Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej
5 marca 2019
Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.
Ogólnym celem tej metodologii jest rozszerzenie poza granicę optyczną większości cytometrów przepływowych poprzez umożliwienie badaczowi zarejestrowania pięciu dodatkowych markerów w celu zbadania złożonych populacji komórek. Korzystając z tej techniki, możliwe jest uzyskanie głębokiego immunofenotypowania podczas pracy z instrumentem z małą liczbą detektorów lub próbką z ograniczoną liczbą komórek. Rozpocznij tę procedurę od ostrożnego przeniesienia pobranej krwi do 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Rozcieńczyć krew równą ilością PBS bez wapnia i magnezu. Dodaj 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości na dno nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki. Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na podłoże o gradiencie gęstości, unikając mieszania się pożywki o gradiencie gęstości z rozcieńczoną krwią.
Wirować przy 400 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca, aby uniknąć zakłócenia interfejsu. Po odwirowaniu należy użyć pipety, aby ostrożnie zassać i wyrzucić górną warstwę, zwracając uwagę, aby nie usunąć komórek na granicy faz między osoczem a podłożem o gradiencie gęstości. Zbierz jak najwięcej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub PBMC z granicy faz bez dotykania osadu krwinek czerwonych na dnie 50-mililitrowej stożkowej probówki i przenieś do nowej probówki.
Dodaj PBS, aby doprowadzić końcową objętość do 25 mililitrów i odwróć kilka razy, aby wymieszać. Następnie umyj PBMC dwukrotnie, jak wskazano w tekście. Po usunięciu płytek krwi i zliczeniu PBMC zgodnie z opisem w tekście, ponownie zawiesić komórki w PBS, 0,1% azydku sodu do stężenia jeden razy 10 do siódmych komórek na mililitr.
Aby przygotować PBMC do barwienia, należy przenieść 100 mikrolitrów każdej próbki na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V. Odwirować płytkę w temperaturze 350 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
Do każdego dołka dodać 100 mikrolitrów PBS zawierającego żywy/martwy barwnik utrwalalny, który reaguje z wolnymi aminami na białkach, i ostrożnie ponownie zawiesić mieszaninę PBMC. Następnie pozostaw płytkę na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu oznaczenia martwych komórek. Dla każdej próbki należy przygotować 30 mikrolitrów mieszanki zawierającej wszystkie siedem przeciwciał.
Na tym etapie można również dodać przeciwciała miareczkowane przeciwko różnym cząsteczkom docelowym i w różnych fluorochromach. Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 350 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj koktajl przeciwciał do każdej studzienki i ostrożnie zawieś ponownie, nie wytwarzając pęcherzyków.
Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po 30 minutach dodaj 150 mikrolitrów buforu barwiącego do każdej studzienki i odwiruj płytkę w temperaturze 350 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach PBS.
Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej. Przeciwciała anty-CD3, CD8, CD14, CD19 i TCR gamma delta są miareczkowane z maksymalną krzywą indeksu barwienia. Miareczkowanie przeciwciał jest najważniejszym krokiem w tym protokole, aby prawidłowo zidentyfikować siedem podzbiorów komórek odpornościowych przy użyciu dwóch fluorochromów.
Aby przygotować dwukrotne rozcieńczenie przeciwciał, należy napełnić 10 dołków 96-dołkowej płytki 40 mikrolitrami buforu barwiącego na dołek. Na potrzeby tego filmu pokazane zostanie tylko miareczkowanie anty-CD8. W pierwszym dołku zwiększ końcową objętość do 80 mikrolitrów buforu barwiącego i dodaj anty-CD8 w stężeniu czterokrotnie większym niż sugerowane przez producenta.
Dobrze wymieszaj i przenieś 40 mikrolitrów do drugiej studzienki. Dobrze wymieszaj i powtórz ten krok dla wszystkich innych studzienek. Wybarwić 10 próbek PBMC lub krwi pełnej 30 mikrolitrami 10 różnych dwukrotnych rozcieńczeń anty-CD8 zgodnie z protokołem pokazanym wcześniej.
