Name: Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzy mikrośrodowiska (MEMA) do badania wpływu zdefiniowanych warunków na fenotypy komórek nowotworowych. Ta technika pozwala szybko identyfikować kluczowe czynniki mikrośrodowiska.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w tym manuskrypcie była wspierana przez NIH Common Fund Library of Network Cellular Signatures (LINCS) grant HG008100 U54 (J.W.G., L.M.H., and J.E.K) oraz NCI Cancer Systems Biology Consortium (CSBC) U54 CA209988grant (J.W.G., L.M.H. i J.E.K.).

UWAGA: Przegląd całego procesu MEMA, w tym szacowany czas, jest przedstawiony na diagramie przepływu pokazanym w Rysunek 1. Protokół ten szczegółowo opisuje wytwarzanie MEMA w płytkach 8-dołkowych. Protokół może być dostosowany do innych tablic lub prowadnic.
1. Przygotowanie białkowych, rozcieńczalników i barwiących
<ol>
	<li>Zrównoważyć fiolki z ECM, ligandami i cytokinami do temperatury pokojowej (RT) i krótko odwirować. Dodać odpowiednią objętość odpowiedniego bufora RT, jak wskazano w karcie charakterystyki produktu. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężeń zapasów. 
	nuta: Pełny wykaz ligandów i ECM wraz z ich stężeniami podstawowymi i końcowymi znajduje się w tabelach 1 i 2. Zarówno ligandy, jak i ECM są zwykle stosowane w najwyższym stężeniu z zakresu zalecanego przez producenta, który wywołuje efekt biologiczny w standardowych 2-dniowych testach hodowli. Z białkami należy obchodzić się delikatnie i w komorach bezpieczeństwa biologicznego pod przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
	<li>Inkubować fiolki, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Nie wiruj białek, ponieważ może to spowodować ich denaturację.</li>
	<li>Podwielokrotności białek do długotrwałego przechowywania, tak aby wszystkie podwielokrotności były jednorazowego użytku, aby uniknąć degradacji przy powtarzających się cyklach zamrażania/rozmrażania. Przechowywać liofilizowane białka w temperaturze -80 °C (o ile nie określono inaczej) do czasu, gdy będą potrzebne. Należy pamiętać o zebraniu wszystkich metadanych do wykorzystania w przyszłości, takich jak: (i) nazwa białka, (ii) data przygotowania, (iii) numer partii/partii, (iv) dostawca, (v) numer katalogowy, (vi) stężenie, (vii) objętość oraz (viii) osoba przygotowująca.</li>
	<li>Przygotować bufor rozcieńczalnika zawierający 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 i wysterylizować filtrem. Utrzymuj ten bufor w sterylnej pozycji i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować bufor barwiący zawierający 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2 i 0,02% NaN3 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płyty źródłowej ECM
<ol>
	<li>Usunąć podany zapas białek ECM do wydrukowania i rozmrozić na lodzie. Zapisz wszystkie numery partii do śledzenia metadanych.</li>
	<li>Delikatnie strzepnij probówki z rozmrożonymi białkami, aby zapewnić prawidłowe ponowne zawieszenie i odwiruj w wirówce.</li>
	<li>Wykonaj mieszaniny drukarskie ECM (EPM) i fluorescencyjny reflektor do użycia przez robota do obsługi cieczy, który utworzy losowe 384-dołkowe płytki źródłowe. 
	UWAGA: 384-dołkowe płytki źródłowe będą używane przez drukarkę z matrycą stykową do tworzenia drukowanych tablic w płytkach 8-dołkowych.
	<ol>
		<li>Oznaczyć probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdego EPM i powiernika.</li>
		<li>Przygotować każdą EPM, łącząc 125 μl buforu rozcieńczającego (patrz krok 1.4) z odpowiednią objętością podstawowego ECM i doprowadzić mieszaninę do całkowitej objętości 250 μl za pomocą PBS. Końcowe stężenia w każdej probówce EPM to 1x białko ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerolu i 100 mM Tris.</li>
		<li>Przygotować fluorescencyjny środek dowodowy, rozpuszczając go w odpowiednim buforze określonym przez producenta i przenieść 250 μl do oznakowanej probówki referencyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Tworzenie płyty źródłowej za pomocą urządzenia do obsługi cieczy
<ol>
	<li>Zaprojektuj 384-dołkowy układ płytek, który losowo wybiera pozycje modułów ECM i jest zoptymalizowany pod kątem używanej głowicy pinowej drukarki matrycowej. Zaprojektuj rozmieszczenie powiernika tak, aby został wydrukowany w wierszu 1, kolumnie 1 w pozycji każdego dołka, aby pomóc w orientacji tablicy. 
	nuta: W celu zapewnienia wiarygodnych danych stosuje się łącznie 14−15 powtórzeń każdego ECM. Uwzględnij dodatkowe powtórzenia kolagenu lub innego ECM, który zapewnia solidne przywiązanie do oceny jednorodności wiązania. Układ może wymagać wykorzystania wielu płytek 384-dołkowych w zależności od liczby interesujących ECM.</li>
	<li>Przenieść probówki EPM do urządzenia do obsługi cieczy, utrzymując je w temperaturze 4 °C za pomocą chłodzonego stojaka na probówki lub za pomocą robota do obsługi cieczy umieszczonego w chłodni</li>.
