Name: Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Naucz się produkcji i oczyszczania wektorów AAV o wysokiej czystości i wydajności przy użyciu komórek HEK. Ta metoda umożliwia uzyskanie specyficznej ekspresji genów w różnych typach komórek i tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.R. jest wspierany przez stypendium podoktoranckie Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO) (133722/1204517N) i potwierdza ciągłe wsparcie Fundacji Sercowo-Naczyniowej Kolumbii oraz Administracyjnego Departamentu Nauki, Technologii i Innowacji (Grant CT-FP44842-307-2016, kod projektu 656671250485). M.M. jest wspierany przez stypendium doktoranckie FWO (1S48018N). M.G.H. otrzymał wsparcie z grantu instytucjonalnego VIB oraz zewnętrznego wsparcia ze strony Fundacja Thierry'ego Latrana (SOD-VIP), Fundacja Badań nad Chorobą Alzheimera (SAO-FRA) (P#14006), FWO (Grant 1513616N) oraz Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERC) (Grant dla początkujących 281961 - AstroFunc; Grant na weryfikację słuszności koncepcji 713755 - AD-VIP). Autorzy dziękują Jeasonowi Haughtonowi za pomoc w hodowli myszy, Stephanie Castaldo za pomoc w wykonywaniu zastrzyków do żyły ogonowej oraz Caroline Eykens za dostarczenie obrazów transfekowanych komórek HEK293T. M.G.H. dziękuje Michaelowi Dunlopowi, Peterowi Hickmanowi i Deanowi Harrisonowi.

<ol><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li>
<li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li>
<li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus%3A+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li>
<li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+for+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li>
<li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus%3A+a+key+to+the+human+genome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus: a key to the human genome?</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li>
<li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+%28Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue%3A+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li>
<li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li>
<li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li>
<li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li>
<li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+cardiovascular+disease%3A+advances+in+vector+development%2C+targeting%2C+and+delivery+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+Vectors%3B+Advances+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17(2014).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+Targeting%2C+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+%28AAV%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li>
<li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19565899">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li>
<li>QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en</a> (2018).</li>
<li>QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf">http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf</a> (2008).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018).</li>
<li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL%2F6J+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li>
<li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+processing+of+poly%28ethylene+imine%29%2Fribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li>
<li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression%3A+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li>
<li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li>
<li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li>
<li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2%2C+4%2C+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li>
<li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj produkcja rekombinowanych wektorów AAV wykorzystuje materiały i sprzęt wspólny dla większości laboratoriów biologii molekularnej i zakładów hodowli komórkowych. Pozwala użytkownikowi na uzyskanie czystych, przedklinicznych wektorów AAV, które mogą być używane do celowania w wiele typów komórek i tkanek w szeregu zastosowań in vitro i in vivo . Jedną z największych zalet tego protokołu, w porównaniu z innymi (tj. oczyszczaniem opartym na CsCl), jest krótszy czas pracy. Gotowe do użycia wektory AAV są możliwe do uzyskania w ciągu maksymalnie 6 dni roboczych po wstępnej transfekcji HEK293T komórek.
Kilka czynników może negatywnie wpłynąć na ostateczny plon lub jakość wektora AAV. Słaba skuteczność transfekcji jest jedną z głównych przyczyn niskiej wydajności wirusa33. Głównym zaleceniem jest stosowanie komórek HEK293T, które nie zostały pasażowane więcej niż 20 razy i nie mają zbiegu komórek większego niż 90% w momencie transfekcji21. Ponadto duży wpływ na wyniki ma wybrana metoda transfekcji. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu PEI. PEI jest polimerem kationowym, który ma zdolność dostarczania egzogennego DNA do jądra komórkowego poprzez wytwarzanie kompleksów polimeru i kwasu nukleinowego, znanych jako polipleksy, które są pobierane przez komórkę i transportowane przez endosomy34. Transfekcja na bazie PEI jest łatwa i szybka do przeprowadzenia, w przeciwieństwie do innych powszechnie stosowanych metod, takich jak współstrącanie DNA z fosforanem wapnia35. Ponadto transfekcja oparta na PEI jest znacznie tańsza w porównaniu z innymi nowo wprowadzonymi metodami, takimi jak zastosowanie lipidów kationowych i transfekcja za pośrednictwem magnesu36.
