Name: Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej do badania aktywności kinazy LRRK2 poprzez ocenę fosforylacji białka Rab10. Technika ta umożliwia identyfikację osób zwiększoną aktywnością szlaku LRRK2 związaną z dziedziczną chorobą Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zdrowym ochotnikom, którzy uprzejmie oddali krew do niniejszego badania. Dziękujemy Fundacji Michaela J. Foxa na rzecz Badań nad Chorobą Parkinsona (MJFF) oraz kierownictwu badania Fox BioNet (FBN) za ich wsparcie i wkład w powstanie pisemnego protokołu i filmu. Dziękujemy profesorowi Alexandrowi Zimprichowi z Uniwersytetu Wiedeńskiego w Austrii za przetestowanie naszego protokołu i współpracę. Doceniamy wkład Paula Daviesa w projekt (dyrektora generalnego MRC PPU). Doceniamy również doskonałe wsparcie techniczne ze strony Jednostki Fosforylacji i Ubikwitylacji Białek MRC (PPU), a mianowicie zespołów Syntezy Chemicznej (Natalia Shpiro za syntezę MLi-2), MRC PPU Reagents and Services w zakresie oczyszczania przeciwciał (koordynowanych przez Hilary McLauchlan i Jamesa Hastie). Dziękujemy Mhairi Towler i Fraserowi Murdochowi z Vivomotion za pomoc w tworzeniu filmów i animacji. Dziękujemy Steve'owi Soave'owi z 81 films za pomoc w ostatecznym montażu. Esther Sammler jest wspierana przez Scottish Senior Clinical Academic Fellowship i otrzymała finansowanie z Parkinson's UK (K-1706).

Zgodnie z lokalnymi przepisami UK, wszystkie manipulacje i pipetowanie ludzkiej krwi odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego kategorii 2. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z lokalną komisją ds. oceny etyki, a wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować 0,1 ml roztworu podstawowego EDTA 1 zawierającego 100 mM EDTA w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Przygotować 60 ml roztworu podstawowego EDTA 2 zawierającego 1 mM EDTA w PBS.</li>
	<li>Przygotować bufor do lizy zawierający 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glicerofosforanu, 5 mM pirofosforanu sodu, 0,27 M sacharozy, 0,1% (v/v) β-merkaptoetanolu, 1x koktajl inhibitorów proteazy, 1 μg/ml mikrocystyny-LR i 0,5 mM fluorofosforanu diizopropylu (DIFP). 
UWAGA: Autorzy rutynowo używają produktu wolnego od EDTA, ale koktajl inhibitorów proteazy zawierający EDTA również powinien działać. Bufor do lizy można przygotować z wyprzedzeniem bez β-merkaptoetanolu, inhibitorów proteazy, mikrocystyny-LR i DIFP i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Upewnij się, że β-merkaptoetanol, inhibitory proteazy, mikrocystyna-LR i DIFP są dodawane tylko bezpośrednio przed użyciem. 
