Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Połączenia szczelinowe zostały zasugerowane jako cele leków. Test jodkowy-YFP-GJIC jest kompatybilny z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi w celu wykrycia modulatorów złączy szczelinowych. Zostały one wykorzystane do przetestowania wpływu dużej liczby związków na aktywność złączy szczelinowych w stosunkowo krótkim czasie.

Test jodkowy-YFP-GJIC jest prosty, solidny, powtarzalny i niedrogi. Ten test wymaga tylko komórek akceptorowych i dawczych oraz dwóch zrównoważonych roztworów soli. Nie są potrzebne żadne dodatkowe odczynniki, takie jak Lucifer yellow i Calcein AM.

Mierzy również całkowitą aktywność połączeń szczelinowych komórek w pojedynczym dołku, co skutkuje niską zmiennością między dołkami. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować komórki LN215 do 80% konfluencji w uzupełnionym DMEM, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dzień przed transdukcją przemyć komórki dwukrotnie 10 mililitrami PBS.

Dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej i dostosuj gęstość komórek do 50 000 komórek na mililitr. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki, która zawiera 20 000 komórek, do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia przeprowadź transdukcję dwóch studzienek, zastępując pożywkę hodowlaną 400 mikrolitrami mieszaniny jeden do jednego lentiwirusa i świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej polibrenem w końcowym stężeniu czterech mikrogramów na mililitr. W przypadku kontroli bez wirusów należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką uzupełnioną polibrenem o końcowym stężeniu czterech mikrogramów na mililitr.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 godzin. Następnie odessać pożywkę zawierającą lentiwirusy i świeżą pożywkę hodowlaną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 72 godziny.

Następnie umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie 0,5 mililitra PBS. Dodaj 300 mikrolitrów 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej, a następnie umieścić je na sześciodołkowych płytkach hodowlanych z dwoma mikrogramami na mililitr puromycyny.

Hoduj komórki, aż wszystkie komórki w studzienkach kontrolnych będą martwe, co zwykle trwa około tygodnia. Po pierwsze, oddzielnie hoduj komórki jodkowe LN215-YFP i LN215 na 100-milimetrowych płytkach w pożywce hodowlanej, aby dotrzeć do populacji wymaganych do testu. Dzień przed badaniem umyj każdą płytkę 10 mililitrami PBS.

Potraktuj każdą płytkę dwoma mililitrami 0,25% roztworu trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach pożywki hodowlanej i przenieść je do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Wirować przy 1 000 g przez trzy minuty w celu osadzenia komórek.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Pipetuj w górę i w dół około 20 razy, aby rozbić wszelkie grudki komórek. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.

A następnie rozcieńczyć komórki w pożywce hodowlanej, aby uzyskać zawiesinę komórek o pokazanych tutaj gęstościach. Następnie wymieszaj ze sobą siedem mililitrów każdej zawiesiny komórkowej w zbiorniku. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 100 mikrolitrów tej mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Najpierw użyj mikroskopu fluorescencyjnego z 20-krotnym powiększeniem i filtrem GFP, aby sprawdzić 96-dołkowe płytki, aby upewnić się, że nie ma grudek komórek i że kultury są w pełni zlewające się i dobrze rozprowadzone. Co najmniej 30 minut przed badaniem włącz czytnik mikropłytek i ustaw go na 37 stopni Celsjusza.

Umyj rurkę automatycznego wtryskiwacza trzema mililitrami 70% etanolu, trzema mililitrami wody destylowanej i trzema mililitrami roztworu I. Następnie podgrzej roztwory C i I do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Albo zassać pożywkę wzrostową, albo odwrócić płytkę, aby ją opróżnić.

Wytrząśnij resztki nośnika. Następnie dodaj roztwór C do zbiornika za pomocą pipety wielokanałowej, aby dodać 200 mikrolitrów roztworu C do każdego dołka płytki. Albo zassać roztwór, albo odwrócić płytkę, aby ją opróżnić, tak aby usunąć resztki roztworu.

Dodaj 50 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki. Następnie dodaj jeden mikrolitr 2,5-milimolowego materiału chemicznego lub DMSO jako nośnik i dodaj kolejne 50 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na powietrzu przez około 10 minut.

Podczas inkubacji należy rozpocząć ustawianie parametrów w programie czytnika mikropłytek, klikając przycisk Manage Protocols (Zarządzaj protokołami). Kliknij przycisk Nowy. Wybierz Intensywność fluorescencji w sekcji Metoda pomiaru i Tryb studni w sekcji Tryb odczytu.

Następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się nowa karta. W menu Parametry podstawowe ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nanometrów, a emisję na 520 nanometrów.

Wybierz dolną optykę, aby odczytać fluorescencję od dołu. Następnie ustaw czas rozpoczęcia pomiaru na zero sekund, liczbę interwałów na 25, liczbę błysków na studzienkę i interwał na 20, a czas interwału na 0,4 sekundy. W menu Układ narysuj obszar płyty, który ma zostać odczytany.

W menu Concentrations/Volumes/Shacking ustaw czytnik mikropłytek tak, aby wstrzykiwał 100 mikrolitrów roztworu I do każdej studzienki z prędkością wtrysku 135 mikrolitrów na sekundę. W menu Injection Time (Czas wstrzyknięcia) ustaw czas rozpoczęcia wstrzyknięcia na jedną sekundę. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar.

Po zakończeniu inkubacji przenieś 96-dołkowe płytki do czytnika mikropłytek i rozpocznij pomiar, ponownie klikając przycisk Rozpocznij pomiar. W tym badaniu test komunikacji międzykomórkowej połączenia jodowo-żółtego fluorescencyjnego białka z przerwą między komórkami jest używany z komórkami jodowymi LN215-YFP i LN215 do badania przesiewowego 2 320 substancji chemicznych w celu zidentyfikowania nowych modulatorów komunikacji wewnątrzkomórkowej ze złączem szczelinowym. Uważa się, że homosalat hamuje 50% komunikacji wewnątrzkomórkowej w połączeniu szczelinowym.

Podczas gdy terbinafina całkowicie go hamuje. Potwierdza to, że terbinafina jest inhibitorem połączeń szczelinowych. Ten test mierzy GJIC między sąsiednimi komórkami dawcy i akceptora, więc komórki dawcy i akceptora muszą być całkowicie zdysocjowane przed posiewem.

A zbieg mieszanej kultury powinien wynosić 100%, aby zmaksymalizować tworzenie połączeń szczelinowych między komórkami. Dane dotyczące przebiegu czasowego, zależności dawka-odpowiedź i ocena odwracalności modulatorów ze złączem szczelinowym można uzyskać za pomocą testu jodko-YFP-GJIC. Również testy GJIC specyficzne dla jodku-YFP można ustalić, indukując ekspresję interesującego połączenia w komórkach pozbawionych funkcjonalnych połączeń szczelinowych.

Umożliwia to określenie wartości IC50 substancji chemicznej określonego rodzaju koneksyny. Test jodkowy-YFP-GJIC może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, ponieważ jest solidny, powtarzalny i niedrogi. Testy te pomagają znaleźć substancje chemiczne modulujące złącza szczelinowe w celu odkrycia leku i oceny toksykologicznej.