Name: Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora. Protokół obejmuje analizę atrybutów krytycznych jakości przy minimalnym zużyciu próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Scottowi Lute za wsparcie analityczne, którego udzielił. Częściowe wewnętrzne finansowanie i wsparcie dla tych prac zapewnia CDER Critical Path Program (CA #1-13). Projekt ten jest częściowo wspierany przez powołanie do Programu Staży/Uczestnictwa w Badaniach w Biurze Produktów Biotechnologicznych Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków, zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education na mocy umowy międzyagencyjnej między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a FDA.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pharmaceutical+cGMPs+for+the+21st+Century%3A+A+Risk-Based+Approach%22">Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach</a>. , (2004).</li>
<li>New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm">https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm</a> (2015).</li>
<li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127, 2222-2230 (2013).</li>
<li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li>
<li>Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+structural+modifications+of+immunoglobulin+G+and+their+effect+on+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+%26+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity.</a> Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).</li>
<li>Rathore, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+for+implementation+of+quality+by+design+%28QbD%29+for+biotechnology+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products.</a> Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).</li>
<li>International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ICH%22">ICH</a>. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+tools+for+characterizing+biopharmaceuticals+and+the+implications+for+biosimilars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).</li>
<li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+high-throughput+automated+microbioreactor+system+for+production+of+model+IgG1+in+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+liquid+chromatography-mass+spectrometry+methods+for+the+comprehensive+characterization+of+therapeutic+glycoproteins%2C+from+released+glycans+to+intact+protein+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).</li>
<li>Yang, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+correlation+between+charge+and+glycosylation+of+IgG1+variants+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).</li>
<li>Agarabi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Process+Parameter+Screening+Utilizing+a+Plackett-Burman+Design+for+a+Model+Monoclonal+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Exclusion+Chromatography+with+On-Line+Light-Scattering%2C+Absorbance%2C+and+Refractive+Index+Detectors+for+Studying+Proteins+and+Their+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.</a> Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).</li>
<li>Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+ranibizumab+%28Lucentis%29+or+bevacizumab+%28Avastin%29+with+dexamethasone+and+triamcinolone+acetonide%3A+An+in+vitro+stability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).</li>
<li>Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high-molecular-weight+nonnative+aggregates+and+aggregation+kinetics+by+size+exclusion+chromatography+with+inline+multi-angle+laser+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).</li>
<li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li>
<li>Han, H., Livingston, E., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+profiling+of+charge+heterogeneity+in+antibodies+by+microchip+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).</li>
<li>Wheeler, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microchip+zone+electrophoresis+for+high-throughput+analysis+of+monoclonal+antibody+charge+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).</li>
<li>Carrillo-Cocom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+consumption+in+naive+and+recombinant+CHO+cell+cultures%3A+producers+of+a+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).</li>
<li>Chen, P., Harcum, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+additions+on+ammonium+stressed+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells.</a> Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).</li>
<li>Xing, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+amino+acid+composition+of+CHO+cell+culture+media+for+a+fusion+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production.</a> Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+and+glucose+metabolism+in+fed-batch+CHO+cell+culture+affects+antibody+production+and+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).</li>
<li>Read, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentanomics+informed+amino+acid+supplementation+of+an+antibody+producing+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture.</a> Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).</li>
<li>Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A+chromatography+increases+monoclonal+antibody+aggregation+rate+during+subsequent+low+pH+virus+inactivation+hold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold.</a> Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).</li>
<li>Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycan+analysis+of+therapeutic+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Glycan analysis of therapeutic glycoproteins.</a> MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).</li>
<li>Wahl, O., Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+analysis+for+pharmacopoeial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes.</a> Talanta. 154, 150-163 (2016).</li>
<li>Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+quantitative+analysis+of+underivatized+amino+acids+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+%28LC-MS%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).</a> Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).</li>
</ol>

Niniejsza publikacja odzwierciedla poglądy autora i nie powinna być interpretowana jako reprezentująca poglądy lub politykę FDA.

HCCF zawiera zanieczyszczenia i duże cząstki, które mogą zatkać i zniszczyć kosztowne oprzyrządowanie, dlatego konieczne jest wyjaśnienie hodowli przed dalszym przetwarzaniem. Wirowanie jest na ogół pierwszym podejściem do oddzielenia komórek i innych nierozpuszczalnych cząstek od białek, po którym następuje filtracja. Ten przefiltrowany HCCF jest następnie poddawany szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) w celu oczyszczenia. Oczyszczanie HCCF ze zautomatyzowanych mikrobioreaktorów w celu uzyskania produktu jest ważnym krokiem w dalszym przetwarzaniu. W tym przypadku laboratoryjny system FPLC z kolumną białka A jest używany do otrzymywania przeciwciał monoklonalnych z HCCF. Analityka dla procesów poprzedzających może dostarczyć użytecznych informacji na temat zachowania komórek i pomóc w projektowaniu bioprocesów, pomagając uzyskać produkt o stałej i niezawodnej jakości. Analityka pozwala nam również łączyć krytyczne atrybuty jakości (CQA) z procesami poprzedzającymi i następczymi. Przedstawiono tutaj cztery testy, które są powszechnie stosowane w charakterystyce przeciwciał monoklonalnych. Techniki te są solidne, niezawodne i łatwe do zastosowania do analizy procesów i produktów z różnych źródeł, które są tylko częściowo oczyszczone i mogą nadal zawierać resztkowe poziomy DNA i HCP.
