15 lutego 2019
Celem tego protokołu jest pokazanie, jak indukować skupione aparaty szparkowe w liścieniach siewek Arabidopsis thaliana poprzez zanurzenie roztworu pożywki zawierającej cukier oraz jak obserwować struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak chloroplasty i mikrotubule w zgrupowanych komórkach ochronnych za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.
Metoda ta pozwoliła odpowiedzieć na kluczowe pytanie z zakresu biologii rozwoju roślin. Czyli jakie znaczenie ma przestrzenne rozmieszczenie aparatów szparkowych? Nasz system indukcji grupowanych aparatów szparkowych przy użyciu roztworu sacharozy jest dość łatwy i ma bezpośrednie zastosowanie do transgenicznych lub zmutowanych linii Arabidopsis thaliana.
Na początek dodaj 1,1 grama średnich soli Murashige-Skoog i 15 gramów sacharozy do zlewki. Dodaj 490 mililitrów wody destylowanej do zlewki i wymieszaj z mieszadłem. Użyj wodorotlenku potasu, aby dostosować pH do 5,8.
Następnie rozcieńczyć roztwór 500 mililitrami wody destylowanej i przenieść rozcieńczony roztwór do średniej butelki. Następnie przeprowadź autoklaw roztworu. Przygotuj roztwór do sterylizacji zgodnie z protokołem tekstowym.
Następnie, pracując w warunkach aseptycznych, umieść około 50 transgenicznych nasion A.thaliana z fluorescencyjnym markerem w 1,5-mililitrowej probówce. Następnie dodaj jeden mililitr 70% etanolu do probówki i wymieszaj, odwracając rurkę pięć razy. Po pozostawieniu nasion na dnie probówki, delikatnie usuń etanol za pomocą mikropipety.
Dodaj jeden mililitr roztworu sterylizacyjnego do nasion i odwróć probówkę pięć razy, aby wymieszać. Delikatnie usuń roztwór sterylizacyjny z nasion za pomocą mikropipety. Następnie dodaj jeden mililitr sterylnej wody.
Dodaj 1,5 mililitra roztworu Murashige-Skoog do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Następnie dodaj dwa wysterylizowane nasiona do każdej studzienki. Za pomocą dwóch warstw parafilmu przyklej pokrywkę do płytki.
Następnie przenieś płytkę do komory wzrostowej w celu inkubacji przez 14 dni. Najpierw przenieś 30 mikrolitrów roztworu Murashige-Skoog z płytki 24-dołkowej na środek szkiełka podstawowego. Za pomocą nożyczek preparacyjnych usuń liścienie z 14-dniowej sadzonki.
Unosić liścienie stroną obserwacyjną skierowaną do góry na kropli roztworu Murashige-Skooga. Przygotuj liścienie zgodnie z metodami opisanymi wcześniej w Journal of Visualized Experiments. Ustaw próbkę na stoliku konfokalnego mikroskopu laserowego.
Na koniec użyj oświetlenia jasnego pola, aby wybrać zgrupowane komórki ochronne do obserwacji. W tym protokole grupowanie aparatów szparkowych zostało wywołane u siewek A.thaliana. Skupione komórki ochronne wyhodowane w pożywce zawierającej sacharozę mają większe chloroplasty niż komórki ochronne wyhodowane w warunkach wolnych od sacharozy.
Powiększenie chloroplastów potwierdzono za pomocą markera zrębu chloroplastów i autofluorescencyjnych chlorofilów, co sugeruje, że leczenie sacharozą spowodowało akumulację ziarna skrobi w chloroplastach. Ponadto obserwacja konfokalna GFP tub-6 ujawniła, że mikrotubule korowe były zorientowane promieniowo w komórkach traktowanych sacharozą, podobnie jak w komórkach ochronnych wolnych od sacharozy. Właściwie odkryliśmy tę metodę przez przypadek.
Po tym odkryciu zbadaliśmy reakcję środowiskową skupionych aparatów szparkowych. Wierzymy, że nasz system może pomóc w zbadaniu znaczenia rozmieszczenia aparatów szparkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Ten protokół pokazuje, jak wywołać zgrupowane stomę w liśćkach zarodkowych sadzonek Arabidopsis thaliana za pomocą pożywki zawierającej cukier. Opisuje również obserwację struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak chloroplasty i mikrotubule w komórkach strzeżących, za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej.
Understanding stomatal spatial distribution informs predictive models of plant water-use efficiency and photosynthetic capacity, which are relevant to crop yield optimization and stress resilience in agricultural biotechnology. This induction system enables mechanistic interrogation of guard cell biology without genetic modification, supporting target validation in plant signaling pathways. The method provides a scalable, reproducible platform for evaluating compound effects on stomatal patterning and function in discovery pipelines.
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening and target validation precede lead identification, particularly in agrochemical and plant trait development pipelines.