	<li>Korzystając z oprogramowania osoby zajmującej się cieczą, uruchom program, aby przenieść 15 μl każdego EPM i powiernika do wcześniej wyznaczonych dołków w 384-dołkowej płycie źródłowej.</li>
	<li>Pipetuj PBS do nieużywanych studzienek, aby zwiększyć wilgotność i zabezpieczyć przed wysuszeniem podczas procesu drukowania. 
	nuta: Zobacz Rysunek 2 dla przykładu zestawu płytek źródłowych 384-dołkowych, który jest zoptymalizowany pod kątem głowicy 4 x 7 pin i zawiera blok kolagenu I oraz PBS.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę (płyty) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do drukowania.</li>
</ol>
4. Drukowanie MEMA za pomocą robota drukującego tablicę
UWAGA: Poniższa część protokołu szczegółowo opisuje przygotowanie i użycie MEMA do zbadania wpływu różnych białek mikrośrodowiska na wzrost i proliferację komórek MCF7. Jednak protokół można łatwo dostosować do wykorzystania różnych ligandów, ECM i komórek do badania innych linii komórkowych i punktów końcowych będących przedmiotem zainteresowania.
<ol>
	<li>Za pomocą drukarki dotykowej drukuj EPM i punkty odniesienia na płytkach 8-dołkowych. Drukuj wiele powtórzeń każdego warunku ECM, aby zapewnić odtwarzalność. 
	UWAGA: Do drukowania można używać innych formatów płyt lub slajdów, ale może być wymagana optymalizacja bufora w celu uzyskania optymalnego tworzenia plamki.
	<ol>
		<li>Wydrukuj ECM dla MEMA za pomocą pinów o średnicy 350 μm ułożonych w konfiguracji głowicy drukującej 4 x 7. Wydrukuj tablice na płytkach 8-dołkowych jako 20 kolumn na 35 rzędów, co daje w sumie ~700 miejsc. Większe matryce są możliwe w tych płytkach, ale wiążą się z kompromisem w postaci zwiększonych efektów krawędziowych zarówno w wiązaniu komórek, jak i barwieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wydrukowaniu należy przechowywać płytki w eksykatorze przez co najmniej 3 dni przed użyciem.</li>
</ol>
5. Tworzenie płytek do leczenia ligandami
<ol>
	<li>Zaprojektuj 96-dołkowy układ płytki, w tym ligandy będące przedmiotem zainteresowania. Aby ułatwić obróbkę wielu płytek MEMA jednocześnie, zaprojektuj tę płytkę z odstępami, które pozwalają na użycie wielokanałowej pipety z 4 rozstawionymi końcówkami do przenoszenia cieczy między studzienkami 8-dołkowych MEMA a płytką 96-dołkową. 
	nuta: W tym protokole wykorzystuje się pełny zestaw ligandów wymienionych w tabeli 2.</li>
	<li>Rozmrozić ligandy na lodzie. Krótko przesuń i odkręć każdą rurkę.</li>
	<li>Rozcieńczyć ligandy do 200-krotnego zapasu roboczego przy użyciu buforu zalecanego przez producenta (zwykle PBS).</li>
	<li>Odpipetować 10 μl każdego 200-krotnego wywaru ligandowego do odpowiedniego dołka w 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Uszczelniać i przechowywać płyty w temperaturze -20 °C. 
	nuta: Twórz płytki do obróbki ligandów w partiach, przechwytując wszystkie metadane do dalszej analizy.</li>
</ol>
6. Hodowla komórek na MEMA
<ol>
	<li>Blokować MEMA przez 20 minut za pomocą 2 ml na studzienkę niepowodującego zanieczyszczeń buforu blokującego zawierającego 1% niepowodującego zanieczyszczeń środka blokującego (tabela materiałów) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O).</li>
	<li>Zasysać bufor blokujący i potrójne płukanie studzienek za pomocą PBS. Aby zapobiec wysuszeniu, pozostaw ostateczną objętość PBS w studzienkach, aż będzie gotowa do posiewu komórek. 
