Name: Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj protokół transfekcji komórek Dictyostelium discoideum niezależnie od warunków wzrostu szczepu. Ta metoda elektroporacji umożliwia szybką manipulację genetyczną i walidację wyników już po dwóch dniach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują laboratorium Kay za wkład w tę metodę oraz urządzeniom mikroskopii LMB i cytometrii przepływowej za doskonałe wsparcie naukowe i techniczne. Praca ta została sfinansowana z grantu Rady ds. Badań Medycznych MC_U105115237 dla R. R. Kaya, grantu BBSRC (Rada ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych) BB/K009699/1 dla R. R. Kaya, grantu Cancer Research UK A15672 dla R. H. Insalla, stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship 202867/Z/16/Z dla Jonathana R. Chubba oraz finansowania MRC (MC_U12266B) dla MRC LMCB University Unit na UCL.

<ol><li>Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology%3A+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary crossroads in developmental biology: Dictyostelium discoideum.</a> Development. 138 (3), 387-396 (2011).</li>
<li>Sussman, R., Sussman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Dictyostelium+discoideum+in+axenic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, 53-55 (1967).</li>
<li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), 75(2008).</li>
<li>Witke, W., Nellen, W., Noegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+in+the+Dictyostelium+alpha-actinin+gene+leads+to+an+altered+mRNA+and+lack+of+the+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination in the Dictyostelium alpha-actinin gene leads to an altered mRNA and lack of the protein.</a> The EMBO Journal. 6, 4143-4148 (1987).</li>
<li>De Lozanne, A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Dictyostelium+myosin+heavy+chain+gene+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Dictyostelium myosin heavy chain gene by homologous recombination.</a> Science. 236, 1086-1091 (1987).</li>
<li>Howard, P. K., Ahern, K. G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+transient+expression+system+for+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum.</a> Nucleic Acids Research. 16, 2613-2623 (1988).</li>
<li>Knecht, D., Pang, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 47, 321-330 (1995).</li>
<li>Wetterauer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+strains+of+Dictyostelium+discoideum+can+be+transformed+using+a+novel+selection+cassette+driven+by+the+promoter+of+the+ribosomal+V18+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Wild-type strains of Dictyostelium discoideum can be transformed using a novel selection cassette driven by the promoter of the ribosomal V18 gene.</a> Plasmid. 36, 169-181 (1996).</li>
<li>Lloyd, M. M., Ceccarelli, A., Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditions+for+the+transformation+of+nonaxenic+Dictyostelium+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditions for the transformation of nonaxenic Dictyostelium strains.</a> Developmental Genetics. 11, 391-395 (1990).</li>
<li>Bloomfield, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromin+controls+macropinocytosis+and+phagocytosis+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Neurofibromin controls macropinocytosis and phagocytosis in Dictyostelium.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP%283%29-dependent+macropinocytosis+is+incompatible+with+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PIP(3)-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (4), 497-505 (2014).</li>
<li>Hoeller, O., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+the+absence+of+PIP3+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in the absence of PIP3 gradients.</a> Current Biology. 17, 813-817 (2007).</li>
<li>Chubb, J. R., Wilkins, A., Thomas, G. M., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dictyostelium+RasS+protein+is+required+for+macropinocytosis%2C+phagocytosis+and+the+control+of+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Dictyostelium RasS protein is required for macropinocytosis, phagocytosis and the control of cell movement.</a> Journal of Cell Science. 113, 709-719 (2000).</li>
<li>Schaap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phylogeny+and+evolution+of+morphology+in+the+social+amoebas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular phylogeny and evolution of morphology in the social amoebas.</a> Science. 314, 661-663 (2006).</li>
<li>Du, Q., Kawabe, Y., Schilde, C., Chen, Z. H., Schaap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Evolution+of+Aggregative+Multicellularity+and+Cell-Cell+Communication+in+the+Dictyostelia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Evolution of Aggregative Multicellularity and Cell-Cell Communication in the Dictyostelia.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3722-3733 (2015).</li>
<li>Hirose, S., Benabentos, R., Ho, H. I., Kuspa, A., Shaulsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-recognition+in+social+amoebae+is+mediated+by+allelic+pairs+of+tiger+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-recognition in social amoebae is mediated by allelic pairs of tiger genes.</a> Science. 333 (6041), 467-470 (2011).</li>
