Name: Ocena integralności DNA komórek macierzystych w terapii komórek serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj protokoły oceny integralności DNA w komórkach macierzystych przed transplantacją. Metody te zapewniają jakość komórek i poprawiają skuteczność terapii regeneracyjnej w leczeniu chorób serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty National Heart, Lung, and Blood Institute RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 i UO1-HL-134764 (dla J. Zhanga) oraz przez American Heart Association Scientific Development Grant 17SDG33670677 (dla R. Kannappan).

1. Test komety
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynnika
	<ol>
		<li>W przypadku agarozy o niskiej temperaturze topnienia umieść 500 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml wody wolnej od DNA/RNA. Podgrzej butelkę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Umieść butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż będzie potrzebna. 
		nuta: Więcej informacji można znaleźć w Azqueta et al., którzy badali wpływ stężenia agarozy na czas odwijania DNA i kilka czynników elektroforezy23.</li>
		<li>Rozcieńczyć zielony barwnik DNA SYBR w buforze Tris-EDTA (TE) w stosunku 1:10 000, aby uzyskać 1x roboczy roztwór barwnika podstawowego. Ten barwnik jest wrażliwy na światło, więc przechowuj go w ciemnym miejscu.</li>
		<li>W przypadku buforu do lizy komórek rozpuść 100 ml buforu do lizy (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100) w wodzie dejonizowanej (DI H2O). Następnie dodaj 10 M NaOH, aby dostosować pH do 10,0. Schłodzić bufor do temperatury 4 °C.</li>
		<li>W przypadku alkalicznego buforu do odwijania/elektroforezy należy rozpuścić 1 l roztworu alkalicznego (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) w DI H2O. Schłodzić bufor do temperatury 4 °C. Upewnij się, że pH >13.</li>
		<li>W przypadku wstępnie powlekanych szkiełek kometarnych umieść kilka kropli 0,5% agarozy na szklanym szkiełku. Natychmiast, korzystając z płaskiej powierzchni innego szkiełka, rozprowadź agarozę, aby utworzyć cienką warstwę powłoki agarozowej. 
		nuta: Wysuszyć szkiełka przed użyciem.</li>
		<li>W przypadku hodowli komórek iPS należy krótko hodować komórki iPS na płytkach hodowlanych pokrytych błoną podstawną (patrz tabela materiałów) w pożywce hodowlanej mTESR1 aż do osiągnięcia konfluencji. 
		nuta: W tym protokole wykorzystano komórki iPS pochodzące z ludzkich fibroblastów serca. Przeprogramowanie warunków wyprowadzania komórek iPS i hodowli jest opisane w ostatnich artykułach naszej grupy badawczej12,13,21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Wyrzuć pożywkę hodowlaną i umyj komórki. Oddziel komórki za pomocą roztworu oddzielającego (patrz Tabela materiałów). Przemyć osad komórkowy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i ponownie zawiesić komórki w PBS w stężeniu 1 x 105 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatu próbnego 
	nuta: Wykonaj następujące czynności w warunkach słabego oświetlenia, aby uniknąć uszkodzenia komórek wywołanego światłem ultrafioletowym.
	<ol>
		<li>Wymieszać 10 μl zawiesiny komórek i 90 μl roztworu agarozy (w stosunku 1:10) w probówce. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec zastygnięciu agarozy.</li>
		<li>Wymieszać roztwory bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i odpipetować 70 μl/punkt na wstępnie powlekane szkiełko komety. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź mieszaninę agarozy komórkowej, aby utworzyć cienką warstwę. Umieść szkiełko w temperaturze 4 °C na 15 minut.</li>
		<li>W pojemniku całkowicie zanurz szkiełko w buforze do lizy zimnej. Umieścić pojemnik w ciemności w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.</li>
		<li>Zastąp bufor do lizy zimnym roztworem alkalicznym. Upewnij się, że prowadnice są całkowicie zanurzone. Umieścić pojemnik w ciemności w temperaturze 4 °C na 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroforezy
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko w poziomym zbiorniku do elektroforezy. Napełnij zbiornik zimnym buforem do elektroforezy alkalicznej, aż szkiełka zostaną całkowicie zanurzone. Zastosuj napięcie 1 V/cm przez 15 do 30 min. 
		nuta: Całkowite napięcie = odległość między elektrodami x 1 V</li>
		<li>W pojemniku całkowicie zanurzyć szkiełko w zimnym DIH 2O. Po 2 minutach usuń DI H2O i dodaj nowy DI H2O. Powtórz ten krok.</li>
		<li>Zastąp DIH 2O zimnym 70% etanolem. Odczekaj 5 min. Delikatnie zdejmij szkiełko, nie przechylaj go i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Po wysuszeniu dodaj 100 μl rozcieńczonego barwnika DNA do każdego miejsca. Odczekaj 15 minut w temperaturze pokojowej. Używając filtra FITC w mikroskopie epifluorescencyjnym, wykonaj zdjęcia łącznie od 50 do 100 komet w próbce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza obrazu i obliczanie wyników
	<ol>
		<li>Do oceny komet, użyj wtyczki ImageJ with comet basay firmy National Institutes of Health (NIH) (pobierz ImageJ tutaj: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; pobierz wtyczkę tutaj: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). 
		nuta: Do wtyczki dołączona jest instrukcja PDF, która zawiera wszystkie szczegóły do przeprowadzenia analizy. Dodatkowo, zrzuty ekranu z analizy komety pokazane są na rysunku 2A-C. Reprezentatywne obrazy komet komórek iPS z grupy kontrolnej i leczonych doksorubicyną (Doxo) oraz kwantyfikacja komet są pokazane na rysunku 3A-C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odpowiedź na uszkodzenie DNA
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki i odczynnika
	<ol>
		<li>W przypadku hodowli komórkowej iPS-CM należy hodować komórki iPS-CM na płytkach hodowlanych pokrytych błoną podstawną (patrz tabela materiałów) w pożywce RPMI uzupełnionej B-27 (CMM) aż do osiągnięcia konfluencji. 
		nuta: W tym protokole wykorzystano kardiomiocyty pochodzące z ludzkich komórek iPS. Protokół różnicowania komórek iPS w kardiomiocyty można znaleźć w ostatnich artykułach naszej grupy badawczej12,13,21.</li>
		<li>Nasiona iPS-CM w szkiełkach komorowych.
		<ol>
			<li>Wyrzucić pożywkę hodowlaną ze studzienek iPS-CM. Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
			<li>Dodać 1 ml 0,25% trypsyny do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Sprawdzić płytkę pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek. Dodaj 1 ml CMM, aby zatrzymać trypsynę.</li>
			<li>Umieścić zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i 200 x g. Wyrzuć pożywkę, dodaj 1 ml CMM i ponownie zawieś komórki. Policz komórki i dostosuj liczbę komórek, aby uzyskać 20 x 105 komórek w 1,6 ml CMM.</li>
			<li>Zasiew: 200 μl zawiesiny komórkowej na studzienkę szkiełka z 8-dołkową komorą (patrz tabela materiałów). Delikatnie postukać w szkiełko, aby rozprowadzić komórki wokół studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku leczenia doksorubicyną iPS-CM należy wyrzucić pożywkę hodowlaną z dołków iPS-CM. Umyj komórki PBS. Traktuj komórki doksorubicyną 1 μM i CMM przez 4 godziny. Odessać pożywkę i przemyć komórki PBS.</li>
		<li>Jako bufor blokujący należy przygotować 10 ml roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) zawierającego 3% BSA i 0,05% Triton X-100. Aby przygotować 10 ml buforu blokującego, dodać 1 ml normalnej surowicy osła do 9 ml przygotowanego roztworu BSA.</li>
		<li>Do pierwszorzędowego roztworu przeciwciała dodać 1 μl fosfohistonu przeciw królikowi H2A. X (Ser139) do 200 μl buforu blokującego.</li>
		<li>W przypadku mieszanki przeciwciał drugorzędowych dodać po 1 μl sprzężonego z fluorochromem przeciwciała drugorzędowego przeciwko królicowi, DAPI i falloidyny sprzężonej z fluorochromem do 200 μl buforu blokującego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie immunologiczne
	<ol>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS i dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki. Napraw komórki na 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Umyj komórki PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 200 μl buforu blokującego do studzienki i blokować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i dodać 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez 45 minut w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Usunąć PBS i dodać 200 μl mieszanki przeciwciał drugorzędowych. Inkubować przez 45 minut w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki trzykrotnie PBS. Umyj je DIH 2O przed zamontowaniem ich za pomocą płynu zapobiegającego blaknięciu. Umieścić szkiełko nakrywkowe i przechowywać szkiełka w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Używając mikroskopu epifluorescencyjnego, wykonaj od trzech do pięciu obrazów losowych pól na próbkę, jak pokazano na Rysunek 4A, i przejdź do analizy obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liczenie ognisk DDR
	<ol>