	nuta: Niezwykle pomocne jest posiadanie dwóch pracowników laboratoryjnych do etapów hodowli komórkowych w MEMA. Jeden pracownik stołowy może wykonywać kroki aspiracji, podczas gdy drugi wykonuje kroki dodawania. Zaleca się stosowanie pipety wielokanałowej o pojemności 1 ml z końcówkami rozmieszczonymi tak, aby pasowały do płytki 8-dołkowej do pipetowania oraz rozdzielacza Y z dwiema pipetami Pasteura do zasysania wielu studzienek jednocześnie.</li>
	<li>Wysiew 2 x 105 komórek MCF7 na studzienkę w 2 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). 
	nuta: Przed pełnym eksperymentem MEMA należy przeprowadzić eksperyment miareczkowania komórek, aby zoptymalizować liczbę komórek w taki sposób, aby plamki MEMA miały wysoką liczbę komórek (ale nie były zlewane) pod koniec pożądanego czasu trwania eksperymentu.</li>
	<li>Po 2−18 godzinach adhezji odessać pożywkę i zastąpić 2 ml pożywki o zredukowanym wzroście (DMEM z 0,1% FBS). 
	nuta: Zmniejszona surowica (np. 0,1% FBS) lub stany zubożone w czynnik wzrostu mogą być stosowane w tym czasie w celu wyizolowania stymulującego wpływu określonych ligandów.</li>
	<li>Rozmrozić płytkę do leczenia ligandem na lodzie. Odwirować rozmrożoną płytkę o masie 200 x g przez 1 min.</li>
	<li>Przenieść 200 μl pożywki z każdej studzienki na płytce hodowlanej do odpowiedniego dołka na płytce zabiegowej. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać objętość liganda z pożywką i przenieść tę mieszaninę z powrotem do odpowiedniego dołka na płytce MEMA.</li>
	<li>Lekko kołysać ręcznie i włożyć płytki MEMA z powrotem do inkubatora. Posiew na czas trwania doświadczenia w obecności kombinacji ligand/ECM w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	nuta: Typowy eksperyment MEMA trwa 72 godziny; Dłuższe eksperymenty mogą wymagać wymiany pożywki i ponownego traktowania ligandem.</li>
	<li>Pulsacyjne dołki MEMA po 71 godzinach ze 100x 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) dla końcowego stężenia 10 μM. Inkubować w warunkach doświadczalnych z EdU przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	nuta: W tym czasie można również zastosować inne zabiegi z żywymi komórkami.</li>
</ol>
7. Naprawianie i barwienie MEMA
<ol>
	<li>Po 72 godzinach i wszelkich zabiegach z żywymi komórkami, odessać studzienki. Utrwalić MEMA w 2 ml na studzienkę 2% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odsysać PFA. Przepuszczać 2 ml na studzienkę 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 15 min.</li>
	<li>Odessać niejonowy środek powierzchniowo czynny i przemyć 2 ml na studzienkę PBS. Zasysać PBS. Przemyć 2 ml PBS z 0,05% polisorbatem 20 (PBS-T). 
	nuta: Powierzchnia MEMA jest hydrofobowa, a nieumycie PBS-T przed inkubacją barwienia i przeciwciał spowoduje powstanie pustych przestrzeni w studzienkach podczas etapów inkubacji i spowoduje powstanie artefaktów barwiących.</li>
	<li>Ssać PBS-T. Dodaj odczynniki do reakcji wykrywania EdU. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc się i chroniąc przed światłem. Po 1 godzinie inkubacji przeprowadzić reakcję hartowania z dostarczonym komercyjnym buforem do gaszenia. 
	nuta: Etapy wykrywania i barwienia EdU/przeciwciał można przeprowadzić w 1,5 ml na studzienkę w celu obniżenia kosztów.</li>
	<li>Odessać bufor hartowniczy i przemyć PBS-T przed inkubacją z barwnikami lub przeciwciałami.</li>
	<li>Inkubować studzienki MEMA z przeciwciałami przeciwko histonowi H3K9me3 (1:1000) i fibrylarynie (1:400) w buforze barwiącym zawierającym 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1 mM MgCl2 i 0,02% NaN3 przez noc w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Wykonać miareczkowanie przeciwciał w celu określenia optymalnych stężeń przed użyciem ich w pełnym zestawie MEMA.</li>
	<li>Po inkubacji przeciwciał pierwotnych lub barwienia przemyć studzienki 2x PBS i raz PBS-T.</li>
	<li>Dodaj przeciwciała drugorzędowe (IgG przeciwko myszemu osła i IgG przeciwko królikowi, oba 1:300) i 0,5 μg / ml 4′-6-diamidyn‐2-fenyloindolu (DAPI). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyj studzienki 2x po 2 ml na studzienkę PBS, pozostawiając je w końcowym 2 ml PBS.</li>
	<li>Przystąpić do obrazowania lub przechowywać barwione MEMA do późniejszego obrazowania w PBS w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
8. Obrazowanie MEMA
<ol>
	<li>Obraz MEMA na zautomatyzowanym systemie obrazowania z odpowiednimi kanałami detekcji fluorescencyjnej.</li>
	<li>Wyprowadzanie wynikowych danych obrazu do systemu zarządzania obrazami. Podziel komórki na segmenty i oblicz poziomy intensywności za pomocą CellProfiler8.</li>
</ol>
9. Analiza danych
UWAGA: Analiza danych składa się z normalizacji, korekty zmienności i podsumowania surowych danych pochodzących z CellProfiler. W tym przypadku środowisko R z kodem niestandardowym jest używane do wykonania wszystkich kroków. Jednak każde środowisko statystyczne lub oprogramowanie może być wykorzystane do wykonania równoważnych działań. Przykład niestandardowego kodu open source dla środowiska R do analizy jest dostępny pod adresem: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
<ol>
	<li>Wstępne przetwarzanie i normalizacja podzielonych na segmenty danych obrazu.</li>
	<li>Określ liczbę komórek punktowych za pomocą jąder barwionych DAPI.</li>
	<li>Intensywność automatycznego bramkowania EdU w celu oznaczenia komórek jako EdU+. Zmierz proliferację przy użyciu proporcji komórek EdU+ w każdym miejscu.</li>
	<li>Mediana podsumowuje barwienia cytoplazmatyczne i pomiary morfologii jądrowej na poziomie plamki.</li>
	<li>Usuń normalizację niepożądanych zmian (RUV) na danych, aby poprawić jakość danych9. 