<li>Strassmann, J. E., Queller, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+cooperation+and+control+of+cheating+in+a+social+microbe%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evolution of cooperation and control of cheating in a social microbe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (2), 10855-10862 (2011).</li>
<li>Wolf, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+Trade-offs+Result+in+the+Illusion+of+Social+Success%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Fitness Trade-offs Result in the Illusion of Social Success.</a> Current Biology. 25 (8), 1086-1090 (2015).</li>
<li>Veltman, D. M., Akar, G., Bosgraaf, L., Van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+set+of+small%2C+extrachromosomal+expression+vectors+for+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A new set of small, extrachromosomal expression vectors for Dictyostelium discoideum.</a> Plasmid. 61 (2), 110-118 (2009).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98 (3), 503-517 (1975).</li>
<li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), 0196809(2018).</li>
<li>Woznica, D., Knecht, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under-agarose+chemotaxis+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Under-agarose chemotaxis of Dictyostelium discoideum.</a> Methods in Molecular Biology. 346, 311-325 (2006).</li>
<li>Dubin, M., Nellen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+set+of+tagged+expression+vectors+to+monitor+protein+localisation+and+function+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium.</a> Gene. 465 (1-2), 1-8 (2010).</li>
<li>de Hostos, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+mutants+lacking+the+cytoskeletal+protein+coronin+are+defective+in+cytokinesis+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium mutants lacking the cytoskeletal protein coronin are defective in cytokinesis and cell motility.</a> Journal of Cell Biology. 120, 163-173 (1993).</li>
<li>Sekine, R., Kawata, T., Muramoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+targeting+of+multiple+genes+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated targeting of multiple genes in Dictyostelium.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8471(2018).</li>
<li>Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safe+harbours+for+the+integration+of+new+DNA+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).</li>
<li>Rosengarten, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaps+and+lulls+in+the+developmental+transcriptome+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Leaps and lulls in the developmental transcriptome of Dictyostelium discoideum.</a> BMC Genomics. 16, 294(2015).</li>
<li>Tunnacliffe, E., Corrigan, A. M., Chubb, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-mediated+diversification+of+transcriptional+bursting+dynamics+following+gene+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Promoter-mediated diversification of transcriptional bursting dynamics following gene duplication.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (33), 8364-8369 (2018).</li>
<li>Gebbie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg2%2C+a+kinase+involved+in+adhesion+and+focal+site+modeling+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phg2, a kinase involved in adhesion and focal site modeling in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 3915-3925 (2004).</li>
<li>Jeon, T. J., Lee, D. J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+controls+cell+adhesion+and+cell+motility+through+the+regulation+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II.</a> Journal of Cell Biology. 176, 1021-1033 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystanie nieaksenicznych, dzikich komórek Dictyostelium było do tej pory bardzo ograniczone w badaniach molekularnych. Dostępne metody inżynierii genetycznej tych szczepów są niewystarczająco niezawodne i skuteczne23, co uniemożliwia ich powszechne przyjęcie. Przedstawione tutaj uzyskane materiały i protokoły mogą być wykorzystane dla dowolnego szczepu D. discoideum, niezależnie od jego zdolności do wzrostu w płynnym podłożu. Należy wspomnieć, że protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem linii komórkowych pochodzących z NC4. Skuteczność transfekcji dla świeżo wyizolowanych szczepów ze środowiska naturalnego różni się od NC4, jak zaobserwowaliśmy wcześniej i jest pokazana tutaj dla V12M2 i WS2162 8,9. Wydaje się, że warunki elektroporacji mają w szczególności znaczący wpływ na wydajność transfekcji i mogą wymagać dalszej optymalizacji w przypadku niektórych szczepów. Ogólnie rzecz biorąc, we wszystkich testowanych do tej pory szczepach zaobserwowano wystarczającą ilość transfektantów, co pokazuje, że metody te są wykonalne. Liczba dodatnich transfektantów uzyskanych przy użyciu szczepów pochodzących z NC4 jest wyższa w porównaniu z innymi nieaksenicznymi szczepami typu dzikiego, ale we wszystkich przypadkach uzyskuje się wystarczającą liczbę transfektantów, aby umożliwić dalsze eksperymenty. To, w połączeniu z prostotą naszego protokołu, jest znaczną poprawą w porównaniu z wcześniejszymi próbami 8,9.
