Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Badanie mikrośrodowiska guza jest trudne ze względu na jego złożoność. Opracowaliśmy mikromacierze mikrośrodowiskowe składające się z prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych, które umożliwiają identyfikację głównych czynników wpływających na fenotypy komórek nowotworowych. Główną zaletą platformy MEMA jest to, że ponieważ wszystkie warunki mikrośrodowiskowe są zdefiniowane, łatwo jest zidentyfikować czynniki mikrośrodowiskowe, które wpływają na interesujące nas fenotypy.

Platforma MEMA ma szerokie zastosowanie w innych systemach nienowotworowych, w tym w pierwotnych szczepach komórkowych i komórkach macierzystych. Istnieje wiele sztuczek i kroków inżynieryjnych, które opracowaliśmy, aby przyspieszyć pracę na mokrym stanowisku i uprościć protokół. Aby rozpocząć, użyj drukarki dotykowej, aby wydrukować mieszaninę wydruków matrycy zewnątrzkomórkowej w miejscach odniesienia na płytkach ośmiodołkowych.

Użyj kołków o średnicy 350 mikrometrów ułożonych w konfiguracji głowicy drukującej cztery razy siedem, aby wydrukować matrycę zewnątrzkomórkową dla mikromacierzy mikrośrodowiska. Blok kolagenu jest drukowany na MEMA jako siatka. Studzienki wypełnione PBS zapewniają dodatkową wilgotność, aby zapobiec wysychaniu płytki źródłowej mieszanki do drukowania matrycy zewnątrzkomórkowej.

Wydrukuj tablice na płytkach ośmiodołkowych jako 20 kolumn na 35 rzędów, co daje w sumie 700 miejsc. Po wydrukowaniu należy przechowywać płytki w eksykatorze przez co najmniej trzy dni przed użyciem. Po pierwsze, należy zaprojektować 96-dołkowy układ płytek z odstępami pozwalającymi na użycie pipety wielokanałowej z czterema rozstawionymi końcówkami, tak aby można było wykonać obróbkę wielu płytek MEMA jednocześnie.

Następnie wyjmij ligandy z zamrażarki i rozmrozić w lodzie w okapie z przepływem laminarnym. Krótko przesuń i odkręć każdą rurkę. Użyj buforu zalecanego przez producenta, aby rozcieńczyć ligandy do 200-krotnego zapasu roboczego.

Odpipetować 10 mikrolitrów każdego 200-krotnego zapasu liganda do odpowiedniego dołka w 96-dołkowej płytce. Użyj folii uszczelniającej, aby uszczelnić płytki i przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Twórz płytki do obróbki ligandów w partiach i przechwytuj wszystkie metadane do dalszej analizy.

Przed hodowlą komórek zablokuj MEMA dwoma mililitrami na studzienkę nieporostowego buforu blokującego na 20 minut. Użyj rozdzielacza Y z dwiema pipetami Pasteura, aby zassać bufor blokujący w wielu studzienkach jednocześnie, a następnie trzykrotnie umyj studzienki PBS. Aby zapobiec wysuszeniu, pozostaw ostateczną objętość PBS w studzienkach, aż będzie gotowa do powlekania komórek.

Przed pełnym eksperymentem MEMA zoptymalizuj stężenie wysiewu komórek MCF7, wykonując eksperyment miareczkowania komórek. Idealne miejsce, jak pokazano tutaj, ma wystarczającą liczbę komórek do wyodrębnienia danych, ale nie na tyle, aby miejsce było nadmiernie zlewające się. W MEMA odessać pozostałe PBS i zasiać komórki MCF7 w ilości od 30 000 do 35 000 komórek na studzienkę w dwóch mililitrach podłoża wysiewającego.

Umieść MEMA w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po przyleganiu przez noc w inkubatorze odessać pożywkę i zastąpić dwoma mililitrami zredukowanej pożywki wzrostowej, aby wyizolować stymulujące działanie określonych ligandów. Następnie rozmrozić na lodzie wcześniej zamrożoną płytkę do leczenia ligandem.