	nuta: To podejście jest stosowane do każdego sygnału intensywności i morfologii niezależnie jako macierz z tablicami wykorzystującymi wiersze i punkty jako kolumny, jak opisano wcześniej9.</li>
	<li>Zastosuj dwuwymiarową normalizację lessu do reszt znormalizowanych RUV, używając wiersza tablicy i kolumny tablicy jako zmiennych niezależnych, aby skorygować efekty przestrzenne lub związane z intensywnością.</li>
	<li>Po zakończeniu normalizacji mediana podsumowuje powtórzenia dla każdego warunku mikrośrodowiska w celu raportowania i dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>LaBarge, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).</li>
<li>Watson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-Mediated+Mechanisms+of+Resistance+to+HER2+Inhibitors+Differ+between+HER2%2B+Breast+Cancer+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes.</a> Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).</li>
<li>Ranga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+niche+microarrays+for+systems-level+analyses+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate.</a> Nature Communications. 5, 4324(2014).</li>
<li>Malta, D. F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+microarrays+to+study+inductive+signaling+for+endoderm+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification.</a> Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).</li>
<li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+structure%2C+function+and+compatibility+for+CellProfiler%3A+modular+high-throughput+image+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li>
<li>Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGagnon-Bartsch%2C+JA+%22University+of+California%2C+Berkeley%2C+Department+of+Statistics%2C+University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley</a>. , Report No. 820 (2013).</li>
<li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMERO%3A+flexible%2C+model-driven+data+management+for+experimental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).</li>
<li>Simian, M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+A+historical+perspective+of+thinking+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiated+state+of+normal+and+malignant+cells+or+how+to+define+a+%22normal%22+cell+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture.</a> International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).</li>
<li>Serban, M. A., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+extracellular+matrices%3A+solutions+for+the+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle.</a> Methods. 45 (1), 93-98 (2008).</li>
<li>Kaylan, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+lung+tumor+cell+drug+responses+as+a+function+of+matrix+context+and+genotype+using+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays.</a> Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).</li>
<li>Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Microenvironments+Impose+a+Continuum+of+Cellular+Responses+to+a+Single+Pathway-Targeted+Anti-cancer+Compound%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound.</a> Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie "wymiarowości" i kontekstu było czynnikiem motywującym do rozwoju systemów hodowli in vitro jako narzędzi do charakteryzowania komórek nowotworowych poprzez ich interakcję z mikrośrodowiskiem11, a zdolność systemów hodowli in vitro do naśladowania środowiska in vivo jest siłą napędową dążenia do ulepszenia tych systemów hodowli. Systemy in vitro pozostają jednak istotnymi narzędziami badań nad rakiem właśnie ze względu na ich zdolność do destylacji złożonej sytuacji in vivo do uproszczon...