Te nowe protokoły nieakseniczne obejmują wszystkie standardowe procedury genetyczne i dodają dalszych korzyści, ponieważ transfekcje mogą być wykonywane szybko i wydajnie równolegle. Dodatnie klony można uzyskać w ciągu kilku dni, a nie tygodni, ponieważ wzrost bakterii skraca czas podziału o połowę. Nowo powstałe plazmidy działają również w warunkach aksenicznych i mogą być rutynowo używane w obu warunkach wzrostu, co jest kolejnym osiągnięciem tej metodologii22. Jak wprowadzono w protokole, plazmid używany do selekcji na bakteriach ma specjalne wymagania, które są kluczowe dla powodzenia transfekcji. W szczególności promotory napędzające kasety ekspresji i oporu są ważne dla udanej transfekcji. Często stosowany promotor act6 (aktyna 6)24 do napędzania kaset oporności lub ekspresji nie jest skuteczny, gdy komórki są hodowane na bakteriach. W naszym układzie plazmidowym wysoce aktywny promotor act15 (aktyna 15) napędza wszystkie kasety ekspresyjne, podczas gdy kasety oporności są pod kontrolą promotora coA (koaktozyny A), z których oba są aktywne w warunkach aksonicznych i w komórkach hodowanych na bakteriach. Wymagania dotyczące ekspresji konstruktów reporterowych oraz konstruktów knock-in i knock-out sprawiają, że konieczne jest korzystanie z naszego repertuaru plazmidowego, ale niestety ograniczają użycie już utworzonych wektorów, które wykorzystują nieefektywny promotor act6 .
Wydajność promotora jest szczególnie istotna w przypadku transfekcji, które zależą od pojedynczego zdarzenia integracji z właściwym locus genomu. Ze względu na nasze ulepszenie promotorów napędzających ekspresję genów oporności, wystarczająca ilość białka oporności jest wytwarzana z integracji pojedynczego locus. Głównym problemem było faworyzowanie wielu integracji z genomem podczas stosowania higromycyny lub G418, jak opisano. Do tej pory nie zaobserwowano faworyzowania wielu integracji, o czym informowano wcześniej w przypadku selekcji G418 korzystających ze starszych systemów promotorów25. Oznacza to, że zarówno higromycyna, jak i G418 są odpowiednimi markerami do generowania czystych wybijaczy i wybijających. Niestety, wybieralny marker blasticydyna nie działa w warunkach nieaksenicznych. Jest to główna wada naszej metody, ponieważ kaseta oporności na blasticydynę jest rutynowo używana do generowania konstruktów nokautujących w D. discoideum. Konstrukty, które zostały już wygenerowane przy użyciu kaset oporności na blasticydynę, będą musiały zostać ponownie wyprowadzone przy użyciu jednego z działających markerów do wyboru. Inną możliwością przezwyciężenia tego ograniczenia jest połączenie niedawno opracowanej technologii CRISPR D . discoideum z tym protokołem transfekcji26. Generowanie odpowiednich, jednoprowadnicowych RNA (sgRNA) jest prostsze i szybsze niż rekonstrukcja kompletnych konstruktów nokautujących. Jeśli chodzi o przyszłe kierunki, możliwość generowania wielu nokautów za pomocą CRISPR/Cas9 w połączeniu z tym protokołem transfekcji jest atrakcyjna i może utorować drogę wielu badaczom w społeczności Dictyostelium . Należy jednak dokładnie zbadać wykonalność ustalonego przejściowego systemu ekspresji stosowanego w CRISPR/Cas9 w komórkach hodowanych aksenicznie.