Strategia oczyszczania odgrywa kluczową rolę w protokole. W porównaniu z innymi metodami, oczyszczanie na bazie jodiksanolu zwykle zawiera większy odsetek pustych cząstek wirusa (20%)20. Jest to do pewnego stopnia równoważone przez fakt, że oczyszczanie oparte na jodiksanolu rutynowo prowadzi do powstania preparatów wektorów AAV o stosunku cząstek do zakaźności mniejszym niż 100. Stanowi to znaczną poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi procedurami opartymi na CsCl, w przypadku których odnotowano znaczną utratę zakaźności cząstek37. Inną powszechną alternatywną metodą oczyszczania wektorów AAV jest oczyszczanie oparte na chromatografii. Jednak ta metoda ma główną wadę polegającą na tym, że dla każdego użytego kapsydu wektora wymagana jest określona kolumna: na przykład, podczas gdy AAV2 jest klasycznie izolowany przy użyciu kolumn heparyny, ta metodologia nie działa w przypadku AAV4 i AAV5, które nie mają miejsc wiążących heparynę na swoich kapsydach38. Biorąc pod uwagę, że oczyszczanie chromatograficzne jest również drogie, oczyszczanie na bazie jodiksanolu jest generalnie bardziej odpowiednie dla laboratoriów, które chcą produkować wysokiej jakości partie wektorów AAV na małą skalę 33,39,40. Jednak, aby zmaksymalizować ostateczny plon i czystość wektora, należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania gradientów jodiksanolu. Różne frakcje jodiksanolu należy przenieść do probówki do ultrawirówki za pomocą sterylnej pipety Pasteura, której końcówka dotyka ścianki probówki: jodiksanol należy usuwać z pipety powoli i w sposób ciągły. Ponieważ cząstki wektora gromadzą się w 40% warstwie jodu, należy zachować ostrożność, aby interfejsy gradientu nie mieszały się20. Na koniec frakcję zawierającą wektor należy odzyskać przez wprowadzenie igły ze stali nierdzewnej o grubości nie większej niż 20 G. Aby zmaksymalizować odzysk wektora, czysta frakcja powinna zostać pobrana w całości. Na tym etapie czas ma kluczowe znaczenie. Aby uniknąć pogorszenia czystości preparatu, konieczne jest przerwanie zbierania przed zebraniem innych (zanieczyszczających) faz gradientu.
Różnice w uzyskanym mianie wektora można również przypisać wewnętrznej zdolności wektora do wytwarzania upakowanych cząstek. Porównanie różnych serotypów AAV wykazało, że niektóre wektory AAV są trudniejsze do wytworzenia przy wyższym mianie niż inne (np. AAV2)41. Wytrącanie się wektora na etapie odsalania może być możliwą przyczyną niższego miana i można mu łatwo zapobiec, unikając nadmiernego zagęszczenia33. Co więcej, możliwe jest również, że skuteczność oczyszczania opartego na gradionym jodiksanolu nieznacznie różni się między serotypami, a zatem można zaobserwować rozbieżności w mianie uzyskanym dla różnych serotypów41.
Na koniec należy podkreślić, że chociaż qPCR jest bardzo dokładną metodą kwantyfikacji DNA, można zaobserwować pewną nieodłączną zmienność w tej technice. Dokładność miareczkowania zależy przede wszystkim od precyzyjnego pipetowania i prawidłowego wirowania wszystkich roztworów. Aby zagwarantować najdokładniejszy odczyt miana, qPCR można niezależnie powtórzyć, a uzyskane wartości uśrednić. Wybór starterów przedstawionych w tym protokole opiera się na sekwencji promotora CBA znajdującego się w plazmidzie pTransgene używanym w naszym laboratorium. Promotor CBA jest silnym syntetycznym promotorem, który jest szeroko stosowany w polu wektorowym do kierowania ekspresją w wielu typach komórek. Zawiera wiele elementów, w tym wczesny element wzmacniający wirusa cytomegalii (CMV); promotor, pierwszy ekson i pierwszy intron genu CBA; i akceptor splicingu genu β-globiny królika. Jednak startery mogą być zaprojektowane dla praktycznie każdego elementu znajdującego się w kasecie ekspresji (w tym promotora, transgenu i elementów regulatorowych). Możliwe jest również porównanie miana w różnych partiach, pod warunkiem, że startery są używane w odniesieniu do regionów wspólnych dla danych wektorów.
Podsumowując, protokół ten może być wykorzystany do produkcji wektorów AAV z różnymi kapsydami, konfiguracjami genomu, typami promotorów i ładunkami transgenowymi. Umożliwi to użytkownikom łatwe dostosowanie końcowej charakterystyki ich wektorów do jak najlepszych potrzeb eksperymentalnych. W przykładzie przedstawionym w reprezentatywnych wynikach, użycie PHP. Kapsyd B, który skutecznie przenika przez barierę krew-mózg, dał bardzo wydajną ekspresję genu w OUN po wstrzyknięciu żyły ogonowej32. Ogólnoustrojowe podawanie wektorów penetrujących OUN ma znaczne zalety pod względem możliwych skutków ubocznych 2,17,32. Możliwą alternatywą dla iniekcji obwodowych, przy jednoczesnym unikaniu zastrzeżeń związanych z technikami inwazyjnymi, jest podanie dooponowe, które polega na dostarczeniu wektora AAV do płynu mózgowo-rdzeniowego. Udowodniono, że ta droga dostarczania jest skuteczna, wykazując szeroką ekspresję transgenu w OUN, mniej efektów poza celem w narządach obwodowych i niski poziom odpowiedzi immunologicznej42. Jednak zastrzyki dooponowe są znacznie trudniejsze, ponieważ wymagają wyższych umiejętności technicznych niż iniekcje do żyły ogonowej.
Dalszy rozwój kapsydu w celu udoskonalenia tej technologii będzie napędzany możliwościami wykorzystania wektora AAV w zastosowaniach terapii genowej. Takie podejścia oferują atrakcyjne możliwości leczenia obecnie nieuleczalnych chorób OUN, takich jak stwardnienie zanikowe boczne, choroba Charcota-Mariego-Tootha, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera18.