Hodowla linii komórek rakowych na plastiku w dwuwymiarowych (2D) monowarstwach pozostaje jednym z głównych zadań dla badaczy raka. Jednak mikrośrodowisko jest coraz częściej rozpoznawane ze względu na jego zdolność do wpływania na fenotypy komórkowe. Wiadomo, że w przypadku raka mikrośrodowisko guza wpływa na wiele zachowań komórkowych, w tym wzrost, przeżycie, inwazję i odpowiedź na terapię1,2. Tradycyjne jednowarstwowe hodowle komórkowe zazwyczaj nie mają wpływu mikrośrodowiska, co doprowadziło do opracowania bardziej złożonych trójwymiarowych (3D) testów do hodowli komórek, w tym dostępnych na rynku oczyszczonych ekstraktów z błony podstawnej. Jednak te oczyszczone matryce są zazwyczaj skomplikowane w użyciu i cierpią z powodu problemów technicznych, takich jak zmienność partii3 i złożone kompozycje3. W rezultacie, przypisanie funkcji do określonych białek, które mogą mieć wpływ na fenotypy komórkowe, może być trudne3.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy technologię mikromacierzy mikrośrodowiska (MEMA), która redukuje mikrośrodowisko do prostych kombinacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i rozpuszczalnych białek czynnika wzrostu4,5. Platforma MEMA umożliwia identyfikację dominujących czynników mikrośrodowiskowych, które wpływają na zachowanie komórek. Korzystając z formatu tablicy, w jednym eksperymencie można oznaczyć tysiące kombinacji czynników mikrośrodowiska. Opisany tutaj MEMA bada ~2,500 różnych unikalnych warunków mikrośrodowiska. Białka ECM wydrukowane na płytkach studzienkowych tworzą poduszki wzrostu, na których można hodować komórki. Rozpuszczalne ligandy są dodawane do poszczególnych studzienek, tworząc unikalne mikrośrodowiska kombinatoryczne (ECM + ligand) w każdym innym miejscu, na które narażone są komórki. Komórki są hodowane przez kilka dni, a następnie utrwalane, barwione i obrazowane w celu oceny fenotypów komórkowych w wyniku ekspozycji na te specyficzne kombinacje mikrośrodowiska. Ponieważ mikrośrodowiska są prostymi kombinacjami, łatwo jest zidentyfikować białka, które napędzają główne zmiany fenotypowe w komórkach. MEMA zostały z powodzeniem wykorzystane do identyfikacji czynników, które wpływają na wiele fenotypów komórkowych, w tym tych, które wpływają na decyzje dotyczące losu komórek i odpowiedź na terapię4,5,6,7. Odpowiedzi te można zwalidować w prostych eksperymentach 2D, a następnie ocenić w warunkach, które pełniej oddają złożoność mikrośrodowiska guza. Platforma MEMA jest wysoce elastyczna do różnych typów komórek i punktów końcowych, pod warunkiem, że dostępne są dobre biomarkery fenotypowe.

<table><tbody><tr><td>Aushon 2470</td> System robota <td>Aushon BioSystems</td><td></td><td>Arrayer używany w protokole</td></tr><tr><td>Nikon HCA</td><td>System obrazowania o wysokiej zawartości firmy Nikon zaprojektowany w oparciu o mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti</td><td></td> Robot do obsługi cieczy BioTek Precision XS stosowany w protokole Roztwór buforowy chlorowodorku Trizma Sigma T2069 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kolliphor P338</td><td>BASF</td><td>50424591</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka mikromatrycowa, cylindryczna Thermo</td><td>Fisher</td><td>ab1055</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 8 dobrze naczynie</td><td>Thermo Fisher</td><td>267062</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 16%</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td> z<td>maską sodową</td> Sigma S2002 <td></td> H32713 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Fluorowe sondy molekularne Click-iTEdU Alexa C10357 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Promo Kine</td><td>PK-CA70740043</td><td></td></tr><tr><td>ALCAM</td><td>R & D Systems</td><td>656-AL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-20 (CDH20)</td><td>R & D Systems</td><td>5604-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-6 (CDH6)</td><td>R & D Systems</td><td>2715-CA</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Cadherin-8 (CDH8)</td><td>R & D Systems</td><td>188-C8</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CD44</td><td>R & D Systems</td><td>3660-CD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>CEACAM6</td><td>R & D Systems</td><td>3934-CM</td><td></td></tr><tr><td>ECM Kolagen I</td><td>Cultrex</td><td>3442-050-01</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kolagen typu II</td><td>Millipore</td><td>CC052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kolagen typu III</td><td>Milipory</td><td>CC054</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kolagen typu IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Kolagen typu V</td><td>Millipore</td><td>CC077</td><td>ECM</td></tr><tr><td>COL23A1</td><td>R & D Systems</td><td>4165-CL</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Desmoglein 2</td><td>R & D Systems</td><td>947-DM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>E-kadheryna (CDH1)</td><td>R & D Systems</td><td>648-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ECM1</td><td>R & D Systems</td><td>3937-EC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>R & D Systems</td><td>1918-FN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>GAP43</td><td>Abcam</td><td>ab114188</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-500K</td><td>R & D Systems</td><td>GLR002</td><td>ECM</td></tr><tr><td>HyA-50K</td><td>R & D Systems</td><td>GLR001</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R & D Systems</td><td>720-IC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L6274</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Laminin-5</td><td>Abcam</td><td>ab42326</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Lumican</td><td>R & D Systems</td><td>2846-LU</td><td>ECM</td></tr><tr><td>M-CAD (CDH15)</td><td>R & D Systems</td><td>4096-MC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Nidogen-1</td><td>R & D Systems</td><td>2570-ND</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteoadheryna/OSAD</td><td>R & D Systems</td><td>2884-AD</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Osteopontyna (SPP)</td><td>R & D Systems</td><td>1433-OP ECM</td><td></td></tr><tr><td>P-Kadheryna (CDH3)</td><td>R & D Systems</td><td>861-PC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>PECAM1</td><td>R & D Systems</td><td>ADP6</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Tenascin C</td><td>R & D Systems</td><td>3358-TC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>VCAM1</td><td>R & D Systems</td><td>ADP5</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Witronektyna</td><td>R & D Systems</td><td>2308-VN</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Biglycan</td><td>R & D Systems</td><td>2667-CM</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Decorin</td><td>R & D Systems</td><td>143-DE</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>R & D Systems</td><td>3548-F2</td><td>ECM</td></tr><tr><td>SPARC/osteonektyna</td><td>R & D Systems</td><td>941-SP</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Trombospondyna-1/2</td><td>R & D Systems</td><td>3074-TH</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Brevican</td><td>R & D Systems</td><td>4009-BC</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Elastyna</td><td>BioMatrix</td><td>5052</td><td>ECM</td></tr><tr><td>Fibrylina</td><td>Lynn Sakai Lab OHSU</td><td>NIE DOTYCZY</td><td>ECM</td></tr><tr><td>ANGPT2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>623-AN-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL1B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>201-LB-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL8</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>208-IL-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>291-G1-200</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNFRSF11B</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>185-OS</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>507-BP-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FLT3LG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>308-FK-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>275-GR-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>DLL4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1506-D4-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>HGF</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>294-HGN-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Wnt5a</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>645-WN-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CTGF</td><td>Life_Technologies_Own</td><td>PHG0286</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>LEP</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>398-LP-01M</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FGF2</td><td></td><td>Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FGF6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>238-F6</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>207-IL-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TGFB1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>246-LP-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>PDGFB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>220-BB-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>WNT10A</td><td>Genemed_Own</td><td>90009</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>PTN</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>252-PL-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>113-BP-100</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>314-BP-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNFSF11</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>390-TN-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CSF2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>215-GM-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP5</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>615-BMC-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>DLL1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1818-DL-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>296-HR-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>KNG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1569-PI-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>GPNMB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>2550-AC-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>350-NS-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL15</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>247-ILB-005</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TNF</td><td>RnD_ Systems_Own</td><td>210-TA-020</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGFBP3</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>675-B3-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>WNT3A</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>5036-WNP-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>PDGFAB</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>222-AB</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>AREG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>262-AR-100</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>JAG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1277-JG-050</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>BMP7</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>354-BP-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>TGFB2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>302-B2-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>VEGFA</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>293-VE-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IL6</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>206-IL-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>CXCL12</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>351-FS-010</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>NRG1</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>378-SM</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>IGFBP2</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>674-B2-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>SHH</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>1314-SH-025</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>FASLG</td><td>RnD_Systems_Own</td><td>126-FL-010</td><td>Ligand</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer

Zrozumienie wpływu mikrośrodowiska na fenotyp komórek jest trudnym problemem ze względu na złożoną mieszaninę zarówno rozpuszczalnych czynników wzrostu, jak i białek związanych z matrycą w mikrośrodowisku in vivo. Co więcej, łatwo dostępne odczynniki do modelowania mikrośrodowisk in vitro zazwyczaj wykorzystują złożone mieszaniny białek, które nie są w pełni zdefiniowane i podlegają zmienności między partiami. Platforma mikromacierzy mikrośrodowiskowych (MEMA) pozwala na ocenę tysięcy prostych kombinacji białek mikrośrodowiskowych pod kątem ich wpływu na fenotypy komórkowe w jednym teście. MEMA są przygotowywane w płytkach studzienkowych, co pozwala na dodanie pojedynczych ligandów do oddzielnych dołków zawierających zgrupowane białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Połączenie rozpuszczalnego liganda z każdym wydrukowanym ECM tworzy unikalną kombinację. Typowy test MEMA zawiera ponad 2500 unikalnych mikrośrodowisk kombinatorycznych, na które narażone są komórki w jednym teście. W ramach testu linię komórkową raka piersi MCF7 poszczepiono na platformie MEMA. Analiza tego testu zidentyfikowała czynniki, które zarówno wzmacniają, jak i hamują wzrost i proliferację tych komórek. Platforma MEMA jest bardzo elastyczna i może być rozszerzana o inne zagadnienia biologiczne poza badaniami nad rakiem.