		<li>Pobierz i zainstaluj CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>UWAGA: Przetwarzanie obrazu w tym badaniu przeprowadzono przy użyciu programu CellProfiler w wersji 2.1.1. Samouczki dotyczące programu CellProfiler, które były używane, można znaleźć gdzie indziej (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk&list=PL7CC87670239B4D10). Jeśli używana jest nowsza wersja programu CellProfiler, potok może wymagać drobnych dostosowań.</li>
		<li>Pobierz plik punctae_gH2AX.cpipe potoku. Wybierz pozycję Plik > Importuj > potok z pliku, a następnie wybierz pozycję punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>Przeciągnij i upuść folder zawierający pozyskane obrazy γH2A. X ogniskuje się do okna Lista plików w sekcji Moduły wejściowe/Obrazy do analizy (Rysunek 5A). Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami, jak pokazano na rysunku 5A-L.</li>
		<li>Ustaw następujące parametry dla obrazów:
		<ol>
			<li>Przeciągnij żądany obraz do analizy na listę Plik. W obszarze Moduły wejściowe wybierz pozycję Obrazy (zobacz Rysunek 5A, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). W obszarze Moduły wejściowe wybierz pozycję Metadane (zobacz Rysunek 5B, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). W obszarze Moduły wejściowe wybierz pozycję NamesAndTypes (zobacz Rysunek 5C, aby zapoznać się z ustawieniami modułu).</li>
			<li>W polu Grupy wybierz opcję nie. W modułach analizy wybierz ColorToGray (zobacz Rysunek 5D, aby zapoznać się z ustawieniami modułu).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W modułach analizy wybierz opcję Gładki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 5E, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). 
		nuta: Ta wartość może wymagać optymalizacji w zależności od rozdzielczości obrazu.</li>
		<li>W modułach analizy wybierz IdentifyPrimaryObjects (zobacz Rysunek 5F, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). 
		nuta: Zoptymalizuj te wartości, aby upewnić się, że wybrane jest całe jądro. Po wykonaniu tego kroku komputer może się opóźnić.</li>
		<li>W module Analysis (Moduły analizy) wybierz opcję Smooth (zobacz Rysunek 5G, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). 
		nuta: Ta wartość może wymagać optymalizacji w zależności od rozdzielczości obrazu.</li>
		<li>W modułach analizy wybierz EnhanceOrSuppressFeatures (zobacz Rysunek 5H, aby zapoznać się z ustawieniami modułu).</li>
		<li>W module Analysis (Moduły analizy) wybierz pozycję IdentifyPrimaryObjects (zobacz Rysunek 5I, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). 
		nuta: Zoptymalizuj te wartości, aby upewnić się, że znaki interpunkcyjne są wybrane. Po wykonaniu tego kroku komputer może ponownie ulec opóźnieniu.
		<ol>
			<li>W modułach analizy wybierz RelateObjects (zobacz Rysunek 5J, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). W modułach analizy wybierz pozycję ClassifyObjects (zobacz Rysunek 5K, aby zapoznać się z ustawieniami modułu). W modułach analizy wybierz opcję ExportToSpreadsheet (zobacz Rysunek 5L, aby zapoznać się z ustawieniami modułu).</li>
			<li>Kliknij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym panelu, aby przeprowadzić analizę obrazu. Po pomyślnym zakończeniu analizy generowanych jest kilka obrazów (Rysunek 6A-F). 
			nuta: Użytkownicy powinni zapisać te obrazy do wykorzystania w przyszłości.</li>
			<li>Zwróć uwagę na plik .csv zawierający dane ilościowe do dalszej analizy, który jest generowany i zapisywany w odpowiednim miejscu na komputerze. W arkuszu kalkulacyjnym o nazwie MyExpt_Image kolumny B i D będą miały liczbę jąder, które mają odpowiednio do pięciu i więcej punktów punktowych. Dodaj kolumny B i D, aby uzyskać całkowitą liczbę jąder.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz kroki 2.3.3 - 2.3.8 dla wszystkich obrazów (zmień nazwę pliku MyExpt_ przed każdą analizą). Wykresy mogą być wykonane w celu oceny integralności DNA, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 4C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Integralność DNA obrazuje integralność komórki. Komórki z uszkodzonym DNA są często w stresie i ostatecznie tracą swoją integralność. Integralność komórek macierzystych i komórek pochodzących z komórek macierzystych, które są rozmnażane w celu przeszczepu, ma zasadnicze znaczenie dla tego, aby komórki spełniały swoją pożądaną funkcję. Przeszczepianie komórek z uszkodzonym DNA skutkowałoby słabym wskaźnikiem wszczepienia i wydajnością komórki 8,20. Dlatego badanie...