Przedstawiony system knock-in act5 oferuje niezawodny i bezpieczny system integracji do generowania stabilnych linii komórkowych w D. discoideum, z przewagą podobnych miejsc powstałych w innych organizmach22. Zależy również od pojedynczego zdarzenia integracyjnego w genomie i daje wiele możliwości dla różnych kierunków badań. Promotor act5 jest silnie aktywny i gwarantuje prawie jednorodną ekspresję27 niezależnie od warunków uprawy. Fluorescencyjne białka reporterowe można łatwo zintegrować z tym bezpiecznym miejscem za pomocą zmodyfikowanych plazmidów docelowych. Może to być przydatne na przykład do celów śledzenia komórek, jak pokazano w eksperymencie mieszanym. Komórki wykazują minimalną zmienność ekspresji między komórkami, co może pomóc w automatycznym śledzeniu komórek. Co ważne, wstawienie pożądanej sekwencji do locus aktu5 wydaje się fenotypowo neutralne28,29. Ponieważ ekspresja nie zależy od selektywnego markera w celu utrzymania ekspresji białka, jak to widać w losowych integrantach lub liniach komórkowych zawierających wektory pozachromosomalne, system act5 może być również przydatny w eksperymentach ratunkowych. Ponieważ linie komórkowe są jednorodne, wszystkie komórki mogą być analizowane. Nie jest to możliwe przy użyciu plazmidu pozachromosomalnego do ekspresji, w którym występuje znaczna niejednorodność ekspresji.
Oprócz tych ogólnych ulepszeń dla wszystkich szczepów, możliwość wykorzystania nieaksenicznych komórek typu dzikiego do badań molekularnych pozwala na ocenę skutków skumulowanych mutacji w obecnych szczepach laboratoryjnych. Od czasu przyjęcia szczepu Ax2 w 1970 r. stwierdzono wiele rearanżacji genetycznych, jak wykazały wcześniej opublikowane analizy mikromacierzy26. Syntetyczne fenotypy są obserwowane ze względu na obecność tych mutacji. Na przykład zgłoszony mutant phg2 wykazuje zmniejszoną adhezję w jednym tle szczepu laboratoryjnego i zwiększoną przyczepność w innych3. Takie sprzeczne dane można teraz rozwiązać, powtarzając eksperyment na wspólnym szczepie przodka (w tym przypadku DdB). Siła tego podejścia została ostatnio pokazana dla małej GTPazy RasS30,31.
Możliwość przeprowadzania eksperymentów genetycznych na dowolnym szczepie D. discoideum rozszerza potencjał nowych kierunków badań, które zależą od wykorzystania dzikich izolatów, w szczególności tych związanych z ewolucją społeczną, rozpoznawaniem krewniactwa i cyklem płciowym22.

Rodzaj Dictyostelium to żyjące w glebie ameby społeczne, które żywią się głównie bakteriami. Umieszczono je w gromadzie Amoebozoa, wyizolowano dużą liczbę gatunków, które można pogrupować w cztery różne klady1. Gatunek Dictyostelium discoideum (D. discoideum) stał się popularnym organizmem modelowym do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek i fagocytoza. Aby kontrolować i standaryzować warunki eksperymentalne, opracowano linie komórek aksenicznych, które są w stanie rosnąć w złożonym lub zdefiniowanym płynnym podłożu pod nieobecność bakterii2. Szczególne znaczenie mają szczepy Ax2, Ax3 i Ax4, które zostały wygenerowane w latach siedemdziesiątych XX wieku i ostatecznie pochodzą z jednego dzikiego izolatu NC43. Narzędzia do inżynierii genetycznej zostały opracowane w tych odmianach aksonicznych, co zaowocowało pierwszym opublikowanym nokautem w 1987 roku4,5. Protokoły zostały dalej rozwinięte i zoptymalizowane do użytku w warunkach aksonicznych6,7.
