Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum oparta na selekcji i wzroście bakterii
25 stycznia 2019
Dictyostelium discoideum to popularny organizm modelowy do badania złożonych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek, endocytoza i rozwój. Użyteczność organizmu zależy od wykonalności manipulacji genetycznej. W tym miejscu przedstawiamy metody transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, które przezwyciężają istniejące ograniczenia hodowli komórek w płynnych pożywkach.
Wartość tego protokołu polega na tym, że pozwala on na manipulowanie prawie każdym szczepem dictyostelium discoideum za pomocą genetyki molekularnej, niezależnie od tego, czy szczep ten będzie rósł osiowo w płynnym podłożu, czy nie. Inną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i prosta. Transponuj do komórek transfekcyjnych z plazmidem egzochromosomalnym przed rozpoczęciem mieszania dictyosteliums.
Wyniki można zwalidować już dwa dni po transfekcji za pomocą mikroskopii. Rzadko zdarza się praca z komórkami dictyostelium i zawiesiną bakteryjną. Wizualizacja pomoże dać eksperymentatorom wyobrażenie o tym, w jaki sposób wykonywane są różne etapy protokołów.
Procedurę zademonstruje mi Soudabeh Imanikia, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Na początek przygotuj 1000 mililitrów roztworu roboczego buforu sorensena z chlorkiem magnezu i chlorkiem wapnia zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie użyj pojedynczej kolonii aerogenów K do zaszczepienia jednego litra pożywki LB.
Pozwól bakteriom rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Zakręć komórki w dwóch 500-mililitrowych probówkach wirówkowych, aby zebrać komórki. Następnie umyj bakterie raz 500 mililitrami buforu.
Zawiesić osad w 20 mililitrach buforu. Za pomocą fotometru sprawdzić gęstość optyczną próbki i rozcieńczyć próbkę buforem, aż gęstość optyczna wyniesie około 100. Następnie należy przygotować bufor do elektroporacji H40 zgodnie z protokołem tekstowym.
Uprawiaj K aerogenes, aby zjednoczyć podłoże SM przez noc w temperaturze pokojowej. Dodaj 400 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do płytki agarowej SM i równomiernie rozprowadz. Następnie weź sterylną pętlę i zaszczep ją komórkami dictyostelium i rozprowadź komórki na jednej krawędzi płytki.
Inkubuj płytkę w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez dwa dni, aby upewnić się, że strefy wzrostu są wystarczająco duże do transfekcji. Dodaj 10 mililitrów zawiesiny aerogenowej K do 10-centymetrowej szalki Petriego poddanej kulturze tkankowej. Następnie użyj jednorazowej pętli do inokulacji o pojemności 10 mikrolitrów, aby zeskrobać komórki ze stref wzrostu płytki hodowlanej.
Przenieś komórki do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej lodowaty bufor H40. Obracaj komórki przez dwie sekundy przy 10000 razy grawitacji. Następnie należy wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze H40.
Następnie dodaj 100 mikrolitrów komórek do probówki zawierającej od jednego do dwóch mikrogramów DNA. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść mieszaninę DNA komórki do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji. Nie należy dodawać więcej niż dwóch mikrogramów DNA.
Wyższe stężenie DNA jest toksyczne dla komórek i zmniejsza wydajność. Po elektroporacji natychmiast przenieś komórki na przygotowaną 10-centymetrową szalkę Petriego i pozwól komórkom zregenerować się przez pięć godzin. Aby wybrać transfektant do knock-out, knock-in lub act-five knock-in, odłącz komórki od płytki Petriego, pipetując płyn po powierzchni.
Następnie należy ustawić trzy rozcieńczenia czynnika selektywnego zgodnie z protokołem tekstowym. Na koniec rozprowadzić 150 mikrolitrów przygotowanych rozcieńczeń do każdej studzienki 96-dołkowych płaskodennych płytek do hodowli tkankowych. W tym protokole zademonstrowano podwójny reporterowy pozachromosomalny system plazmidowy.
