Izolacja tkanek embrionalnych i tworzenie chimerycznych narządów przepiórki i kurczaka na przykładzie grasicy

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie zoptymalizowanego podejścia eksperymentalnego do izolacji tkanek embrionalnych z zarodków przepiórek i kurczaków. Dzięki tej technice uzyskujemy czyste tkanki embrionalne, które można wykorzystać w badaniach ekspresji genów i testach funkcjonalnych. Tkanki z zarodków przepiórek i kurczaków są izolowane metodą mikrochirurgiczną i poddawane trawieniu enzymatycznemu in vitro z zachowaniem ich właściwości biologicznych.

Po wyizolowaniu, trójwymiarowe zachowane tkanki mogą być wykorzystane do analizy topograficznych wzorców ekspresji genów w wysokiej rozdzielczości. Podejście to jest szczególnie przydatne do szczegółowego określania ekspresji genów in situ na terytoriach embrionalnych, które w inny sposób byłyby niedostępne za pomocą konwencjonalnych metod. Ponadto metody analizy transkryptomu mogą być również stosowane w izolowanych tkankach bez konieczności stosowania markerów genetycznych, zapewniając jednocześnie specyficzną dla tkanki wysokoprzepustową analizę omiczną.

Alternatywnie, izolowane tkanki obu gatunków można powiązać w teście organotypowym in vitro przez 48 godzin. Takie podejście pozwala na badanie interakcji tkankowych, ponieważ komórki przepiórki i kurczaka można rozróżnić na podstawie odrębnych cech jądrowych i markerów molekularnych. Zdolność tkanek hodowlanych do tworzenia narządów można dodatkowo przetestować za pomocą testu in ovo.

Metoda ta jest zatem użytecznym narzędziem do badania złożonych interakcji tkankowych w procesach rozwojowych z wysoce dynamicznymi modyfikacjami przestrzennymi, a także może pomóc w ujawnieniu potencjału określonych terytoriów embrionalnych do tworzenia narządów. Jako przykład opisano tutaj powstawanie chimerycznej grasicy kury przepiórczej z izolowanych tkanek embrionalnych. Po pierwsze, endoderma trzeciego i czwartego worka gardłowego, prospektywny zaczątek grasicy jest izolowany z okolicy gardła zarodków przepiórczych po trzech dniach rozwoju.

Następnie tkanka ta jest związana z mezenchymą zdolną do wspierania jej rozwoju, mezodermą somatopleury. Wreszcie, heterospecyficzne asocjacja tkanek jest hodowana in vitro i in ovo w celu utworzenia chimerycznej grasicy. Wszystkie procedury manipulacji jajami należy wykonywać w sterylnych warunkach, używając poziomego okapu z przepływem laminarnym oraz wysterylizowanych narzędzi i materiałów.

Zapłodnione jaja przepiórcze inkubowano z komorą powietrzną skierowaną do góry. Na początek wyjmij jaja przepiórcze z inkubatora. Przygotuj dużą miskę ze szkła borokrzemianowego wypełnioną zimnym PBS.

Zakrzywionymi nożyczkami dotknij i wytnij okrągły otwór w skorupce jaja przepiórczego po trzech dniach inkubacji. Zrób otwór po przeciwnej stronie jajka i przenieś żółtko do miski z zimnym PBS. Usuń zarodek z żółtka, przecinając błonę witeliny zewnętrznie do naczyń pozazarodkowych.

Za pomocą cienkich kleszczy przenieś zarodek do małej miski wypełnionej zimnym PBS, a następnie przenieś zarodek na szalkę Petriego z czarną podstawą ze skimmerem. Usuń obszar gardła zawierający trzeci i czwarty worek gardłowy, jak opisano w poprzednim podwiązaniu Jove SPA. Następnie przenieś trzeci i czwarty obszar łuku gardła do szklanki wypełnionej zimną pankreatyną i inkubuj przez godzinę na lodzie w celu trawienia enzymatycznego.

Należy pamiętać, że okres inkubacji trawienia enzymatycznego zależy od etapu rozwoju. Umieść szklane naczynie pod mikroskopem stereoskopowym i odizoluj endodermę z trzeciego i czwartego obszaru łuku gardłowego za pomocą dwóch mikroskalpeli w uchwycie. Najpierw umieść obszar gardła grzbietową stroną do góry, pokazując wewnętrznie endodermę i ektodermę na zewnętrznej powierzchni.