W ciągu ostatnich 30 lat, AAV typu dzikiego zostały zaprojektowane do tworzenia rekombinowanych wektorów AAV, które okazały się wyjątkowo użytecznymi narzędziami do transferu genów do CNS1,2,3,4,5,6 i podejścia do terapii genowej chorób (w tym zatwierdzone przez FDA i EMA) terapie)4,7. Ich przydatność do stosowania w OUN w dużej mierze wynika z ich zdolności do infekowania niedzielących się, postmitotycznych komórek, zwykle znajdujących się w klasie CNS<sup="xref">8. Jednak wektory oparte na AAV mają również tę zaletę, że umożliwiają długotrwałą ekspresję dowolnego terapeutycznego transgenu 4,9, wywołując jednocześnie łagodniejszą odpowiedź immunologiczną w porównaniu z innymi wektorami wirusowymi7,8,10,11,12.
Głównymi elementami każdego wektora AAV są genom i kapsyd. AAV typu dzikiego to jednoniciowe (ss) wirusy DNA o genomie około 5 kilozasad (kb)13. W celu wytworzenia rekombinowanych wektorów AAV, geny rep i cap (niezbędne do replikacji genomu i złożenia kapsydu wirusa) są usuwane z genomu AAV typu dzikiego i dostarczane w trans, pozostawiając miejsce na kasetę ekspresyjną zawierającą transgene14,15. Odwrócone końcowe sekwencje powtórzeń (ITR) oryginalnego genomu wirusa są jedynymi zachowanymi elementami w wektorze AAV, ponieważ są one niezbędne do replikacji i pakowania3,10,14. Wektory AAV mogą być modyfikowane w celu zwiększenia ekspresji transgenu; mutacja w jednym z ITR prowadzi do powstania pętli spinki do włosów, która skutecznie umożliwia generowanie komplementarnej nici DNA3,7,15. Główną zaletą tej konfiguracji, określanej jako genom samokomplementarny (sc), jest to, że omija ona potrzebę syntezy drugiej nici typowej dla konwencjonalnego cyklu życia AAV, znacznie zwiększając szybkość i poziomy ekspresji transgenu1. Niemniej jednak użycie genomu scAAV zmniejsza pojemność ładunkową wektora do około 2,4 kb. Obejmuje to sekwencje transgenów, a także wszelkie sekwencje regulatorowe, takie jak promotory lub miejsca wiązania mikroRNA, w celu ograniczenia ekspresji do określonych typów komórek16.
Kapsyd AAV określa interakcję wektor-komórka gospodarza i nadaje stopień tropizmu komórkowego lub tkankowego dla serotypu AAV, który może być również wykorzystany do ograniczenia ekspresji transgenu do określonych lokalizacji. Kilka serotypów AAV występuje w naturze, podczas gdy inne zostały wytworzone w laboratoriach za pomocą metod rekombinowanych (tj. PHP. Ponadto niektóre kapsydy nadają również inne przydatne cechy, takie jak zdolność do przekraczania bariery krew-mózg, co skutkuje dostarczaniem transgenów przez OUN po podaniu ogólnoustrojowym. Zostało to pokazane dla AAV9, a także dla niedawno opisanego PHP. B capsid17. W związku z tym serotypy te okazują się być szczególnie istotne dla nowych podejść do terapii genowej chorób neurodegeneracyjnych1,17,18.
Celem tego protokołu jest opisanie opłacalnej metody produkcji na małą skalę wektorów AAV o wysokim mianie i czystości. Chociaż przedstawione tutaj wyniki korzystają z PHP. Kapsyd B i kaseta ekspresyjna scAAV, protokół jest odpowiedni do produkcji kilku serotypów wektorów AAV i konfiguracji genomu, co pozwala na maksymalną elastyczność eksperymentalną. Jednak plon wektora i końcowa czystość mogą się różnić w zależności od wybranego serotypu.
Sam protokół jest wariantem klasycznej metody tri-transfekcji do produkcji wektorów wirusowych i zawiera użycie gradientu jodiksanolu do oczyszczania wektorów, który, w porównaniu do klasycznego zastosowania gradientów chlorku cezu (CsCl), został zgłoszony do wytwarzania wektorów AAV o wyższej czystości w bardziej efektywny czasowo sposób19,20,21.
Etapy transfekcji, oczyszczania i zagęszczania są przeznaczone do przeprowadzenia zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną (GLP) w laboratorium kultur tkankowych przystosowanym do pracy z wektorami wirusowymi. Każde zadanie musi być wykonane zgodnie z odpowiednimi lokalnymi i krajowymi przepisami dotyczącymi produkcji i stosowania wektorów wirusowych. Prace należy wykonywać pod okapem z przepływem laminarnym i w sterylnych warunkach. Wewnątrz placówki dla nosicieli zaleca się noszenie fartucha laboratoryjnego, oprócz zwykłego fartucha laboratoryjnego do hodowli tkankowych. Ponadto przez cały czas należy nosić podwójną parę rękawiczek, a także plastikowe kalosze.