Podczas oczyszczania próbek do analizy należy zachować ważną równowagę między tworzeniem próbki, która jest wystarczająco czysta do analizy, a zachowaniem zmienności występującej w bioreaktorze. Dwa najczęstsze zanieczyszczenia wpływające na produkt to DNA i HCP, które można sprawdzić, mierząc współczynnik absorbancji przy 260/280 nm oraz za pomocą SDS-PAGE lub μCE-SDS. Przedstawione tutaj testy nie są wrażliwe na niskie poziomy zawartości DNA. Czystość produktu wynosi >95%, zgodnie z μCE-SDS.
Analiza wariantów ładunku za pomocą systemu elektroforezy mikrokapilarnej zapewnia wysokowydajną metodę identyfikacji wariantów ładunku, przy użyciu chipów i odczynników, które są stosunkowo łatwe do wdrożenia. Charakter tej techniki i skład chemiczny odczynnika do znakowania są wrażliwe na substancje pomocnicze i inne aminy pierwszorzędowe, co wymaga etapu odsalania w przypadku większości matryc próbek. Z doświadczenia wynika, że niskie poziomy DNA komigrują z wolnym barwnikiem z reakcji znakowania i nie wpływają na jakość wyników. Podczas gdy zmienność kwantyfikacji pików zasadowych, głównych i kwasowych wynosi zwykle <1%, wyższe poziomy DNA i innych zanieczyszczeń mogą zwiększyć zmienność testu. Niezwykle ważne jest, aby zachować spójność z oznakowaniem białek i zapewnić szybkie użycie DMF po wyjęciu z butelki i zmieszaniu z barwnikiem. Wzorce lizyny i/lub histydyny są zalecane jako kontrole etykietowania. Z biegiem czasu i w zależności od jakości próbki, wióry mogą zanieczyścić lub stracić powłokę na kanałach mikroprzepływowych, co prowadzi do większego szumu, obecności pików widmowych i większej zmienności między próbkami. Aby zidentyfikować to zjawisko, ślepe próby i wzorzec przydatności systemu (tj. NISTmAb) analizowano jednocześnie z próbkami w regularnych odstępach czasu. Gdy pojawią się problemy z wiórami, wióry można umyć roztworem do przechowywania lub wymienić.
Metody stosowane do analizy glikanów glikoprotein terapeutycznych obejmują przede wszystkim chromatografię cieczową (LC) i/lub spektrometrię mas (MS), przy czym analiza mikromacierzy lektynowych zyskuje na popularności jako trzecia opcja25. Metoda opisana w tym artykule wykorzystuje zarówno LC, jak i MS, co ma zalety i wady. Metody spektrometrii mas mają tę zaletę, że polegają na weryfikacji masy analizowanych glikanów, co nie jest możliwe w przypadku metod opartych na LC wykorzystujących wyjście detekcji fluorescencyjnej lub mikromacierze lektynowe. Metoda ta wykorzystuje LC i detekcję fluorescencji do przypisania tożsamości glikanów przy użyciu porównania czasu retencji ze standardem drabinki dekstranu. Monitorowanie fluorescencji pozwala na zwiększenie czułości i kwantyfikacji ze względu na łatwość jej wykrywania, podczas gdy sam MS może nie być w stanie określić ilościowo gatunków o niskiej liczebności ze względu na słabą skuteczność jonizacji oligosacharydów. Informacje o masie z MS są wykorzystywane do potwierdzania tożsamości glikanów, ale oprogramowanie do przetwarzania nie wykorzystuje informacji o masie jako podstawowego kryterium przypisania. W związku z tym, bez powtarzalnej chromatografii i łatwo rozpuszczalnych pików, metoda ta może ucierpieć z powodu przypisania glikanów. Na szczęście informacje o masie mogą pomóc w przypisaniu glikanów nawet w sytuacjach, gdy chromatografia jest słaba, takich jak przesunięcia w czasie retencji, które utrudniają powtarzalne przypisania glikanów. Jeżeli metoda ta jest stosowana bez MS, chromatografia musi być na najwyższym poziomie, ponieważ informacje o masie nie mogą być wykorzystane do skorygowania dryftu czasu przebywania.
Opisana tutaj metoda analizy aminokwasów wykorzystuje LC-MS do szybkiego oznaczania ilościowego aminokwasów niedoszczepionych w surowych pożywkach do hodowli komórkowych. Alternatywne metody analizy aminokwasów wymagają środków do derywatyzacji aminokwasów, aby umożliwić wykrywanie UV26. Metoda LC-MS ma istotne zalety w porównaniu z metodą LC-UV: pozwala na identyfikację na podstawie zarówno czasu retencji, jak i masy jonów, w przeciwieństwie do metody LC-UV, która jest ograniczona przez brak charakterystyki masy. Ponadto metoda LC-MS oferuje korzyści w zakresie czasu i odtwarzalności, ponieważ metoda LC-UV wymaga czasochłonnej reakcji derywatyzacji, która może powodować zmienność próbki27. Jednak wstrzykiwanie surowych pożywek do hodowli komórkowych metodą LC-MS może mieć szkodliwy wpływ na sygnał MS z powodu zanieczyszczenia odpieniacza jonowego. Drabinka kalibracyjna jest często wstrzykiwana w celu sprawdzenia przydatności systemu, a kolejność próbek jest losowa, aby zapobiec stronniczości danych.
