Name: Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w hepatocytopodobne komórki o wysokiej czystości w ciągu 18 dni. Technika ta wykorzystuje bezsrumowe warunki hodowlane i kontrolę szlaków sygnałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bingowi Limowi za dyskusję oraz Stanfordzkiemu Instytutowi Biologii Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej za wsparcie infrastruktury. Prace te były wspierane przez Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej (DISC2-10679) oraz Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (do L.T.A. i K.M.L.) oraz Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine, a także rodziny Anonymous, Baxter i DiGenova (do K.M.L.).

<ol><li>Bernal, W., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Liver+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute Liver Failure.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2525-2534 (2013).</li>
<li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li>
<li>Fisher, R. A., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Hepatocyte+Transplantation%3A+Worldwide+Results%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human Hepatocyte Transplantation: Worldwide Results.</a> Transplantation. 82, 441-449 (2006).</li>
<li>Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+human+hepatocyte+transplantation%3A+Current+status+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical human hepatocyte transplantation: Current status and challenges.</a> Liver transplantation. 21, S39-S44 (2015).</li>
<li>Salama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplantation+in+48+Patients+with+End-Stage+Chronic+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in 48 Patients with End-Stage Chronic Liver Diseases.</a> Cell Transplantation. 19, 1475-1486 (2017).</li>
<li>Tan, A. K. Y., Loh, K. M., Ang, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+regenerative+potential+and+functionality+of+human+liver+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evaluating the regenerative potential and functionality of human liver cells in mice.</a> Differentiation. 98, 25-34 (2017).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Endoderm+Induction+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Logically+Directing+Signals+Controlling+Lineage+Bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Endoderm Induction from Human Pluripotent Stem Cells by Logically Directing Signals Controlling Lineage Bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li>
<li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+the+efficient+metabolic+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+by+correcting+specification+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Promotion of the efficient metabolic maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes by correcting specification defects.</a> Cell Research. 23, 157-161 (2012).</li>
<li>Si Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 297-305 (2010).</li>
<li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+miniaturized+format+suitable+for+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of human pluripotent stem cells in miniaturized format suitable for high-throughput screen.</a> Stem Cell Research. 16, 640-650 (2016).</li>
<li>Avior, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial-derived+lithocholic+acid+and+vitamin+K2+drive+the+metabolic+maturation+of+pluripotent+stem+cells-derived+and+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Microbial-derived lithocholic acid and vitamin K2 drive the metabolic maturation of pluripotent stem cells-derived and fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 62, 265-278 (2015).</li>
<li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li>
<li>Rostovskaya, M., Bredenkamp, N., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+consistent+generation+of+pancreatic+lineage+progenitors+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards consistent generation of pancreatic lineage progenitors from human pluripotent stem cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370, 20140365(2015).</li>
<li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+Efficiencies+of+Adult+Hepatocytes%2C+Fetal+Liver+Progenitor+Cells%2C+and+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatic+Cells+in+Albumin-Promoter-Enhancer+Urokinase-Type+Plasminogen+Activator+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Repopulation Efficiencies of Adult Hepatocytes, Fetal Liver Progenitor Cells, and Embryonic Stem Cell-Derived Hepatic Cells in Albumin-Promoter-Enhancer Urokinase-Type Plasminogen Activator Mice.</a> The American Journal of Pathology. 175, 1483-1492 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta umożliwia generowanie wzbogaconych populacji komórek progenitorowych pączków wątroby, a następnie komórek hepatocytopodobnych, z hPSC. Zdolność do generowania wzbogaconych populacji ludzkich komórek wątroby jest ważna dla praktycznego wykorzystania takich komórek. Poprzednie metody generowania hepatocytów z hPSC dawały zanieczyszczone populacje komórek zawierające zarówno komórki wątroby, jak i komórki niewątrobowe, które po przeszczepieniu gryzoniom dawały kości i chrząstki oprócz tkanki wątroby<sup class="xre...