	UWAGA: DIFP jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie w dygestorium po lokalnej ocenie ryzyka dla zdrowia i bezpieczeństwa. DIFP można dodać do buforu do lizy i natychmiast zużyć. Alternatywnie, kompletny bufor do lizy zawierający wszystkie inne składniki, w tym DIFP, może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia przez co najmniej 4 tygodnie.</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili z krwi pełnej
<ol>
	<li>Zbierz 10 ml krwi do probówki do pobrania krwi. Wymieszaj delikatnie, odwracając probówki 7−8x.</li>
	<li>Przenieś 10 ml krwi do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu podstawowego EDTA 1 do krwi. Delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Dodać 500 μl koktajlu izolacyjnego (50 μl/ml) z zestawu do izolacji neutrofili (tabela materiałów) do próbki krwi pełnej.</li>
	<li>Przed użyciem należy wirować kulki magnetyczne z zestawu do izolacji neutrofili przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia bardzo drobnych kulek magnetycznych.</li>
	<li>Dodaj 500 μl kulek magnetycznych do próbki krwi i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
	<li>Napełnij probówkę do 50 ml roztworem podstawowym EDTA 2. Mieszać bardzo delikatnie, pipetując w górę i w dół 2–3 razy.</li>
	<li>Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywkę, aby uniknąć późniejszego poruszenia rurki.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Nie dotykaj strony probówki, która styka się z magnesem i unikaj gromadzenia się i zaburzeń czerwonych krwinek na dnie probówki. Pozostawić około 10 ml zawiesiny czerwonych krwinek na dnie probówki.</li>
	<li>Przed użyciem należy wirować kulki magnetyczne przez 30 s i dodać 0,5 ml kulek magnetycznych do probówki zawierającej wzbogacone neutrofile. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywę, aby uniknąć późniejszego mieszania.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem. Pozostawić około 5 ml zawiesiny na dnie probówki.</li>
	<li>Aby zapewnić całkowite usunięcie kulek magnetycznych z mieszaniny komórek, umieść rurkę zawierającą wzbogacone komórki w magnesie.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową, która zawiera teraz czyste neutrofile, do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem. Pozostawić około 5 ml zawiesiny na dnie probówki.</li>
	<li>Wymieszać wyizolowane komórki z 1 mM roztworem podstawowym EDTA 2 do końcowej objętości około 41 ml. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.</li>
	<li>Podzielić roztwór równomiernie na dwie probówki, w każdej z nich znajduje się około 20 ml.</li>
	<li>Odwirować obie probówki o sile 335 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Podczas tego wirowania wyjąć inhibitor MLi-2 (stężenie 200 μM/1,000x) z zamrażarki w temperaturze -80 °C i pozostawić w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia.</li>
	<li>Bezpośrednio po etapie wirowania i bez mieszania probówek odlać supernatant, nie naruszając osadów obojętnochłonnych. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetując komórki w górę iw dół 4x.</li>
</ol>
3. Leczenie czystych neutrofili inhibitorem kinazy LRRK2
<ol>
	<li>Oznacz jedną probówkę "DMSO", a drugą probówkę "MLi-2".</li>
	<li>Do probówki oznaczonej "DMSO" dodać 10 μl DMSO i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół 2x za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Do probówki z napisem "MLi-2" dodać 10 μl roztworu podstawowego MLi-2 o stężeniu 200 μM (stężenie końcowe 200 nM) i delikatnie wymieszać, pipetując 2x w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej masy. Podczas inkubacji delikatnie mieszać przez odwrócenie co 10 minut.</li>
	<li>W okresie inkubacji usunąć 0,5 M materiału DIFP z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić w dygestorium na lodzie. Wyjąć 1 mg/ml roztworu podstawowego mikrocystyny-LR z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić w temperaturze pokojowej do rozmrożenia. Wyjmij podwielokrotność (0,25 ml) buforu do lizy z zamrażarki, pozwól mu się rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie umieść go na lodzie do późniejszego użycia.</li>
	<li>Przygotować 1 ml pożywki do hodowli komórkowych zawierającej 1 μl DMSO i wywołać ten bufor do reprodukcji DMSO. Przygotować 1 ml pożywki RPMI zawierającej 1 μl 200 μM MLi-2 i wywołać ten bufor do reprodukcji MLi-2.</li>
	<li>Po 30-minutowym okresie inkubacji odwirować obie probówki o stężeniu 335 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant z każdej probówki, nie naruszając osadu neutrofili.</li>
	<li>W przypadku próbki znakowanej DMSO delikatnie zawiesić osad w 1 ml buforu do rezawieszania DMSO, a w przypadku probówki znakowanej MLi-2, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do respensji MLi-2.</li>
	<li>Przenieść zawieszone granulki komórek do odpowiednich probówek wirówkowych oznaczonych "DMSO" i "MLi-2" i odwirować obie probówki przy 335 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Na etapie wirowania należy przygotować bufor do lizy. W dygestorium ostrożnie dodać 0,25 μl 0,5 M roztworu DIFP oraz 0,25 μl 1 mg/ml mikrocystyny-LR do 0,25 ml buforu do lizy. Wymieszaj i pozostaw na lodzie do użycia. 
	UWAGA: Dodaj DIFP do buforu do lizy w ciągu 15 minut od lizy komórek, ponieważ DIFP jest stosunkowo niestabilny w roztworze wodnym.</li>
	<li>Natychmiast po odwirowaniu ostrożnie i całkowicie usunąć cały supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu neutrofili i umieścić probówki na lodzie.</li>
	<li>Natychmiast dodać 100 μl buforu do lizy zawierającego DIFP i mikrocystynę-LR do każdej probówki. Za pomocą pipety o pojemności 100–200 μl ponownie zawiesić granulki komórek, pipetując w górę i w dół około 5–10 razy.</li>
	<li>Lizuj komórki na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Probówki wirowe o masie 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Przenieść supernatanty "DMSO" i "MLi-2" zawierające lizaty neutrofili do nowych probówek wirowych. Wyrzuć granulki gruzu. 
	UWAGA: Lizaty neutrofili są teraz gotowe do użycia lub mogą zostać zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Paisan-Ruiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+Potent%2C+Selective%2C+and+Centrally+Active+Compound+for+Exploring+the+Therapeutic+Potential+and+Safety+of+LRRK2+Kinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Therapies+for+Parkinson%27s+Disease%3A+From+Genetics+to+the+Clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Movement+Disorders%22%5BJournal%5D)">Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic.</a> Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).</li>
<li>Alessi, D. R., SammLer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+kinase+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRRK2 kinase in Parkinson's disease.</a> Science. 360 (6384), 36-37 (2018).</li>
<li>Yue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+dopaminergic+alterations+and+mitochondrial+abnormalities+in+LRRK2+G2019S+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice.</a> Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).</li>
<li>Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2+serines+955+and+973+is+disrupted+by+Parkinson%27s+disease+mutations+and+LRRK2+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Parkinson%27s+disease+LRRK2+kinase+pathway+activity+by+assessing+Rab10+phosphorylation+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).</li>
<li>Scott, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+3-%284-Pyrimidinyl%29+Indazole+%28MLi-2%29%2C+an+Orally+Available+and+Selective+Leucine-Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Inhibitor+that+Reduces+Brain+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).</li>
<li>Pham, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+serine+proteases%3A+specific+regulators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).</li>
<li>Lis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+phospho-specific+Rab+protein+antibodies+to+monitor+in+vivo+activity+of+the+LRRK2+Parkinson%27s+disease+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase.</a> Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).</li>
<li>Mir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+VPS35%5BD620N%5D+mutation+enhances+LRRK2-mediated+Rab+protein+phosphorylation+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human.</a> Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).</li>
<li>Rieckmann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+network+architecture+of+human+immune+cells+unveiled+by+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics.</a> Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Bain, B., Dean, A., Broom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+lymphocyte+percentage+by+the+Coulter+Counter+Model+S+Plus+III%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Laboratory+Haematology%22%5BJournal%5D)">The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III.</a> Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).</li>
<li>Tomazella, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+total+cellular+proteins+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils.</a> Proteome Science. 7, 32(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przekonujące dowody kliniczne, genetyczne i biochemiczne wskazują na ważną rolę LRRK2, a w szczególności jego funkcji kinazy w chorobie Parkinsona7. Opracowano inhibitory kinazy LRRK2 i wchodzą one w fazę badań klinicznych 2,4,12. W związku z tym istnieje potrzeba wykorzystania LRRK2 jako biomarkera do docelowego zaangażowania, a także stratyfikacji pacjentów. Nasz protokół opisuje solidny i łatwy test do...

Próby spowolnienia lub zatrzymania choroby Parkinsona (PD) jak dotąd nie powiodły się. Odkrycie hiperaktywujących mutacji w bogatej w leucynę kinazie powtórzeniowej 2 (LRRK2), które powodują i/lub zwiększają ryzyko PD, doprowadziło do opracowania inhibitorów kinazy LRRK21,2,3. Zostały one już włączone do badań klinicznych4. Dokładna funkcja LRRK2 jest niejasna, ale dużym postępem była identyfikacja podzbioru białek GTPazy Rab, w tym Rab10, jako pierwszych bona fide fizjologicznych substratów kinazy LRRK25,6,7. Kluczowymi wyzwaniami w erze terapii modyfikujących przebieg choroby są biochemiczne markery stanu aktywacji kinazy LRRK2 oraz docelowe zaangażowanie inhibitorów kinazy LRRK2.
