Name: Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę Iodide-YFP-GJIC do badania komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe w liniach komórkowych LN215. Ta technika umożliwia szybki przesiew związków chemicznych w odkrywaniu leków i ocenie toksykologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397 i 2018R1A6A1A03023718).

1. Generowanie lentiwirusów eksprymujących YFPQL oraz SLC26A4
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki embrionalnej nerki HEK293T do osiągnięcia 80% konfluencji na płytkach hodowlanych o średnicy 100 mm. Jako pożywka hodowlana do utrzymania komórek HEK293T oraz pozostałych wymienionych poniżej komórek w całym protokole stosuje się DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnione o 10% płatowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny.</li>
	<li>Przygotować płytki hodowlane 6-dołkowe, dodając do każdego dołka 2 mL 0,005% roztworu sterylnej poli-L-lizyny (PLL) na 10 min. Odessać roztwór PLL i dwukrotnie przepłukać powierzchnię 2 mL sterylnej wody.</li>
	<li>Przemyć komórki HEK293T 10 mL roztworem PBS (phosphate buffered saline) i traktować monowarstwy komórek w każdej płytce 100 mm 2 mL 0,25% roztworem trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 min. Dodać 5 mL pożywki hodowlanej i resuspendować komórki.</li>
	<li>Policzyć komórki przy użyciu hemocytometru i dostosować gęstość zawiesiny komórkowej do 250 000 komórek/mL w pożywce hodowlanej, a następnie nanieść 500 000 komórek w 2 mL pożywki do każdego dołka pokrytego lizyną w płytkach 6-dołkowych. Inkubować komórki w atmosferze 5% CO2/95% powietrza w warunkach uwilgotnienia przy 37 °C przez 24 h, a następnie zastąpić pożywkę hodowlaną DMEM bez penicyliny i streptomycyny.</li>
	<li>W probówce 1,5 mL rozcieńczyć 20 µL odczynnika do transfekcji w 500 µL DMEM bez surowicy i antybiotyków. Wymieszać delikatnie za pomocą pipety i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 min.</li>
	<li>W międzyczasie nalać 250 µL DMEM do każdej z dwóch probówek 1,5 mL, a następnie dodać do każdej z nich 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL lub pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng psPAX2 oraz 375 ng pMD2.G. Dwa plazmidy lentiwirusowe zostały opisane wcześniej21. Dodać 250 µL rozcieńczonego odczynnika do transfekcji do każdej probówki z plazmidem, delikatnie wymieszać i inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 20 min dodać kroplami 500 µL kompleksów odczynnika do transfekcji i plazmidów z probówek 1,5 mL do każdego dołka płytki hodowlanej z kroku 1.4 i wymieszać, kołysząc płytką w przód i w tył. Inkubować komórki przy 37 °C w inkubatorze z CO2 przez 12 h.</li>
	<li>Wymienić pożywkę na 2,5 mL świeżej pożywki i inkubować przez dodatkowe 48 h. Następnie umieścić płytkę hodowlaną na lodzie na 5 min, aby utrzymać niską temperaturę pożywki warunkującej zawierającej lentiwirusy w celu zachowania ich zakaźności.</li>
	<li>Zebrać pożywkę zawierającą lentiwirusy i przenieść do stożkowych probówek 15 mL. Wirować przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min, a następnie usunąć pływające komórki HEK293T z supernatantu poprzez filtrację przez membranę 0,4 µm.</li>
	<li>Przechowywać pożywkę zawierającą lentiwirusy w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 2 dni. Do późniejszego zastosowania przechowywać aliquoty po 200 µL w temperaturze −80 °C.</li>
</ol>
2. Generowanie komórek LN215-YFPQL oraz LN215-I− poprzez transdukcję lentiwirusową
<ol>
	<li>Hodować komórki LN215 w 100 mm płytkach hodowlanych do osiągnięcia 80% konfluencji w pośrodku DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny zgodnie z powyższym opisem. 
	UWAGA: Jeśli test I-YFP-GJIC jest przeprowadzany z użyciem innej linii komórkowej, należy zastosować odpowiednią pożywkę hodowlaną. Komórki LN215-YFPQL oraz LN215-I- mogą zostać udostępnione przez University-Industry foundation, Yonsei University. Proszę kontaktować się z autorem korespondencyjnym.</li>
	<li>Na dzień przed transdukcją dwukrotnie przemyć komórki 10 mL PBS i traktować 2 mL 0,25% trypsyny-EDTA w 37 °C przez 3 min. Resuspendować komórki w 5 mL pożywki hodowlanej za pomocą pipety serologicznej 10 mL i dostosować gęstość do 50 000 komórek/mL. Do każdego dołka płytki hodowlanej 24-dołkowej przenieść 20 000 komórek w 400 µL pożywki w celu przygotowania grup: kontrolnej (bez wirusa), YFPQL oraz SLC26A4.</li>