Eksperymentalne i kliniczne dowody pokazują, że przeszczep komórek może umiarkowanie poprawić zdolność skurczową lewej komory serca u niewydolnych serc1,2,3,4,5,6,7,8,9. Ostatnie postępy otworzyły kolejne atrakcyjne możliwości regeneracji układu sercowo-naczyniowego; obejmują one wymuszoną ekspresję czynników przeprogramowujących w komórkach somatycznych w celu wywołania pluripotencji i różnicowania tych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w różne linie serca, co ważne, kardiomiocyty (CM)<klasa sup="xref">10,<klasa sup="xref">11,<klasa sup="xref">12,13. Materiałem dziedzicznym w każdej komórce, w tym sztucznie wygenerowanymi iPSC i CM pochodzącymi z iPSC (iPS-CM), jest DNA. Instrukcje genetyczne przechowywane w DNA dyktują wzrost, rozwój i funkcję komórek, tkanek, narządów i organizmów. DNA nie jest obojętne; metabolity komórkowe, takie jak reaktywny tlen, karbonyl i azot oraz czynniki alkilujące mogą powodować uszkodzenia DNA in vitro i in vivo14,15,16,17. Co ważne, do uszkodzenia DNA dochodzi intuicyjnie w każdej komórce, ze znaczną częstotliwością. Jeśli te uszkodzenia nie zostaną skorygowane, doprowadzi to do mutacji DNA, starzenia się komórek, utraty DNA i integralności komórek, a być może także chorób, w tym zagrażających życiu nowotworów. Dlatego zachowanie integralności DNA jest niezbędne dla każdej komórki, zwłaszcza iPSC, która ma ogromny potencjał w klinice.
Do oceny ilości i integralności wyizolowanego genomowego DNA dostępny jest drogi sprzęt na rynku. Nie ma jednak prostych i opłacalnych metod oceny integralności DNA w komórkach bez izolowania komórek. Co więcej, degradacja DNA wywołana przez użytkownika podczas izolacji DNA jest jedną z głównych wad stosowania tych metod. Jednokomórkowa elektroforeza żelowa (znana jako test komet)18,19 i γH2A. X techniki immunolabeling8 są podstawowymi podejściami w laboratoriach badawczych do oceny uszkodzeń DNA. Te dwie metody nie wymagają drogiego sprzętu ani wyizolowanego genomowego DNA do analizy integralności DNA8,20,21. Od tego czasu techniki te były wykonywane na całych komórkach; Degradacja DNA/RNA/białka wywołana przez użytkownika podczas przygotowywania próbki nie będzie miała wpływu na te protokoły. Tutaj, aby ocenić uszkodzenia DNA i odpowiedź na uszkodzenia DNA w komórkach macierzystych i pochodzących z komórek macierzystych, udostępniamy protokoły krok po kroku do przeprowadzenia zarówno testu komety, jak i γH2A. X znakowanie immunologiczne. Co więcej, łącząc te dwa podejścia, proponujemy naiwną ocenę, którą można wykorzystać do oceny przydatności komórki do przeszczepu.
Test komet, czyli elektroforeza żelowa jednokomórkowa, mierzy pęknięcia DNA w komórkach. Komórki osadzone w niskotopliwej agarozie są poddawane lizie, tworząc nukleoidy zawierające superskręcone DNA. Podczas elektroforezy małe fragmenty rozdrobnionego DNA i zerwane nici DNA migrują przez pory agarozy, podczas gdy nienaruszone DNA, ze względu na ich ogromny rozmiar i koniugację z białkiem macierzy, będzie miało ograniczoną migrację. Wzór wybarwionego DNA pod mikroskopem fluorescencyjnym naśladuje kometę. Głowa komety zawiera nienaruszone DNA, a warkocz składa się z fragmentów i uszkodzonych nici DNA. Odsetek uszkodzeń DNA można zmierzyć za pomocą intensywności fluorescencji uszkodzonego DNA (warkocza komety) w stosunku do intensywności nienaruszonego DNA (głowy komety). Moment końcowy parametru można obliczyć, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
Uszkodzenie DNA indukuje fosforylację histonu H2A. X (γH2A. X) w Ser139 przez kinazy ATM, ATR i DNA-PK. Fosforylacja i rekrutacja H2A. X przy pęknięciu nici DNA nazywa się reakcją na uszkodzenie DNA (DDR) i zachodzi szybko po uszkodzeniu DNA. Po tym procesie inicjowane jest zatrzymanie cyklu komórkowego za pośrednictwem punktu kontrolnego i procesy naprawy DNA. Po pomyślnym zakończeniu naprawy DNA, γH2A. X jest defosforylowany i inaktywowany przez fosfatazy. Długotrwałe i wielokrotne pęknięcia nici DNA prowadzą do akumulacji γH2A. X ognisk w DNA. Wskazuje to na niezdolność komórki do naprawy uszkodzeń DNA i utratę integralności DNA. Te γH2A. Ogniska X w DNA można zidentyfikować za pomocą protokołu opisanego w sekcji 2, a liczbę ognisk DDR można policzyć.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowy szkiełko komorowe</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Roztwór do odrywania komórek</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Suplement, bez surowicy,</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Zmniejszona redukcja czynnika wzrostu Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>FalloidynaA488</td><td>Technologia życia</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfohiston H2A. X (Ser139)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> przeciwciał <td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; Zielona I barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