Do tej pory, głównym markerem farmakokinetycznym dla inhibitorów LRRK2 in vivo było skupisko konstytutywnie fosforylowanych reszt seryny LRRK2, w szczególności seryny 935, które ulegają defosforylacji w odpowiedzi na różne inhibitory LRRK28,9. Jednak fosforylacja seryny 935 nie koreluje z wewnętrzną komórkową aktywnością kinazy LRRK2, ponieważ nie jest ona bezpośrednio fosforylowana przez LRRK2 i nadal jest fosforylowana w nieaktywnej kinazie LRRK210. Aktywność kinazy LRRK2 dobrze koreluje z autofosforylacją seryny 1292, ale w praktyce nie jest to odpowiedni odczyt dla endogennej aktywności kinazy LRRK2 za pomocą analizy immunoblot ekstraktów z całych komórek ze względu na obecny brak wiarygodnych i fosfospecyficznych przeciwciał dla tego miejsca10,11.
Opracowaliśmy solidny i łatwy test do ilościowego oznaczania aktywności szlaku kinazy LRRK2 w ludzkich komórkach krwi obwodowej, który mierzy kontrolowaną przez LRRK2 fosforylację fizjologicznego białka docelowego Rab10 w treoninie 7311. Krew obwodowa jest łatwo dostępna przez żyłę, która jest szybkim zabiegiem o niskim ryzyku, powodującym minimalny dyskomfort. Skupiamy się na neutrofilach ludzkiej krwi obwodowej, ponieważ stanowią one liczną (37-80% wszystkich białych krwinek) i jednorodną populację komórek, która wyraża stosunkowo wysokie poziomy zarówno LRRK2, jak i Rab1011. Co więcej, neutrofile krwi obwodowej można szybko i skutecznie wyizolować dzięki zastosowaniu podejścia immunomagnetycznego ujemnego. Aby upewnić się, że późniejsza obserwowana fosforylacja Rab10 jest pośredniczona przez LRRK2, każda partia neutrofili jest inkubowana z silnym i selektywnym inhibitorem kinazy LRRK2 lub bez niego (używamy i zalecamy MLi-2)2,12. Następnie następuje liza komórek w buforze zawierającym inhibitor proteazy diizopropylofluorofosforan (DIFP), który jest niezbędny do tłumienia wewnętrznej aktywności proteazy seryny, o której wiadomo, że jest wysoka w neutrofilach13. Do końcowej analizy za pomocą ilościowego immunoblottingu zalecamy użycie króliczego przeciwciała monoklonalnego MJFF-pRab10, które specyficznie wykrywa Rab10 Thr73-fosfoepitop i nie reaguje krzyżowo z innymi fosforylowanymi białkami Rab14. Selektywność i swoistość tego przeciwciała została potwierdzona w modelach nadekspresji różnych białek Rab i linii komórkowej A549 Rab10 knock-out class14. W ten sposób mierzymy różnicę w fosforylacji Rab10 w lizatach neutrofili, które były traktowane silnym i selektywnym inhibitorem kinazy LRRK2 i bez niego2. Alternatywnie próbki mogą być również analizowane innymi metodami, takimi jak ilościowa spektrometria mas.
Podsumowując, fosforylacja Rab10 kontrolowana przez LRRK2 jest lepszym markerem aktywności kinazy LRRK2 niż fosforylacja LRRK2 przy serynie 935, a neutrofile w ludzkiej krwi obwodowej są cennym źródłem do badań nad LRRK2 w chorobie Parkinsona. Nasz protokół zapewnia solidny i łatwy test do badania aktywności szlaku LRRK2 w neutrofilach krwi obwodowej i umożliwia biochemiczną stratyfikację osób ze zwiększoną aktywnością kinazy LRRK215. Co ważne, takie osoby mogą odnieść korzyści z przyszłego leczenia inhibitorem kinazy LRRK2.