Proces hodowli komórkowej w celu produkcji przeciwciał przy użyciu mikrobioreaktorów został opisany wcześniej9. W tym badaniu dobrze zdefiniowano szczegółowe protokoły metod charakteryzacji przeciwciał monoklonalnych, które maksymalizują dane uzyskane z ograniczonych objętości próbek. Ograniczone ilości pobranego płynu z hodowli komórkowych mogą czasami ograniczać pozyskiwane informacje o produkcie, a wybór odpowiednich procedur analitycznych w celu uzyskania danych dotyczących jakości produktu ma zasadnicze znaczenie. Analityka jest ważna, aby powiązać ze sobą parametry procesu poprzedzającego ze zmianami jakości produktu. W tym miejscu znajdują się wytyczne dla użytkowników, jak scharakteryzować mAb podczas pracy z mikrobioreaktorami.

Terapie białkowe są stosowane w leczeniu coraz większej liczby schorzeń, w tym powikłań po przeszczepie tkanki, zaburzeń autoimmunologicznych i nowotworów1. Od 2004 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (USFDA) udokumentowała rosnący odsetek wniosków o licencje biologiczne (BLA) wszystkich zatwierdzeń regulowanych przez Center for Drug Evaluation and Research (CDER), przy czym BLA stanowiły ponad 25% w 2014 i 2015 roku2.
Biorąc pod uwagę ten rozwijający się rynek, producenci biofarmaceutyków stoją przed wyzwaniem szybkiego dostarczania większej ilości produktów o stałej jakości. Wysiłki mające na celu zwiększenie wydajności produktu koncentrowały się na inżynierii komórek CHO i badaniach przesiewowych linii produkcyjnych, chociaż najbardziej znaczące ulepszenia wynikają z postępów w optymalizacji strategii pożywki/paszy i kontroli środowiska hodowli komórkowych1,3,4,5 podczas procesu produkcyjnego.
Ponieważ mAb są wytwarzane w systemie biologicznym, może istnieć nieodłączna zmienność białek. Skład przeciwciał może ulec zmianie potranslacyjnej, na przykład glikozylacji lub pod wpływem degradacji lub reakcji enzymatycznych. Te zmiany strukturalne mogą wywoływać niebezpieczne reakcje immunologiczne lub zmieniać wiązanie przeciwciał, co z kolei może zmniejszyć lub wyeliminować zamierzoną funkcję terapeutyczną5. W związku z tym krytyczne atrybuty jakości (CQA) przeciwciał monoklonalnych - profil N-glikanu, rozkład wariantów ładunku i procent przeciwciał w postaci monomerycznej - są regularnie monitorowane i kontrolowane w ramach podejścia Quality by Design (QbD) podczas procesów produkcyjnych1,6. W regulowanym środowisku produkcyjnym białka terapeutyczne muszą spełniać kryteria akceptacji, aby zostać dopuszczonym do obrotu jako zatwierdzony komercyjny produkt leczniczy7. Metody przedstawione w niniejszym dokumencie zazwyczaj stanowią część procesu charakterystyki jakości przeciwciała7,8, a każdy naukowiec zajmujący się białkami będzie zaznajomiony z ich zastosowaniem.
W poprzednich pracach9, opisano zastosowanie i działanie mikrobioreaktorów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych warunków hodowli komórkowych w bioprocesach poprzedzających. Oczyszczony produkt otrzymany w różnych warunkach pożywki poddaje się analizie N-glikanów przy użyciu LC-MS. Wzorce glikozylacji białek terapeutycznych można wykryć i scharakteryzować za pomocą technik LC-MS10,11, a obecność różnych gatunków glikanów została powiązana z parametrami bioprocesu, takimi jak strategia paszy, pH i temperatura12. Wpływ różnych warunków pożywki na jakość produktu, wskazywany przez procent powstałej IgG w postaci monomerycznej, jest również oceniany za pomocą chromatografii wykluczania wielkości - wielokątowe rozpraszanie światła (SEC-MALS)13,14,15. Profil wariantu ładunku reprezentuje szereg modyfikacji16, które mogą mieć wpływ na funkcję produktu. Elektroforeza strefowa mikrokapilarna (mCZE) to technika, która oferuje znacznie szybszy czas analizy w porównaniu z tradycyjnymi metodami chromatografii kationowymiennej (CEX) i kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego (cIEF) stosowanymi do analizy wariantów ładunku17,18. Zużyte pożywki bioreaktorowe przeanalizowano w celu śledzenia zużycia aminokwasów podczas produkcji białka, ponieważ odnosi się to do zmian w atrybutach identyfikujących przeciwciało19,20,21,22,23.
Analiza białek pozwala nam identyfikować krytyczne parametry procesu (CPP) na podstawie relacji między danymi wejściowymi procesu a zmianami w CQA. Podczas opracowywania bioprocesu identyfikacja i pomiar CPP zasadniczo demonstruje kontrolę procesu i zapewnia, że produkt nie uległ zmianie, co jest niezbędne w ściśle regulowanych środowiskach produkcyjnych. W artykule przedstawiono techniki analityczne służące do pomiaru niektórych cech biochemicznych białka najbardziej istotnych dla produktu CQA (profil N-glikanu, warianty ładunku i jednorodność wielkości).