Zebrać dane za pomocą cytometru przepływowego i wykreślić sygnał z każdego rozcieńczenia. Po obliczeniu wskaźnika barwienia dla każdego stężenia przeciwciała, jak wyszczególniono w tekście, należy wykreślić indeks barwienia w stosunku do stężenia przeciwciał wyrażonego jako ułamek rozcieńczenia przeciwciała i określić stężenie przeciwciała o maksymalnej wartości wskaźnika barwienia. Aby miareczkować przeciwciała anty-CD4 i anty-CD56, zacznij od pokazanej wcześniej strategii dwukrotnego rozcieńczania, dodając dodatkowe stężenia pomiędzy nimi, aby dokładnie określić zakres stężeń, który pozwoli na oddzielenie limfocytów T CD4-dodatnich i komórek NK od innych populacji komórek.
Miareczkować przeciwciało anty-CD4, umieszczając sygnał anty-CD4 między podwójnym CD8-dodatnim, CD3-dodatnim sygnałem a populacją CD3 z pojedynczym dodatnim CD3. Miareczkować przeciwciało anty-CD56 zgodnie ze strategią podobną do miareczkowania przeciwciał anty-CD4, umieszczając komórki NK między populacjami CD3-ujemnymi i CD3-dodatnimi. Aby rozpocząć tę strategię bramkowania z dwoma fluorochromami, siedmioma markerami, wybierz bramkę limfocytów i utwórz wykres punktowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi.
Bramka na CD8-dodatnich limfocytach T zidentyfikowanych jako podwójnie dodatnie komórki CD3 i CD8 w prawym górnym rogu wykresu kropkowego. Wyklucz populację dim CD8, która może zawierać komórki NKT. Brama na limfocytach T CD4-dodatnich zidentyfikowanych jako populacja pomiędzy limfocytami T CD8-dodatnimi a pojedynczymi populacjami dodatnimi CD3.
Bramka na limfocytach T gamma delta zidentyfikowanych jako komórki o wysokim poziomie CD3. Podziel limfocyty T gamma delta na CD8 dodatnie i CD8 ujemne. Bramka na komórkach NK zidentyfikowana jako populacja pomiędzy komórkami CD3-dodatnimi i CD3-ujemnymi.
Podziel komórki NK na CD8 dodatnie i CD8 ujemne. Bramka na komórkach B zidentyfikowana jako populacja CD3-ujemna, CD19-dodatnia w prawym dolnym rogu wykresu kropkowego. Wybierz bramkę monocytów i utwórz wykres punktowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi.
Brama w populacji CD3-ujemnej, CD14-dodatniej. Stosując tę strategię, limfocyty od pacjenta ze szpiczakiem mnogim bramkowano na podstawie ich rozproszenia do przodu i rozrzutu bocznego oraz profilu cytometrii przepływowej. Subpopulacje pamięci CD8-dodatniej i naiwne limfocyty T zidentyfikowano na podstawie ekspresji CD45RA i CCR7.
Ekspresję HLA-DR i CD57 wykorzystano do badania aktywacji limfocytów T w komórkach CD8-dodatnich naiwnych, pamięciowych, pamięci centralnej, pamięci efektorowej i pamięci efektorowej CD45RA-dodatnich. W podobny sposób zidentyfikowano CD4-dodatnie naiwne limfocyty T i limfocyty T pamięci. W populacji pamięci CCR4 i CCR6 wykorzystano do identyfikacji subpopulacji pomocniczych T w limfocytach T CD4-dodatnich.