<table><tbody><tr><td>1 ml Końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikroprobówki</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td>lub odpowiedniki</td></tr><tr><td>10 ml Końcówki do pipet&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025&nbsp;</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>10 &mu; L Końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>70.113</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>15 ml probówka Falcon&nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>200 &mu; L Końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>lub równoważne</td></tr><tr><td>25 ml Końcówki do pipet&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>probówka sokoła 50 ml&nbsp;</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Hemogard Zamknięcie Plastikowa rurka K2-EDTA</td><td>BD&nbsp;</td><td>Wirówka 367525 BD</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-15R,</td><td>Beckman</td><td></td><td>lub równoważna wirówka z obracaczem kubełkowym do probówek sokoła o pojemności 15 ml i 50 ml o prędkości 1000-1200 x g</td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego kategorii 2.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompletny (wolny od EDTA) koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>DIFP (diizopropylofosforan)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0879</td><td>Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy w izopropanolu z zachowaniem specjalnych środków ostrożności&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulcotlenek dimetylu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>6250</td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód lub ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14190094</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>magnes Easy 50 EasySep &nbsp;</td><td>Stemcell</td><td>18002</td><td>do przechowywania 1 x 50ml stożkowa probówka</td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit&nbsp;</td><td>Stemcell</td><td>19666</td><td>Zawiera rozwiązania o nazwie " Koktajl izolacyjny" oraz " Kulki magnetyczne RapidSpheres</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5417R Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, w butelce</td><td></td><td></td><td></td>z rozpylaczem</tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol lodowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(gatunek bezwodny)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM &beta;-glicerofosforan, 5 mM pirofosforan sodu, 0,27 M sacharoza, 0,1% (v/v) &beta;-merkaptoetanol, 1x koktajl inhibitorów proteazy cOmplete (wolny od EDTA) (Roche), 1 &mu; g/ml Microcystin-LR, 0,5 mM diizopropylofluorofosforanu (DIFP).&nbsp;</td><td></td><td></td><td>alternatywnie mrożony bufor do lizy w podwielokrotnościach bez Microcystin-LR, DIFP dostępny z MRC-PPU Odczynniki (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)</td></tr><tr><td>Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2)</td><td>Merck</td><td>438194-10MG</td><td>lub równoważny (silny i selektywny inhibitor LRRK2)</td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-350-012-M001</td><td>1 mg/ml zapas w DMSO i przechowywać w temperaturze -80 oC.