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 Linia komórkowa</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>General Electric Life Sciences</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA Ultra Chromatografia Żywica</td><td>Millipore Sigma</td><td>115115830</td><td>Oczyszczanie Faza stacjonarna</td></tr><tr><td>Omnifit 10cm Kolumna</td><td>Diba Fluid Intelligence</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>Obudowa do stacjonarnej</td></tr><tr><td>podstawy fazowej Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 10 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Wielokątny detektor rozpraszania światła Dawn</td><td>Wyatt</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Jednostka filtrująca Millex GV Membrana PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 ml Pompa binarna</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&nbsp;</td><td>Próbnik Infinity Agilent Technologies</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290</td><td>Termostat Infinity Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Nieskończoność Termostatowana komora kolumny</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352097 Wkładki szklane 150 uL z polimerowymi nóżkami&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka Falcon</td><td>Corning Inc.</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Klasa UPLC BSM</td><td>Waters Corporation</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager</td><td>Waters Corporation</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>Detektor ACQUITY UPLC FLR</td><td>Waters Corporation</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4 100 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Amino Acid Standard, 1 nmol/&mikro; L&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5061-3330</td><td></td></tr><tr><td>Suplement aminokwasowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór mrówczanu amonu - Glycan Analysis</td><td>Waters Corporation</td><td>186007081</td><td></td></tr><tr><td>Niebieskie nakrętki z przegrodą</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Chip</td><td>Perkin Elmer</td><td>760435</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Zestaw odczynników</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS760670</td><td></td></tr><tr><td>Chromatografia Woda (klasa MS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor z płytką ekstrakcyjną dla Oasis 96-Well Plates</td><td>Waters Corporation</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks Zestaw startowy N-glikanu RapiFlour-MS - 24 Sample</td><td>Waters Corporation</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII Probówki buforowe</td><td>E& K Scientific</td><td>697075-NC</td><td></td></tr><tr><td>GXII Ściereczka do czyszczenia okien</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT Touch</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII Rurki drabinkowe</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII Niestrzępiący się wacik GXII</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Nienaruszona kontrola masy mAb Standard</td><td>Waters Corporation</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Intrada Kolumna aminokwasowa 150 x 2 mm</td><td>Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Mikroobjętościowy spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX Detektor różnicowego indeksu refrakcji</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td>Kwas</td> <td>nadchlorowyAldrich Chemistry</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z mikrokapilarą do ładowania żeli</td><td>Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowa 96-dołkowa mikropłytka, z dnem F, w stylu kominowym,</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS Drabina do kalibracji dekstranu</td><td>Waters Corporation</td><td>186007982</td><td></td></tr><tr><td>Zakręcana przezroczysta fiolka 2 ml</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Jodek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 4,6 mm ID x 30 cm L</td><td>Tosoh Biosciences</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI Scientific Information System</td><td>Waters Corporation</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy Shims</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td>186007986</tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Waters Corporation</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>Waters Corporation</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca Zeba Spin, 0,5 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Przeciwciała monoklonalne (mAb) są jednym z najpopularniejszych i najlepiej scharakteryzowanych produktów biologicznych produkowanych obecnie. Najczęściej wytwarzane przy użyciu komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), warunki hodowli i procesu muszą być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować miano przeciwciał i osiągnąć docelowe profile jakościowe. Zazwyczaj ta optymalizacja wykorzystuje zautomatyzowane bioreaktory w mikroskali (15 ml) do równoległego badania przesiewowego wielu warunków procesowych. Kryteria optymalizacji obejmują wydajność hodowli i krytyczne atrybuty jakości (CQA) produktu z przeciwciałem monoklonalnym (mAb), które mogą mieć wpływ na jego skuteczność i bezpieczeństwo. Wskaźniki wydajności hodowli obejmują wzrost komórek i zużycie składników odżywczych, podczas gdy CQA obejmują profile N-glikozylacji i agregacji mAb, warianty ładunku i masę cząsteczkową. Ten szczegółowy protokół opisuje, w jaki sposób oczyszczać, a następnie analizować próbki HCCF wytwarzane przez zautomatyzowany system mikrobioreaktorów w celu uzyskania cennych wskaźników wydajności i wyników. Po pierwsze, do oczyszczania mAb z pobranych próbek kultur komórkowych stosuje się zautomatyzowaną metodę szybkiej chromatografii cieczowej białek A (FPLC). Po zagęszczeniu profile glikanów są analizowane za pomocą spektrometrii mas przy użyciu specjalnej platformy (patrz Tabela materiałów). Masy cząsteczkowe przeciwciał i profile agregacji są określane za pomocą chromatografii wykluczania wielkości i rozpraszania światła pod wieloma kątami (SEC-MALS), podczas gdy warianty ładunku są analizowane za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej mikroprocesora (mCZE). Oprócz wskaźników wydajności kultur zarejestrowanych podczas procesu bioreaktora (tj. żywotności hodowli, liczby komórek i typowych metabolitów, w tym glutaminy, glukozy, mleczanu i amoniaku), zużyte pożywki są analizowane w celu zidentyfikowania ograniczających składników odżywczych w celu poprawy strategii karmienia i ogólnego projektu procesu. W związku z tym opisano również szczegółowy protokół bezwzględnej kwantyfikacji aminokwasów za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) zużytych pożyw. Metody stosowane w tym protokole wykorzystują platformy o wysokiej przepustowości, które są kompatybilne z dużą liczbą próbek o małej objętości.