32 godziny po transfekcji większość komórek wykazywała ekspresję obu znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych. Próbowano również wykonać M Cherry knock-in w piątym akcie i NC4. Dwa prążki uzyskano po przeprowadzeniu trawienia na żelu agarozowym.
Pasmo par zasad 4127 zawiera żądaną konstrukcję. Oczyszczone DNA wykorzystano do transfekcji komórek NC4. Dwa klony transfekcji NC4 przeanalizowano za pomocą PCR i oba wykazały przewidywane wzorce prążków.
Southern blot został następnie użyty do walidacji wyników PCR. NC4 rósł szybciej na trawnikach bakteryjnych niż komórki Ax2. Po czterech godzinach więcej komórek NC4 było w stanie wczołgać się pod agarozę niż komórki Ax2.
Komórki NC4 były szybsze i wykazywały silniejszą odpowiedź chemotaktyczną na kwas foliowy niż komórki Ax2. Zawsze używaj ogniw ze świeżo ustawionych płytek SM. Nigdy nie używaj ogniw starszych niż cztery dni, w przeciwnym razie wydajność spadnie.
Świeżo wyizolowane, nienextenne, białe szczepy HAP są powszechnie używane do rozwiązywania problemów dotyczących ruchów lub zachowań społecznych dictyosteliums. Nasze możliwości pozwalają na zastosowanie genetyki molekularnej za pomocą tych izolatów.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół transfekcji komórek Dictyostelium discoideum, który umożliwia manipulacje genetyczne niezależnie od warunków wzrostu szczepu. Metoda ta jest wydajna i prosta, co pozwala na szybką walidację wyników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Manipulacje genetyczne
- Organizmy modelowe
Wstęp
- Dictyostelium discoideum jest szeroko stosowanym organizmem modelowym do badania procesów komórkowych.
- Manipulacje genetyczne są kluczowe dla zgłębiania różnych zagadnień biologicznych.
- Istniejące metody mają ograniczenia wynikające z warunków wzrostu różnych szczepów.
- Niniejszy protokół ma na celu pokonanie tych ograniczeń.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody transfekcji różnych szczepów Dictyostelium discoideum.
- Ułatwienie zastosowań genetyki molekularnej w szczepach, które nie rosną aksenicznie.
- Wykazanie wydajności procesu transfekcji.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów bakteryjnych i buforów do transfekcji.
- Elektroporacja komórek Dictyostelium discoideum za pomocą plazmidowego DNA.
- Walidacja wyników transfekcji przy użyciu mikroskopii i PCR.
- Ocena zachowania i wzrostu komórek w odpowiedzi na transfekcję.
Główne wyniki
- Skuteczna transfekcja wielu szczepów Dictyostelium discoideum.
- Obserwacja ekspresji białek fluorescencyjnych 32 godziny po transfekcji.
- Komórki NC4 wykazały szybszy wzrost i reakcję chemotaktyczną w porównaniu do komórek Ax2.
- Walidacja modyfikacji genetycznych za pomocą analizy PCR oraz Southern blot.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia skuteczną manipulację genetyczną szczepów Dictyostelium discoideum.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych badań nad genetyką i zachowaniem komórek.
- Najlepsze wyniki w zakresie wydajności transfekcji uzyskuje się przy użyciu świeżo wyizolowanych szczepów.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia manipulacje genetyczne szczepów Dictyostelium typu dzikiego hodowanych na bakteriach, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia szczepów przystosowanych do warunków aksenicznych z zaburzonym szlakiem sygnałowym Ras. Zapewnia on skalowalną i szybką metodę walidacji celów w modelu istotnym dla przebiegu choroby, wspierając proces ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Podejście to rozszerza genetykę molekularną na szczepy izolowane środowiskowo, zwiększając ciągłość translacyjną oraz pewność prognostyczną w procesach przesiewowych fenotypowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w niezakłóconych szlakach sygnałowych i motorycznych poprzez zastosowanie szczepów nieaksenicznych z nienaruszonym sygnałowaniem Ras.
