Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie metody oceny endogennej aktywności kinazy LRRK2 w ludzkiej krwi obwodowej. Osiąga się to poprzez monitorowanie fosforylacji białek Rab za pośrednictwem LRRK2, z wykorzystaniem fosfospecyficznych przeciwciał monoklonalnych Rab Fundacji Michaela J. Foxa. Tutaj skupiamy się na ludzkich neutrofilach krwi obwodowej jako stanowiących jednorodną populację miejscową o wysokich poziomach ekspresji zarówno Rab2, jak i Rab10.

Izolacja neutrofili opiera się na selekcji negatywnej, która w ciągu 40 minut od zakończenia działania pozwala na izolację 99% czystych i żywotnych neutrofili, zapewniając jednocześnie wysoki poziom białka. Zbierz 10 mililitrów krwi do probówki do pobierania krwi. Wymieszaj delikatnie, odwracając probówki siedem do ośmiu razy.

Przenieś 10 mililitrów krwi do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać do krwi 100 mikrolitrów roztworu podstawowego EDTA 1, 0,1 molowego roztworu PBS EDTA, delikatnie wymieszać. Dodaj 500 mikrolitrów koktajlu izolacyjnego, 50 mikrolitrów na mililitr z zestawu do izolacji neutrofili do próbki krwi pełnej.

Przed użyciem należy wirować kulki magnetyczne z zestawu do izolacji neutrofili przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia bardzo drobnych kulek magnetycznych. Dodaj 500 mikrolitrów kulek magnetycznych do próbki krwi i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Uzupełnij probówkę do 50 mililitrów roztworem podstawowym EDTA 2. Jest to jednomilimolowy roztwór PBS EDTA. Mieszać bardzo delikatnie, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy.

Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywkę, aby uniknąć późniejszego poruszenia rurki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie pipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Nie dotykaj strony probówki, która styka się z magnesem i unikaj gromadzenia się i zaburzeń czerwonych krwinek na dnie probówki. Pozostawić około 10 mililitrów zawiesiny czerwonych krwinek na dnie probówki. Wiruj kulki magnetyczne przez 30 sekund przed użyciem i dodaj 0,5 mililitra kulek magnetycznych do probówki zawierającej wzbogacone neutrofile.

Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywę, aby uniknąć późniejszego mieszania.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem.

Pozostaw około pięciu mililitrów zawiesiny na dnie tubki. Aby zapewnić całkowite usunięcie kulek magnetycznych z mieszaniny komórek, umieść rurkę zawierającą wzbogacone komórki w magnesie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową, która teraz zawiera czyste neutrofile, do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem. Pozostaw około pięciu mililitrów zawiesiny na dnie tubki.

Uzupełnij izolowane komórki jednym milimolowym roztworem podstawowym EDTA 2 do końcowej objętości około 41 mililitrów. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Podziel roztwór równo na dwie probówki po około 20 mililitrów w każdej probówce.

Odwirować obie probówki w temperaturze 335G przez pięć minut. Podczas etapu wirowania wyjmij z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni zapas inhibitora MLi-2 o stężeniu 200 mikromolów i 1000X i pozostaw w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia. Bezpośrednio po etapie wirowania i bez mieszania probówek odlać supernatant, nie naruszając osadów obojętnochłonnych.

Ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetując komórki w górę iw dół cztery razy. Oznacz jedną probówkę DMSO, a drugą probówkę MLi-2. Do probówki oznaczonej DMSO dodać 10 mikrolitrów DMSO i dodać 10 mikrolitrów 200 mikromolowego roztworu podstawowego MLi-2, delikatnie pipetując w górę iw dół do wymieszania.

Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać delikatnie przez odwrócenie co 10 minut w okresie inkubacji. Podczas 30-minutowej kuracji inhibitorem kinazy LRRK2 należy wyjąć 0,5 molowy roztwór podstawowy DIFP z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni i umieścić w dygestorii na lodzie.

Następnie przenieś jeden miligram na mililitr roztworu podstawowego Microcystin-LR z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni i umieść w temperaturze pokojowej do rozmrożenia. Rozmrozić podwielokrotność 0,25 mililitra buforu do lizy, wyjmując go z zamrażarki, pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić na lodzie w celu późniejszego użycia. Przygotuj jeden mililitr pożywki RPMI zawierającej jeden mikrolitr DMSO, nazwij to buforem do ponownego zawieszania DMSO.