ocena integralności dna komórek macierzystych w terapii komórek serca

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Komórki macierzyste i komórki macierzyste mają ogromny potencjał jako terapia regeneracyjna dla różnych chorób zwyrodnieniowych. DNA jest magazynem danych genetycznych we wszystkich komórkach, w tym komórkach macierzystych, a jego integralność ma fundamentalne znaczenie dla jego zdolności regeneracyjnych. Komórki macierzyste ulegają szybkiej namnażaniu w laboratoriach, aby osiągnąć liczbę niezbędną do przeszczepu. Przyspieszony wzrost komórek prowadzi do utraty integralności DNA przez nagromadzone metabolity, takie jak reaktywny tlen, karbonyl i środki alkilujące. Przeszczepienie tych komórek skutkowałoby słabym wszczepieniem i regeneracją pogarszającego się narządu. Co więcej, przeszczepianie uszkodzonych komórek DNA prowadzi do mutacji, niestabilności DNA, starzenia się komórek i ewentualnie chorób zagrażających życiu, takich jak rak. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania metody kontroli jakości w celu oceny przydatności komórki do przeszczepu. W tym miejscu przedstawiamy protokoły krok po kroku dotyczące oceny integralności DNA komórek macierzystych przed przeszczepem komórki.

Hodowano ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, a uszkodzenia DNA oraz moment ogona, służące jako miernik integralności DNA, analizowano za pomocą testu kometowego. Komórki iPS zatopiono w agarozie o niskiej temperaturze topnienia i umieszczono na szkiełku przedmiotowym. Następnie komórki poddano działaniu buforu lizującego, a potem roztworu alkalicznego, aby uzyskać superzwinięte DNA. Nukleoidy poddano elektroforezie, a komety zwizualizowano za pomocą barwnika do DNA (<...

Tutaj podajemy szczegółowy opis eksperymentalnego zestawu do analizy oceny integralności DNA w komórkach macierzystych przed przeszczepem komórki.