- Wartość operacyjna: Ogranicza błędy eksperymentalne wynikające z defektów makropinocytozy i upośledzenia migracji obserwowane w szczepach aksenicznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalną walidację celów i redukcję ryzyka biologicznego, umożliwiając przeprowadzanie mutagenezy w fizjologicznie istotnych warunkach wzrostu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytworzenie komórek rekombinowanych wykazujących ekspresję podwójnych reporterów fluorescencyjnych w ciągu 32 godzin, co umożliwia szybkie odczyty analiz w celu przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces transfekcji z wykorzystaniem trawników bakteryjnych i elektroporacji, co poprawia powtarzalność wyników między laboratoriami.
- Skalowalność: Przyspiesza czas od transfekcji do uzyskania zwalidowanych klonów z tygodni do dni, wspierając wysokoprzepustową inżynierię szczepów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia badanie chemotaksji i zachowań społecznych w świeżo wyizolowanych szczepach typu dzikiego, co zwiększa istotność modeli chorób.
- Wartość operacyjna: Umożliwia bezpośrednie zastosowanie genetyki molekularnej do izolatów środowiskowych bez konieczności uprzedniej adaptacji aksenicznej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy walidację celów w fazie odkryć z fenotypami przedklinicznymi poprzez mierzalne wyniki, takie jak testy chemotaksji indukowanej folianami oraz testy penetracji agarozy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w etapy od wczesnego odkrywania do identyfikacji wiodących związków, dostarczając genetycznie modyfikowalnych modeli do badania szlaków sygnałowych oraz przesiewu fenotypowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez w zakresie chemotaksji, makropinocytozy i sygnalizacji rozwojowej z wykorzystaniem nienaruszonych szczepów typu dzikiego.
- Przesiewy: Zapewnia ilościowe odczyty fluorescencji i wzrostu na trawnikach bakteryjnych w celu rzetelnej oceny związków.
- Analityka: Umożliwia walidację modyfikacji genetycznych za pomocą PCR, Southern blot oraz mikroskopii w ciągu 32–48 godzin po transfekcji.
- Badania translacyjne: Łączy manipulacje genetyczne z testami funkcjonalnymi, takimi jak chemotaksja i wzrost pod agarozy, co pozwala na dostosowanie postępów badań do poziomu ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do inżynierii dowolnego szczepu Dictyostelium, niezależnie od źródła izolacji czy warunków wzrostu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez eliminację artefaktów wynikających z adaptacji aksenicznej i przywrócenie natywnych szlaków sygnalizacyjnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania buforów, parametrów elektroporacji oraz protokołów selekcji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez skrócenie czasu inżynierii szczepów i umożliwienie szybkiego podejmowania decyzji go/no-go w procesie walidacji celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez tworzenie modeli o zredukowanym ryzyku mechanistycznym z walidowanymi modyfikacjami genetycznymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikrobiologii w celu przygotowania kultur bakteryjnych oraz obsługi Dictyostelium na trawnikach bakteryjnych.
- Procedura zależy od dostępu do sprzętu do elektroporacji oraz sterylnej infrastruktury do hodowli tkankowych niezbędnej do etapów transfekcji i regeneracji.
- Konieczna jest standaryzacja gęstości inokulum bakteryjnego (OD ~100) oraz przygotowania buforu H40 przez wszystkich użytkowników.
- W przypadku stosowania protokołu w odniesieniu do różnych izolatów typu dzikiego lub szczepów środowiskowych należy rozważyć odpowiednie adaptacje.
- Metoda jest ograniczona do szczepów zdolnych do wzrostu na trawnikach bakteryjnych; wydajność spada w przypadku komórek starszych niż cztery dni od izolacji.