	<li>Po 24 h inkubacji w 37 °C przeprowadzić transdukcję w dwóch dołkach, zastępując pożywkę hodowlaną 400 µL mieszaniny w stosunku 1:1 lentiwirusa pLVX-EIP-YFPQL lub pLenti6P-SLC26A4 ze świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną o polybrene w stężeniu końcowym 4 µg/mL. W przypadku kontroli bez wirusa zastąpić pożywką hodowlaną.</li>
	<li>Inkubować komórki w 37 °C przez 15 h, odessać pożywkę zawierającą lentiwirusy, dodać świeżą pożywkę hodowlaną i inkubować komórki przez kolejne 72 h. 
	OSTROŻNIE: Aby zapobiec kontaminacji lentiwirusami między dołkami, należy używać nowych końcówek lub pipet dla każdego dołka podczas odsysania pożywki zawierającej lentiwirusy lub dozowania świeżej pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Komórki w każdym dołku dwukrotnie przemyć 0,5 mL PBS i traktować 300 µL trypsyny-EDTA przez 3 min. Resuspendować komórki w 2 mL pożywki hodowlanej i wysiać na płytki hodowlane sześciodołkowe z dodatkiem 2 µg/mL puromycyny.</li>
	<li>Hodować komórki w pożywce zawierającej 2 µg/mL puromycyny aż do momentu, gdy wszystkie komórki w dołku kontrolnym obumrą (stanie się okrągłe lub będą pływać w obserwacji mikroskopowej), co zazwyczaj trwa tydzień. Wymieniać pożywkę zawierającą puromycynę co drugi dzień w okresie selekcji. Jeśli hodowle LN215-YFPQL lub LN215-I- osiągną konfluencję przed zakończeniem selekcji, przenieść komórki na płytkę 100 mm i kontynuować selekcję zgodnie z krokiem 2.5.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów niezbędnych do analizy
<ol>
	<li>Przygotować 500 mL roztworu C (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glukozy, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 oraz 1 mM CaCl2) i 500 mL roztworu I (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glukozy, 5 mM KCl oraz 1 mM CaCl2).</li>
	<li>Dostosować pH obu roztworów do wartości 7.4 za pomocą 1 N NaOH, a następnie wysterylizować roztwory poprzez filtrację przez filtr 0.4 µm przed przechowywaniem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca. Przed użyciem sprawdzić wartość pH.</li>
</ol>
4. Wysiewanie komórek LN215-YFPQL oraz LN215-I−
<ol>
	<li>Hodować komórki LN215-YFPQL oraz LN215-I− osobno w płytkach 100 mm w pożywce hodowlanej, aby uzyskać populacje wymagane do analizy. Do analizy na płytce 96-dołkowej wystarczająca jest konfluencja komórek LN215-YFPQL na poziomie 40% oraz LN215-I− na poziomie 80% w płytkach 100 mm.</li>
	<li>Na jeden dzień przed przeprowadzeniem analizy GJIC I-YFP przemyć każdą płytkę hodowlaną 100 mm 10 mL PBS. Potraktować każdą płytkę 2 mL 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w 37 °C przez 5 min. Resuspendować komórki z każdej płytki w 4 mL pożywki hodowlanej i przenieść do stożkowych probówek 15 mL.</li>
	<li>Zwirować komórki w celu uzyskania osadu przy 1 000 x g przez 3 min. Odlać nadsącz i resuspendować każdy osad komórkowy w 5 mL pożywki hodowlanej. Rozbić skupiska komórek do pojedynczych komórek, pipetując ciecz w górę i w dół około 20 razy za pomocą pipety serologicznej 10 mL.</li>
	<li>Policzyć komórki w komorze hemocytometrycznej, a następnie rozcieńczyć je w pożywce hodowlanej, aby przygotować zawiesiny komórkowe LN215-YFPQL o stężeniu 80 000 cells/mL oraz LN215-I− o stężeniu 160 000 cells/mL.</li>
	<li>Wmieszać 7 mL zawiesiny komórkowej LN215-YFPQL i 7 mL zawiesiny LN215-I− w zbiorniku. Do każdego dołka płytki hodowlanej 96-dołkowej dodać 100 µL mieszaniny za pomocą pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Aby dodać 100 µL mieszaniny do każdego dołka płytki 96-dołkowej, potrzeba około 10 mL zmieszanej zawiesiny komórkowej. Zaleca się przygotowanie większej ilości zawiesiny komórkowej niż jest to wymagane.</li>
	<li>Inkubować komórki w warunkach zwiększonej wilgotności, w atmosferze 5% CO2/95% powietrza w 37 °C przez 24 h. Hodowla komórek LN215-YFPQL i LN215-I− powinna osiągnąć 100% konfluencji w momencie przeprowadzania analizy.</li>
</ol>
5. Przeprowadzenie testu GJIC z użyciem I-YFP
UWAGA: Przed przeprowadzeniem analizy należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 20x oraz filtrem GFP, aby sprawdzić płytki 96-dołkowe i upewnić się, że nie ma skupisk komórek LN215-YFPQL lub LN215-SLC26A4, a kultury komórkowe są w pełni konfluentne i równomiernie rozmieszczone.
<ol>
	<li>Przynajmniej 30 min przed wykonaniem analizy włączyć czytnik mikropłytek i ustawić go na 37 °C.</li>
	<li>Przemyj przewody automatycznego wtryskiwacza 3 ml 70% etanolu, 3 ml wody destylowanej, a następnie 3 ml roztworu I przy szybkości przepływu wynoszącej 300 µL/s.</li>
	<li>Podgrzać roztwory C i I do 37 °C w łaźni wodnej. 
	UWAGA: Jako 100 µL dla każdego dołka płytki 96-dołkowej, zatem dla każdego testu potrzeba około 10 ml każdego roztworu. Do przygotowania każdej płytki wymagane jest dodatkowe 10 ml roztworu I (łącznie 20 ml), a do płukania każdej płytki dodatkowe 25 ml roztworu C (łącznie 35 ml).</li>
	<li>Odessać pożywkę wzrostową lub odwrócić płytkę, aby ją opróżnić; ostrożnie wyklepać pozostałości pożywki. 
	UWAGA: Pozostałości płodowej surowicy bydlęcej w pożywce wzrostowej powodują fluorescencję tła i obniżenie jakości analizy.</li>
	<li>Dodaj 200 µL roztworu C do każdej studzienki z rezerwuaru przy użyciu pipety wielokanałowej. Odessać roztwór C lub odwrócić płytkę, aby go opróżnić, i ostukać, by usunąć pozostałości roztworu.</li>
	<li>Dodaj 50 µL µL roztwór C, 1 µL z 2,5 mM roztworu zapasowego (patrz Tabela 1) lub dimetylosulfotlenek (DMSO) jako nośnik, a następnie 50 µL µL do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Większość reagentów w bibliotece chemicznej jest rozpuszczona w DMSO, a w większości testów opartych na komórkach dopuszczalne jest stężenie do 1% (v/v) tego rozpuszczalnika24Ponieważ DMSO ma większą gęstość niż woda, odczynniki rozpuszczone w DMSO mają tendencję do opadania na dno po dodaniu do dołków płytki hodowlanej, co zaburza stężenia roztworów testowych. Można tego uniknąć poprzez dodanie 50 µL roztworu C, odczynników w DMSO oraz 50 µL C roztworu w odpowiedniej kolejności. Ostatni 50 µL roztworu C służy do mieszania.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w powietrzu, a nie w 5% CO22Czas inkubacji można zmodyfikować, jednak zazwyczaj 10 min jest wystarczające, aby modulatory kanałów jonowych zaczęły działać.</li>
	<li>Podczas inkubacji w programie czytnika mikropłytek ustaw funkcję wtryskiwania 100 µL roztworu I do każdej studzienki w czasie 1 s i zmierzyć fluorescencję przez 10 s w odstępach 0,4 s. Ustawyć czytnik tak, aby odczytywał fluorescencję od dołu. Zalecana prędkość wtrysku wynosi 135 µL/sUstaw długość fali wzbudzenia na 485 nm i odczytaj emisję przy 520 nm. 
	UWAGA: Szczegółowe ustawienia programów czytnika mikropłytek są następujące.
	<ol>
		<li>Kliknij w Zarządzanie protokołami przycisk</li>
		<li>Kliknij Nowy Przycisk. Wybierz Intensywność fluorescencji w sekcji metody pomiarowe, a Tryb wielodołkowy w sekcji trybu czytania. Następnie kliknij Proszę podać tekst do tłumaczenia. przycisk. Pojawi się nowa karta.</li>
		<li>W Podstawowe parametry menu, ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nm, a emisji na 520 nm. Wybierz Dolna optyka aby odczytać fluorescencję od dołu. Ustaw czas rozpoczęcia pomiaru na „0 s”, liczbę interwałów na „25”, liczbę błysków na studzienkę oraz interwał na „20”, a czas interwału na „0,4 s”.</li>
		<li>W Układ menu, zaznacz obszar płytki do odczytu.</li>
		<li>W Stężenia/Objętości/Mieszanie menu, ustaw czytnik mikropłytek na wtryskiwanie 100 µL roztworu I do każdej studzienki za pomocą 135 µL/s prędkość wtrysku 
		UWAGA: Należy unikać zbyt dużych prędkości wstrzykiwania, ponieważ mogą one doprowadzić do odklejenia się komórek.</li>
		<li>W Czas wtrysku menu, ustaw czas rozpoczęcia wtrysku na 1 s. Następnie kliknij Rozpocznij pomiar przycisk</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji umieść płytki 96-dołkowe w czytniku mikropłytek i rozpocznij pomiar, klikając Rozpocznij pomiar ponownie przycisk</li>
</ol>
6. Obliczanie aktywności GJIC
<ol>
	<li>Obliczyć procentowe wygaszanie YFPQL oraz aktywność GJIC zgodnie z23 
	Wygaszanie YFPQL (%) = <img alt="Wzór na retencję fluorescencji YFP w mikroskopii, schemat badania białek, obliczenia fluorescencji." src="/files/ftp_upload/58966/58966eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	Aktywność GJIC (%) = <img alt="Równowaga statyczna, równanie; analiza wygaszania YFP, wzór do porównywania danych naukowych, wynik eksperymentu." src="/files/ftp_upload/58966/58966eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	UWAGA: W zasadzie aktywność GJIC powinna być obliczana z różnicy między procentową fluorescencją YFP w studzienkach z komórkami akceptorowymi i donorem a odpowiadającymi im studzienkami zawierającymi wyłącznie komórki akceptorowe. Jednakże, ponieważ komórki LN215-YFPQL wykazują pomijalne wygaszanie YFP przez jodek po 10 s, nie uwzględniamy tła wygaszania YFP podczas przeprowadzania HTS z użyciem komórek LN215-YFPQL i LN215-I-.</li>
</ol>