Ocena integralności DNA komórek macierzystych w terapii komórek serca

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

W przypadku chorób noworodków, takich jak kardiomiopatia, terapia regeneracyjna z wykorzystaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek pochodzących z komórek macierzystych ma ogromny potencjał. Jednak przyspieszony wzrost komórek in vitro prowadzi do uszkodzenia DNA przez nagromadzone metabolity, takie jak reaktywne formy tlenu. Przeszczepienie tych uszkodzonych przez DNA komórek skutkowałoby słabym wszczepieniem i regeneracją narządu.Przed przeszczepem należy ocenić jakość komórek. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły krok po kroku do oceny uszkodzeń DNA w komórkach macierzystych. Procedury zademonstrują Jessica Miller, badaczka, Nikhil Mardhekar, badaczka i Vasanthi Rajasekaran, technik laboratoryjny.Na początek umieść 500 miligramów niskotopliwej agarozy w 100 mililitrach wody wolnej od DNA-RNA. Podgrzej butelkę w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Następnie umieść butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna.Aby przygotować wstępnie powlekane szkiełka kometowe, umieść kilka kropli 0,5% agarozy na szklanym szkiełku. Natychmiast rozprowadź agarozę, aby utworzyć cienką warstwę powłoki agarozowej za pomocą szkiełka nakrywkowego. Pracując w warunkach słabego oświetlenia, aby uniknąć uszkodzenia komórek wywołanego światłem ultrafioletowym, wymieszaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek i 90 mikrolitrów roztworu agarozy w probówce.Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec zestaleniu się agarozy. Wymieszaj roztwór bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i odpipetuj 70 mikrolitrów na plamkę na wstępnie pokryty szkiełko kometowe. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź mieszaninę agarozy komórkowej, aby utworzyć cienką warstwę.Umieść szkiełko w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut. W pojemniku całkowicie zanurz szkiełko w buforze do lizy zimnej. Umieść pojemnik w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na godzinę.Zastąp bufor do lizy zimnym roztworem alkalicznym. Upewnij się, że prowadnice są całkowicie zanurzone. Po pozostawieniu pojemnika w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kolejne 30 minut, umieść szkiełko w poziomym zbiorniku do elektroforezy.Napełnij zbiornik zimnym buforem do elektroforezy alkalicznej, aż szkiełka zostaną całkowicie zanurzone. Zastosuj napięcie o napięciu jednego wolta na centymetr przez 15 do 30 minut. W pojemniku całkowicie zanurz szkiełko w zimnej wodzie dejonizowanej.Po dwóch minutach usuń wodę dejonizowaną i dodaj świeżą wodę dejonizowaną, a następnie powtórz ten krok po raz drugi. Następnie zastąp wodę dejonizowaną zimnym 70% etanolem. Po pięciu minutach delikatnie zdejmij szkiełko, nie przechylając go, i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.Po wysuszeniu dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika DNA do każdego miejsca i odczekaj 15 minut w temperaturze pokojowej. Używając filtra FITC w mikroskopie epifluorescencyjnym, wykonaj zdjęcia łącznie od 50 do 100 komet w próbce. Posiew kardiomiocytów pochodzących z iPS zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby zobaczyć kardiomiocyty pochodzące z iPS na szkiełkach