Zbiór cieczy z hodowli komórkowej z automatycznego bioreaktora mikroskalowego jest oczyszczany przy użyciu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), co przedstawiono na Rysunku 1, a krytyczne atrybuty jakościowe (CQAs) oczyszczonych białek zostały scharakteryzowane za pomocą różnych analitycznych metod downstream. Jest to kluczowa zaleta systemu automatycznego mikrobioreaktora; różnice w CQAs mogą być szybko oceniane w szerokim zakresie warunków. Dane dotyczące N-glikanów z przeciwciał mAb produkowanych przez komórki CHO, które są analizowane metodą spektrometrii mas, powinny przypominać chromatogramy przedstawione na Rysunku 2. Rysunek obrazuje porównanie dwóch chromatogramów, wykazując, że pik mannozy 5 (M5) z jednej próbki jest znacznie niższy. Jeśli zamiast pików zaobserwowano jedynie szum linii bazowej, może to oznaczać wadliwe ustawienie układu chromatograficznego lub niepowodzenie procedury. Zastosowanie kontroli pozwala uprościć rozwiązywanie problemów. Najpierw należy ocenić piki FLR z drabinki dekstranowej; piki te wskazują, że system chromatograficzny działa prawidłowo. Następnie należy porównać piki uzyskane eksperymentalnie z pikami uzyskanymi ze standardu nienaruszonego mAb. Jeśli piki ze standardu są widoczne, ale nie zidentyfikowano pików z próbki, oznacza to, że próbki mAb nie zostały przetworzone prawidłowo. Może to być spowodowane obecnością SDS lub nukleofila w buforze, co zakłóca znakowanie i oczyszczanie N-glikanów.
Technikę SEC-MALS można wykorzystać do oceny dwóch kolejnych CQA: profilu agregacji oraz masy cząsteczkowej przeciwciała. Reprezentatywny chromatogram SEC-MALS jest porównywalny do tego przedstawionego na Rysunku 3. Rozkład masy cząsteczkowej oraz bezwzględną masę cząsteczkową określono przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, przyjmując współczynnik ekstynkcji 1,37 mL*(mg*cm)-1 oraz wartość dn/dc wynoszącą 0,185 mL/g. Ponieważ wyznaczanie pików i ustawianie linii bazowej w oprogramowaniu odbywa się ręcznie, wyniki mogą się nieznacznie różnić w zależności od użytkownika. Bezwzględna masa cząsteczkowa monomeru IgG1 z Rysunku 3 wynosi 1,504 x 105 Da ± 0,38% (kolor niebieski), a kompleksu wyższego rzędu 7,799 x 105 Da ± 3,0% (kolor czerwony). Polidyspersyjność agregatów jest znacznie większa niż monomeru, co wskazuje czerwony rozkład masy molowej Piku 1 (Rysunek 3). Mała ilość próbki oraz znaczenie agregacji jako CQA sprawiają, że technika ta jest niezwykle wartościowym, komplementarnym narzędziem analitycznym dla zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora.
Wynikiem mCZE jest elektroferogram, taki jak na Rysunku 4, który przedstawia profil wariantów ładunku dla przeciwciała monoklonalnego. Profil ten stanowi unikalną sygnaturę badanego białka i jest bardzo wrażliwy na pH robocze. Po lewej stronie profilu wariantów ładunku widoczny jest również piki wolnego barwnika. Podczas ustalania pH roboczego operator ma pewną swobodę w balansowaniu rozdzielczości i sygnału; dodatkowo operator musi zapewnić dobrą separację od piku wolnego barwnika, który migruje w czasie ~30 s. Próbkę można odsolić po znakowaniu, aby usunąć ten pik, choć prowadzi to do znacznego spadku sygnału. Po ustaleniu pH roboczego można porównać profile próbek. Mimo ogólnej spójności, zmiany w wydajności znakowania lub różnice w substancjach pomocniczych mogą prowadzić do niewielkich różnic w migracji próbki i profilu wariantów ładunku, co utrudnia bezpośrednie porównywanie elektroferogramów. Zamiast tego metoda porównania zazwyczaj opiera się na procentowym udziale postaci zasadowych, głównych i kwasowych. W takim przypadku za pomocą mCZE można zidentyfikować różnice względne rzędu zaledwie 1-2%.