Adaptacja tych protokołów do dzikich szczepów D. discoideum, które nie są w stanie rosnąć w płynnym bulionie, została podjęta przez kilka laboratoriów. Jednak nie udało się to w pełni, ponieważ protokoły transfekcji są złożone i brakuje im wydajności, częściowo ze względu na zdolność bakterii do działania jako pochłaniacz dla selektywnych odczynników8,9. W rezultacie, zasadniczo wszystkie dane molekularne dotyczące D. discoideum pochodzą od potomków pojedynczego izolatu typu dzikiego. Chcieliśmy przezwyciężyć to ograniczenie i opracować metodę genetycznej modyfikacji komórek D. discoideum niezależnie od ich zdolności do wzrostu w płynnym podłożu. Potrzebę takiej metody można wytłumaczyć obserwacją, że w przeszłości zakładano, iż mutacje umożliwiające wzrost akseniczny są głównie neutralne i nie upośledzają fizjologii komórki. Przypuszczenie to jest tylko częściowo słuszne. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie znaczące różnice; Po pierwsze, między różnymi izolowanymi szczepami aksenicznymi, a po drugie, gdy te szczepy akseniczne są porównywane z dzikimi izolatami nieaksenicznymi8,9.
Być może najbardziej krytycznym czynnikiem jest kluczowy gen aksoniczny, axeB, który został niedawno zidentyfikowany jako RasGAP NF1. Główną funkcją NF1 jako RasGAP jest ograniczanie aktywności Ras3. Delecja enzymu we wszystkich szczepach aksenicznych prowadzi do nadmiernej aktywności Ras, objawiającej się tworzeniem dużych aktywnych plam Ras. Te powiększone plamy Ras prowadzą do akumulacji PIP3 w błonie plazmatycznej. Te przypadkowo pojawiające się plamy PIP3 i aktywnego Ras są szablonem do tworzenia okrągłej falbanki, która ostatecznie zamyka się i prowadzi do powstania makropinosomów10. Konsekwencją jest nadmierny wzrost aktywności makropinocytarnej. Makropinocytoza jest procesem napędzanym przez aktynę. Wynikiem jest konkurencja o składniki cytoszkieletu w celu tworzenia makropinosomów lub pseudopodów. Jego wpływ na zachowanie komórek znajduje odzwierciedlenie w prawie całkowitym zapobieganiu chemotaksji komórek wegetatywnych do folianów11. Znacznie powiększone plastry PIP3 są bardzo trwałe. Nawet w wygłodzonych komórkach plamy PIP3 pozostają i mogą być błędnie interpretowane jako pseudopody, co może powodować problemy z interpretacją badań nad chemotaksją do cAMP.
W niektórych przypadkach mutacja NF1 jest eksperymentalnie użyteczna. To prowadzi nas do drugiej motywacji do opracowania metody transfekcji dla hodowanych bakteryjnie komórek D. discoideum, ponieważ wzrost częstości makropinocytozy sprawia, że komórki akseniczne są cenne dla badania podstawowych aspektów tego procesu12. Jednak mutacje w genach wymaganych do makropinocytozy, takich jak kinazy Ras i PI310, prawie zniosły wzrost aksenów, co spowodowało konieczność manipulowania tymi komórkami poprzez wzrost na bakteriach. Innym powodem, dla którego transfekcje oparte na bakteriach są cenne, jest coraz częstsze wykorzystanie Dictyostelids do badania kwestii związanych z ewolucją wielokomórkowości13,14, kin recognition15,16, oraz altruistyczne zachowania komórkowe, które zależą głównie od użycia świeżo wyizolowanych izolatów typu dzikiego17. Wszystkie wymienione obszary badawcze mogą być ułatwione dzięki skutecznym metodom manipulacji genetycznej dzikimi izolatami, które nie są akseniczne i nie rosną w płynnym bulionie.
Nasze protokoły pozwalają na pokonanie opisanych ograniczeń. Podsumowując, możliwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych na wyhodowanych bakteryjnie komórkach D. discoideum przynosi korzyści wszystkim badaczom Dictyostelium, nawet jeśli jest to tylko zwiększona szybkość procesu selekcji ze względu na szybszy wzrost ameby (4 godziny czasu podwojenia) na bakteriach w porównaniu ze wzrostem w pożywce aksenicznej (10 godzin czasu podwojenia).