Zanim rozpoczniesz produkcję wektorów, upewnij się, że wszystkie niezbędne urządzenia i plazmidy są dostępne. 1) Plazmid pCapsid zawiera gen rep, który koduje cztery niestrukturalne białka niezbędne do replikacji, a mianowicie Rep78, Rep68, Rep52 i Rep40, oraz gen cap, który koduje trzy strukturalne białka kapsydu, mianowicie VP1, VP2 i VP3. 2) Plazmid pHelper zawiera geny E4, E2A i VA adenowirusa, które ułatwiają produkcję AAV w komórkach HEK293T. 3) plazmid pTransgene zawiera kasetę ekspresji transgenu, otoczoną dwoma ITR. Plazmidy te mogą być syntetyzowane de novo w laboratorium przy użyciu sekwencji dostępnych online22. W przypadku plazmidów wytworzonych de novo, zwłaszcza tych zawierających nowe transgeny, wymagane jest sekwencjonowanie, aby upewnić się, że transgen i ITR są prawidłowe. Alternatywnie, gotowe plazmidy można uzyskać bezpośrednio za pośrednictwem internetowych repozytoriów plazmidów. W razie potrzeby plazmidy mogą być amplifikowane i oczyszczane za pomocą standardowych zestawów, zgodnie z instrukcjami producenta23.
Miano i czystość wektora mogą negatywnie wpływać na zdolność wektora do transdukcji. Dostarczane są dodatkowe protokoły do oceny jakości wyprodukowanego wektora. Końcowe wektory będą przydatne do badań funkcji komórek OUN zarówno w zastosowaniach in vitro, jak i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Plasmid production</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTransgene plasmid</td><td>De novo design lub uzyskany z repozytorium plazmidu</td><td>Nie dotyczy</td><td>Więcej informacji można znaleźć w kroku 1 głównego protokołu</td></tr><tr><td>pCapsid</td><td>De novo lub uzyskany z repozytorium plazmidu</td><td>Nie dotyczy</td><td>Więcej informacji można znaleźć w kroku 1 głównego protokołu</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Plus maxi</td><td>zestaw Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV Helper-Free System</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla i transfekcja komórkowa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM), wysoka glukoza, bez glutaminy</td><td>Technologie życia</td><td>11960-044</td><td>Suplement DMEM z FBS (1% lub 10% v/v) i GlutaMAX 200 mM (1% v/v), a następnie filtr wysterylizuj pożywkę za pomocą 0,22 &mikro; m filtr</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 mM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelkowy system filtrów próżniowych Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) bez wapnia i magnezu</td><td>GIBCO</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T komórek</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>CRL3216</td><td>Po otrzymaniu rozmrozić komórki i hodowlę zgodnie z opisem w protokole. Po minimalnej liczbie przejść zamroź subfrakcję na przyszłość w porcjach.&nbsp; Zawsze używaj komórek poniżej przejścia numer 20. Gdy wyhodowane komórki zostaną pasażowane więcej niż 20 razy, należy ponownie uruchomić hodowlę z przechowywanych podwielokrotności</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>Szalki hodowlane o średnicy 15 cm</td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>PEI w postaci proszku rozpuszcza się w 1 &mikro; g/&mikro; L w wodzie dejonizowanej (ddwoda) o pH = 2 (użyć HCl). Przygotować w zlewce i mieszać przez 2-3 godziny. Po rozpuszczeniu doprowadzić pH z powrotem do 7 za pomocą NaOH. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać zawieszony roztwór podstawowy w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności PEI mogą 
 być wielokrotnie zamrażane/rozmrażane.</td></tr><tr><td>Roztwór Virkon</td><td>Fisher Scientific NC9821357</td><td></td><td>Zdezynfekuj każdy materiał, który miał kontakt ze zmontowanymi cząstkami wektorowymi, roztworem Virkon</td></tr><tr><td>Fartuchy z długim rękawem Mutexi</td><td>Fisher Scientific 11735423</td><td></td><td>Noś fartuch na zwykłym fartuchu laboratoryjnym</td></tr><tr><td>Fisherbrand maksymalna ochrona jednorazowe ochraniacze na buty</td><td>Fisher Scientific</td><td>15401952</td><td></td></tr><tr><td>AAV Oczyszczanie i odsalanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiprep gradient gęstości średni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep to 60% (w/v) roztwór jodiksanolu w wodzie (sterylny). OSTROŻNOŚĆ. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z627992</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>OptiSeal Rurki polipropylenowe</td><td>Beckman</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza (250 U/&micro; L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Dostarczany jako gotowe do użycia</td></tr><tr><td>rozwiązanie Filtr strzykawkowy Acrodisc Strzykawka</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix (5 ml)</td><td>Braun</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>igła strzykawkowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>Igła strzykawkowa ze stali nierdzewnej 316, do pipetowania 90&deg; końcówka 16, L 4 in. Określany w tekście jako igła z końcem</td></tr>, <tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>Sterylna woda wolna od endotoksyn. Określany jako "Woda ultraczysta"Filtr</td></tr> <tr><td>odśrodkowy Amicon ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td>Filtry te koncentrują produkt końcowy poprzez zbieranie cząstek wektorowych w kolejnych etapach wirowania</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>24040032</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny. Rozcieńczyć w sterylnym PBS do użycia w stężeniu 0,01% (v/v)</td></tr><tr><td>Sterylne probówki do mikrowirówek Fisherbrand z nakrętkami (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>Użyj probówek z listwą do łatwej obsługi</td></tr><tr><td>AAV Miareczkowanie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>enzym restrykcyjny: StuI (10 U/&micro; L)</td><td>Promega</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNAza I (1 U/&mikro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115852001</td><td>Rozpuścić w ultraczystej wodzie i stosować w końcowym stężeniu 10 mg/ml. Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 & deg; Paski</td></tr><tr><td>tubowe C EasyStrip Plus (z dołączonymi nasadkami)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf mikroprobówka 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Multiwell Plates, 96 dołków</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>Biała płyta polipropylenowa (z unikalnym identyfikującym kodem kreskowym)</td></tr><tr><td>Płytka Microseal "A" do PCR i folia uszczelniająca do płytek PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td>AAV Kontrola czystości </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Rozpuszcza się w ultraczystej wodzie do 10% (v/v). OSTROŻNOŚĆ. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>UWAGA. Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić</td></tr><tr><td>rękawice Tris Base ULTROL Grade</td><td>Merck</td><td>648311</td><td>UWAGA: Używać pod kapturem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&reg; Żel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>Wodny 30% roztwór podstawowy akrylamidu i bisakryloamidu w stosunku 37,5:1. UWAGA: Używać pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus marker wstępnie barwiony</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>UWAGA: Stosować pod okapem z przepływem laminarnym. Nosić rękawice</td></tr><tr><td><silny>Immunohistochemia</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-GFP</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>132002</td><td>1:300 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anty-królik Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:1,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny> </td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Vector laboratorium produkcyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Rotina 380 *</td><td>Ultrawirówka Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 *</td><td>Redlica Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Typ 50.2 Ti o stałym kącie nachylenia *</td><td>Redlica Beckmann 337901</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Entris digital skala *</td><td>Sartorius</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>Ciepła kąpiel wodna *</td><td></td><td></td><td>Ustawiona na 37 & deg; C</td></tr><tr><td>Wiadro na lód *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>Materiał używany w laboratorium produkcji wektorów należy oddzielać od materiału używanego w standardowych obszarach laboratoryjnych</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156 400</td><td></td></tr><tr><td>Pipety z podziałką: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>Pojemność 5 ml</td></tr><tr><td>Pipety z podziałką: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td>Pojemność 10 ml</td></tr><tr><td>Pipety miarowe: Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>Pojemność 25 ml</td></tr><tr><td>inkubatora CO2 CB150 *</td><td>Binder</td><td>9040-0038</td><td>Ustawiony na 37 stopni; C, 5% CO2 i 95% wilgotności</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa Nuaire NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>Wyczyść wszystkie powierzchnie 70% etanolem i Virkonem przed i po użyciu</td></tr><tr><td>Konwencjonalny termocykler lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer *</td><td>Eppendorf</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop *</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell*</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td>Do stosowania z ręcznie robionymi lub prefabrykowanymi żelami</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra ProteoSilver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PROTSIL1</td><td>Wysoka czułość wykrywania białek z niskim tłem</td></tr><tr><td>Wirówka 5804 R * </td><td>Eppendorf</td><td>B1_022628045</td><td>Wirówka szybkoobrotowa do średnich potrzeb w zakresie wydajności (do 250 ml)</td></tr><tr><td>Pipety miarowe Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pipety miarowe Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180 25</td><td>mL</td></tr><tr><td>Pipety miarowe Cell star *</td><td>Greiner bio-one</td><td>760180</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące *</td><td>Greiner bio-one</td><td>750257</td><td>1250 &mikro; L</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące *</td><td>Greiner bio-one</td><td>738257</td><td>300 &micro; L</td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące *</td><td>Greiner bio-one</td><td>771257</td><td>10 &micro; L</td></tr><tr><td>Wiadro na lód z pokrywką *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>Mini membranowa pompa próżniowa, VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* Materiały oznaczone gwiazdką są drogimi elementami wyposażenia i zwykle są centralnymi elementami infrastruktury współdzielonymi przez wiele laboratoriów. Przedmioty te można również zastąpić ich odpowiednikami, jeśli są dostępne. Uwaga, gdy używana jest inna ultrawirówka, należy zachować ostrożność, aby wybrać odpowiedni wirnik i probówki wirówkowe.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Narzędzia do dostarczania genów oparte na wirusach związanych z adenowirusami (AAV) są popularnym wyborem do dostarczania transgenów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym do zastosowań terapii genowej. Wektory AAV są niereplikujące, zdolne do infekowania zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek oraz zapewniają długotrwałą ekspresję transgenu. Co ważne, niektóre serotypy, takie jak nowo opisany PHP. B, może przekroczyć barierę krew-mózg (BBB) w modelach zwierzęcych, po dostarczeniu ogólnoustrojowym. Wektory AAV mogą być wydajnie wytwarzane w laboratorium. Jednak do uzyskania wektorów AAV o wystarczających poziomach czystości i wartościach miana wystarczająco wysokich do zastosowań in vivo wymagane są solidne i powtarzalne protokoły. Protokół ten opisuje wydajną i powtarzalną strategię produkcji wektorów AAV, opartą na strategii oczyszczania gradientu jodiksanolu. Metoda oczyszczania jodixanolem jest odpowiednia do otrzymywania partii wektorów AAV o wysokim mianie i wysokiej czystości w porównaniu z innymi metodami oczyszczania. Co więcej, protokół jest generalnie szybszy niż inne obecnie opisane metody. Ponadto opisano ilościową strategię opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w celu szybkiego i dokładnego określenia miana wektora, a także metodę barwienia srebrem w celu określenia czystości partii wektora. Wreszcie, reprezentatywne wyniki dostarczania genów do OUN po ogólnoustrojowym podaniu AAV-PHP. B, są prezentowane. Takie wyniki powinny być możliwe we wszystkich laboratoriach korzystających z protokołów opisanych w tym artykule.

