dejonizowaną uzupełnioną 1%Tween 20, a na koniec buforem myjącym FACS. Pod koniec inkubacji przy użyciu systemu myjki płytkowej umyć płytkę buforem myjącym FACS, stosując dziewięciokrotny cykl mycia.

Każde płukanie dodaje i usuwa 55 mikrolitrów buforu płuczącego przez przepływ laminarny, co powoduje wykładnicze rozcieńczenie odczynników w studzienkach. Aby zabarwić antygeny powierzchniowe, najpierw rozcieńczyć jedną jednostkę objętości przeciwciał anty-CD-3, anty-CD-4, anty-CD-8 i anty-CD-69 w 100-jednostkowych objętościach buforu płuczącego FACS. Następnie ponownie zawiesić komórki w 25 mikrolitrach mieszaniny przeciwciał barwiących.

Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę, a następnie pozostaw płytkę na lodzie na 30 minut. Aby utrwalić komórki, najpierw umyj płytkę 55 mikrolitrami buforu do płukania FACS, stosując dziewięciokrotny cykl mycia, jak opisano powyżej. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu utrwalająco-nieprzepuszczalnego do każdej studzienki.

Dobrze wymieszaj i inkubuj talerz na lodzie przez 30 minut. Po inkubacji przygotuj jednorazową trwałą ondulację i bufor do mycia, rozcieńczając 25 mililitrów dostarczonego bulionu 10X w 225 mililitrach wody ultraczystej. Zalać myjkę do płytek buforem one-X i umyć płytkę 55 mikrolitrami buforu one-X, stosując dziewięciokrotny cykl mycia, jak opisano powyżej.

Na początek wymieszaj jeden mililitr przeciwciała anty-kaspazy 3 z dwoma mililitrami trwałej ondulacji one-X i przepłucz bufor. Dodaj 25 mikrolitrów mieszaniny na studzienkę do utrwalonych komórek. Użyj wytrząsarki orbitalnej do mikropłytek, aby delikatnie poruszyć płytkę.

Pozostaw talerz na lodzie na godzinę. Pod koniec inkubacji powtórzyć etap płukania dziewięć razy z trwałą ondulacją one-X i buforem do płukania. Następnie dodaj 25 mikrolitrów buforu myjącego FACS do wszystkich dołków płytki.

Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać roztwór. Na koniec przenieś zmieszane próbki do probówek do mikromiareczkowania. Uzupełnij probówki buforem płuczącym FACS do całkowitej objętości 200 mikrolitrów i przystąp do analizy cytometrii przepływowej.

Po stymulacji anty-CD-3, CD-28 zaobserwowano wzrost aktywacji kaspazy-3 i regulację w dół TCR zarówno w próbkach nieleczonych, jak i pozorowanych DMSO. Zaobserwowano również wzrost ekspresji CD-69 w obu stymulowanych próbkach. Próbki poddane działaniu deksametazonu wykazały wzrost aktywacji kaspazy-3 niezależnie od regulacji w górę CD-69, zgodnie z oczekiwaniami w przypadku niezależnego efektu indukującego apoptozę i stymulacji TCR.

Selektywne upośledzenie zjawisk aktywacji limfocytów T wykazano za pomocą różnych inhibitorów, które albo hamowały zarówno aktywację kaspazy-3, jak i regulację w górę CD-69, albo hamowały regulację w górę CD-69, ale nie upośledzały aktywacji kaspazy-3. Istniały również inhibitory, które nie były ukierunkowane na odpowiednią kinazę szlaku sygnałowego TCR, a zatem nie hamowały zarówno regulacji w górę CD-69, jak i aktywacji kaspazy-3. Wynik badania przesiewowego staurosporyny, kontroli pozytywnej apoptozy, wykazał wysoki poziom aktywacji kaspazy-3, zgodnie z oczekiwaniami.

Jednak wynik wykazał również niski poziom ekspresji CD-69, który można przypisać albo hamowaniu kinazy białkowej C, albo indukowanej apoptozie przed ekspresją CD-69. Porównanie różnych protokołów testów nie wykazało różnic w barwieniu aktywną kaspazą-3, CD-69 i TCR kontroli negatywnej, kontroli pozytywnej śmierci komórki, kontroli nośnika i próbki traktowanej inhibitorem. Etapy preinkubacji mają na celu ułatwienie wykorzystania płytki o małej objętości do hodowli komórek.

W manuskrypcie znajduje się również standardowy protokół zależny od wirówki. Potencjalnie interesujące inhibitory lub cele mogą być weryfikowane przy użyciu różnych typów komórek, a także u różnych gatunków, takich jak limfocyty pagoferyjne myszy lub ludzkie komórki pierwotne. Późniejsza charakterystyka zidentyfikowanych cząsteczek i celów może pomóc w lepszym zrozumieniu biologii limfocytów T i rozszerzeniu możliwych celów immunomodulacji.