Aby uprościć analizę wpływu mikrośrodowiska na wzrost i proliferację komórek oraz zidentyfikować warunki sprzyjające lub hamujące te procesy, linię komórkową raka piersi MCF7 wysiano na zestaw ośmiu 8-dołkowych MEMA zgodnie z opisem w protokole. W tym badaniu komórki poddano działaniu 48 różnych ECM i 57 różnych ligandów, co dało łącznie 2736 kombinatorycznych warunków mikrośrodowiskowych. Po 71 h hodowli komórki poddano pulsowaniu EdU, utrwaleniu, permeabilizacji oraz barwieniu DAPI, zastosowano reakcję detekcji EdU ora...

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Understanding the impact of the microenvironment on the phenotype of cells is a difficult problem due to the complex mixture of both soluble growth ...

Badanie mikrośrodowiska guza jest trudne ze względu na jego złożoność. Opracowaliśmy mikromacierze mikrośrodowiskowe składające się z prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych, które umożliwiają identyfikację głównych czynników wpływających na fenotypy komórek nowotworowych. Główną zaletą platformy MEMA jest to, że ponieważ wszystkie warunki mikrośrodowiskowe są zdefiniowane, łatwo jest zidentyfikować czynniki mikrośrodowiskowe, które wpływają na interesujące nas fenotypy.Platforma MEMA ma szerokie zastosowanie w innych systemach nienowotworowych, w tym w pierwotnych szczepach komórkowych i komórkach macierzystych. Istnieje wiele sztuczek i kroków inżynieryjnych, które opracowaliśmy, aby przyspieszyć pracę na mokrym stanowisku i uprościć protokół. Aby rozpocząć, użyj drukarki dotykowej, aby wydrukować mieszaninę wydruków matrycy zewnątrzkomórkowej w miejscach odniesienia na płytkach ośmiodołkowych.Użyj kołków o średnicy 350 mikrometrów ułożonych w konfiguracji głowicy drukującej cztery razy siedem, aby wydrukować matrycę zewnątrzkomórkową dla mikromacierzy mikrośrodowiska. Blok kolagenu jest drukowany na MEMA jako siatka. Studzienki wypełnione PBS zapewniają dodatkową wilgotność, aby zapobiec wysychaniu płytki źródłowej mieszanki do drukowania matrycy zewnątrzkomórkowej.Wydrukuj tablice na płytkach ośmiodołkowych jako 20 kolumn na 35 rzędów, co daje w sumie 700 miejsc. Po wydrukowaniu należy przechowywać płytki w eksykatorze przez co najmniej trzy dni przed użyciem. Po pierwsze, należy zaprojektować 96-dołkowy układ płytek z odstępami pozwalającymi na użycie pipety wielokanałowej z czterema rozstawionymi końcówkami, tak aby można było wykonać obróbkę wielu płytek MEMA jednocześnie.Następnie wyjmij ligandy z zamrażarki i rozmrozić w lodzie w okapie z przepływem laminarnym. Krótko przesuń i odkręć każdą rurkę. Użyj buforu zalecanego przez producenta, aby rozcieńczyć ligandy do 200-krotnego zapasu roboczego.Odpipetować 10 mikrolitrów każdego 200-krotnego zapasu liganda do odpowiedniego dołka w 96-dołkowej płytce. Użyj folii uszczelniającej, aby uszczelnić płytki i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Twórz płytki do obróbki ligandów w partiach i przechwytuj wszystkie metadane do dalszej analizy.Przed hodowlą komórek zablokuj MEMA dwoma mililitrami na studzienkę nieporostowego buforu blokującego na 20 minut. Użyj rozdzielacza Y z dwiema pipetami Pasteura, aby zassać bufor blokujący w wielu studzienkach jednocześnie, a następnie trzykrotnie umyj studzienki PBS. Aby zapobiec wysuszeniu, pozostaw ostateczną objętość PBS w studzienkach, aż będzie gotowa do powlekania komórek.Przed pełnym eksperymentem MEMA zoptymalizuj stężenie wysiewu komórek MCF7, wykonując eksperyment miareczkowania komórek. Idealne miejsce, jak pokazano tutaj, ma wystarczającą liczbę komórek do wyodrębnienia danych, ale nie na tyle, aby miejsce było nadmiernie zlewające się. W MEMA odessać pozostałe PBS i zasiać komórki MCF7 w ilości od 30 000 do 35 000 komórek na studzienkę w dwóch mililitrach podłoża wysiewającego.Umieść MEMA w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przyleganiu przez noc w inkubatorze odessać pożywkę i zastąpić dwoma mililitrami zredukowanej pożywki wzrostowej, aby wyizolować stymulujące działanie określonych ligandów. Następnie rozmrozić na lodzie wcześniej zamrożoną płytkę do leczenia ligandem.Odwirować rozmrożoną płytkę 200 razy g przez jedną minutę. Przenieść 200 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki na płytce hodowlanej MEMA do odpowiedniego dołka na płytce do traktowania ligandem. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać ligand z pożywką, a następnie przenieść tę mieszaninę z powrotem do odpowiedniego dołka na płytce hodowlanej MEMA.Lekko kołysz ręcznie i włóż płytki MEMA z powrotem do inkubatora, aby wyhodować kombinację ligand-ECM w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 71 godzinach dodać 100 razy EdU do studzienek MEMA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromolowych. Inkubuj go przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po końcowej inkubacji odessać studzienki. Utrwal MEMA w dwóch mililitrach na studzienkę 2% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać PFA ze studzienek.Przepuszczać z dwoma mililitrami na studzienkę 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 15 minut. Odessać środek powierzchniowo czynny, a następnie kolejno umyć studzienki dwoma mililitrami PBS i PBS-T. Następnie dodaj 1,5 mililitra odczynników do reakcji wykrywania EdU do każdej studzienki.Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc się i chroniąc przed światłem. Następnie wygasić reakcję za pomocą 1,5 mililitra komercyjnego bufora hartującego na studzienkę. Ponownie odessać i przemyć PBS-T przed inkubacją ze zoptymalizowanymi stężeniami barwników lub przeciwciał.Inkubować studzienki MEMA z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze barwiącym, kołysząc się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć studzienki PBS, a następnie PBS-T. Dodać przeciwciała drugorzędowe w 0,5 mikrograma na mililitr DAPI, rozcieńczone w buforze barwiącym.Inkubuj, kołysząc się przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj studzienki dwa razy dwoma mililitrami na studzienkę PBS i pozostaw je w ostatnich dwóch mililitrach PBS. Aby zobrazować barwiony MEMA, należy umieścić go na stoliku mikroskopowym zautomatyzowanego systemu obrazowania z odpowiednimi kanałami detekcji fluorescencyjnej.Wyprowadzanie wynikowych danych obrazu do systemu zarządzania obrazami. Segmentuj komórki i obliczaj poziomy intensywności za pomocą CellProfiler. W tym protokole profile cyklu komórkowego binowanych wartości intensywności DAPI w funkcji liczby komórek z jednej ośmiodołkowej płytki wskazują komórki w fazie cyklu komórkowego G1 i G2.Odpowiada to dwóm zawartościom nDNA w komórkach we wczesnej fazie wzrostu i czterem zawartościom nDNA w komórkach, które mają przejść mitozę. Przedstawiono wpływ mikrośrodowiska ligandów i ECM zarówno na liczbę komórek, jak i inkorporację EdU. Kolor czerwony oznacza wyższy numer komórki, a niebieski oznacza niższy numer komórki.Wiele efektów jest zależnych od ligandów, ponieważ stan ECM nie miał silnego wpływu na liczbę komórek ani dodatnią wartość EdU. Natagen 1 jest wyraźnym wyjątkiem, ponieważ obecność tej cząsteczki ECM hamuje wiązanie komórek i wzrost MCF7. Ligandy, takie jak FGF6 i neuregulina-1 alfa, zwiększają liczbę komórek i mają wysokie wskaźniki wbudowywania EdU, podczas gdy ligandy, takie jak amfiregulina i neuregulina-1 SMDF, hamują wiązanie komórek i wzrost komórek.Przykład komórek MCF7 rosnących w plamce MEMA traktowanej neureguliną-1 alfa wykazuje wysokie wskaźniki inkorporacji EdU, na co wskazują różowe jądra. Na tym obrazie zielona plama to maska komórki, a niebieska to DAPI. Ponieważ pełny eksperyment MEMA jest kosztowny, bardzo ważne jest, aby przed przeprowadzeniem pełnego eksperymentu wykonać kroki optymalizacyjne, takie jak miareczkowanie komórek i surowicy.Po zidentyfikowaniu interesujących warunków mikrośrodowiskowych za pomocą platformy MEMA, określone ligandy i białka macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być badane bardziej szczegółowo przy użyciu tradycyjnych systemów hodowli komórkowych 2D i 3D.

using-microarrays-to-interrogate-microenvironmental-impact-on

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Ten film opisuje technikę badania ekspresji białek w transfekowanych komórkach raka płuc transfekowanych miRNA za pomocą mikromacierzy przeciwciał do pomiaru ekspresji określonych genów. W przedstawionym protokole wykonujemy mikromacierz przeciwciał w celu identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Mikromacierz przeciwciał: technika badania ekspresji białek w komórkach raka płuc leczonych miRNA

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Poznaj metodę mikromacierzy mikrośrodowiska (MEMA) do badania wpływu zdefiniowanych warunków na fenotypy komórek nowotworowych. Ta technika pozwala szybko identyfikować kluczowe czynniki mikrośrodowiska.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Przeglądaj więcej filmów