&nbsp;</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx skan System obrazowania Western Blot</td><td>Odyssey Marker permanentny Odyssey</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środki</td><td></td><td></td><td></td>ochrony osobistej</tr><tr><td>RPMI 1640 Średni&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>21875034</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>pirofosforan sodu</td><td>Sigma</td><td>S22</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Sugerowane przeciwciała przeciwko Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RAB10 (fosfo T73) [MJF-R21]</td><td>abcam</td><td>ab230261</td><td></td></tr><tr><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>anty-&alfa;-tubuliny</td><td>5174</td><td>stosowane w rozcieńczeniu 1:2000</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi IRDye 680LT</td><td>LI-COR</td><td>926-68020</td><td>stosowany w rozcieńczeniu 1:10 000</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysz IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>stosowany w rozcieńczeniu 1:10 000</td></tr><tr><td>Kozia przeciwciało przeciw królikom IRDye 800CW</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td>stosowane w rozcieńczeniu 1:10 000</td></tr><tr><td>MJFF-całkowite przeciwciało myszy Rab10</td><td>generowane przez nanoTools (nanotools.de)</td> <td>nie dotyczy *</td> <td>stosowane przy 2 &mu; g/ml stężenie końcowe; * Przeciwciało MJFF-total Rab10 wygenerowane przez nanoTools (www.nanotools.de) [11] zostanie skomercjalizowane przez Fundację Michaela J. Foxa w 2018</td></tr> r. <tr><td>Mysie przeciwciało anty-LRRK2 C-endus</td><td>antibodies Incorporated</td><td>&nbsp; 75-253</td><td>używany w 1 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>pS935-LRRK2</td><td>MRC PPU Odczynniki i usługi</td><td>UDD2</td><td>stosowane przy 1 &mu; g/ml stężenie końcowe</td></tr></tbody></table>

izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy lrrk2 związanego z chorobą parkinsona poprzez ocenę fosforylacji rab10

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Kinaza powtórzeniowa bogata w leucynę 2 (LRRK2) jest najczęściej mutowanym genem w dziedzicznej chorobie Parkinsona (PD), a wszystkie patogenne mutacje LRRK2 powodują hiperaktywację funkcji kinazy. Tutaj opisujemy łatwy i solidny test do ilościowego określenia aktywności szlaku kinazy LRRK2 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej poprzez pomiar kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji jednego z jego fizjologicznych substratów, Rab10 przy treoninie 73. Opisana analiza immunoblottingu wymaga w pełni selektywnego i fosfospecyficznego przeciwciała, które rozpoznaje epitop Rab10 Thr73 fosforylowany przez LRRK2, takiego jak królicze przeciwciało monoklonalne MJFF-pRab10. Wykorzystuje ludzkie neutrofile krwi obwodowej, ponieważ krew obwodowa jest łatwo dostępna, a neutrofile są obfitym i jednorodnym składnikiem. Co ważne, neutrofile wyrażają stosunkowo wysoki poziom zarówno LRRK2, jak i Rab10. Potencjalną wadą neutrofili jest ich wysoka wewnętrzna aktywność proteazy seryny, co wymaga stosowania bardzo silnych inhibitorów proteazy, takich jak neurotoksyna organiczna diizopropylofluorofosforan (DIFP) jako część buforu do lizy. Niemniej jednak neutrofile są cennym zasobem do badań nad aktywnością szlaku kinazy LRRK2 in vivo i powinny być brane pod uwagę przy włączaniu do kolekcji biorepozytoriów PD.

Nasza metoda pozwala na badanie aktywacji kinazy LRRK2 związanej z chorobą Parkinsona w neutrofilach krwi obwodowej człowieka, przyjmując zależną od LRRK2 fosforylację Rab10 jako odczyt. Neutrofile stanowią jednorodną i liczną populację białych krwinek krwi obwodowej, która wykazuje wysoki poziom białek LRRK2 i Rab10 (Rysunek 1). Jedyną inną populacją komórek wśród pozostałych mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs) o wysokiej liczbie kopii obu białek są monocyty, ale stanowią one jed...

Mutacje w genie bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2 (LRRK2) powodują dziedziczną chorobę Parkinsona. Opracowaliśmy łatwą i solidną metodę oceny kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji Rab10 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej. Może to pomóc w identyfikacji osób ze zwiększoną aktywnością szlaku kinazy LRRK2.

