Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Mutageneza ukierunkowana jest przydatna do badania interakcji molekularnych, takich jak interakcje RNA-RNA i białka RNA. Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z dwu- lub 3-etapowym podejściem PCR. Głównymi zaletami tej metody jest różnorodność różnych mutacji, które można włączyć, a także względna łatwość i koszt takiego działania.

Aby rozpocząć, użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów dwóch, jeden i dwóch, trzech, specyficznych dla 2-etapu, lub par starterów trzy, jeden i trzy, cztery, specyficznych dla 3-etapowego PCR, aby uzyskać pierwszy produkt PCR. Aby zwalidować produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, należy przygotować 2% żel agarozowy, rozpuszczając dwa gramy agarozy w 100 mililitrach buforu 1X TAE za pomocą kuchenki mikrofalowej. Dodać bromek etydyny w końcowym stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr.

Następnie odlej żel agarozowy. Po zestaleniu umieść go w urządzeniu do elektroforezy. Załaduj drabinę DNA o znanym rozmiarze, a próbki PCR zmieszane z DNA ładują barwnik do studzienek.

Badaj próbki pod napięciem 75 V przez 45 minut. I wizualizuj opaski na transiluminatorze UV lub za pomocą żelowego systemu obrazowania. Następnie oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru.

Następnie przechowuj oczyszczone DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w buforze TE. Aby rozpocząć mutagenezę ukierunkowaną z 2-etapową PCR, najpierw użyj matrycy DNA typu dzikiego, a następnie par starterów dwóch, jednego i dwóch, dwóch, dla pięciu mutacji starterów lub par starterów dwóch, dwóch i dwóch, trzech dla trzech mutacji primentowych, aby uzyskać drugi produkt PCR. Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem.

Następnie użyj matrycy DNA typu dzikiego i produktu PCR dwa jako startera, wraz ze starterem drugim, trzema dla pięciu mutacji primentowych lub starterem drugim, jednym dla trzech mutacji primentowych, aby otrzymać trzeci produkt PCR. Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przechowuj oczyszczone DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w buforze TE.

Aby rozpocząć mutagenezę bezpośrednią z 3-etapowym PCR, najpierw użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów trzech, jeden i trzech, dwóch, aby uzyskać drugi produkt PCR. Użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów trzy, trzy i trzy, cztery, aby uzyskać trzeci produkt PCR. Użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów trzy, trzy i trzy, cztery, aby uzyskać trzeci produkt PCR.

Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem. Na koniec użyj od dwóch do pięciu nanogramów produktów PCR dwa i trzy jako matrycę wraz z parami starterów trzecim, pierwszym i trzecim, czwartym, aby uzyskać czwarty produkt PCR. Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem.

Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w buforze TE. W tym badaniu zastosowano 2-etapową i 3-etapową mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu zbadania interakcji RNA dotyczących potranskrypcyjnej regulacji CsgD. CsgD typu dzikiego amplifikowano PCR w celu uzyskania produktu PCR IA, a mcaS typu dzikiego amplifikowano PCR w celu uzyskania produktu PCR IB. Stosując 3-etapową strategię PCR, produkty PCR IIA i IIIA zsyntetyzowano w pierwszych dwóch etapach, a IVA w trzecim etapie w celu wprowadzenia mutacji w CsgD.

Podobnie, komplementarne mutacje ukierunkowane na miejsce zostały wprowadzone w mcaS, aby uzyskać produkty PCR IIB, IIIB w pierwszych dwóch etapach i IVB w trzecim etapie. Analiza Western blot wykazała, że podczas gdy ekspresja mcaS typu dzikiego zapobiega translacji CsgD typu dzikiego, mutacje w mcaS lub CsgD łagodzą obserwowaną represję. Jednak mutacje zarówno w CsgD, jak i mcaS zapobiegają translacji CsgD.

Stosując 2-etapową strategię PCR, W PIERWSZYM ETAPIE ZSYNTETYZOWANO PRODUKTY PCR IIC, IID, IIE, IIF i IIG, a w drugim etapie produkty PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF i IIIG w celu wprowadzenia mutacji do całego DNA CsgD. Wyniki EMSA wiązania HFQ z transskrybowanymi in vitro dzikimi i zmutowanymi RNA CsgD, zsyntetyzowanymi przy użyciu produktów PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF i IIIG, wykazały zwiększone wartości KD zmutowanych alleli. Okazało się, że HFQ może wiązać się z mutantami mniej skutecznie.

Ponadto HFQ ma kilka miejsc wiązania na CsgD, co pokazują trzy przesunięcia obserwowane dla RNA typu dzikiego. Jednak dla różnych zmutowanych RNA obserwuje się tylko dwa miejsca wiązania. W ten sposób podejście mutacyjne ukierunkowane na miejsce identyfikuje pierwszorzędowe i/lub drugorzędowe struktury mRNA CsgD, które są ważne dla całkowitego wiązania HFQ.

Opisana tutaj metoda mutagenezy ukierunkowanej opiera się na PCR. Dobre praktyki PCR mają zatem kluczowe znaczenie dla metody i mogą wymagać optymalizacji, aby odnieść sukces. Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest skuteczna tylko w przypadku wszystkich trzech metod, takich jak EMSA i Western Blotting.

Inne metody, na przykład, obejmują różne testy strukturalne i niektóre testy aktywności, a także badania modyfikacji po translacji.