Subpopulacje komórek NK charakteryzowano ekspresją CD16 i CD57. Strategia ta została wykorzystana do zbadania dynamiki w populacjach immunologicznych próbek podłużnych od dawcy ze szpiczakiem mnogim otrzymującego przeszczep komórek macierzystych. Charakterystyka subpopulacji CD8 i CD4 w czasie wykazała utrzymującą się aktywację limfocytów T CD4-dodatnich i CD8-dodatnich oraz przekrzywienie pomocnicy T do fenotypu T-pomocniczego.
Ale w 60. dniu odsetek limfocytów B dramatycznie wzrósł, przewidując nawrót choroby u pacjenta. Właściwe przygotowanie komórek i miareczkowanie przeciwciał są kluczowymi krokami do osiągnięcia wiarygodnych wyników przy użyciu tej techniki. Można dodać przeciwciała ukierunkowane na inne markery, aby przeprowadzić głębszą analizę cytometrii przepływowej i stworzyć modułowe panele cytometrii przepływowej ukierunkowane na kilka linii w tym samym czasie.
Podobne podejścia mające na celu zwiększenie liczby markerów, które można zarejestrować, można również opracować przy użyciu różnych zestawów markerów lub do wykorzystania w różnych modelach zwierzęcych. Nie zapominaj, że azydek sodu może powodować oparzenia skóry i oczu. Dlatego podczas pracy z tym odczynnikiem należy zawsze nosić fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół cytometrii przepływowej służący do identyfikacji różnych typów komórek odpornościowych we krwi obwodowej człowieka przy użyciu tylko dwóch fluorochromów. Metoda ta pozwala na rejestrację pięciu dodatkowych markerów, co usprawnia analizę złożonych populacji komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Cytometria przepływowa
- Biologia komórki
Wstęp
- Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do analizy populacji komórek.
- Tradycyjne metody często wymagają zastosowania wielu fluorochromów, co ogranicza liczbę markerów, które można analizować jednocześnie.
- Celem niniejszego badania jest uproszczenie tego procesu przy jednoczesnym rozszerzeniu możliwości analitycznych.
- Zrozumienie populacji komórek odpornościowych jest kluczowe dla wielu zastosowań w badaniach biomedycznych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu umożliwiającego identyfikację wielu typów komórek odpornościowych przy użyciu mniejszej liczby fluorochromów.
- Ułatwienie głębszego immunofenotypowania przy ograniczonych zasobach.
- Poprawa wydajności analizy cytometrycznej w warunkach badawczych.
Zastosowane metody
- Próbki krwi rozcieńcza się w PBS i nakłada na medium do gradientu gęstości.
- Przeprowadza się cytometrię przepływową w celu identyfikacji populacji komórek.
- Do znakowania komórek wykorzystuje się dwa fluorochromy.
- W celu pogłębienia analizy rejestruje się pięć dodatkowych markerów.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie identyfikuje limfocyty T CD4+ i CD8+, limfocyty T γδ, limfocyty B, komórki NK oraz monocyty.
- Bez utraty jakości danych można przeanalizować pięć dodatkowych markerów.
- Metoda ta wykazuje możliwość zastosowania mniejszej liczby fluorochromów w cytometrii przepływowej.
- Wyniki wskazują na zwiększoną efektywność analizy złożonych populacji komórek odpornościowych.
Wnioski
- Opracowany protokół usprawnia analizę cytometryczną poprzez zmniejszenie liczby wymaganych fluorochromów.
- Podejście to pozwala na bardziej kompleksowe zrozumienie populacji komórek odpornościowych.