Odwirować rozmrożoną płytkę 200 razy g przez jedną minutę. Przenieść 200 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki na płytce hodowlanej MEMA do odpowiedniego dołka na płytce do traktowania ligandem. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać ligand z pożywką, a następnie przenieść tę mieszaninę z powrotem do odpowiedniego dołka na płytce hodowlanej MEMA.

Lekko kołysz ręcznie i włóż płytki MEMA z powrotem do inkubatora, aby wyhodować kombinację ligand-ECM w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 71 godzinach dodać 100 razy EdU do studzienek MEMA, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromolowych. Inkubuj go przez kolejną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po końcowej inkubacji odessać studzienki. Utrwal MEMA w dwóch mililitrach na studzienkę 2% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać PFA ze studzienek.

Przepuszczać z dwoma mililitrami na studzienkę 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez 15 minut. Odessać środek powierzchniowo czynny, a następnie kolejno umyć studzienki dwoma mililitrami PBS i PBS-T. Następnie dodaj 1,5 mililitra odczynników do reakcji wykrywania EdU do każdej studzienki.

Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc się i chroniąc przed światłem. Następnie wygasić reakcję za pomocą 1,5 mililitra komercyjnego bufora hartującego na studzienkę. Ponownie odessać i przemyć PBS-T przed inkubacją ze zoptymalizowanymi stężeniami barwników lub przeciwciał.

Inkubować studzienki MEMA z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze barwiącym, kołysząc się w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć studzienki PBS, a następnie PBS-T. Dodać przeciwciała drugorzędowe w 0,5 mikrograma na mililitr DAPI, rozcieńczone w buforze barwiącym.

Inkubuj, kołysząc się przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj studzienki dwa razy dwoma mililitrami na studzienkę PBS i pozostaw je w ostatnich dwóch mililitrach PBS. Aby zobrazować barwiony MEMA, należy umieścić go na stoliku mikroskopowym zautomatyzowanego systemu obrazowania z odpowiednimi kanałami detekcji fluorescencyjnej.

Wyprowadzanie wynikowych danych obrazu do systemu zarządzania obrazami. Segmentuj komórki i obliczaj poziomy intensywności za pomocą CellProfiler. W tym protokole profile cyklu komórkowego binowanych wartości intensywności DAPI w funkcji liczby komórek z jednej ośmiodołkowej płytki wskazują komórki w fazie cyklu komórkowego G1 i G2.

Odpowiada to dwóm zawartościom nDNA w komórkach we wczesnej fazie wzrostu i czterem zawartościom nDNA w komórkach, które mają przejść mitozę. Przedstawiono wpływ mikrośrodowiska ligandów i ECM zarówno na liczbę komórek, jak i inkorporację EdU. Kolor czerwony oznacza wyższy numer komórki, a niebieski oznacza niższy numer komórki.

Wiele efektów jest zależnych od ligandów, ponieważ stan ECM nie miał silnego wpływu na liczbę komórek ani dodatnią wartość EdU. Natagen 1 jest wyraźnym wyjątkiem, ponieważ obecność tej cząsteczki ECM hamuje wiązanie komórek i wzrost MCF7. Ligandy, takie jak FGF6 i neuregulina-1 alfa, zwiększają liczbę komórek i mają wysokie wskaźniki wbudowywania EdU, podczas gdy ligandy, takie jak amfiregulina i neuregulina-1 SMDF, hamują wiązanie komórek i wzrost komórek.

Przykład komórek MCF7 rosnących w plamce MEMA traktowanej neureguliną-1 alfa wykazuje wysokie wskaźniki inkorporacji EdU, na co wskazują różowe jądra. Na tym obrazie zielona plama to maska komórki, a niebieska to DAPI. Ponieważ pełny eksperyment MEMA jest kosztowny, bardzo ważne jest, aby przed przeprowadzeniem pełnego eksperymentu wykonać kroki optymalizacyjne, takie jak miareczkowanie komórek i surowicy.

Po zidentyfikowaniu interesujących warunków mikrośrodowiskowych za pomocą platformy MEMA, określone ligandy i białka macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być badane bardziej szczegółowo przy użyciu tradycyjnych systemów hodowli komórkowych 2D i 3D.