Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Postępując zgodnie z tym protokołem, użytkownik będzie w stanie wyprodukować wektory AAV o wysokiej czystości i wydajności odpowiednie do zastosowań in vitro lub in vivo. Protokół ten może być stosowany do produkcji i oczyszczania szeregu serotypów AAV o różnych konfiguracjach. Połączenie tych dwóch elementów może być przydatne do uzyskania ekspresji specyficznej dla typu komórki i tkanki.

Produkcja niektórych serotypów może prowadzić do niższych plonów. Jest to produkcja, w której występują bliskie serotypy i powinna być oceniana indywidualnie. Procedury te zademonstruje Shelly Fripont, technik z naszego laboratorium.

Po wyhodowaniu komórek HEK wymieszaj 360 mikrogramów plazmidu pomocniczego, 180 mikrogramów plazmidu kodującego kapsyd wektorowy i 180 mikrogramów plazmidu zawierającego transgen w 18 mililitrach 150-milimolowego chlorku sodu, aby przygotować mieszankę DNA. Rozprowadź tę mieszankę na trzech 50-mililitrowych stożkowych rurkach. W nowej stożkowej probówce wymieszaj 840 mikrogramów PEI i sześć mililitrów 150 milimolowego chlorku sodu, aby przygotować mieszankę PEI dla sześciu naczyń do hodowli komórkowych.

Następnie dodaj sześć mililitrów mieszanki PEI, kropla po kropli, do jednej ze stożkowych probówek zawierających mieszankę DNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie wyjmij sześć szalek z kultur komórkowych z inkubatora.

W okapie z przepływem laminarnym całkowicie zassaj pożywkę z każdego naczynia. Opłucz naczynia pięcioma mililitrami wstępnie podgrzanego DPBS, aby usunąć ślady pożywki. Delikatnie przechyl każde naczynie, aby upewnić się, że DPBS jest równomiernie rozłożony na całej powierzchni.

Następnie delikatnie zassać DPBS. Dodaj 12 mililitrów DMEM po jednym do każdego naczynia powoli, z pipetą umieszczoną na krawędzi naczynia. Wymieszaj mieszaninę PEI i DNA, pipetując ją w górę i w dół trzy do pięciu razy.

Dodaj dwa mililitry tej mieszaniny do każdej z sześciu naczyń do hodowli komórkowych kropla po kropli, upewniając się, że dokładnie rozprowadzasz ją na całej powierzchni. Powtórz ten proces, używając sześciu szalek do hodowli komórkowych na raz, aż osiągniesz 18 szalek do hodowli komórkowych. Delikatnie potrząśnij szalkami z kulturami komórkowymi, aby rozprowadzić mieszaninę PEI DNA.

Inkubuj transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 95 procentach wilgotności i pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez pięć godzin. Następnie dodaj dodatkowe 12 mililitrów DMEM 10 do każdej z 18 naczyń bez usuwania istniejącego wcześniej podłoża. Kontynuować inkubację transfekowanych komórek w tych samych warunkach.

Po 72 godzinach od transfekcji użyj skrobaka do komórek, aby ostrożnie odłączyć komórki od każdej płytki hodowlanej. Zebrać pożywkę i komórki dwóch szalek hodowlanych w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów, trzymanej na lodzie. Odwirować probówki w temperaturze 420 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem wirówki.

Ostrożnie wyrzucić supernatant z każdej probówki, delikatnie wlewając go do pojemnika na odpady. Następnie umieść probówki zawierające granulki komórek na lodzie. Zawieszamy każdą osadkę w dwóch mililitrach buforu do lizy i mieszamy, pipetując w górę iw dół od pięciu do 10 razy.

Wyciągnij AAV z trzech rurek razem. Na początek zamroź ponownie zawieszone komórki, umieszczając je w wiadrze zawierającym suchy lód zmieszany z etanolem. Następnie rozmrozić komórki, natychmiast umieszczając je w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.

Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania trzy razy, aby zlizować komórki i uwolnić cząsteczki AAV. Po trzecim etapie rozmrażania odwirować w temperaturze 1167 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Ostrożnie przenieś supernatanty do czystych 50-mililitrowych stożkowych probówek.

Dodaj nukleazę do każdej probówki do końcowego stężenia 50 jednostek na mililitr supernatantu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, obracając probówki co 10 minut, aby upewnić się, że nukleaza jest dokładnie wymieszana z supernatantem. Wirować w temperaturze 13490 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut w celu sklarowania supernatantu.