komorowych, najpierw wyrzuć pożywkę hodowlaną ze studzienek i trzykrotnie umyj komórki PBS. Dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny na studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Sprawdź płytkę pod mikroskopem pod kątem oderwania komórek.Następnie dodaj jeden mililitr CMM, aby zatrzymać trypsynę. Umieść zawiesinę komórkową w 15-mililitrowej probówce i wiruj przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 200 razy g. Wyrzuć pożywkę, dodaj jeden mililitr CMM i ponownie zawieś komórki.Policz komórki i dostosuj liczbę komórek, aby uzyskać dwa miliony komórek w 1,6 mililitra współrzędnościowej maszyny pomiarowej. Teraz wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na dołek szkiełka ośmiodołkowego. Delikatnie dotknij slajdu, aby rozmieścić komórki wokół studni.Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W przypadku leczenia doksorubicyną kardiomiocytów pochodzących z iPS należy wyrzucić pożywkę hodowlaną z dołków kardiomiocytów pochodzących z iPS i przemyć komórki PBS. Traktuj komórki jednomikromolową doksorubicyną przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odessać pożywkę i przemyć komórki PBS. Aby wykonać znakowanie immunoznakowane, umyj komórki trzykrotnie PBS i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu do każdej studzienki. Utrwal komórki przez 20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.Po umyciu komórek PBS dodać 200 mikrolitrów buforu blokującego do studzienki i blokować przez 30 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i dodać 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Po inkubacji przez 45 minut w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, umyć studzienki trzykrotnie PBS.Usuń PBS i dodaj 200 mikrolitrów mieszanki przeciwciał wtórnych. Inkubować przez 45 minut w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki trzykrotnie PBS.Umyj wodą dejonizowaną przed zamontowaniem prowadnic z płynem zapobiegającym blaknięciu. Umieść szklankę nakrywkową i przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą mikroskopu konfokalnego wykonaj od trzech do pięciu zdjęć losowych pól na próbkę i przystąp do analizy obrazu.Aby policzyć ogniska odpowiedzi na uszkodzenia DNA, pobierz i zainstaluj CellProfiler. Wybierz plik, import, potok z pliku i wybierz plik potoku o nazwie puncti gamma-H2AX. Przeciągnij i upuść folder zawierający pozyskane obrazy ognisk gamma-H2AX do okna listy plików w sekcji obrazów modułów wejściowych w celu analizy.Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami przedstawionymi w protokole tekstowym. Aby ustawić parametry obrazów, przeciągnij żądany obraz do analizy na listę plików. W obszarze Moduły wejściowe wybierz obrazy.Również w modułach wejściowych wybierz metadane, a następnie wybierz nazwy i typy. W przypadku grup wybierz opcję nie. Pracując w modułach analizy, wybierz kolor na szary.Następnie wybierz pozycję wygładzanie, wybierz opcję Identyfikuj obiekty podstawowe i ponownie wybierz pozycję wygładzanie. Następnie wybierz opcję Ulepsz lub wyłącz obiekty, a następnie wybierz opcję Identyfikuj obiekty podstawowe. Nadal pracując w modułach analizy, wybierz powiąż obiekty, następnie klasyfikuj obiekty, a na końcu wybierz eksport do arkusza kalkulacyjnego.Kliknij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym panelu, aby