Obserwuj ektodermę, endodermę, mezenchymę, rurkę serca i brzuszną część cewy nerwowej. Usuń cewę nerwową i mezodermę przyczepioną do grzbietowej powierzchni endodermy gardła. Obserwuj endodermę gardła, czwartą i trzecią torebkę gardłową oraz rurkę serca.

Stroną grzbietową do góry ostrożnie odłącz i usuń mezenchymę między łukami gardłowymi i odsłoń woreczki gardłowe. Wykonaj tę procedurę po drugiej stronie okolicy gardła. Usuń mezenchymę przyczepioną do najbardziej tylnej części endodermy i obserwuj czwartą torebkę gardłową.

Tylną stroną do góry obserwuj zarówno lewą, jak i prawą czwartą torebkę gardłową. Kontynuuj, usuwając mezenchymę przyczepioną do najbardziej tylnej części endodermy i do drugiej torebki. Usuń rurkę serca i mezenchymę otaczającą wewnętrzne torebki.

Stroną brzuszną do góry obserwuj endodermę gardła i prawą stronę drugiego łuku gardłowego. Na tym etapie powinna być widoczna endoderma podstawy tarczycy. Odłącz ektodermę drugiego i trzeciego łuku gardłowego i ostrożnie usuń mezenchymę łuków.

Obserwuj usunięcie mezenchymii drugiego łuku gardłowego po prawej stronie. Zwróć uwagę na położenie czwartej i trzeciej torebki oraz podstawy tarczycy. Usunąć resztki do komórek mezenchymalnych przyczepionych do woreczków gardłowych.

Obserwuj trzecią i czwartą torebkę po prawej stronie oraz czwartą torebkę po lewej stronie. Powtórz oderwanie mezenchymii po lewej stronie. Przyjrzyj się teraz trzeciej torebce po lewej stronie.

Obserwuj oderwanie mezenchymy drugiego łuku po lewej stronie. Należy pamiętać, że podczas tej procedury wszystkie powierzchnie i roztwory powinny być utrzymywane w niskiej temperaturze. Zmień na nowy zimny roztwór pankreatyny i naczynie w przypadku, gdy wypreparowanie tkanek zajmuje dużo czasu.

Na koniec wykonaj poprzeczne cięcie między drugim a trzecim woreczkiem gardłowym, aby usunąć drugie woreczki i zaczątek tarczycy. W tym momencie izolowana endoderma składa się z trzeciego i czwartego woreczka gardłowego oraz tylnego końca gardła. Usuń resztki oderwanej mezenchymy za pomocą dwóch mikroskalpeli.

Przenieść wyizolowaną endodermę do szklanego naczynia wypełnionego zimną płodową surowicą bydlęcą i trzymać ją na lodzie podczas przygotowywania testu in vitro. Jajka umieszczono w pozycji poziomej, a górną stronę oznaczono do użycia węgla drzewnego. Na początek wyjmij jaja z inkubatora.

Zakrzywionymi nożyczkami otwórz mały otwór w skorupie, włóż igłę i odessaj dwa mililitry albuminy za pomocą 10-mililitrowej strzykawki. Otwórz okrągły otwór w zaznaczonym obszarze skorupy i przetnij błonę witelinową na zewnątrz do dodatkowych naczyń zarodkowych, trzymając zarodek cienkimi kleszczami. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść zarodek na szalce Petriego z czarną podstawą zawierającą zimny PBS.

Użyj czterech szpilek do owadów, aby przytrzymać zarodek do dna płytki. Umieść szpilki w obszarze pozazarodkowym, tworząc kwadratowy kształt. Wykonaj dwa cięcia między somitami 19 i 24 poprzecznie do osi zarodka i przecinając zarodek.

Zwolnij tę sekcję, przecinając brzeżne krawędzie zarodka. Obserwuj płytkę boczną, cewę nerwową i somity. Odessać i przenieść tkanki do szklanego naczynia wypełnionego zimną pankreatyną.

Inkubować przez 30 minut na lodzie w celu trawienia enzymatycznego. Pod mikroskopem stereoskopowym odizoluj mezodermę od otaczających tkanek za pomocą dwóch mikroskalpeli w uchwytach. Obserwuj mezodermę somatopleury, splanchnopleurę, cewę nerwową i ektodermę.

