Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Protokół ten dotyczy analizy ograniczonej liczby próbek uzyskanych z mikrobioreaktorów w celu wydobycia istotnych informacji na temat krytycznych atrybutów jakościowych produktów. Kolejną zaletą tych technik jest to, że wykorzystują one minimalny czas analizy w celu określenia kluczowych atrybutów, które dyktują parametry jakościowe wytwarzanego produktu. Procedurę zademonstrują David Powers, Talia Faison i Phillip Angart, pracownicy naukowi z mojego laboratorium.

Zacznij od otwarcia oprogramowania dołączonego do systemu oczyszczania i umieszczenia 15-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania oczyszczonego eluatu przeciwciał i 50-mililitrowych stożkowych probówek do zbierania przepływu podczas płukania o wysokiej zawartości soli do kolektora frakcji. Następnie dodaj 0,22 mikrometra, przefiltrowany przez pory płyn z kultur komórkowych do pustej 12-mililitrowej strzykawki z zaślepioną dyszą. Po zdjęciu nakrętki włożyć dyszę strzykawki do portu do wstrzykiwania ręcznego systemu oczyszczania.

Przekręcić strzykawkę, aby ją dokręcić i wcisnąć tłok, aż cała objętość próbki zostanie wstrzyknięta i będzie widoczna w dołączonej pętli próbki o dużej objętości 10 mililitrów. Wybierz zapisaną metodę i kliknij przycisk Uruchom po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie urządzenia. Gdy wszystkie przeciwciała zostaną usunięte, natychmiast zneutralizuj oczyszczone białko za pomocą jednej molowej zasady tris do pH około 5,5.

Aby zagęścić oczyszczone przeciwciało przez odwirowanie, należy umieścić filtry o pojemności 100 kilodaltonów w probówkach do pobierania filtratu. Umyj filtry 500 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody, a następnie odwiruj. Powtórz mycie filtra dwa razy.

Po drugim płukaniu wyrzucić filtrat i przenieść przepłukane filtry do nowych probówek wirówkowych. Następnie dodaj 500 mikrolitrów próbki do każdego filtra w celu odwirowania. Pod koniec wirowania odwrócić filtr do nowej probówki zbiorczej, aby uzyskać zagęszczoną próbkę z końcowym odwirowaniem.

W celu znakowania i izolacji N-glikanu rozcieńczyć 7,5 mikrolitra każdej skoncentrowanej próbki przeciwciała. Z 15,3 mikrolitrami chromatografii cieczowej spektrometrii mas lub wody klasy LCMS w jednomililitrowych probówkach z zestawu i denaturować przeciwciała sześcioma mikrolitrami 5% roztworu środka powierzchniowo czynnego przyjaznego dla enzymów i spektrometrii mas w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Pod koniec denaturacji pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez trzy minuty przed dodaniem 1,2 mikrolitra peptydu N-glikozydazy F na pięciominutową inkubację w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Po schłodzeniu próbek przez trzy minuty do temperatury pokojowej, oznaczyć próbki 12 mikrolitrami odczynnika do znakowania fluorescencyjnego rozpuszczonego w bezwodnym dimetyloformamidzie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji rozcieńczyć znakowaną mieszaninę N-glikanów 358 mikrolitrami acetonitrylu i umieścić płytkę chromatografii oddziaływań hydrofilowych w kolektorze próżniowym z podkładkami i tacą na odpady. Kondycjonuj studzienki 200 mikrolitrami wody z próżnią dostosowaną do 10 do 15 kilopaskalów, aby upewnić się, że ciecz potrzebuje od 15 do 30 sekund, aby przejść przez żywicę chromatografii hydrofilowej.

Zrównoważyć studzienki z 200 mikrolitrami 85% acetonitrylu przez 15 do 30 sekund przed załadowaniem 400 mikrolitrów każdej oznakowanej mieszaniny glikanów do każdej studzienki, stosując próżnię po dodaniu każdej nowej cieczy. Po dodaniu wszystkich próbek przemyj żywicę dwa razy 600 mikrolitrami 1% kwasu mrówkowego i 90% acetonitrylu na pranie i zastąp tacę na odpady probówkami zbiorczymi o pojemności 600 mikrolitrów. Następnie należy wymknąć się znakowanym N-glikanom za pomocą trzech 30-mikrolitrowych objętości buforu elucyjnego do spektrometrii i rozcieńczyć rozcieńczenia puli 310 mikrolitrami dimetyloformamidu w eluentach acetonitrylu.

