Ocena integralności DNA komórek macierzystych w terapii komórek serca

W przypadku chorób noworodków, takich jak kardiomiopatia, terapia regeneracyjna z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek pochodzących z komórek macierzystych ma ogromny potencjał. Jednak przyspieszony wzrost komórek in vitro prowadzi do uszkodzenia DNA przez nagromadzone metabolity, takie jak reaktywne formy tlenu. Przeszczepienie tych uszkodzonych przez DNA komórek skutkowałoby słabym wszczepieniem i regeneracją narządu.

Przed przeszczepem należy ocenić jakość komórek. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły krok po kroku do oceny uszkodzeń DNA w komórkach macierzystych. Procedury zademonstrują Jessica Miller, badaczka, Nikhil Mardhekar, badaczka i Vasanthi Rajasekaran, technik laboratoryjny.

Na początek umieść 500 miligramów niskotopliwej agarozy w 100 mililitrach wody wolnej od DNA-RNA. Podgrzej butelkę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Następnie umieść butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna.

Aby przygotować wstępnie powlekane szkiełka kometowe, umieść kilka kropli 0,5% agarozy na szklanym szkiełku. Natychmiast rozprowadź agarozę, aby utworzyć cienką warstwę powłoki agarozowej za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pracując w warunkach słabego oświetlenia, aby uniknąć uszkodzenia komórek wywołanego światłem ultrafioletowym, wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i 90 mikrolitrów roztworu agarozy w probówce.

Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec zestaleniu się agarozy. Wymieszaj roztwór bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i odpipetuj 70 mikrolitrów na plamkę na wstępnie pokryty szkiełko kometowe. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź mieszaninę agarozy komórkowej, aby utworzyć cienką warstwę.

Umieść szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut. W pojemniku całkowicie zanurz szkiełko w buforze do lizy zimnej. Umieść pojemnik w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę.

Zastąp bufor do lizy zimnym roztworem alkalicznym. Upewnij się, że prowadnice są całkowicie zanurzone. Po pozostawieniu pojemnika w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kolejne 30 minut, umieść szkiełko w poziomym zbiorniku do elektroforezy.

Napełnij zbiornik zimnym buforem do elektroforezy alkalicznej, aż szkiełka zostaną całkowicie zanurzone. Zastosuj napięcie o napięciu jednego wolta na centymetr przez 15 do 30 minut. W pojemniku całkowicie zanurz szkiełko w zimnej wodzie dejonizowanej.

Po dwóch minutach usuń wodę dejonizowaną i dodaj świeżą wodę dejonizowaną, a następnie powtórz ten krok po raz drugi. Następnie zastąp wodę dejonizowaną zimnym 70% etanolem. Po pięciu minutach delikatnie zdejmij szkiełko, nie przechylając go, i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.

Po wysuszeniu dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika DNA do każdego miejsca i odczekaj 15 minut w temperaturze pokojowej. Używając filtra FITC w mikroskopie epifluorescencyjnym, wykonaj zdjęcia łącznie od 50 do 100 komet w próbce. Posiew kardiomiocytów pochodzących z iPS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby zobaczyć kardiomiocyty pochodzące z iPS na szkiełkach komorowych, najpierw wyrzuć pożywkę hodowlaną ze studzienek i trzykrotnie umyj komórki PBS. Dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny na studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Sprawdź płytkę pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek.

Następnie dodaj jeden mililitr CMM, aby zatrzymać trypsynę. Umieść zawiesinę komórkową w 15-mililitrowej probówce i wiruj przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 200 razy g. Wyrzuć pożywkę, dodaj jeden mililitr CMM i ponownie zawieś komórki.

Policz komórki i dostosuj liczbę komórek, aby uzyskać dwa miliony komórek w 1,6 mililitra współrzędnościowej maszyny pomiarowej. Teraz wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek szkiełka ośmiodołkowego. Delikatnie dotknij slajdu, aby rozmieścić komórki wokół studni.

Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku leczenia doksorubicyną kardiomiocytów pochodzących z iPS należy wyrzucić pożywkę hodowlaną z dołków kardiomiocytów pochodzących z iPS i przemyć komórki PBS. Traktuj komórki jednomikromolową doksorubicyną przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Odessać pożywkę i przemyć komórki PBS. Aby wykonać znakowanie immunoznakowane, umyj komórki trzykrotnie PBS i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu do każdej studzienki. Utrwal komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.

Po umyciu komórek PBS dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego do studzienki i blokować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i dodać 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Po inkubacji przez 45 minut w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, umyć studzienki trzykrotnie PBS.

Usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał wtórnych. Inkubować przez 45 minut w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki trzykrotnie PBS.

Umyj wodą dejonizowaną przed zamontowaniem prowadnic z płynem zapobiegającym blaknięciu. Umieść szklankę nakrywkową i przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą mikroskopu konfokalnego wykonaj od trzech do pięciu zdjęć losowych pól na próbkę i przystąp do analizy obrazu.

Aby policzyć ogniska odpowiedzi na uszkodzenia DNA, pobierz i zainstaluj CellProfiler. Wybierz plik, import, potok z pliku i wybierz plik potoku o nazwie puncti gamma-H2AX. Przeciągnij i upuść folder zawierający pozyskane obrazy ognisk gamma-H2AX do okna listy plików w sekcji obrazów modułów wejściowych w celu analizy.

Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w protokole tekstowym. Aby ustawić parametry obrazów, przeciągnij żądany obraz do analizy na listę plików. W obszarze Moduły wejściowe wybierz obrazy.

Również w modułach wejściowych wybierz metadane, a następnie wybierz nazwy i typy. W przypadku grup wybierz opcję nie. Pracując w modułach analizy, wybierz kolor na szary.

Następnie wybierz pozycję wygładzanie, wybierz opcję Identyfikuj obiekty podstawowe i ponownie wybierz pozycję wygładzanie. Następnie wybierz opcję Ulepsz lub wyłącz obiekty, a następnie wybierz opcję Identyfikuj obiekty podstawowe. Nadal pracując w modułach analizy, wybierz powiąż obiekty, następnie klasyfikuj obiekty, a na końcu wybierz eksport do arkusza kalkulacyjnego.

Kliknij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym panelu, aby przeprowadzić analizę obrazu. Po pomyślnym zakończeniu analizy generowanych jest kilka obrazów. Zanotuj plik CSV, który został wygenerowany i zapisany w odpowiedniej lokalizacji na komputerze.

Plik ten zawiera dane ilościowe do dalszej analizy. W arkuszu kalkulacyjnym o nazwie obraz mojego eksperymentu kolumna B będzie zawierała liczbę jąder, które mają do pięciu punktów, a kolumna D będzie zawierała liczbę jąder, które mają więcej niż pięć punktów. Dodaj kolumny B i D, aby uzyskać całkowitą liczbę jąder.

Powtórz te kroki dla wszystkich obrazów, zmieniając nazwę pliku mojego eksperymentu przed każdą analizą. Reprezentatywne mikrofotografie komet z komórek iPS poddanych działaniu dokso, i niepotraktowanych dokso, pokazano tutaj. W komórkach iPS stwierdzono podstawową ilość uszkodzeń DNA, wyrażoną jako ułamek uszkodzenia DNA i momentu ogonowego.

Jednak leczenie dokso, zgodnie z oczekiwaniami, zwiększyło uszkodzenia DNA w komórkach iPS, co wskazuje, że test komety może być wykorzystany do oceny integralności DNA w pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Reprezentatywne mikrofotografie znakowania immunologicznego gamma-H2AX są pokazane tutaj, w mniejszym powiększeniu i przy większym powiększeniu. W kontrolnych kardiomiocytach pochodzących z iPS ponad 90% komórek miało mniej niż pięć ognisk DDR na jądra.

W sumie mniej niż 10% komórek miało więcej niż sześć ognisk DDR na jądro. W przypadku kardiomiocytów pochodzących z iPS hodowanych przez sześć miesięcy, mniej niż 90% komórek miało do pięciu ognisk DDR na jądra, a łącznie ponad 13% komórek miało więcej niż sześć ognisk DDR na jądro. Natomiast w kardiomiocytach pochodzących z iPS poddanych działaniu dokso, mniej niż 80% komórek miało do pięciu ognisk DDR na jądro.

W sumie około 24% komórek miało więcej niż sześć ognisk DDR na jądro. Dane te wskazują, że przedłużona hodowla komórek kardiomiocytów pochodzących z iPS i leczenie dokso spowodowały znaczne uszkodzenie DNA, co czyni je nieodpowiednimi do przeszczepu komórek. Bardzo ważne jest, aby unikać zmiennych podczas mieszania zawiesiny ogniw, ponieważ może to wpłynąć na elektroforezę.

Po tej procedurze można przeprowadzić testy komet i procedury znakowania immunologicznego na komórkach różnych typów. Techniki te pozwolą na ocenę różnego rodzaju komórek pod kątem uszkodzeń DNA przed ich wykorzystaniem w badaniach nad przeszczepami komórek.