<ol><li>Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins%2C+connexons%2C+and+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Connexins, connexons, and Intercellular Communication.</a> Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+Gap+Junctional+Intercellular+Communication+as+a+Biomarker+of+PAH+Epigenetic+Toxicity%3A+Structure-Function+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship.</a> Environmental Health Perspectives. 106, 975(1998).</li>
<li>U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+toxicology+as+toxicant-induced+changes+in+intracellular+signalling+leading+to+altered+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology Letters. , 71-78 (1998).</li>
<li>Yamasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+disrupted+gap+junctional+intercellular+communications+in+detection+and+characterization+of+carcinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens.</a> Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).</li>
<li>Yamasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+and+cell+proliferation+during+rat+liver+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis.</a> Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+target+for+liver+toxicity+and+carcinogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).</li>
<li>Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+in+astrocytic+connexin+43+gap+junction+levels+may+exacerbate+generalized+seizures+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).</li>
<li>Garbelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+connexin+43+in+the+human+epileptic+and+drug-resistant+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex.</a> Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).</li>
<li>Schulz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+43+is+an+emerging+therapeutic+target+in+ischemia%2Freperfusion+injury%2C+cardioprotection+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection.</a> Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).</li>
<li>Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+gap+junction+channels+in+the+pathophysiology+of+migraine+with+aura%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura.</a> Frontiers in Physiology. , (2014).</li>
<li>Patel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+inhibition+prevents+drug-induced+liver+toxicity+and+fulminant+hepatic+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).</li>
<li>Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+living+skin+equivalent+amenable+to+live-cell+imaging%3A+analysis+of+the+roles+of+connexins+in+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+2+%2C+6+%2C+and+8+carbon+ceramides+on+the+modulation+of+gap+junctional+communication+and+apoptosis+during+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis.</a> Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Weis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+Baylike+Regions+of+Polycyclic+Aromatic+Hydrocarbons+Were+Potent+Inhibitors+of+Gap+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication.</a> Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-Loading+and+Dye+Transfer%3A+A+Rapid+and+Simple+Technique+to+Study+Gap+Junctional+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication.</a> Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+Assay+of+Gap+Junction-+Mediated+Communication+Between+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advancement+of+Science%22%5BJournal%5D)">Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells.</a> Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).</li>
<li>Abbaci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+gap-FRAP+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique.</a> Proceedings of SPIE. , 585909(2005).</li>
<li>Neyton, J., Trautmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+of+an+intercellular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents of an intercellular junction.</a> Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).</li>
<li>Wilders, R., Jongsma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+dual+voltage+clamp+method+in+assaying+conductance+and+kinetics+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels.</a> Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).</li>
<li>Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-throughput+screening-compatible+gap+junctional+intercellular+communication+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein-based+halide+indicators+with+improved+chloride+and+iodide+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities.</a> FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).</li>
<li>Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbinafine+inhibits+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).</li>
<li>Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Principles of early drug discovery.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Integrative+Signaling+Through+Gap+Junctions+in+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2011).</li>
<li>Schalper, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gap+junction+channels+and+hemichannels+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors.</a> Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).</li>
<li>Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+induces+apoptotic+cell+death+in+a+subset+of+Balb+%2F+c+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).</li>
<li>Harris, A. L., Locke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+Connexin+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Connexins%22%5BJournal%5D)">Permeability of Connexin Channels.</a> Connexins. , 165-206 (2009).</li>
<li>Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gambogic+Acid+and+Its+Analogs+Inhibit+Gap%5BTitle%5D)+AND+%22Junctional+Intercellular+Communication%22%5BJournal%5D)">Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap.</a> Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Test I-YFP-GJIC może być stosowany do HTS, ponieważ jest solidny, szybki i niedrogi. Test HTS uważa się za odporny, jeśli współczynnik Z' jest powyżej 0,525. Patrz Zhang et al., aby zapoznać się z opisem analizy statystycznej stosowanej do oceny przydatności testów HTS25. Gdy użyto komórek LN215, współczynnik Z' wynosił >0,5 bez żadnej optymalizacji testu. Jeśli w teście stosuje się inne typy komórek, a ich współczynnik Z' wynosi <0,5, odporność można poprawić, wydłużając c...

Połączenia szczelinowe (GJ) działają jak kanały międzykomórkowe, umożliwiając dyfuzję małych cząsteczek o <1 kDa, takich jak składniki odżywcze, metabolity i cząsteczki sygnałowe między sąsiednimi komórkami. Elementy połączeniowe obejmują półkanał lub konekton w każdej komórce, a każde połączenie składa się z sześciu połączeń (Cxs)1. GJ i Cxs zostały użyte w testach toksykologicznych czynników rakotwórczych, takich jak wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), które są inhibitorami GJ2,3,4. Zakłócony GJIC jest związany z niegenotoksyczną kancerogenezą5,6. Jako potencjalny cel terapeutyczny, udział GJ został zgłoszony w określonych podtypach napadów7,8, ochrona przed niedokrwieniem serca i mózgu/uszkodzeniem reperfuzyjnym9, migrena z aurą10, polekowe uszkodzenie wątroby6,11 i gojenie się ran12. Wysokoprzepustowe testy przesiewowe (HTS) są wymagane do identyfikacji substancji chemicznych lub przeciwciał modulujących GJ w celu odkrycia leków, testów toksykologicznych oraz identyfikacji nowych komórkowych regulatorów aktywności GJ. Testy HTS mogą być również wykorzystywane do badania zależności struktura-aktywność modulatorów GJ2,13,14,15.
Niektóre testy GJIC obejmują techniki transferu barwnika lub podwójnego zacisku punktowego. Żółcień lucyferowa CH (LY) i ester acetoksymetylowy kalceiny (calceina-AM) były stosowane w testach transferu barwnika. Ogniwa nie są przepuszczalne dla LY, który jest wprowadzany przez mikroiniekcję, ładowanie skrobaniem lub elektroporację. Po wejściu do komórki LY rozprzestrzenia się na sąsiednie komórki za pośrednictwem GJ, a aktywność GJ jest oznaczana na podstawie zakresu migracji LY16. Testy Calcein-AM zwykle obejmują odzyskiwanie fluorescencji szczelinowej po fotowybielaniu17,18. Calcein-AM to barwnik przenikający komórkę, który jest przekształcany wewnątrzkomórkowo w nieprzepuszczalną kalceinę przez wewnętrzną esterazy. Test wymaga mikroskopu konfokalnego, aby zaobserwować transfer kalceiny-AM do komórki z otaczających ją osób po laserowym fotowybielaniu. Jeśli obecne są funkcjonalne GJ, kalceina-AM w sąsiednich komórkach dostaje się do komórek wybielonych fotometrycznie i fluorescencja zostaje odzyskana. Aktywność GJ jest oznaczana na podstawie stopnia odzysku fluorescencji komórek wybielonych fotodynamicznie. Testy transferu barwnika są pracochłonne i czasochłonne lub mają niską czułość. Mocowanie z podwójną łatą to metoda elektrofizjologiczna, która mierzy przewodność złącza. Jest stosunkowo czuły, z bezpośrednią zależnością przewodności od liczby otwartych GJs19; Jest to jednak technicznie wymagające, czasochłonne i kosztowne20. Test I-YFP-GJIC został opracowany do stosowania w HTS.
Rysunek 1 ilustruje komponenty i etapy testu I-YFP GJIC, który wykorzystuje komórki akceptorowe wyrażające wrażliwy na jodek wariant YFP o cechach H148Q i I152L (YFPQL) oraz komórki dawcy wyrażające transporter jodku (SLC26A4)21. Dwie mutacje przenoszone przez YFPQL pozwalają na wygaszanie fluorescencji przez jodek22. Jodyki są dodawane do współhodowanych komórek akceptorowych i donorowych; Nie dostają się one do komórek akceptorowych, ale są pobierane przez SLC26A4 transportery obecne na komórkach dawcy. Jodki w komórkach dawcy dyfundują przez funkcjonujące GJ do sąsiednich komórek akceptorowych, gdzie wygaszają fluorescencjęYFP QL. Jeśli GJ są zamknięte lub zablokowane przez inhibitory, jodek nie może dostać się do komórek akceptorowych w celu wygaszenia fluorescencji. Szybkość hartowaniaYFP QL odzwierciedla aktywność GG. Procedura testowa I-YFP GJIC nie jest ani skomplikowana, ani czasochłonna. Jest kompatybilny z HTS i może być stosowany do badania wpływu dużej liczby związków na aktywność GJ w stosunkowo krótkim czasie. Wymaga tylko komórek akceptorowych i donorowych oraz dwóch zrównoważonych roztworów soli. Opisany poniżej protokół jest oparty na komórkach LN215, których głównym Cx jest Cx4321. Receptor LN215-YFPQL i komórki dawcy LN215-I− zostały wygenerowane przez transdukcję z lentiwirusami eksprymującymi YFPQL lub SLC26A421,23.

<table><tbody><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>D-(+)-glukozy</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C-roztwór, roztwór</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>RES6003H-B7</td><td>C-roztwór, roztwór</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Odczynnik do transfekcji</td> <td>Invitrogen</td><td>11668-027</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>C-roztwór</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek&nbsp;</td><td>BMG LabTech&nbsp;</td><td>POLARstar Omega 415-1618</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>C-roztwór, roztwór</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#12260</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>C-roztwór, roztwór</td></tr><tr><td>Hyroxide sodu (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Jodek sodu (NaI)</td><td>Sigma</td><td>383112</td><td>roztwór</td></tr></tbody></table>

test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Połączenia szczelinowe (GJ) to kanały błony komórkowej, które umożliwiają dyfuzję cząsteczek mniejszych niż 1 kDa między sąsiednimi komórkami. Ponieważ pełnią one rolę fizjologiczną i patologiczną, istnieje potrzeba wysokoprzepustowych testów przesiewowych (HTS) w celu identyfikacji modulatorów GJ w testach odkrywania leków i toksykologii. Nowy test komunikacji międzykomórkowej (I-YFP-GJIC) oparty na jodkowo-żółtej fluorescencji białkowej, łączącej lukę białkową i komunikację międzykomórkową (I-YFP-GJIC). Jest to test komórkowy obejmujący komórki akceptorowe i dawcze, które są zaprojektowane tak, aby stabilnie wyrażały wariant białka żółtej fluorescencji (YFP), którego fluorescencja jest wrażliwie wygaszana odpowiednio przez jodek lub SLC26A4, transporter jodku. Kiedy jodek jest dodawany do mieszanej kultury dwóch typów komórek, dostają się one do komórek dawcy przez transporter SLC26A4 i dyfundują do sąsiednich komórek akceptorowych przez GJ, gdzie wygaszają fluorescencję YFP. Fluorescencja YFP jest dobrze mierzona w trybie kinetycznym. Szybkość hartowania YFP odzwierciedla aktywność GJ. Test jest wystarczająco wiarygodny i szybki, aby można go było zastosować do HTS. Opisano protokół testu I-YFP-GJIC z wykorzystaniem komórek LN215, ludzkich komórek glejaka.

Do przesiewania 2 320 substancji chemicznych w celu zidentyfikowania nowych modulatorów GJIC wykorzystano dwadzieścia dziewięć 96-dołkowych płytek hodowlanych, stosując test GJIC z użyciem I-YFP oraz komórek LN215-YFPQL i LN215-I−. Wyniki uzyskane dla reprezentatywnej płytki przedstawiono na Rysunku 2. Procent fluorescencji YFP w każdym dołku przedstawiono jako wykres liniowy na Rysunku 2A, ...

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiego testu komunikacji międzykomórkowej z połączeniem szczelinowym, przeznaczonego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych modulujących złącze szczelinowe w celu odkrycia leków i oceny toksykologicznej.

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Połączenia szczelinowe zostały zasugerowane jako cele leków. Test jodkowy-YFP-GJIC jest kompatybilny z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi w celu wykrycia modulatorów złączy szczelinowych. Zostały one wykorzystane do przetestowania wpływu dużej liczby związków na aktywność złączy szczelinowych w stosunkowo krótkim czasie.Test jodkowy-YFP-GJIC jest prosty, solidny, powtarzalny i niedrogi. Ten test wymaga tylko komórek akceptorowych i dawczych oraz dwóch zrównoważonych roztworów soli. Nie są potrzebne żadne dodatkowe odczynniki, takie jak Lucifer yellow i Calcein AM.Mierzy również całkowitą aktywność połączeń szczelinowych komórek w pojedynczym dołku, co skutkuje niską zmiennością między dołkami. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować komórki LN215 do 80% konfluencji w uzupełnionym DMEM, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dzień przed transdukcją przemyć komórki dwukrotnie 10 mililitrami PBS.Dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej i dostosuj gęstość komórek do 50 000 komórek na mililitr. Dodaj 400 mikrolitrów pożywki, która zawiera 20 000 komórek, do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia przeprowadź transdukcję dwóch studzienek, zastępując pożywkę hodowlaną 400 mikrolitrami mieszaniny jeden do jednego lentiwirusa i świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej polibrenem w końcowym stężeniu czterech mikrogramów na mililitr. W przypadku kontroli bez wirusów należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką uzupełnioną polibrenem o końcowym stężeniu czterech mikrogramów na mililitr.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 godzin. Następnie odessać pożywkę zawierającą lentiwirusy i świeżą pożywkę hodowlaną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dodatkowe 72 godziny.Następnie umyj komórki w każdej studzience dwukrotnie 0,5 mililitra PBS. Dodaj 300 mikrolitrów 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej, a następnie umieścić je na sześciodołkowych płytkach hodowlanych z dwoma mikrogramami na mililitr puromycyny.Hoduj komórki, aż wszystkie komórki w studzienkach kontrolnych będą martwe, co zwykle trwa około tygodnia. Po pierwsze, oddzielnie hoduj komórki jodkowe LN215-YFP i LN215 na 100-milimetrowych płytkach w pożywce hodowlanej, aby dotrzeć do populacji wymaganych do testu. Dzień przed badaniem umyj każdą płytkę 10 mililitrami PBS.Potraktuj każdą płytkę dwoma mililitrami 0,25% roztworu trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie zawiesić komórki w czterech mililitrach pożywki hodowlanej i przenieść je do 15-mililitrowych stożkowych probówek. Wirować przy 1 000 g przez trzy minuty w celu osadzenia komórek.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej. Pipetuj w górę i w dół około 20 razy, aby rozbić wszelkie grudki komórek. Użyj hemocytometru, aby policzyć komórki.A następnie rozcieńczyć komórki w pożywce hodowlanej, aby uzyskać zawiesinę komórek o pokazanych tutaj gęstościach. Następnie wymieszaj ze sobą siedem mililitrów każdej zawiesiny komórkowej w zbiorniku. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 100 mikrolitrów tej mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki hodowlanej.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Najpierw użyj mikroskopu fluorescencyjnego z 20-krotnym powiększeniem i filtrem GFP, aby sprawdzić 96-dołkowe płytki, aby upewnić się, że nie ma grudek komórek i że kultury są w pełni zlewające się i dobrze rozprowadzone. Co najmniej 30 minut przed badaniem włącz czytnik mikropłytek i ustaw go na 37 stopni Celsjusza.Umyj rurkę automatycznego wtryskiwacza trzema mililitrami 70% etanolu, trzema mililitrami wody destylowanej i trzema mililitrami roztworu I. Następnie podgrzej roztwory C i I do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Albo zassać pożywkę wzrostową, albo odwrócić płytkę, aby ją opróżnić.Wytrząśnij resztki nośnika. Następnie dodaj roztwór C do zbiornika za pomocą pipety wielokanałowej, aby dodać 200 mikrolitrów roztworu C do każdego dołka płytki. Albo zassać roztwór, albo odwrócić płytkę, aby ją opróżnić, tak aby usunąć resztki roztworu.Dodaj 50 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki. Następnie dodaj jeden mikrolitr 2,5-milimolowego materiału chemicznego lub DMSO jako nośnik i dodaj kolejne 50 mikrolitrów roztworu C do każdej studzienki. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na powietrzu przez około 10 minut.Podczas inkubacji należy rozpocząć ustawianie parametrów w programie czytnika mikropłytek, klikając przycisk Manage Protocols (Zarządzaj protokołami). Kliknij przycisk Nowy. Wybierz Intensywność fluorescencji w sekcji Metoda pomiaru i Tryb studni w sekcji Tryb odczytu.Następnie kliknij przycisk OK. Pojawi się nowa karta. W menu Parametry podstawowe ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nanometrów, a emisję na 520 nanometrów.Wybierz dolną optykę, aby odczytać fluorescencję od dołu. Następnie ustaw czas rozpoczęcia pomiaru na zero sekund, liczbę interwałów na 25, liczbę błysków na studzienkę i interwał na 20, a czas interwału na 0,4 sekundy. W menu Układ narysuj obszar płyty, który ma zostać odczytany.W menu Concentrations/Volumes/Shacking ustaw czytnik mikropłytek tak, aby wstrzykiwał 100 mikrolitrów roztworu I do każdej studzienki z prędkością wtrysku 135 mikrolitrów na sekundę. W menu Injection Time (Czas wstrzyknięcia) ustaw czas rozpoczęcia wstrzyknięcia na jedną sekundę. Następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar.Po zakończeniu inkubacji przenieś 96-dołkowe płytki do czytnika mikropłytek i rozpocznij pomiar, ponownie klikając przycisk Rozpocznij pomiar. W tym badaniu test komunikacji międzykomórkowej połączenia jodowo-żółtego fluorescencyjnego białka z przerwą między komórkami jest używany z komórkami jodowymi LN215-YFP i LN215 do badania przesiewowego 2 320 substancji chemicznych w celu zidentyfikowania nowych modulatorów komunikacji wewnątrzkomórkowej ze złączem szczelinowym. Uważa się, że homosalat hamuje 50% komunikacji wewnątrzkomórkowej w połączeniu szczelinowym.Podczas gdy terbinafina całkowicie go hamuje. Potwierdza to, że terbinafina jest inhibitorem połączeń szczelinowych. Ten test mierzy GJIC między sąsiednimi komórkami dawcy i akceptora, więc komórki dawcy i akceptora muszą być całkowicie zdysocjowane przed posiewem.A zbieg mieszanej kultury powinien wynosić 100%, aby zmaksymalizować tworzenie połączeń szczelinowych między komórkami. Dane dotyczące przebiegu czasowego, zależności dawka-odpowiedź i ocena odwracalności modulatorów ze złączem szczelinowym można uzyskać za pomocą testu jodko-YFP-GJIC. Również testy GJIC specyficzne dla jodku-YFP można ustalić, indukując ekspresję interesującego połączenia w komórkach pozbawionych funkcjonalnych połączeń szczelinowych.Umożliwia to określenie wartości IC50 substancji chemicznej określonego rodzaju koneksyny. Test jodkowy-YFP-GJIC może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, ponieważ jest solidny, powtarzalny i niedrogi. Testy te pomagają znaleźć substancje chemiczne modulujące złącza szczelinowe w celu odkrycia leku i oceny toksykologicznej.

an-iodide-yellow-fluorescent-protein-gap-junction-intercellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano procedurę przesiewową w czasie rzeczywistym służącą do identyfikacji leków oddziałujących z kanałami K+ wewnątrzstymulowanymi, bramkowanymi przez białka G (GIRK). Test wykorzystuje fluorescencyjne barwniki czułe na potencjał błonowy do pomiaru aktywności kanałów GIRK. Technika ta może być dostosowana do zastosowania w wielu liniach komórkowych.

Fluorescencyjny test przesiewowy do identyfikacji modulatorów kanałów GIRK

Przedstawiono metody opracowania i walidacji ilościowego testu fluorescencyjnego do pomiaru aktywności kanałów potasowych prostujących do wewnątrz (Kir) w celu wysokoprzepustowego przesiewu związków.

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w celu poszukiwania małocząsteczkowych modulatorów potasowych kanałów prostujących do wewnątrz

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Tutaj prezentujemy protokół do wyrażania białek połączeniowych w oocytach Xenopus i rejestrowania prądu połączeniowego między dwoma przypisanymi oocytami za pomocą komercyjnego wzmacniacza zaprojektowanego do zapisów napięcia z dwoma oocytami w trybie pomiaru wysokiego prądu bocznego.

Rejestrowanie prądu złącza szczelinowego z oocytów Xenopus

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Poznaj metodę Iodide-YFP-GJIC do badania komunikacji międzykomórkowej przez złącza szczelinowe w liniach komórkowych LN215. Ta technika umożliwia szybki przesiew związków chemicznych w odkrywaniu leków i ocenie toksykologicznej.

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Przeglądaj więcej filmów