Aby przeanalizować znakowane próbki elucji N-glikanu w ultrasprawnym systemie chromatografii cieczowej sprzężonym z detektorem fluorescencyjnym i spektrometrem masowym o poczwórnym czasie przelotu, należy użyć 50-milimolowego mrówczanu amonu i 100% acetonitrylu klasy LCMS do faz ruchomych. Ustaw początkowe natężenie przepływu na 0,4 mililitra na minutę, przy czym gradient LC zapewnia wzrost mrówczanu amonu w fazie elucji. Ustaw detektor fluorescencji tak, aby mierzył wzbudzenie 265 nanometrów i emisję 425 nanometrów z częstotliwością próbkowania dwóch herców.

Ustaw poczwórny czas lotu w trybie czułości jonów dodatnich MS1 z zakresem masy od 100 do 2 000 daltonów, czasem skanowania 0,25 sekundy i ciągłą akwizycją danych. Następnie załaduj próbki do automatycznego samplera ustawionego na 10 stopni Celsjusza i uruchom załadowaną metodę. Aby odsolić próbkę w ramach przygotowań do analizy wariantu wsadu, oderwij dolny korek 0,5-mililitrowej kolumny odsalającej, poluzuj górny korek i umieść kolumnę odsalającą w 1,7-mililitrowej probówce wirówkowej.

Przenieś nową kolumnę do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj 80 mikrolitrów 3,5 miligrama na mililitr roztworu przeciwciał na górę kolumny. Wyrównaj kolumnę do pierwotnej orientacji i odwiruj kolumnę. Następnie odrzucić kolumnę odsalającą i dokładnie wymieszać zagęszczoną próbkę.

Rozcieńczyć próbkę do stężenia dwóch miligramów na mililitr w 25 mikrolitrach ultraczystej wody w jednym dołku na 96-dołkowej płytce i dodać do studzienki pięć mikrolitrów buforu do znakowania i pięć mikrolitrów odczynnika do znakowania. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, zmieszać 60 mikrolitrów wody z odczynnikiem z próbką i przykryć płytkę uszczelką płytkową do odwirowania. Aby przygotować chip wariantu ładunku, usuń roztwór do przechowywania i umyj wodą studzienki pierwszą, trzecią, cztery, siódmą, ósmą i dziesiątą.

Zastąp wodę buforem o pH 7,2 i dodaj 750 mikrolitrów buforu do probówki buforowej. Naciśnij przycisk Rozładuj płytkę na interfejsie użytkownika przyrządu i usuń uszczelkę z płytki 96-dołkowej. Włóż płytkę i rurkę buforową we wskazane miejsca na tackę na próbki GX2 i naciśnij przycisk Load Plate.

Umieść chip w komorze na wióry, zamknij pokrywę komory na wióry, po wyświetleniu monitu wybierz test wariantu ładunku białka HT i kliknij przycisk Uruchom. Oczyszczanie pobranej próbki kultury komórkowej z automatycznego bioreaktora w mikroskali za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek pozwala na scharakteryzowanie krytycznych cech jakościowych oczyszczonych białek za pomocą różnych dalszych metod analitycznych, jak pokazano. Dane dotyczące N-glikanów z przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych w jajnikach chomika chińskiego przetworzonych metodą spektrometrii mas powinny wydawać się podobne do tych reprezentatywnych chromatogramów.

Chromatografia wykluczająca rozmiar, rozpraszanie światła pod wieloma kątami, może być wykorzystana do oceny profilu agregacji i masy cząsteczkowej przeciwciała. Niewielka ilość próbki i znaczenie agregacji są kluczowymi atrybutami jakości, które sprawiają, że technika ta jest bardzo cennym narzędziem analitycznym uzupełniającym zautomatyzowany system mikrobioreaktorów. Wynikiem elektroforezy w strefie mikrokapilarnej jest elektroferogram, który można wykorzystać do przedstawienia profilu wariantu ładunku dla przeciwciała monoklonalnego, unikalnej sygnatury badanego białka, które jest bardzo wrażliwe na operacyjne pH.

Zużycie aminokwasów można również monitorować w celu określenia, czy wyczerpanie powoduje zmiany w krytycznych atrybutach jakościowych przeciwciała. Ważne jest, aby zapewnić prawidłowe i skuteczne oczyszczanie wytwarzanego produktu, ponieważ etapy analityczne można przeprowadzić tylko przy odpowiednio oczyszczonym białku. Produkt może być również poddany mapowaniu peptydów i testom stabilności.

Ale gdy białko zostanie użyte do jednej metody charakteryzacji, zazwyczaj nie może być użyte do innej. Techniki te umożliwiają analizę produktów wytwarzanych z małoseryjnych, wysokoprzepustowych platform przesiewowych bioprocesów w celu zrozumienia wpływu parametrów bioprzetwarzania na jakość produktu. Niektóre z tych technik wykorzystują stężony kwas nadchlorowy, kwas mrówkowy, N-dimetyloformamid, z których wszystkie są niebezpieczne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny.