Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii dotyczące dynamiki kolonizacji i infekcji mikroorganizmami w przewodzie pokarmowym. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona bardziej reprezentatywna dla infekcji przenoszonych przez żywność u ludzi i zmniejsza potencjalne uszkodzenia tkanek u ryb w porównaniu z zgłębnikiem doustnym. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mycia mogą być trudne do wykonania ze względu na bardzo ruchliwy charakter pantofelka.

Z żywej hodowli dodać jeden mililitr kultury pantofelka i jeden mililitr kultury E-coli MG1655 do dziesięciomililitrowej kolby do hodowli tkankowej zawierającej osiem mililitrów pożywki E3. Lekko zamieszaj kolbę przed umieszczeniem jej w temperaturze 22 stopni Celsjusza, przechodząc jeden mililitr kokultury do nowej dziesięciomililitrowej kolby do hodowli tkankowej zawierającej dziewięć mililitrów świeżej pożywki E3, uzupełnionej 108 jednostkami tworzącymi kolonie na mililitr e-coli MG1655, co dwa tygodnie. Aby określić okres półtrwania bakterii w pantofelku, policz liczbę pantofelków z gęstości optycznej 600 bakterii paramecji i dodaj 50 mikrolitrów podwielokrotności supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki co godzinę przez sześć godzin.

Dodaj 950 mikrolitrów jednoprocentowego niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS do probówek. I poddać lizie pantofelek w każdej próbce za pomocą jednej minuty wirowania, a następnie wykonać jedno na dziesięć rozcieńczeń każdej próbki w sterylnym PBS. I rozłóż 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na selektywne płytki przez 16 godzin inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia policz tylko izolowane i odrębne pojedyncze kolonie, aby określić liczbę kolonii bakteryjnych na płytce. I zidentyfikuj płytkę z rozcieńczeniem, które daje 30-300 jednostek tworzących kolonie. W dniu poprzedzającym zakażenie należy pobrać jedną objętość bakterii z kultury o gęstości optycznej 600 na zabieg przez odwirowanie.

I ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze pożywki E3 na probówkę. Następnie dodaj jeden mikrolitr odpowiedniego barwnika bakteryjnego do każdej zawiesiny bakteryjnej. I zabezpiecz probówki do wybielania zdjęć folią.

Przed inkubacją próbek bakterii z rotacją od końca do końca przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj bakterie dwa razy w dużej objętości pożywki E3, aby usunąć nadmiar barwnika. I ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze świeżego podłoża E3 na probówkę.

Następnie dodać jeden mililitr zawiesiny bakteryjnej do każdej z dwóch kolb świeżej paratofelka na warunki na dwugodzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Pobrać zawartość obu kolb pod każdym warunkiem do indywidualnych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów. I granulować próbki przez odwirowanie.

Za pomocą pipety sterologicznej zastąpić około dziesięciu mililitrów supernatantu E3 w każdej probówce dziesięcioma mililitrami świeżej pożywki E3 na 3 płukania przez odwirowanie. Po ostatnim praniu usunąć około dziesięciu mililitrów supernatantów E3, uważając, aby nie zakłócić działania granulek, i ponownie zawiesić granulki w pozostałych dziesięciu mililitrach podłoża E3. Przenieś 500 mikrolitrów każdej zawiesiny do pojedynczych 1,5 mililitrowych probówek do mikrocenrifuge i granuluj pantofelek przez odwirowanie.

Odrzucić 400 mikrolitrów supernatantów i dodać 20 mikrolitrów 36,5% roztworu formaldehydu do pozostałych 100 mikrolitrów pantofelka za pomocą delikatnego pipetowania. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej zmierz rzeczywistą całkowitą objętość w każdej probówce za pomocą pipety, a następnie policz liczbę martwych pantofelków na mililitr. W przypadku zakażenia danio pręgowanego przenoszonego przez żywność, rozcieńczyć próbki pantofelka do dwa razy dziesięć do pięciu pantofelków na mililitr stężenia podłoża E3.

I dodaj 3 mililitry każdej kultury pantofelka do jednego dołka z 6-dołkową płytką na warunek. Następnie przenieś dziesięć znieczulonych danio pręgowanego do każdej studzienki w minimalnej objętości płynu. I inkubować kokultury przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze dobowym w warunkach światła dziennego.

Aby określić tempo żerowania, obejrzyj żerującego danio pręgowanego pod mikroskopem stereoskopowym, jednocześnie uzyskując materiał wideo z chwytania zdobyczy. Chwytanie zdobyczy charakteryzuje się uderzeniem danio pręgowanego w kierunku zdobyczy. Szacuje się, że każde uderzenie to jedno schwytanie zdobyczy.

Pod koniec inkubacji umyj danio pręgowanego w 5 różnych studzienkach zawierających 3 mililitry świeżej pożywki E3 uzupełnionej 100 miligramami na litr tricainy na studzienkę. I osadź każdego danio pręgowanego w 3 mililitrach 1% niskotopliwej agarozy w czarnej płytce z sześcioma dołkami. Kiedy wszystkie ryby zostaną osadzone, umieść płytkę pod mikroskopem stereoskopowym i użyj przyciętej końcówki ładującej żel, aby upewnić się, że głowy znajdują się po lewej stronie, a ogony po prawej stronie w każdym polu view.

Odczekaj 5 minut, aż agaroza stwardnieje, a następnie nałóż osadzoną rybę na świeże podłoże E3 uzupełnione trikainą i zobrazuj danio pręgowanego pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby ocenić postęp infekcji bakteryjnych. W przypadku patogennej e-coli początkowa gęstość bakteryjna wynosi 790 bakterii na pantofelek, a bakterie są rozkładane w wakuolach każdego atomu przeciętego pantofelka z okresem półtrwania wynoszącym około 2,3 godziny. Żerowaniu towarzyszy charakterystyczne zachowanie uderzeniowe, a określenie wskaźnika żerowania opiera się na założeniu, że każde uderzenie prowadzi do internalizacji 1 pantofelka.

Po strawieniu wolne bakterie przemieszczają się z jelita przedniego do jelita środkowego i tylnego, gdzie są wykrywane około 1 do 2 godzin po rozpoczęciu żerowania. Na przykład S-enterica lokalizuje się głównie w błonie śluzowej jelit z pewną inwazją nabłonkową prowadzącą do infiltracji neutrofili do nabłonka. Nie zapominaj, że praca z niektórymi rodzajami bakterii może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.