Zużycie aminokwasów można monitorować, aby ustalić, czy ich wyczerpanie powoduje zmiany w CQA. Odczyty chromatogramów ze spektrometru mas mogą być wykorzystane do oceny poprawności utworzenia krzywej kalibracyjnej dla bezwzględnego oznaczania ilościowego aminokwasów w surowych próbkach pożywek z bioreaktora. Rysunek 5 przedstawia dwa całkowite chromatogramy jonowe (TIC) oraz jeden wyekstrahowany chromatogram jonowy (XIC) jako reprezentatywne wyniki w tym procesie. Na Rysunku 5A przedstawiony TIC obrazuje sygnał tła z układu buforowego, ponieważ wstrzyknięto jedynie próbę ślepą z wodą. Rysunek 5B przedstawia reprezentatywny TIC wzorca aminokwasów, w którym w porównaniu z próbą ślepą z wodą można zaobserwować niewielkie piki odpowiadające poszczególnym gatunkom aminokwasów (np. lizynę w 7,96 minucie). Aby zintegrować pik i umożliwić oznaczenie ilościowe powierzchni piku (a tym samym stężenia), stosuje się XIC, w którym wyświetlany jest tylko sygnał z zdefiniowanego „okna masowego chromatogramu”. W zależności od czułości instrumentu i jakości rozdziału chromatograficznego, optymalne okno masowe musi zostać określone przez użytkownika. W tym przykładzie (Rysunek 5C) przedstawiono XIC lizyny (m/z = 147,1144) przy oknie masowym 10 ppm, gdzie lizyna we wzorcu aminokwasów eluuje z kolumny w 8,03 minucie.
<img alt="Chromatografia oczyszczania białek; wykres absorpcji UV; proces elucji zanieczyszczeń w stosunku do piku mAb." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywny chromatogram schematu oczyszczania z wykorzystaniem techniki szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Fazy metody oczyszczania odpowiadające objętości (mL) są oznaczone wzdłuż osi x. Absorbancja UV przy 280 nm (oś y w mAU, linia ciągła) jest monitorowana w całym cyklu oczyszczania. Zanieczyszczenia związane nieswoiście są wypierane poprzez zwiększanie przewodnictwa (oś y w mS/cm, linia przerywana) podczas płukania wysoką solą. Przeciwciało jest eluowane z kolumny z Proteiną A po wprowadzeniu buforu elucyjnego (Conc B, linia kropkowana), gdy pH spada do 4 (nie pokazano). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny; analiza glikanów; piki oznaczone jako G0F, M5; dane intensywności względem czasu retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny chromatogram fluorescencyjny uzyskany z oznakowanych glikanów zweryfikowanych masowo. Oś x przedstawia czas retencji (minuty), natomiast oś y przedstawia intensywność sygnału. Pik przy 14,94 min reprezentuje glikan Mannose 5 (M5), gdzie między dwiema nałożonymi na siebie próbkami można zaobserwować znaczną różnicę w sile sygnału M5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy chromatograficznej, absorbancja w funkcji czasu, z zaznaczonymi pikami masy molowej dla HMW oraz monomeru." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rozkład masy cząsteczkowej przeciwciała monoklonalnego IgG1. Chromatogram nienaruszonego przeciwciała monoklonalnego IgG1 rozdzielonego metodą chromatografii wykluczania wielkości w 1x PBS (pH 7.4). Absorbancję monitorowano przy 280 nm (kolor czarny; oś lewa), a detektory rozpraszania światła i współczynnika załamania światła wykorzystano do obliczenia bezwzględnej masy cząsteczkowej każdego piku (kolory czerwony i niebieski; oś prawa). Gatunki o wysokiej masie cząsteczkowej są oznaczone pikiem „HMW”. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający rozdział form; RFU w funkcji czasu; główny pik w 0,60 min." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Profil wariantów ładunku przeciwciała monoklonalnego IgG1. Ten elektroferogram został wygenerowany na platformie mCZE. Pik wolnego barwnika migruje w czasie ~30 s i jest wyraźnie oddzielony od IgG1. W celu ilościowego oznaczenia piki podzielono na formy zasadowe, główne i kwasowe przy użyciu oprogramowania do analizy danych z instrumentu. Czerwona linia obrysowuje zintegrowane pola powierzchni pików. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny TIC i XIC; chromatogramy próbki kontrolnej wody, aminokwasów i lizyny; analiza LC-MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywne wyniki chromatogramów jonowych dla analizy aminokwasów w surowych pożywkach z bioreaktora z wykorzystaniem spektrometrii mas. Oś x przedstawia czas (minuty), natomiast oś y intensywność sygnału (A) Próba kontrolna wody służy jako kontrola negatywna i ujawnia sygnał tła obserwowany w trakcie gradientu chromatografii cieczowej (B) Standard aminokwasowy o stężeniu 225 pmol/µL jest tutaj wykorzystany jako kontrola dodatnia; poszczególne piki widoczne na tym całkowitym chromatogramie jonowym reprezentują różne aminokwasy z mieszaniny standardowej rozdzielane chromatograficznie (C) Reprezentatywny chromatogram jonów wyekstrahowanych dla m/z 147.1144, który odpowiada lizynie. Pik w 7,96 min w panelu B odpowiada pikowi w 8,03 min w panelu C dla lizyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Protokół ten dotyczy analizy ograniczonej liczby próbek uzyskanych z mikrobioreaktorów w celu wydobycia