Przygotuj jeden mililitr pożywki RPMI zawierającej jeden mikrolitr 200 mikromolowych MLi-2 lub alternatywnego inhibitora kinazy LRRK2 i nazwij to buforem do reprodukcji MLi-2. Po 30-minutowym okresie inkubacji odwirować obie probówki w temperaturze 335G przez pięć minut, tak jak poprzednio. Ostrożnie wyrzucić supernatant z każdej probówki, nie naruszając osadu neutrofili.

W przypadku probówki z oznaczeniem DMSO delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze bufora do ponownego zawieszania DMSO. A w przypadku probówki z oznaczeniem MLi-2 ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do zawieszania MLi-2. Przenieś zawieszone granulki komórek do odpowiednich probówek wirówkowych oznaczonych DMSO i MLi-2 i odwiruj obie probówki przy 335G przez trzy minuty.

Na etapie wirowania należy przygotować bufor do lizy. W dygestorii ostrożnie dodaj 0,25 mikrolitra 0,5 molowego roztworu DIFP, a także 0,25 mikrolitra jednego miligrama na mililitr mikrocystyny-LR do 0,25 mililitra buforu do lizy. Wymieszaj i pozostaw na lodzie do użycia.

Natychmiast po odwirowaniu ostrożnie i całkowicie usunąć cały supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu neutrofili i umieścić probówki na lodzie. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego DIFP i mikrocystynę-LR do każdej probówki. Używając pipety o pojemności od 100 do 200 mikrolitrów, ponownie zawieś granulki komórek, pipetując w górę iw dół około pięciu do 10 razy.

Połóż komórki na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 20 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Przenieść DMSO i supernatant MLi-2 zawierający lizaty neutrofili do nowych probówek wirówkowych.

Wyrzuć granulki gruzu. Lizaty neutrofili są teraz gotowe do użycia lub mogą być natychmiast zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni do przyszłej analizy. Korzystając z danych z publicznie dostępnej bazy danych importu, wykres ten pokazuje, że obfitość białek LRRK2 i Rab10 jest szczególnie wysoka w neutrofilach i monocytach ludzkiej krwi obwodowej.

Wyizolowanie ludzkich neutrofili krwi obwodowej za pomocą tej procedury powoduje wysoką zanieczyszczoną wydajność komórek. Tabela u góry pokazuje całkowitą liczbę komórek wyizolowanych z 10 mililitrów krwi obwodowej od trzech zdrowych dawców. Pokazano również czystość i żywotność wyizolowanych komórek, a także całkowitą wydajność lizatu białkowego.

Po leczeniu inhibitorem kinazy LRRK2 MLi-2 i bez niego, neutrofile są poddawane lizie w obecności silnego inhibitora proteazy, DIFP. W przypadku ryciny B po lewej stronie, 10 mikrogramów ekstraktów z całych komórek na linię poddano multipleksowej ilościowej analizie immunoblot ze wskazanymi przeciwciałami. Rysunek po prawej, C, pokazuje znaczenie DIFP w zapobieganiu degradacji proteolitycznej, w szczególności dużego białka LRRK2.

Dla porównania, wysokie stężenia samego PMSF są mniej skuteczne. Wykazano, że fosforylacja Rab10 kontrolowana przez LRRK2 jest znacznie zwiększona około trzykrotnie w neutrofilach krwi obwodowej pochodzących od pacjentów z dziedziczną chorobą Parkinsona z heterozygotyczną mutacją VPS35 D620N w porównaniu z kontrolą. Górny wykres przedstawia analizę immunoblot multipleksowy, a dolny jej kwantyfikację.

Sugeruje to, że mutacja VPS35 D620N aktywuje ścieżkę aktywności kinazy LRRK2 za pomocą nieznanego jeszcze mechanizmu. Podsumowując, przedstawiamy łatwy i solidny test do pomiaru aktywności szlaku kinazy LRRK2 poprzez monitorowanie fosforylacji białka Rab, takiego jak Rab10, w ludzkich neutrofilach pochodzenia obwodowego, metoda ta pozwala nam ocenić aktywność szlaku LRRK2 i określić, w jaki sposób mutacje, stany chorobowe lub inhibitory modulują aktywność szlaku LRRK2.