Celem tego protokołu jest efektywne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na wzbogacone populacje komórek progenitorowych zawiązków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów2. Dostęp do gotowego zapasu ludzkich komórek progenitorowych wątroby i komórek podobnych do hepatocytów przyspieszy wysiłki zmierzające do zbadania funkcji i chorób wątroby oraz może umożliwić nowe terapie przeszczepów komórkowych w przypadku niewydolności wątroby3,4,5. W przeszłości okazało się to wyzwaniem, ponieważ hPSC (które obejmują embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) mogą różnicować się we wszystkich typach komórek ludzkiego ciała; W związku z tym trudno było je wyłącznie zróżnicować w czystą populację jednego typu komórek, takich jak komórki wątroby6.
Aby precyzyjnie rozróżnić hPSC na komórki wątroby, najpierw ważne jest zrozumienie nie tylko, jak komórki wątroby są określane, ale także jak rozwijają się typy komórek niezwiązanych z wątrobą. Wiedza o tym, jak rozwijają się komórki inne niż wątroba, jest ważna dla logicznego zahamowania tworzenia się linii niezwiązanych z wątrobą podczas różnicowania, kierując w ten sposób wyłącznie hPSC w kierunku losu wątroby2. Po drugie, konieczne jest nakreślenie wielu etapów rozwojowych, w których hPSC różnicują się w kierunku losu wątroby. Wiadomo, że hPSC sekwencyjnie różnicują się w wiele typów komórek znanych jako prymitywna smuga (APS), ostateczna endoderma (DE), tylne jelito przednie (PFG) i komórki progenitorowe zawiązków wątroby (LB) przed utworzeniem komórek podobnych do hepatocytów (HEP). Wcześniejsze prace ujawniły sygnały określające los wątroby oraz sygnały, które hamowały tworzenie się alternatywnych typów komórek niezwiązanych z wątrobą (w tym komórek progenitorowych żołądka, trzustki i jelit) w każdej wybranej linii rozwojowej2,7,8.
Łącznie, te spostrzeżenia dały początek bezsurowicy, jednowarstwowej metodzie różnicowania hPSC w kierunku prymitywnych smug, definitywnych endoderm, tylnego jelita przedniego, progenitorów pączków wątroby i wreszcie komórek podobnych do hepatocytów2. Ogólnie rzecz biorąc, metoda polega na wysiewie hPSC w monowarstwie o odpowiedniej gęstości, przygotowaniu sześciu koktajli pożywek różnicujących (zawierających czynniki wzrostu i małe cząsteczki, które regulują różne rozwojowe szlaki sygnałowe) i sekwencyjnym dodawaniu tych pożywek w celu wywołania różnicowania w ciągu 18 dni. Podczas tego procesu nie jest potrzebne pasażowanie komórek. Warto zauważyć, że ponieważ metoda ta wyraźnie obejmuje sygnały, które hamują tworzenie się komórek innych niż wątrobowe, to podejście różnicujące 1 bardziej efektywnie generuje komórki progenitorowe wątroby i komórki podobne do hepatocytów w porównaniu z istniejącymi metodami różnicowania2,9,10,11,12. Co więcej, protokół opisany w tym tekście umożliwia szybsze generowanie hepatocytów, które ostatecznie wyrażają wyższe poziomy wątrobowych czynników transkrypcyjnych i enzymów niż te wytwarzane przez inne protokoły9,10,11,12.
Opisany tutaj protokół ma pewne zalety w porównaniu z obecnymi protokołami różnicowania. Po pierwsze, pociąga za sobą jednowarstwowe różnicowanie hPSC, które jest technicznie prostsze w porównaniu z trójwymiarowymi metodami różnicowania, takimi jak te, które opierają się na ciałach embrionalnych13. Po drugie, metoda ta wykorzystuje niedawny postęp, dzięki któremu ostateczne komórki endodermy (wczesny prekursor komórek wątroby) mogą być skutecznie i szybko generowane w ciągu 2 dni od różnicowania hPSC2,7, umożliwiając w ten sposób późniejszą produkcję hepatocytów o zwiększonej czystości. Po trzecie, w porównaniach równoległych, komórki podobne do hepatocytów wytworzone tą metodą2 wytwarzają więcej albuminy i wyrażają wyższe poziomy wątrobowych czynników transkrypcyjnych i enzymów w porównaniu z hepatocytami wytwarzanymi innymi metodami10,11,12.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Geltrex</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>1:1 DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>0,2&nbsp; &mu; m Filtr membranowy</td><td>porowy Millipore</td><td>GTTP02500</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Accutase</td><td>Gibco lub Millipore&nbsp;</td><td>Gibco A11105, Milipore&nbsp; SCR005</td><td></td></tr><tr><td>IMDM, GlutaMAX&handel; Suplement</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka odżywcza F-12 dla szynki, GlutaMAX&trade; Suplement</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>KOSR, Zamiennik serum nokautującego</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10652202001</tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin</td><td>R& D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99201</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PI103</td><td>Tocris</td><td>2930/1</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek FGF2</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>DM3189</td><td>Tocris</td><td>6053/10</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek BMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>C59</td><td>Tocris</td><td>5148</td><td></td></tr><tr><td>TTNPB</td><td>Tocris</td><td>0761/10</td><td></td></tr><tr><td>Forskolina</td><td>Tocris</td><td>1099/10</td><td></td></tr><tr><td>Onkostatyna M</td><td>R& D</td><td>295-OM</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Tocris</td><td>1126</td><td></td></tr><tr><td>Ro4929097</td><td>Selleck Chem</td><td>S1575</td><td></td></tr><tr><td>AA2P</td><td>Cayman chemicals</td><td>16457</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka rekombinowana insulina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>11061-68-0</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Wątroba detoksykuje szkodliwe substancje, wydziela niezbędne białka i wykonuje kluczowe czynności metaboliczne, podtrzymując w ten sposób życie. W związku z tym niewydolność wątroby - która może być spowodowana przewlekłym spożyciem alkoholu, zapaleniem wątroby, ostrym zatruciem lub innymi urazami - jest ciężkim stanem, który może zakończyć się krwawieniem, żółtaczką, śpiączką i ostatecznie śmiercią. Jednak podejścia do leczenia niewydolności wątroby, a także badania nad funkcją i chorobami wątroby, zostały częściowo utrudnione przez brak obfitego zaopatrzenia w ludzkie komórki wątroby. W tym celu protokół ten szczegółowo opisuje skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki podobne do hepatocytów, kierując się rozwojową mapą drogową, która opisuje, w jaki sposób los wątroby jest określany w sześciu kolejnych etapach różnicowania. Manipulując rozwojowymi szlakami sygnałowymi w celu promowania różnicowania wątroby i wyraźnego hamowania tworzenia się niepożądanych losów komórek, metoda ta skutecznie generuje populacje ludzkich komórek progenitorowych pączków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów odpowiednio w 6 i 18 dniu różnicowania PSC. Osiąga się to poprzez czasowo precyzyjną kontrolę rozwojowych szlaków sygnałowych, wywieranych przez małe cząsteczki i czynniki wzrostu w pożywce hodowlanej bez surowicy. Różnicowanie w tym systemie zachodzi w monowarstwach i daje komórki podobne do hepatocytów, które wyrażają charakterystyczne enzymy hepatocytowe i mają zdolność do wszczepienia mysiego modelu przewlekłej niewydolności wątroby. Zdolność do wydajnego generowania dużej liczby ludzkich komórek wątroby in vitro ma konsekwencje w leczeniu niewydolności wątroby, badaniach przesiewowych leków i mechanistycznych badaniach chorób wątroby.