Najpierw usuń ektodermę z powierzchni. Obserwuj mezodermę somatopleury oddzieloną od ektodermy. Następnie ostrożnie odłącz brzusznie zlokalizowaną splanchnopleurę od somatopleury.

Obserwuj prawą boczną mezodermę somatopleury. Zwolnij go, przecinając go ruchem równoległym do cewy nerwowej. Należy pamiętać, że podczas tej procedury wszystkie powierzchnie i roztwory powinny być utrzymywane w niskiej temperaturze.

Zmień na nowy zimny roztwór pankreatyny i naczynie w przypadku, gdy wypreparowanie tkanek zajmuje dużo czasu. Obserwuj lewą boczną mezodermę somatopleury, somitów, cewy nerwowej i ektodermy. Powtórz uwalnianie mezodermy z tej strony.

Wykonuj powolne ruchy mikroskalpelem. Odsłonięte białka macierzy zewnątrzkomórkowej przechowują się w tkankach i instrumentach, zapobiegając ruchom płynów. Ostrożnie przeciąć somatopleurę ruchem równoległym do cewy nerwowej.

Przenieść wyizolowaną mezodermę do szklanego naczynia wypełnionego zimną płodową surowicą bydlęcą i trzymać ją na lodzie podczas przygotowywania testu in vitro. Umieść metalowy ruszt o drobnych oczkach na szalce Petriego i wypełnij go pożywką hodowlaną. Usuń nadmiar płynów, aby wyrównać powierzchnię medium z górną częścią rusztu.

Za pomocą cienkich kleszczyków zanurz filtr membranowy w pożywce hodowlanej i ostrożnie umieść go na górze rusztu, aby powierzchnia miała z nią kontakt. Pod mikroskopem stereoskopowym przenieś wyizolowaną endodermę ze szklanego naczynia do filtra membranowego, delikatnie przesuwając za pomocą szpatułki i cienkich kleszczyków. Powtórz tę procedurę dla izolowanej mezodermy.

Za pomocą mikroskalpela wymieszaj tkanki, aby zmaksymalizować jego skojarzenie. Ostrożnie umieść powiązane tkanki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 na 48 godzin. Po okresie inkubacji należy przeszczepić tkanki hodowlane na błonę typu koriolanowego i pozwolić jej rozwijać się w owalu przez kolejne 10 dni, aby zakończyć tworzenie narządu, jak opisano wcześniej.

Oto metoda siatkowata, która pozwala na izolację tkanek embrionalnych ptaków w różnych podejściach eksperymentalnych. Na przykład oceniono również ekspresję genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w tworzenie woreczków gardłowych, izolowanej endodermy zawierającej drugą, trzecią i czwartą torebkę gardłową z zarodków kurczaka w trzecim i pół dniu embrionalnym przez hybrydyzację in situ całego mounta. Ekspresję Sonic Hedgehog wykryto w endodermie gardła środkowego i wykluczono z torebek, podczas gdy BMP7 ulegono ekspresji w endodermie drugiego i trzeciego woreczka gardłowego i wykluczono z gardła środkowego i czwartego woreczka gardłowego.

Wyizolowane tkanki można również specyficznie połączyć in vitro in vitro przez 48 godzin, wszczepić na błonę typu koriolanowego i pozostawić do rozwoju przez kolejne 10 dni. Eksplantaty można analizować za pomocą konwencjonalnej histologii i immunohistochemii. Niektóre reprezentatywne wyniki związku endodermy przepiórczej z trzeciego i czwartego worka gardłowego z mezodermą somatopleura kurczaka są następujące: - Przeszczepy wykazały w pełni uformowaną chimeryczną grasicę z komórkami nabłonka grasicy pochodzącymi z przepiórek, dodatnimi dla QCPN i komórek limfoidalnych kurczaka.

Dodatkowo nabłonek grasicy cytokeratynowo-dodatni wykazywał normalne cechy morfologiczne, wykazując typową architekturę siatkowatą. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować tkanki embrionalne przepiórek i kurczaków, które mogą być wykorzystane w badaniach ekspresji genów, a tworząc chimeryczne narządy, mogą również pomóc w rozszyfrowaniu złożoności genetyki narządów.