Następnie wyjmij tłok 10-mililitrowej strzykawki, podłącz filtr 0,45 mikrometra do strzykawki i umieść go na czystej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Ostrożnie napełnić strzykawkę sklarowanym supernatantem. Użyj tłoka, aby przepchnąć lizat przez filtr.

Następnie należy przygotować każdą z frakcji jodiksanolu w czterech oddzielnych stożkowych probówkach o pojemności 50 mililitrów, zgodnie z tabelą pierwszą protokołu tekstowego. Odpipetuj osiem mililitrów 15-procentowego jodiksanolu do każdej z trzech probówek ultrawirówek. Odpipetuj 5,5 mililitra 25-procentowego jodiksanolu do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Używając pipety Pasteura bez podziałki, ostrożnie ułóż 5,5 mililitra 25-procentowego roztworu jodiksanolu poniżej 15-procentowego roztworu jodiksanolu. Dodaj rozwiązania 40 procent i 60 procent zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Frakcje jodixanolu nie powinny mieszać się podczas nakładania warstw.

Za pomocą pipety Pasteura ułóż surowy lizat na wierzchu 15-procentowego gradientu jodu, kropla po kropli, aby uniknąć zakłócenia granicy faz między surowym lizatem a roztworem jodu. Napełnij każdą probówkę do ultrawirowania buforem do lizy, aż menisk dotrze do podstawy szyjki probówki, aby upewnić się, że probówka nie zapadnie się pod wpływem bardzo dużych sił wytwarzanych podczas ultrawirowania. Zamknij probówki za pomocą odpowiednich pokrywek.

Używając wagi cyfrowej, upewnij się, że wszystkie trzy probówki do ultrawirowania mają tę samą wagę. W razie potrzeby dostosowanie masy poprzez dodanie większej ilości buforu do lizy surowego na wierzchu surowego lizatu. Użyj tytanowego wirnika o stałym kącie, aby odwirować probówki w temperaturze 301580 razy G i w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez godzinę i 40 minut, używając maksymalnego przyspieszania i zwalniania.

Następnie przymocuj igłę do pięciomililitrowej strzykawki. Usuń przekładkę z rurek w wirniku i odzyskaj probówki po odwirowaniu. Odsysaj tylko 40-procentową frakcję jodiksanalu, która zawiera cząstki wektora.

Albo przetworzyć próbkę, albo przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W tym miejscu zademonstrowano protokół, który można wykorzystać do produkcji wektorów AAV z różnymi kapsydami, konfiguracjami genomu, typami promotorów i ładunkami transgenowymi. W tym przykładzie wyprodukowaliśmy i oczyściliśmy dwa różne wektory AAV, które wyrażały zielone białko fluorescencyjne z genomu samouzupełniającego się.

Te dwa wektory różnią się kapsydami: PHPB i AAV9. Zostały one dostarczone, poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, dorosłym czarnym sześciu myszom C57. Aby ocenić poziom ekspresji transgenu trzy tygodnie po wstrzyknięciu, skrawki barwi się pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko GFP z wykrywaniem za pomocą przeciwciał drugorzędowych skoniugowanych z barwnikiem fluorescencyjnym.

Pomiary intensywności fluorescencji wykazują znaczny wzrost ekspresji GFP, gdy wektor PHPB jest używany w stosunku do AAV9. Wzrost GFP zaobserwowano w mózgu, móżdżku i pniu mózgu. Dokładne zebranie wektora zawierającego frakcję ma kluczowe znaczenie dla tego protokołu.

W przypadku, gdy nie zostanie to wykonane prawidłowo, wpłynie to niekorzystnie na wydajność wektora, a także na czystość wektora. Będąc w stanie wyprodukować wektory AAV, małe laboratoria będą w stanie wykorzystać liczne możliwości eksperymentalne w celu dostarczenia genów do ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten wymaga użycia ultrawirówki i ważne jest, aby przejść odpowiednie szkolenie przed przystąpieniem do pracy, aby uniknąć wypadków.

Co więcej, wektory AAV są często klasyfikowane jako zagrożenia biologiczne, dlatego przed obchodzeniem się z nimi i zarządzaniem nimi należy zapoznać się z lokalnymi przepisami.