Po 24 h różnicowania w obecności APS kolonie zazwyczaj przybierają inną morfologię niż kolonie nieróżnicowane, co współistnieje z utratą jasnej krawędzi, która typowo otacza kolonie hPSC. Pod względem morfologicznym komórki pręgi pierwotnej mają zazwyczaj poszarpane brzegi, są bardziej rozproszone i mniej zwarte niż hPSC – przywodzi to na myśl przejście epitelialno-mezenchymalne, podczas którego pluripotencjalne komórki epiblastu różnicują się i wnikają do pręgi pierwotnej in vivo. Jeśli ...

Ten protokół opisuje monowarstwową, pozbawioną surowicy metodę efektywnego generowania komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w ciągu 18 dni. Obejmuje to sześć etapów, w których hPSC sekwencyjnie różnicują się w pośrednie typy komórek, takie jak prymitywna smuga, ostateczna endoderma, tylne jelito przednie i progenitorzy zawiązków wątroby, zanim utworzą komórki podobne do hepatocytów.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Metoda ta umożliwia generowanie dużej liczby komórek progenitorowych ludzkich pączków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów o wysokiej czystości. Zdolność do generowania tych komórek wątroby może być ważna dla medycyny regeneracyjnej i innych dziedzin. Kontrolując rozwojowe szlaki sygnałowe w celu promowania różnicowania wątroby i hamowania tworzenia niepożądanych typów komórek, metoda ta umożliwia wydajne generowanie ludzkich komórek progenitorowych pączków wątroby i komórek podobnych do hepatocytów odpowiednio przez sześć i 18 dni różnicowania.Główną zaletą tej techniki jest wysoka czystość wytwarzanych komórek wątroby ludzkiej. Aby wykonać tę procedurę, dodaj 50 mililitrów IMDM do stożkowej kolby zawierającej mieszadło. Podgrzej podłoże do 50 stopni Celsjusza i dodaj 0,5 grama PVA, ciągle mieszając, aby przygotować bulion PVA w stężeniu 10 miligramów na mililitr.Następnie usuń roztwór PVA z poduszki grzewczej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Po schłodzeniu roztworu przefiltruj go przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrometra. Przygotować CDM2 i CDM3, łącząc przefiltrowany PVA z innymi odczynnikami, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego.Użyj sterylnego filtra 0,2 mikrometra, aby przefiltrować wszystkie media. Następnie przygotuj pozostały nośnik podstawowy, CDM4 i CDM5, zgodnie z opisem w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Aby przygotować pożywkę różnicującą, należy najpierw rozmrozić zamrożone małe cząsteczki i/lub czynniki wzrostu w temperaturze pokojowej.Podwielokrotnić wymaganą ilość pożywki bazowej i dodać określone małe cząsteczki i czynniki wzrostu do pożywki podstawowej w odpowiednich stężeniach. Dzień przed użyciem rozmrozić matrycę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć matrycę w stosunku jeden do 100, dodając 500 mikrolitrów matrycy do 50 mililitrów zimnego DMEM.Odpipetować rozcieńczoną matrycę do wymaganej liczby studzienek, używając tylko takiej objętości roztworu, aby pokryć powierzchnię studzienki. Przenieść płytkę pokrytą matrycą do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 60 minut. Bezpośrednio przed siewem należy odessać pozostały roztwór matrycy z powlekanych studzienek.Następnie odessać pożywkę z w dużej mierze zlewającej się płytki hodowlanej hPSC i dodać komercyjnie zakupiony środek dysocjacyjny, upewniając się, że używasz tylko tyle, aby pokryć powierzchnię, na której rosną komórki. Inkubować hPSC w środku dysocjacyjnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut lub do momentu, gdy niektóre kolonie zaczną się odłączać. Następnie dodaj DMEM i F-12, aby rozcieńczyć środek dysocjacyjny.Użyj pięciomililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie pipetować w górę iw dół wiele razy, aby zmyć wszystkie komórki z powierzchni studzienki. Zebrać zawieszone pojedyncze komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i w razie potrzeby rozcieńczyć DMEM i F-12. Odwirować tę probówkę z zebranymi hPSC w temperaturze 350 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby osadzać komórki.Czekając na odwirowanie, odessać matrycę z płytki, w której zostaną wysiane hPSC. Dodaj wystarczającą ilość pożywki mTeSR do studzienek odbiorczych, aby je zakryć. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając granulowane hPSC na dnie stożkowej probówki.Zawiesić osad komórkowy w mTeSR uzupełniony jednym mikromolem komercyjnie uzyskanej tiazowiwiny. Za pomocą pipety P1000 delikatnie rozetrzyj dwa do trzech razy, aby równomiernie zawiesić osad komórek w zawiesinie pojedynczej komórki. Natychmiast odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemocytometru i policzyć liczbę komórek.Dostosuj objętość ponownie zawieszonych hPSC za pomocą mTeSR uzupełnionego tiazowiwiną, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do posiewu. Następnie kilkakrotnie potrząśnij płytką na krzyż, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone. Po posiewie hPSC przez co najmniej 24 godziny należy użyć mikroskopu z kontrastem fazowym, aby sprawdzić morfologię komórek, ze szczególnym naciskiem na średnicę posianych kolonii hPSC.Następnie przygotuj pożywkę różnicującą APS z pierwszego dnia, jak opisano w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Jednego dnia po wysiewie należy odessać mTeSR uzupełniony tiazowiwiną z posianych hPSC i krótko przemyć je pożywką IMDM. Następnie dodać pożywkę pierwszego dnia do hPSC.Zapisz czas i umieść komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Kontynuuj kolejne etapy różnicowania, przygotowując potrzebną pożywkę różnicującą i dodając ją do komórek w odpowiednich dniach różnicowania mniej więcej o tej samej porze dnia. W tym badaniu z hPSC generowane są wzbogacone populacje komórek progenitorowych zawiązków wątroby, a następnie komórek podobnych do hepatocytów.W drugim dniu różnicowania prymitywne komórki smugowe zróżnicowały się w ostateczne komórki endodermy w drugim dniu. Zdecydowana większość tych komórek wykazuje ekspresję SOX17 i FOXA2. W trzecim dniu różnicowania komórki endodermy zróżnicowały się w progenitory jelita przedniego, które wydają się mieć kształt wielokątny.Później, w szóstym dniu, przodkowie jelita przedniego zróżnicowali się w przodków zawiązków wątrobowych. Ci przodkowie pączków wątroby wyrażają AFP, TPX3 i HNF4alpha. W trzech liniach hPSC metoda ta generuje AFP-dodatnie komórki progenitorowe wątroby w szóstym dniu z wydajnością około 89%Wreszcie, po 18 dniach różnicowania wątroby od hPSC, pojawiają się albuminowo-dodatnie komórki hepatocytowe.Morfologicznie komórki te wydają się nabłonkowe, tworząc jasne obwódki przypominające kanały żółciowe. Na tym etapie cytoplazma hepatocytów pochodzących z hPSC dnia 18 wydaje się ciemniejsza niż jądro. Podczas wysiewu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu różnicowania konieczne jest wysianie ich w odpowiedniej gęstości, a także rozprowadzenie ich w studzience poprzez potrząsanie płytką.Zdolność do wytwarzania ludzkich hepatocytów in vitro jest technologią umożliwiającą, która pozwoli naukowcom zbadać mechanizmy leżące u podstaw rozwoju wątroby. Metoda ta pozwala na uzyskanie dużej liczby ludzkich hepatocytów in vitro, które mogą być wykorzystane do badania funkcji i chorób wątroby, a ostatecznie do umożliwienia nowych terapii niewydolności wątroby.