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrowirówki 5424/5424R</td><td>ThermoScientific</td><td>05-400-002</td><td></td></tr><tr><td>Wirówki Eppendorf 5702R z wirnikiem modelu A-4-38</td><td>ThermoScientific</td><td>12823252</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mastercycler Nexus Thermal Cyclers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP6331000025</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser X Cell, w tym CE & Moduły PC</td><td>Szafa bezpieczeństwa BioRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Foruna - SCANLAF</td><td>Labogene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLSM 710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media & Agarozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LoFlo Medium</td><td>Formedium</td><td>LF0501</td><td></td></tr><tr><td>Seakem GTG Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td></td></tr><tr><td>Low EEO Agaroza</td><td>BioGene</td><td>300-200</td><td></td></tr><tr><td>Agar Czysty</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>SM Rosół</td><td>Formedium</td><td>SMB0102</td><td></td></tr><tr><td>2x LB bulion</td><td>Formedium</td><td>LBD0102</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>ThermoScientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus Drabinka DNA</td><td>ThermoScientific</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Kwas wolny od HEPES</td><td>Sigma Aldrich/Merck</td><td>391340 EMD</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>P/4800/53</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 * 2 H2O</td><td>VWR</td><td>10028-24-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6 H2O</td><td>Sigma Aldrich/Merck</td><td>5982 EMD</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 2 H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>442909</td><td></td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>VWR</td><td>26668.263</td><td></td></tr><tr><td>Cult Dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Klaster hodowli komórkowych studzienek, płaskie dno z pokrywką o niskiej parowaniu, poddany hodowli tkankowej</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy klaster hodowli komórkowych, płaskie dno z pokrywką, Corning Incorporated poddany hodowli tkankowej</td><td></td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej w stylu 100 x 20 mm,</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td>Incorporated</tr><tr><td>Naczynia Microwell ze szklanym dnem 50 mm No1.5</td><td>MatTek Corporation</td><td>P50G-1.5-30-F</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneticin G418-siarczan</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Gold InvivoGen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dodatkowe materiały eksploatacyjne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mm kuwety elektroporacyjne szczelinowe, długa elektroda</td><td>Geneflow</td><td>Limited E6-0062</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Pętla do zaszczepiania, niebieska 10 mikro L</td> Rozsiewacz <td>129399</td><td></td><td>ThermoScientific</td></tr><tr><td>, sterylny</td><td>Greiner Bio-one</td><td>730190</td><td></td></tr><tr><td>Combitips advanced 5 ml</td><td>Eppendorf BIOPUR</td><td>30089669</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZR Plasmid Miniprep Classic</td><td>Zymoresearch</td><td>D4016</td><td></td></tr><tr><td>Quick DNA Zestaw Miniprep</td><td>Zymoresearch</td><td>D3025</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Zestaw do odzyskiwania DNA</td><td>Zymoresearch</td><td>D40002</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzymy</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 2X Master Mix ze standardowym buforem</td><td>NEB</td><td>M0482L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max Polimeraza DNA</td><td>TakaraBio</td><td>R045A</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria genetyczna komórek dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum to intrygujący organizm modelowy do badania procesów różnicowania komórek podczas rozwoju, sygnalizacji komórkowej i innych ważnych zagadnień biologii komórkowej. Dostępne technologie genetycznej manipulacji komórkami Dictyostelium są dobrze rozwinięte. Transfekcje mogą być wykonywane przy użyciu różnych wybieralnych markerów i recyklingu markerów, w tym rekombinacji homologicznej i mutagenezy insercyjnej. Potwierdza to dobrze opisany genom. Jednak podejścia te są zoptymalizowane pod kątem linii komórek aksenowych rosnących w płynnych kulturach i są trudne do zastosowania w nieaksenicznych komórkach typu dzikiego, które żywią się tylko bakteriami. Mutacje, które są obecne w szczepach aksenowych, zaburzają sygnalizację Ras, powodując nadmierną makropinocytozę wymaganą do odżywiania się i upośledzają migrację komórek, co zakłóca interpretację eksperymentów z transdukcją sygnału i chemotaksją w tych szczepach. Wcześniejsze próby genetycznej manipulacji komórkami nieaksenicznymi były nieskuteczne i wymagały skomplikowanych procedur eksperymentalnych. Opracowaliśmy prosty protokół transfekcji, który po raz pierwszy pokonuje te ograniczenia. Ta seria dużych ulepszeń genetyki molekularnej Dictyostelium pozwala na manipulowanie komórkami typu dzikiego tak łatwo, jak standardowymi szczepami laboratoryjnymi. Oprócz korzyści płynących z badania nieuszkodzonych procesów sygnalizacji i ruchliwości, mutanty, które zakłócają wzrost oparty na makropinocytozie, można teraz łatwo wyizolować. Co więcej, cały proces transfekcji jest znacznie przyspieszony, dzięki rekombinowanym komórkom, które można wygenerować w ciągu kilku dni, a nie tygodni. Kolejną zaletą jest to, że genetyka molekularna może być dalej prowadzona na świeżo wyizolowanych próbkach Dictyostelium typu dzikiego ze środowiska. Może to przyczynić się do rozszerzenia zakresu podejść stosowanych w tych obszarach badawczych.