Do niedawna uważano, że AAV9 jest najskuteczniejszym serotypem wektora AAV w przenikaniu przez barierę krew-mózg (BBB) i transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego (CNS) po podaniu obwodowym. Znaczący postęp w projektowaniu kapsydów osiągnięto, gdy Deverman et al. opisali zastosowanie metody selekcji kapsydów nazywanej ewolucją ukierunkowaną AAV opartą na rekombinacji Cre (CREATE)17. Używając tej metody, zidentyfikowali nowy kapsyd o nazwie PHP.B, który, według ich doniesień, jest w stanie transdukować większość astrocytów i neuronów w wielu regionach CNS po wstrzyknięciu systemowym17. W tym miejscu należy zauważyć, że mimo iż PHP.B daje pozytywne wyniki u myszy C57/Bl6 (które były szczepem wykorzystanym w początkowych eksperymentach izolacyjnych), wstępne raporty sugerują, że jego wydajność może różnić się w zależności od szczepu. Dalsze eksperymenty bez wątpienia rzucą więcej światła na tę kwestię31.
Mimo tych problemów PHP.B oferuje interesujące możliwości nieinwazyjnej manipulacji genetycznej w OUN myszy, w tym eksperymenty typu proof-of-concept w terapii genowej w modelach chorób. W związku z tym zdecydowaliśmy się ocenić wydajność ekspresji transgenu przy użyciu PHP.B kontra AAV9, który od 2009 roku stanowi wektor „złotego standardu” w transdukcji OUN po podaniu obwodowym2Aby przeprowadzić bezpośrednie porównanie obu serotypów w optymalnych warunkach dla ekspresji transgenu, zastosowano konfigurację genomu sc32Oba wektory zawierały transgen białka fluorescencyjnego zielonego (GFP) pod kontrolą powszechnego promotora $\beta$-aktyny kurczaka (CBA). Samice myszy C57/Bl6 w 42. dniu po urodzeniu (o masie około 20 g) otrzymały dawkę $1 \times 10$12 vg na mysz w przypadku scAAV2/PHP.B-CBA-GFP lub scAAV2/9-CBA-GFP. Podanie wektora wykonano poprzez iniekcja do żyły ogonowej. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną KU Leuven.
Trzy tygodnie po wstrzyknięciu myszy poddano perfuzji transkardialnej schłodzonym do temperatury lodowej PBS, a następnie 4% (w/v) schłodzonym do temperatury lodowej paraformaldehydem (PFA). Ich mózgi zostały pobrane i poddane dalszej postfiksacji poprzez inkubację przez noc w tym samym utrwalaczu, a następnie przeniesione do 0,01% (w/v) Na-azide/PBS w celu przechowywania do czasu dalszych analiz. Następnie mózgi zostały pocięte na sekcje przy użyciu wibrotomu, a immunohistochemia została przeprowadzona na skrawkach o grubości 50 µm.
Aby ocenić poziomy ekspresji transgenu, przekroje barwiono przeciwciałami pierwotnymi przeciwko GFP (królicze anty-GFP), a detekcję przeprowadzono przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym (anty-królicze Alexa Fluor 48) (Rysunek 4A, B). Pomiary intensywności fluorescencji (w jednostkach arbitralnych [au]) potwierdziły znaczący wzrost ekspresji GFP przy zastosowaniu genomu sc i kapsydu PHP.B w porównaniu z AAV9. Wzrost poziomu GFP zaobserwowano w mózgu przednim (2105 ± 161 vs. 141 ± 9 au; p = 0,032), móżdżku (2601 ± 196 vs. 1737 ± 135 au; p = 0,032) oraz pniu mózgu (3082 ± 319 vs. 2485 ± 88 au; p = 0,038) (Rysunek 4C).