efficient-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół opisuje półautomatyczne podejście do produkcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki 96-dołkowej. Proces ten jest szybki i opłacalny, co pozwala na produkcję partii komórek podobnych do hepatocytów o gwarantowanej jakości do podstawowych i stosowanych badań na ludziach.

Półautomatyczna produkcja komórek podobnych do hepatocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w funkcjonalne komórki podobne do hepatocytów (HLC) poprzez ciągłe uzupełnianie Activiny A i CHIR99021 podczas różnicowania hESC do ostatecznej endodermy (DE).

Skuteczna metoda ukierunkowanej indukcji komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Dostępne systemy różnicowania komórek macierzystych pluripotencjalnych (PSC) do funkcjonalnych komórek są obecnie utrudnione przez problemy związane z poważną zmiennością między liniami i między partiami. Tutaj, używając różnicowania serca jako głównego przykładu, przedstawiamy protokół inteligentnego monitorowania i modulowania procesu różnicowania PSC w oparciu o uczenie maszynowe oparte na obrazie.

Strategia uczenia maszynowego oparta na obrazie żywych komórek do monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w hepatocytopodobne komórki o wysokiej czystości w ciągu 18 dni. Technika ta wykorzystuje bezsrumowe warunki hodowlane i kontrolę szlaków sygnałowych.

Skuteczne różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki wątroby

Przeglądaj więcej filmów