przeprowadzić analizę obrazu. Po pomyślnym zakończeniu analizy generowanych jest kilka obrazów. Zanotuj plik CSV, który został wygenerowany i zapisany w odpowiedniej lokalizacji na komputerze.Plik ten zawiera dane ilościowe do dalszej analizy. W arkuszu kalkulacyjnym o nazwie obraz mojego eksperymentu kolumna B będzie zawierała liczbę jąder, które mają do pięciu punktów, a kolumna D będzie zawierała liczbę jąder, które mają więcej niż pięć punktów. Dodaj kolumny B i D, aby uzyskać całkowitą liczbę jąder.Powtórz te kroki dla wszystkich obrazów, zmieniając nazwę pliku mojego eksperymentu przed każdą analizą. Reprezentatywne mikrofotografie komet z komórek iPS poddanych działaniu dokso, i niepotraktowanych dokso, pokazano tutaj. W komórkach iPS stwierdzono podstawową ilość uszkodzeń DNA, wyrażoną jako ułamek uszkodzenia DNA i momentu ogonowego.Jednak leczenie dokso, zgodnie z oczekiwaniami, zwiększyło uszkodzenia DNA w komórkach iPS, co wskazuje, że test komety może być wykorzystany do oceny integralności DNA w pluripotencjalnych komórkach macierzystych. Reprezentatywne mikrofotografie znakowania immunologicznego gamma-H2AX są pokazane tutaj, w mniejszym powiększeniu i przy większym powiększeniu. W kontrolnych kardiomiocytach pochodzących z iPS ponad 90% komórek miało mniej niż pięć ognisk DDR na jądra.W sumie mniej niż 10% komórek miało więcej niż sześć ognisk DDR na jądro. W przypadku kardiomiocytów pochodzących z iPS hodowanych przez sześć miesięcy, mniej niż 90% komórek miało do pięciu ognisk DDR na jądra, a łącznie ponad 13% komórek miało więcej niż sześć ognisk DDR na jądro. Natomiast w kardiomiocytach pochodzących z iPS poddanych działaniu dokso, mniej niż 80% komórek miało do pięciu ognisk DDR na jądro.W sumie około 24% komórek miało więcej niż sześć ognisk DDR na jądro. Dane te wskazują, że przedłużona hodowla komórek kardiomiocytów pochodzących z iPS i leczenie dokso spowodowały znaczne uszkodzenie DNA, co czyni je nieodpowiednimi do przeszczepu komórek. Bardzo ważne jest, aby unikać zmiennych podczas mieszania zawiesiny ogniw, ponieważ może to wpłynąć na elektroforezę.Po tej procedurze można przeprowadzić testy komet i procedury znakowania immunologicznego na komórkach różnych typów. Techniki te pozwolą na ocenę różnego rodzaju komórek pod kątem uszkodzeń DNA przed ich wykorzystaniem w badaniach nad przeszczepami komórek.

assessing-stem-cell-dna-integrity-for-cardiac-cell-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.

Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

W tym protokole pokazujemy i rozwijamy, jak używać ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do różnicowania i oczyszczania kardiomiocytów, a ponadto, jak poprawić efektywność ich przeszczepu za pomocą wstępnego leczenia inhibitorem kinazy białkowej związanej z Rho w modelu zawału mięśnia sercowego u myszy.

Zwiększenie wszczepienia indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez przejściowe hamowanie aktywności kinazy Rho

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Poznaj protokoły oceny integralności DNA w komórkach macierzystych przed transplantacją. Metody te zapewniają jakość komórek i poprawiają skuteczność terapii regeneracyjnej w leczeniu chorób serca.

Ocena integralności DNA komórek macierzystych w terapii komórek serca

Przeglądaj więcej filmów