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie metody oceny endogennej aktywności kinazy LRRK2 w ludzkiej krwi obwodowej. Osiąga się to poprzez monitorowanie fosforylacji białek Rab za pośrednictwem LRRK2, z wykorzystaniem fosfospecyficznych przeciwciał monoklonalnych Rab Fundacji Michaela J. Foxa. Tutaj skupiamy się na ludzkich neutrofilach krwi obwodowej jako stanowiących jednorodną populację miejscową o wysokich poziomach ekspresji zarówno Rab2, jak i Rab10.Izolacja neutrofili opiera się na selekcji negatywnej, która w ciągu 40 minut od zakończenia działania pozwala na izolację 99% czystych i żywotnych neutrofili, zapewniając jednocześnie wysoki poziom białka. Zbierz 10 mililitrów krwi do probówki do pobierania krwi. Wymieszaj delikatnie, odwracając probówki siedem do ośmiu razy.Przenieś 10 mililitrów krwi do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać do krwi 100 mikrolitrów roztworu podstawowego EDTA 1, 0,1 molowego roztworu PBS EDTA, delikatnie wymieszać. Dodaj 500 mikrolitrów koktajlu izolacyjnego, 50 mikrolitrów na mililitr z zestawu do izolacji neutrofili do próbki krwi pełnej.Przed użyciem należy wirować kulki magnetyczne z zestawu do izolacji neutrofili przez 30 sekund w celu ponownego zawieszenia bardzo drobnych kulek magnetycznych. Dodaj 500 mikrolitrów kulek magnetycznych do próbki krwi i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Uzupełnij probówkę do 50 mililitrów roztworem podstawowym EDTA 2. Jest to jednomilimolowy roztwór PBS EDTA. Mieszać bardzo delikatnie, pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy.Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywkę, aby uniknąć późniejszego poruszenia rurki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie pipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Nie dotykaj strony probówki, która styka się z magnesem i unikaj gromadzenia się i zaburzeń czerwonych krwinek na dnie probówki. Pozostawić około 10 mililitrów zawiesiny czerwonych krwinek na dnie probówki. Wiruj kulki magnetyczne przez 30 sekund przed użyciem i dodaj 0,5 mililitra kulek magnetycznych do probówki zawierającej wzbogacone neutrofile.Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść rurkę w magnesie i zdejmij pokrywę, aby uniknąć późniejszego mieszania.Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową zawierającą neutrofile w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem.Pozostaw około pięciu mililitrów zawiesiny na dnie tubki. Aby zapewnić całkowite usunięcie kulek magnetycznych z mieszaniny komórek, umieść rurkę zawierającą wzbogacone komórki w magnesie. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odpipetować wzbogaconą zawiesinę komórkową, która teraz zawiera czyste neutrofile, do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Nie dotykaj tej strony rurki, która styka się z magnesem. Pozostaw około pięciu mililitrów zawiesiny na dnie tubki.Uzupełnij izolowane komórki jednym milimolowym roztworem podstawowym EDTA 2 do końcowej objętości około 41 mililitrów. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Podziel roztwór równo na dwie probówki po około 20 mililitrów w każdej probówce.Odwirować obie probówki w temperaturze 335G przez pięć minut. Podczas etapu wirowania wyjmij z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni zapas inhibitora MLi-2 o stężeniu 200 mikromolów i 1000X i pozostaw w temperaturze pokojowej do późniejszego użycia. Bezpośrednio po etapie wirowania i bez mieszania probówek odlać supernatant, nie naruszając osadów obojętnochłonnych.Ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetując komórki w górę iw dół cztery razy. Oznacz jedną probówkę DMSO, a drugą probówkę MLi-2. Do probówki oznaczonej DMSO dodać 10 mikrolitrów DMSO i dodać 10 mikrolitrów 200 mikromolowego roztworu podstawowego MLi-2, delikatnie pipetując w górę iw dół do wymieszania.Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszać delikatnie przez odwrócenie co 10 minut w okresie inkubacji. Podczas 30-minutowej kuracji inhibitorem kinazy LRRK2 należy wyjąć 0,5 molowy roztwór podstawowy DIFP z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni i umieścić w dygestorii na lodzie.Następnie przenieś jeden miligram na mililitr roztworu podstawowego Microcystin-LR z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni i umieść w temperaturze pokojowej do rozmrożenia. Rozmrozić podwielokrotność 0,25 mililitra buforu do lizy, wyjmując go z zamrażarki, pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić na lodzie w celu późniejszego użycia. Przygotuj jeden mililitr pożywki RPMI zawierającej jeden mikrolitr DMSO, nazwij to buforem do ponownego zawieszania DMSO.Przygotuj jeden mililitr pożywki RPMI zawierającej jeden mikrolitr 200 mikromolowych MLi-2 lub alternatywnego inhibitora kinazy LRRK2 i nazwij to buforem do reprodukcji MLi-2. Po 30-minutowym okresie inkubacji odwirować obie probówki w temperaturze 335G przez pięć minut, tak jak poprzednio. Ostrożnie wyrzucić supernatant z każdej probówki, nie naruszając osadu neutrofili.W przypadku probówki z oznaczeniem DMSO delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze bufora do ponownego zawieszania DMSO. A w przypadku probówki z oznaczeniem MLi-2 ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do zawieszania MLi-2. Przenieś zawieszone granulki komórek do odpowiednich probówek wirówkowych oznaczonych DMSO i MLi-2 i odwiruj obie probówki przy 335G przez trzy minuty.Na etapie wirowania należy przygotować bufor do lizy. W dygestorii ostrożnie dodaj 0,25 mikrolitra 0,5 molowego roztworu DIFP, a także 0,25 mikrolitra jednego miligrama na mililitr mikrocystyny-LR do 0,25 mililitra buforu do lizy. Wymieszaj i pozostaw na lodzie do użycia.Natychmiast po odwirowaniu ostrożnie i całkowicie usunąć cały supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu neutrofili i umieścić probówki na lodzie. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego DIFP i mikrocystynę-LR do każdej probówki. Używając pipety o pojemności od 100 do 200 mikrolitrów, ponownie zawieś granulki komórek, pipetując w górę iw dół około pięciu do 10 razy.Połóż komórki na lodzie przez 10 minut. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 20 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Przenieść DMSO i supernatant MLi-2 zawierający lizaty neutrofili do nowych probówek wirówkowych.Wyrzuć granulki gruzu. Lizaty neutrofili są teraz gotowe do użycia lub mogą być natychmiast zamrożone w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze minus 80 stopni do przyszłej analizy. Korzystając z danych z publicznie dostępnej bazy danych importu, wykres ten pokazuje, że obfitość białek LRRK2 i Rab10 jest szczególnie wysoka w neutrofilach i monocytach ludzkiej krwi obwodowej.Wyizolowanie ludzkich neutrofili krwi obwodowej za pomocą tej procedury powoduje wysoką zanieczyszczoną wydajność komórek. Tabela u góry pokazuje całkowitą liczbę komórek wyizolowanych z 10 mililitrów krwi obwodowej od trzech zdrowych dawców. Pokazano również czystość i żywotność wyizolowanych komórek, a także całkowitą wydajność lizatu białkowego.Po leczeniu inhibitorem kinazy LRRK2 MLi-2 i bez niego, neutrofile są poddawane lizie w obecności silnego inhibitora proteazy, DIFP. W przypadku ryciny B po lewej stronie, 10 mikrogramów ekstraktów z całych komórek na linię poddano multipleksowej ilościowej analizie immunoblot ze wskazanymi przeciwciałami. Rysunek po prawej, C, pokazuje znaczenie DIFP w zapobieganiu degradacji proteolitycznej, w szczególności dużego białka LRRK2.Dla porównania, wysokie stężenia samego PMSF są mniej skuteczne. Wykazano, że fosforylacja Rab10 kontrolowana przez LRRK2 jest znacznie zwiększona około trzykrotnie w neutrofilach krwi obwodowej pochodzących od pacjentów z dziedziczną chorobą Parkinsona z heterozygotyczną mutacją VPS35 D620N w porównaniu z kontrolą. Górny wykres przedstawia analizę immunoblot multipleksowy, a dolny jej kwantyfikację.Sugeruje to, że mutacja VPS35 D620N aktywuje ścieżkę aktywności kinazy LRRK2 za pomocą nieznanego jeszcze mechanizmu. Podsumowując, przedstawiamy łatwy i solidny test do pomiaru aktywności szlaku kinazy LRRK2 poprzez monitorowanie fosforylacji białka Rab, takiego jak Rab10, w ludzkich neutrofilach pochodzenia obwodowego, metoda ta pozwala nam ocenić aktywność szlaku LRRK2 i określić, w jaki sposób mutacje, stany chorobowe lub inhibitory modulują aktywność szlaku LRRK2.

human-peripheral-blood-neutrophil-isolation-for-interrogating

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Poznaj metodę izolacji neutrofili z ludzkiej krwi obwodowej do badania aktywności kinazy LRRK2 poprzez ocenę fosforylacji białka Rab10. Technika ta umożliwia identyfikację osób zwiększoną aktywnością szlaku LRRK2 związaną z dziedziczną chorobą Parkinsona.

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10 (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Przeglądaj więcej filmów