<img alt="Fluorescencja przekrojów mózgu dla scAAV2/9 i scAAV2/PHP.B; tabela porównawcza intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Systemiczne podanie scAAV2/PHP.B-CBA-GFP prowadzi do wysokiej ekspresji GFP w OUN. scAAV2/PHP.B-CBA-GFP lub scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 1012 (vg/mysz) podano 6-tygodniowym myszom szczepu C57/Bl6 poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej. Obecność GFP wykryto za pomocą immunohistochemii w koronalnych przekrojach mózgu 3 tygodnie po wstrzyknięciu. (A) mózgowie i (B) widoczne są móżdżek i pień mózgu. Paski skali = 1 mm. (C) Przeprowadzono kwantyfikację względnych intensywności fluorescencji w celu określenia poziomu sygnału GFP uzyskanego dla każdego wektora (10 przekrojów na mysz; trzy myszy w grupie dla każdego wektora). Wykonano jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie dwustronny test t-Studenta t-test; dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe; **p &lt; 0,01; au. jednostki arbitralne. pCapsid, stosowany do produkcji wektorów AAV, zawiera gen rep z serotypu 2 oraz genu zakrętka odpowiednio z serotypu PHP.B lub AAV9. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Rincona i in.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Postępując zgodnie z tym protokołem, użytkownik będzie w stanie wyprodukować wektory AAV o wysokiej czystości i wydajności odpowiednie do zastosowań in vitro lub in vivo. Protokół ten może być stosowany do produkcji i oczyszczania szeregu serotypów AAV o różnych konfiguracjach. Połączenie tych dwóch elementów może być przydatne do uzyskania ekspresji specyficznej dla typu komórki i tkanki.Produkcja niektórych serotypów może prowadzić do niższych plonów. Jest to produkcja, w której występują bliskie serotypy i powinna być oceniana indywidualnie. Procedury te zademonstruje Shelly Fripont, technik z naszego laboratorium.Po wyhodowaniu komórek HEK wymieszaj 360 mikrogramów plazmidu pomocniczego, 180 mikrogramów plazmidu kodującego kapsyd wektorowy i 180 mikrogramów plazmidu zawierającego transgen w 18 mililitrach 150-milimolowego chlorku sodu, aby przygotować mieszankę DNA. Rozprowadź tę mieszankę na trzech 50-mililitrowych stożkowych rurkach. W nowej stożkowej probówce wymieszaj 840 mikrogramów PEI i sześć mililitrów 150 milimolowego chlorku sodu, aby przygotować mieszankę PEI dla sześciu naczyń do hodowli komórkowych.Następnie dodaj sześć mililitrów mieszanki PEI, kropla po kropli, do jednej ze stożkowych probówek zawierających mieszankę DNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie wyjmij sześć szalek z kultur komórkowych z inkubatora.W okapie z przepływem laminarnym całkowicie zassaj pożywkę z każdego naczynia. Opłucz naczynia pięcioma mililitrami wstępnie podgrzanego DPBS, aby usunąć ślady pożywki. Delikatnie przechyl każde naczynie, aby upewnić się, że DPBS jest równomiernie rozłożony na całej powierzchni.Następnie delikatnie zassać DPBS. Dodaj 12 mililitrów DMEM po jednym do każdego naczynia powoli, z pipetą umieszczoną na krawędzi naczynia. Wymieszaj mieszaninę PEI i DNA, pipetując ją w górę i w dół trzy do pięciu razy.Dodaj dwa mililitry tej mieszaniny do każdej z sześciu naczyń do hodowli komórkowych kropla po kropli, upewniając się, że dokładnie rozprowadzasz ją na całej powierzchni. Powtórz ten proces, używając sześciu szalek do hodowli komórkowych na raz, aż osiągniesz 18 szalek do hodowli komórkowych. Delikatnie potrząśnij szalkami z kulturami komórkowymi, aby rozprowadzić mieszaninę PEI DNA.Inkubuj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 95 procentach wilgotności i pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez pięć godzin. Następnie dodaj dodatkowe 12 mililitrów DMEM 10 do każdej z 18 naczyń bez usuwania istniejącego wcześniej podłoża. Kontynuować inkubację transfekowanych komórek w tych samych warunkach.Po 72 godzinach od transfekcji użyj skrobaka do komórek, aby ostrożnie odłączyć komórki od każdej płytki hodowlanej. Zebrać pożywkę i komórki dwóch szalek hodowlanych w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, trzymanej na lodzie. Odwirować probówki w temperaturze 420 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem wirówki.Ostrożnie wyrzucić supernatant z każdej probówki, delikatnie wlewając go do pojemnika na odpady. Następnie umieść probówki zawierające granulki komórek na lodzie. Zawieszamy każdą osadkę w dwóch mililitrach buforu do lizy i mieszamy, pipetując w górę iw dół od pięciu do 10 razy.Wyciągnij AAV z trzech rurek razem. Na początek zamroź ponownie zawieszone komórki, umieszczając je w wiadrze zawierającym suchy lód zmieszany z etanolem. Następnie rozmrozić komórki, natychmiast umieszczając je w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania trzy razy, aby zlizować komórki i uwolnić cząsteczki AAV. Po trzecim etapie rozmrażania odwirować w temperaturze 1167 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Ostrożnie przenieś supernatanty do czystych 50-mililitrowych stożkowych probówek.Dodaj nukleazę do każdej probówki do końcowego stężenia 50 jednostek na mililitr supernatantu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając probówki co 10 minut, aby upewnić się, że nukleaza jest dokładnie wymieszana z supernatantem. Wirować w temperaturze 13490 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w celu sklarowania supernatantu.Następnie wyjmij tłok 10-mililitrowej strzykawki, podłącz filtr 0,45 mikrometra do strzykawki i umieść go na czystej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Ostrożnie napełnić