- Stanowi ono cenne narzędzie dla badaczy dysponujących ograniczonymi zasobami lub wyposażeniem.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia głębokie immunofenotypowanie subpopulacji ludzkich komórek odpornościowych przy użyciu tylko dwóch fluorochromów, co zwiększa możliwości analityczne cytometrów przepływowych o niskiej liczbie parametrów. Wspiera ona walidację celów oraz opracowywanie testów w badaniach odkrywczych, pozwalając na jednoczesną analizę siedmiu markerów linii bez konieczności stosowania zaawansowanej aparatury. Podejście to jest szczególnie wartościowe przy przesiewaniu ograniczonej liczby próbek klinicznych i umożliwia efektywne pod względem zasobów monitorowanie immunologiczne w badaniach przedklinicznych i translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia walidację funkcjonalną subpopulacji komórek odpornościowych poprzez potwierdzenie kombinacji markerów specyficznych dla linii komórkowych, co jest kluczowe dla minimalizacji ryzyka związanego z celem terapeutycznym.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zależność od złożonych paneli wielobarwnych, usprawniając weryfikację hipotez we wczesnych etapach projektów badawczych skoncentrowanych na immunologii.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia standaryzację testu poprzez umożliwienie spójnej detekcji limfocytów T CD4+, CD8+, γδ, limfocytów B, komórek NK oraz monocytów przy użyciu stałego panelu dwufluorochromowego.
- Wartość operacyjna: Zwiększa przepustowość w warunkach ograniczonej ilości próbek, pozwalając na rejestrację pięciu dodatkowych markerów poza limitem optycznym instrumentu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera podłużny monitoring immunologiczny w modelach przedklinicznych, umożliwiając wykrywanie markerów aktywacji (np. HLA-DR, CD57) oraz zmian w rozkładzie subpopulacji w czasie.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność w porównaniach międzybadawczych poprzez zapewnienie ustandaryzowanej strategii bramkowania (gatingu) dla głównych populacji immunologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy biologii odkrywczej, umożliwiając wczesne profilowanie immunologiczne, które dostarcza informacji niezbędnych do wyboru celu oraz zrozumienia mechanizmów przed etapem identyfikacji związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie oparte na hipotezach dotyczące składu komórek odpornościowych i ich stanów funkcjonalnych w układach istotnych dla przebiegu chorób.
- Screening: Umożliwia przygotowanie zestandaryzowanych próbek PBMC do późniejszych testów odpowiedzi na leki poprzez zapewnienie spójnej identyfikacji podgrup immunologicznych.
- Analityka: Generuje ilościowe, multiparametryczne odczyty, które pozwalają na porównanie częstotliwości występowania komórek odpornościowych oraz stanów ich aktywacji w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając monitorowanie rekonstytucji układu odpornościowego i dynamiki podgrup w próbkach pobieranych podłużnie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalny moduł immunofenotypowania, który można zastosować w wielu projektach badających modulację odpornościową lub stan zapalny.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów związanych z odpornością poprzez ograniczenie niejednoznaczności w identyfikacji podzbiorów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność analizy w ośrodkach o zróżnicowanych możliwościach w zakresie cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Wspiera efektywne kosztowo immunofenotypowanie poprzez rozszerzenie użyteczności istniejących instrumentów obsługujących 2–10 fluorochromów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji uwzględniających ryzyko w rozwoju immunoterapii dzięki niezawodnemu monitorowaniu odporności w próbkach przedklinicznych i klinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie kompensacji w cytometrii przepływowej, strategii bramkowania oraz miareczkowania przeciwciał w celu rozdzielenia nakładających się sygnałów.
- Zależne od dostępu do cytometru przepływowego zdolnego do detekcji dwóch fluorochromów oraz odpowiednich odczynników barwiących (np. barwnika live/dead, PBS, azotku sodu).
- Wymaga standaryzacji protokołów miareczkowania przeciwciał dla wszystkich użytkowników, aby zapewnić spójną rozdzielczość subpopulacji.
- Wymaga adaptacji przy rozszerzeniu metody na gatunki niehumanoidalne lub inne źródła tkanek ze względu na potencjalne różnice w ekspresji markerów.
- Ograniczone w rozdzielaniu blisko spokrewnionych subpopulacji, takich jak komórki NKT, bez zastosowania dodatkowych markerów lub aparatury o większej liczbie parametrów.