istotnych informacji na temat krytycznych atrybutów jakościowych produktów. Kolejną zaletą tych technik jest to, że wykorzystują one minimalny czas analizy w celu określenia kluczowych atrybutów, które dyktują parametry jakościowe wytwarzanego produktu. Procedurę zademonstrują David Powers, Talia Faison i Phillip Angart, pracownicy naukowi z mojego laboratorium.Zacznij od otwarcia oprogramowania dołączonego do systemu oczyszczania i umieszczenia 15-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania oczyszczonego eluatu przeciwciał i 50-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania przepływu podczas płukania o wysokiej zawartości soli do kolektora frakcji. Następnie dodaj 0,22 mikrometra, przefiltrowany przez pory płyn z kultur komórkowych do pustej 12-mililitrowej strzykawki z zaślepioną dyszą. Po zdjęciu nakrętki włożyć dyszę strzykawki do portu do wstrzykiwania ręcznego systemu oczyszczania.Przekręcić strzykawkę, aby ją dokręcić i wcisnąć tłok, aż cała objętość próbki zostanie wstrzyknięta i będzie widoczna w dołączonej pętli próbki o dużej objętości 10 mililitrów. Wybierz zapisaną metodę i kliknij przycisk Uruchom po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie urządzenia. Gdy wszystkie przeciwciała zostaną usunięte, natychmiast zneutralizuj oczyszczone białko za pomocą jednej molowej zasady tris do pH około 5,5.Aby zagęścić oczyszczone przeciwciało przez odwirowanie, należy umieścić filtry o pojemności 100 kilodaltonów w probówkach do pobierania filtratu. Umyj filtry 500 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody, a następnie odwiruj. Powtórz mycie filtra dwa razy.Po drugim płukaniu wyrzucić filtrat i przenieść przepłukane filtry do nowych probówek wirówkowych. Następnie dodaj 500 mikrolitrów próbki do każdego filtra w celu odwirowania. Pod koniec wirowania odwrócić filtr do nowej probówki zbiorczej, aby uzyskać zagęszczoną próbkę z końcowym odwirowaniem.W celu znakowania i izolacji N-glikanu rozcieńczyć 7,5 mikrolitra każdej skoncentrowanej próbki przeciwciała. Z 15,3 mikrolitrami chromatografii cieczowej spektrometrii mas lub wody klasy LCMS w jednomililitrowych probówkach z zestawu i denaturować przeciwciała sześcioma mikrolitrami 5% roztworu środka powierzchniowo czynnego przyjaznego dla enzymów i spektrometrii mas w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Pod koniec denaturacji pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez trzy minuty przed dodaniem 1,2 mikrolitra peptydu N-glikozydazy F na pięciominutową inkubację w temperaturze 50 stopni Celsjusza.Po schłodzeniu próbek przez trzy minuty do temperatury pokojowej, oznaczyć próbki 12 mikrolitrami odczynnika do znakowania fluorescencyjnego rozpuszczonego w bezwodnym dimetyloformamidzie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji rozcieńczyć znakowaną mieszaninę N-glikanów 358 mikrolitrami acetonitrylu i umieścić płytkę chromatografii oddziaływań hydrofilowych w kolektorze próżniowym z podkładkami i tacą na odpady. Kondycjonuj studzienki 200 mikrolitrami wody z próżnią dostosowaną do 10 do 15 kilopaskalów, aby upewnić się, że ciecz potrzebuje od 15 do 30 sekund, aby przejść przez żywicę chromatografii hydrofilowej.Zrównoważyć studzienki z 200 mikrolitrami 85% acetonitrylu przez 15 do 30 sekund przed załadowaniem 400 mikrolitrów każdej oznakowanej mieszaniny glikanów do każdej studzienki, stosując próżnię po dodaniu każdej nowej cieczy. Po dodaniu wszystkich próbek przemyj żywicę dwa razy 600 mikrolitrami 1% kwasu mrówkowego i 90% acetonitrylu na pranie i zastąp tacę na odpady probówkami zbiorczymi o pojemności 600 mikrolitrów. Następnie należy wymknąć się znakowanym N-glikanom za pomocą trzech 30-mikrolitrowych objętości buforu elucyjnego do spektrometrii i rozcieńczyć rozcieńczenia puli 310 mikrolitrami dimetyloformamidu w eluentach acetonitrylu.Aby przeanalizować znakowane próbki elucji N-glikanu w ultrasprawnym systemie chromatografii cieczowej sprzężonym z detektorem fluorescencyjnym i spektrometrem masowym o poczwórnym czasie przelotu, należy użyć 50-milimolowego mrówczanu amonu i 100% acetonitrylu klasy LCMS do faz ruchomych. Ustaw początkowe natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę, przy czym gradient LC zapewnia wzrost mrówczanu amonu w fazie elucji. Ustaw detektor fluorescencji tak, aby mierzył wzbudzenie 265 nanometrów i emisję 425 nanometrów z częstotliwością próbkowania dwóch herców.Ustaw poczwórny czas lotu w trybie czułości jonów dodatnich MS1 z zakresem masy od 100 do 2 000 daltonów, czasem skanowania 0,25 sekundy i ciągłą akwizycją danych. Następnie załaduj próbki do automatycznego samplera ustawionego na 10 stopni Celsjusza i uruchom załadowaną metodę. Aby odsolić próbkę w ramach przygotowań do analizy wariantu wsadu, oderwij dolny korek 0,5-mililitrowej kolumny odsalającej, poluzuj górny korek i umieść kolumnę odsalającą w 1,7-mililitrowej probówce wirówkowej.Przenieś nową kolumnę do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj 80 mikrolitrów 3,5 miligrama na mililitr roztworu przeciwciał na górę kolumny. Wyrównaj kolumnę do pierwotnej orientacji i odwiruj kolumnę. Następnie odrzucić kolumnę odsalającą i dokładnie wymieszać zagęszczoną próbkę.Rozcieńczyć próbkę do stężenia dwóch miligramów na mililitr w 25 mikrolitrach ultraczystej wody w jednym dołku na 96-dołkowej płytce i dodać do studzienki pięć mikrolitrów buforu do znakowania i pięć mikrolitrów odczynnika do znakowania. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, zmieszać 60 mikrolitrów wody z odczynnikiem z próbką i przykryć płytkę uszczelką płytkową do odwirowania. Aby przygotować chip wariantu ładunku, usuń roztwór do przechowywania i umyj wodą studzienki pierwszą, trzecią, cztery, siódmą, ósmą i dziesiątą.Zastąp wodę buforem o pH 7,2 i dodaj 750 mikrolitrów buforu do probówki buforowej. Naciśnij przycisk Rozładuj płytkę na interfejsie użytkownika przyrządu i usuń uszczelkę z płytki 96-dołkowej. Włóż płytkę i rurkę buforową we wskazane miejsca na tackę na próbki GX2 i naciśnij przycisk Load Plate.Umieść chip w komorze na wióry, zamknij pokrywę komory na wióry, po wyświetleniu monitu wybierz test wariantu ładunku białka HT i kliknij przycisk Uruchom. Oczyszczanie pobranej próbki kultury komórkowej z automatycznego bioreaktora w mikroskali za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek pozwala na scharakteryzowanie krytycznych cech jakościowych oczyszczonych białek za pomocą różnych dalszych metod analitycznych, jak pokazano. Dane dotyczące N-glikanów z przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych w jajnikach chomika chińskiego przetworzonych metodą spektrometrii mas powinny wydawać się podobne do tych reprezentatywnych chromatogramów.Chromatografia wykluczająca rozmiar, rozpraszanie światła pod wieloma kątami, może być wykorzystana do oceny profilu agregacji i masy cząsteczkowej przeciwciała. Niewielka ilość próbki i znaczenie agregacji są kluczowymi atrybutami jakości, które sprawiają, że technika ta jest bardzo cennym narzędziem analitycznym uzupełniającym zautomatyzowany system mikrobioreaktorów. Wynikiem elektroforezy w strefie mikrokapilarnej jest elektroferogram, który można wykorzystać do przedstawienia profilu wariantu ładunku dla przeciwciała monoklonalnego, unikalnej sygnatury badanego białka, które jest bardzo wrażliwe na operacyjne pH.Zużycie aminokwasów można również monitorować w celu określenia, czy wyczerpanie powoduje zmiany w krytycznych atrybutach jakościowych przeciwciała. Ważne jest, aby zapewnić prawidłowe i skuteczne oczyszczanie wytwarzanego produktu, ponieważ etapy analityczne można przeprowadzić tylko przy odpowiednio oczyszczonym białku. Produkt może być również poddany mapowaniu peptydów i testom stabilności.Ale gdy białko zostanie użyte do jednej metody charakteryzacji, zazwyczaj nie może być użyte do innej. Techniki te umożliwiają analizę produktów wytwarzanych z małoseryjnych, wysokoprzepustowych platform przesiewowych bioprocesów w celu zrozumienia wpływu parametrów bioprzetwarzania na jakość produktu. Niektóre z tych technik wykorzystują stężony kwas nadchlorowy, kwas mrówkowy, N-dimetyloformamid, z których wszystkie są niebezpieczne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny.

purification-analytics-monoclonal-antibody-from-chinese-hamster-ovary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ten film demonstruje technikę badania in vivo lokalizacji przeciwciał specyficznych dla nowotworu w modelu ksenoprzeszczepu guza myszy. Po podskórnym wstrzyknięciu komórek rakowych myszom w celu powstania guza, wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane przeciwciała, które wiążą się z receptorami specyficznymi dla guza, umożliwiając ocenę in vivo lokalizacji przeciwciał za pomocą obrazowania.

Technika oceny lokalizacji in vivo przeciwciał specyficznych dla nowotworu

Film wyjaśnia proces wytwarzania przeciwciał w komórkach gospodarza ssaków, od ekspresji genów do wydzielania. Obejmuje transkrypcję, translację, rozpoznawanie sygnału, prawidłowe fałdowanie i ostateczne uwolnienie do ośrodka zewnątrzkomórkowego przez pęcherzyki wydzielnicze.

Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych przeciwciał z komórek ssaków

Ten film demonstruje test do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z płynu do hodowli komórkowych pobranego z komórek jajnika chomika chińskiego. Wykorzystuje porowatą żywicę szklaną z unieruchomionym białkiem A, które wiąże się z regionem Fc przeciwciał w próbce, skutecznie oddzielając je od zanieczyszczeń. Zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH osłabia interakcję, ułatwiając pobieranie oczyszczonych przeciwciał.

Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie...

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Poznaj metodę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora. Protokół obejmuje analizę atrybutów krytycznych jakości przy minimalnym zużyciu próbek.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Przeglądaj więcej filmów