strzykawkę sklarowanym supernatantem. Użyj tłoka, aby przepchnąć lizat przez filtr.Następnie należy przygotować każdą z frakcji jodiksanolu w czterech oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów, zgodnie z tabelą pierwszą protokołu tekstowego. Odpipetuj osiem mililitrów 15-procentowego jodiksanolu do każdej z trzech probówek ultrawirówek. Odpipetuj 5,5 mililitra 25-procentowego jodiksanolu do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Używając pipety Pasteura bez podziałki, ostrożnie ułóż 5,5 mililitra 25-procentowego roztworu jodiksanolu poniżej 15-procentowego roztworu jodiksanolu. Dodaj rozwiązania 40 procent i 60 procent zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Frakcje jodixanolu nie powinny mieszać się podczas nakładania warstw.Za pomocą pipety Pasteura ułóż surowy lizat na wierzchu 15-procentowego gradientu jodu, kropla po kropli, aby uniknąć zakłócenia granicy faz między surowym lizatem a roztworem jodu. Napełnij każdą probówkę do ultrawirowania buforem do lizy, aż menisk dotrze do podstawy szyjki probówki, aby upewnić się, że probówka nie zapadnie się pod wpływem bardzo dużych sił wytwarzanych podczas ultrawirowania. Zamknij probówki za pomocą odpowiednich pokrywek.Używając wagi cyfrowej, upewnij się, że wszystkie trzy probówki do ultrawirowania mają tę samą wagę. W razie potrzeby dostosowanie masy poprzez dodanie większej ilości buforu do lizy surowego na wierzchu surowego lizatu. Użyj tytanowego wirnika o stałym kącie, aby odwirować probówki w temperaturze 301580 razy G i w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez godzinę i 40 minut, używając maksymalnego przyspieszania i zwalniania.Następnie przymocuj igłę do pięciomililitrowej strzykawki. Usuń przekładkę z rurek w wirniku i odzyskaj probówki po odwirowaniu. Odsysaj tylko 40-procentową frakcję jodiksanalu, która zawiera cząstki wektora.Albo przetworzyć próbkę, albo przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tym miejscu zademonstrowano protokół, który można wykorzystać do produkcji wektorów AAV z różnymi kapsydami, konfiguracjami genomu, typami promotorów i ładunkami transgenowymi. W tym przykładzie wyprodukowaliśmy i oczyściliśmy dwa różne wektory AAV, które wyrażały zielone białko fluorescencyjne z genomu samouzupełniającego się.Te dwa wektory różnią się kapsydami: PHPB i AAV9. Zostały one dostarczone, poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, dorosłym czarnym sześciu myszom C57. Aby ocenić poziom ekspresji transgenu trzy tygodnie po wstrzyknięciu, skrawki barwi się pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko GFP z wykrywaniem za pomocą przeciwciał drugorzędowych skoniugowanych z barwnikiem fluorescencyjnym.Pomiary intensywności fluorescencji wykazują znaczny wzrost ekspresji GFP, gdy wektor PHPB jest używany w stosunku do AAV9. Wzrost GFP zaobserwowano w mózgu, móżdżku i pniu mózgu. Dokładne zebranie wektora zawierającego frakcję ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu.W przypadku, gdy nie zostanie to wykonane prawidłowo, wpłynie to niekorzystnie na wydajność wektora, a także na czystość wektora. Będąc w stanie wyprodukować wektory AAV, małe laboratoria będą w stanie wykorzystać liczne możliwości eksperymentalne w celu dostarczenia genów do ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten wymaga użycia ultrawirówki i ważne jest, aby przejść odpowiednie szkolenie przed przystąpieniem do pracy, aby uniknąć wypadków.Co więcej, wektory AAV są często klasyfikowane jako zagrożenia biologiczne, dlatego przed obchodzeniem się z nimi i zarządzaniem nimi należy zapoznać się z lokalnymi przepisami.

production-purification-quality-control-for-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

W tym protokole, wektor AAV2 jest wytwarzany przez kokulturację komórek owadów Spodoptera frugiperda (Sf9) z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wirusa bakulowirusa (BV)-AAV2-AAV2 lub genem terapeutycznym oraz komórkami Sf9 zakażonymi BV-AAV2-rep-cap w hodowli zawiesinowej. Cząsteczki AAV są uwalniane z komórek za pomocą detergentu, klarowane, oczyszczane za pomocą chromatografii kolumnowej powinowactwa i zagęszczane przez filtrację o przepływie stycznym.

Opracowanie procesu produkcji i oczyszczania wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV)2 przy użyciu systemu hodowli komórek bakulowirusa i owadów

Wirus związany z adenowirusem jest wytwarzany w hodowli komórek zawiesinowych i oczyszczany przez wirowanie w gradiacji gęstości podwójnego jodixanolu. Uwzględniono kroki mające na celu zwiększenie całkowitej wydajności wirusa, zmniejszenie ryzyka wytrącania się wirusa i dalszą koncentrację końcowego produktu wirusowego. Oczekiwane końcowe miana osiągają10-12 cząstek wirusa/ml i nadają się do przedklinicznego stosowania in vivo.

Produkcja kultur zawiesinowych i oczyszczanie wirusa związanego z adenowirusem za pomocą wirowania w gradicynacji gradientu gęstości jodiksanolu do zastosowań in vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę wewnątrzczaszkowej iniekcji wektorów AAV w celu fluorescencyjnego znakowania neuronów i gleju w korze wzrokowej.

Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych opartych na wirusach adeno-zależnych

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Naucz się produkcji i oczyszczania wektorów AAV o wysokiej czystości i wydajności przy użyciu komórek HEK. Ta metoda umożliwia uzyskanie specyficznej ekspresji genów w różnych typach komórek i tkankach.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Przeglądaj więcej filmów