Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Metoda ta umożliwia generowanie dużej liczby komórek progenitorowych ludzkich pączków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów o wysokiej czystości. Zdolność do generowania tych komórek wątroby może być ważna dla medycyny regeneracyjnej i innych dziedzin. Kontrolując rozwojowe szlaki sygnałowe w celu promowania różnicowania wątroby i hamowania tworzenia niepożądanych typów komórek, metoda ta umożliwia wydajne generowanie ludzkich komórek progenitorowych pączków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów odpowiednio przez sześć i 18 dni różnicowania.

Główną zaletą tej techniki jest wysoka czystość wytwarzanych komórek wątroby ludzkiej. Aby wykonać tę procedurę, dodaj 50 mililitrów IMDM do stożkowej kolby zawierającej mieszadło. Podgrzej podłoże do 50 stopni Celsjusza i dodaj 0,5 grama PVA, ciągle mieszając, aby przygotować bulion PVA w stężeniu 10 miligramów na mililitr.

Następnie usuń roztwór PVA z poduszki grzewczej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po schłodzeniu roztworu przefiltruj go przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrometra. Przygotować CDM2 i CDM3, łącząc przefiltrowany PVA z innymi odczynnikami, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego.

Użyj sterylnego filtra 0,2 mikrometra, aby przefiltrować wszystkie media. Następnie przygotuj pozostały nośnik podstawowy, CDM4 i CDM5, zgodnie z opisem w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Aby przygotować pożywkę różnicującą, należy najpierw rozmrozić zamrożone małe cząsteczki i/lub czynniki wzrostu w temperaturze pokojowej.

Podwielokrotnić wymaganą ilość pożywki bazowej i dodać określone małe cząsteczki i czynniki wzrostu do pożywki podstawowej w odpowiednich stężeniach. Dzień przed użyciem rozmrozić matrycę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć matrycę w stosunku jeden do 100, dodając 500 mikrolitrów matrycy do 50 mililitrów zimnego DMEM.

Odpipetować rozcieńczoną matrycę do wymaganej liczby studzienek, używając tylko takiej objętości roztworu, aby pokryć powierzchnię studzienki. Przenieść płytkę pokrytą matrycą do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 60 minut. Bezpośrednio przed siewem należy odessać pozostały roztwór matrycy z powlekanych studzienek.

Następnie odessać pożywkę z w dużej mierze zlewającej się płytki hodowlanej hPSC i dodać komercyjnie zakupiony środek dysocjacyjny, upewniając się, że używasz tylko tyle, aby pokryć powierzchnię, na której rosną komórki. Inkubować hPSC w środku dysocjacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut lub do momentu, gdy niektóre kolonie zaczną się odłączać. Następnie dodaj DMEM i F-12, aby rozcieńczyć środek dysocjacyjny.

Użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie pipetować w górę iw dół wiele razy, aby zmyć wszystkie komórki z powierzchni studzienki. Zebrać zawieszone pojedyncze komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i w razie potrzeby rozcieńczyć DMEM i F-12. Odwirować tę probówkę z zebranymi hPSC w temperaturze 350 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby osadzać komórki.

Czekając na odwirowanie, odessać matrycę z płytki, w której zostaną wysiane hPSC. Dodaj wystarczającą ilość pożywki mTeSR do studzienek odbiorczych, aby je zakryć. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając granulowane hPSC na dnie stożkowej probówki.

Zawiesić osad komórkowy w mTeSR uzupełniony jednym mikromolem komercyjnie uzyskanej tiazowiwiny. Za pomocą pipety P1000 delikatnie rozetrzyj dwa do trzech razy, aby równomiernie zawiesić osad komórek w zawiesinie pojedynczej komórki. Natychmiast odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemocytometru i policzyć liczbę komórek.

Dostosuj objętość ponownie zawieszonych hPSC za pomocą mTeSR uzupełnionego tiazowiwiną, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do posiewu. Następnie kilkakrotnie potrząśnij płytką na krzyż, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone. Po posiewie hPSC przez co najmniej 24 godziny należy użyć mikroskopu z kontrastem fazowym, aby sprawdzić morfologię komórek, ze szczególnym naciskiem na średnicę posianych kolonii hPSC.

Następnie przygotuj pożywkę różnicującą APS z pierwszego dnia, jak opisano w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Jednego dnia po wysiewie należy odessać mTeSR uzupełniony tiazowiwiną z posianych hPSC i krótko przemyć je pożywką IMDM. Następnie dodać pożywkę pierwszego dnia do hPSC.

Zapisz czas i umieść komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kontynuuj kolejne etapy różnicowania, przygotowując potrzebną pożywkę różnicującą i dodając ją do komórek w odpowiednich dniach różnicowania mniej więcej o tej samej porze dnia. W tym badaniu z hPSC generowane są wzbogacone populacje komórek progenitorowych zawiązków wątroby, a następnie komórek podobnych do hepatocytów.

W drugim dniu różnicowania prymitywne komórki smugowe zróżnicowały się w ostateczne komórki endodermy w drugim dniu. Zdecydowana większość tych komórek wykazuje ekspresję SOX17 i FOXA2. W trzecim dniu różnicowania komórki endodermy zróżnicowały się w progenitory jelita przedniego, które wydają się mieć kształt wielokątny.

Później, w szóstym dniu, przodkowie jelita przedniego zróżnicowali się w przodków zawiązków wątrobowych. Ci przodkowie pączków wątroby wyrażają AFP, TPX3 i HNF4alpha. W trzech liniach hPSC metoda ta generuje AFP-dodatnie komórki progenitorowe wątroby w szóstym dniu z wydajnością około 89%Wreszcie, po 18 dniach różnicowania wątroby od hPSC, pojawiają się albuminowo-dodatnie komórki hepatocytowe.

Morfologicznie komórki te wydają się nabłonkowe, tworząc jasne obwódki przypominające kanały żółciowe. Na tym etapie cytoplazma hepatocytów pochodzących z hPSC dnia 18 wydaje się ciemniejsza niż jądro. Podczas wysiewu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu różnicowania konieczne jest wysianie ich w odpowiedniej gęstości, a także rozprowadzenie ich w studzience poprzez potrząsanie płytką.

Zdolność do wytwarzania ludzkich hepatocytów in vitro jest technologią umożliwiającą, która pozwoli naukowcom zbadać mechanizmy leżące u podstaw rozwoju wątroby. Metoda ta pozwala na uzyskanie dużej liczby ludzkich hepatocytów in vitro, które mogą być wykorzystane do badania funkcji i chorób wątroby, a ostatecznie do umożliwienia nowych terapii niewydolności wątroby.