Dictyostelium discoideum to popularny organizm modelowy do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek, endocytoza i rozwój. Użyteczność organizmu zależy od wykonalności manipulacji genetycznej. W tym miejscu przedstawiamy metody transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, które przezwyciężają istniejące ograniczenia hodowli komórek w płynnych pożywkach.

Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Wartość tego protokołu polega na tym, że pozwala on na manipulowanie prawie każdym szczepem dictyostelium discoideum za pomocą genetyki molekularnej, niezależnie od tego, czy szczep ten będzie rósł osiowo w płynnym podłożu, czy nie. Inną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i prosta. Transponuj do komórek transfekcyjnych z plazmidem egzochromosomalnym przed rozpoczęciem mieszania dictyosteliums.Wyniki można zwalidować już dwa dni po transfekcji za pomocą mikroskopii. Rzadko zdarza się praca z komórkami dictyostelium i zawiesiną bakteryjną. Wizualizacja pomoże dać eksperymentatorom wyobrażenie o tym, w jaki sposób wykonywane są różne etapy protokołów.Procedurę zademonstruje mi Soudabeh Imanikia, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek przygotuj 1000 mililitrów roztworu roboczego buforu sorensena z chlorkiem magnezu i chlorkiem wapnia zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie użyj pojedynczej kolonii aerogenów K do zaszczepienia jednego litra pożywki LB.Pozwól bakteriom rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Zakręć komórki w dwóch 500-mililitrowych probówkach wirówkowych, aby zebrać komórki. Następnie umyj bakterie raz 500 mililitrami buforu.Zawiesić osad w 20 mililitrach buforu. Za pomocą fotometru sprawdzić gęstość optyczną próbki i rozcieńczyć próbkę buforem, aż gęstość optyczna wyniesie około 100. Następnie należy przygotować bufor do elektroporacji H40 zgodnie z protokołem tekstowym.Uprawiaj K aerogenes, aby zjednoczyć podłoże SM przez noc w temperaturze pokojowej. Dodaj 400 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do płytki agarowej SM i równomiernie rozprowadz. Następnie weź sterylną pętlę i zaszczep ją komórkami dictyostelium i rozprowadź komórki na jednej krawędzi płytki.Inkubuj płytkę w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez dwa dni, aby upewnić się, że strefy wzrostu są wystarczająco duże do transfekcji. Dodaj 10 mililitrów zawiesiny aerogenowej K do 10-centymetrowej szalki Petriego poddanej kulturze tkankowej. Następnie użyj jednorazowej pętli do inokulacji o pojemności 10 mikrolitrów, aby zeskrobać komórki ze stref wzrostu płytki hodowlanej.Przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej lodowaty bufor H40. Obracaj komórki przez dwie sekundy przy 10000 razy grawitacji. Następnie należy wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze H40.Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek do probówki zawierającej od jednego do dwóch mikrogramów DNA. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść mieszaninę DNA komórki do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji. Nie należy dodawać więcej niż dwóch mikrogramów DNA.Wyższe stężenie DNA jest toksyczne dla komórek i zmniejsza wydajność. Po elektroporacji natychmiast przenieś komórki na przygotowaną 10-centymetrową szalkę Petriego i pozwól komórkom zregenerować się przez pięć godzin. Aby wybrać transfektant do knock-out, knock-in lub act-five knock-in, odłącz komórki od płytki Petriego, pipetując płyn po powierzchni.Następnie należy ustawić trzy rozcieńczenia czynnika selektywnego zgodnie z protokołem tekstowym. Na koniec rozprowadzić 150 mikrolitrów przygotowanych rozcieńczeń do każdej studzienki 96-dołkowych płaskodennych płytek do hodowli tkankowych. W tym protokole zademonstrowano podwójny reporterowy pozachromosomalny system plazmidowy.32 godziny po transfekcji większość komórek wykazywała ekspresję obu znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych. Próbowano również wykonać M Cherry knock-in w piątym akcie i NC4. Dwa prążki uzyskano po przeprowadzeniu trawienia na żelu agarozowym.Pasmo par zasad 4127 zawiera żądaną konstrukcję. Oczyszczone DNA wykorzystano do transfekcji komórek NC4. Dwa klony transfekcji NC4 przeanalizowano za pomocą PCR i oba wykazały przewidywane wzorce prążków.Southern blot został następnie użyty do walidacji wyników PCR. NC4 rósł szybciej na trawnikach bakteryjnych niż komórki Ax2. Po czterech godzinach więcej komórek NC4 było w stanie wczołgać się pod agarozę niż komórki Ax2.Komórki NC4 były szybsze i wykazywały silniejszą odpowiedź chemotaktyczną na kwas foliowy niż komórki Ax2. Zawsze używaj ogniw ze świeżo ustawionych płytek SM. Nigdy nie używaj ogniw starszych niż cztery dni, w przeciwnym razie wydajność spadnie.Świeżo wyizolowane, nienextenne, białe szczepy HAP są powszechnie używane do rozwiązywania problemów dotyczących ruchów lub zachowań społecznych dictyosteliums. Nasze możliwości pozwalają na zastosowanie genetyki molekularnej za pomocą tych izolatów.

genetic-engineering-dictyostelium-discoideum-cells-based-on-selection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Paschke, P., et al. Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum w oparciu o selekcję i wzrost bakterii. J. Vis. Exp. (2019).Ten film przedstawia procedurę wprowadzania plazmidu przenoszącego gen docelowy do komórek ameby za pomocą elektroporacji, a następnie odzyskiwania w suplemencie bakteryjnym, aby umożliwić skuteczne dostarczanie genów w amebach typu dzikiego.

Transfekcja ameby typu dzikiego za pomocą elektroporacji ze wspomaganiem karmienia bakteryjnego

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Tutaj opisujemy metody oceny odpowiedzi komórkowej na ostrą stymulację mechaniczną. W teście opartym na mikroskopii badamy lokalizację biosensorów znakowanych fluorescencyjnie po krótkiej stymulacji przepływem ścinającym. Badamy również biochemicznie aktywację różnych interesujących nas białek w odpowiedzi na ostrą stymulację mechaniczną.

Ocena odpowiedzi Dictyostelium discoideum na ostrą stymulację mechaniczną

Ta metoda pozwala na generowanie tetraploidalnych i triploidalnych nicieni Caenorhabditis z dowolnego szczepu diploidalnego. Szczepy poliploidalne wygenerowane tą metodą zostały wykorzystane do badania interakcji chromosomów w profazie mejotycznej, a metoda ta jest przydatna do badania ważnych podstawowych pytań w biologii komórki, rozwoju, ewolucji i raka.

Manipulacja ploidalnością u Caenorhabditis elegans

Poznaj protokół transfekcji komórek Dictyostelium discoideum niezależnie od warunków wzrostu szczepu. Ta metoda elektroporacji umożliwia szybką manipulację genetyczną i walidację wyników już po dwóch dniach.

Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii

Przeglądaj więcej filmów