Name: Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w badaniach RNA-RNA i RNA-białko w Escherichia coli. Ta metoda PCR pozwala wprowadzać różne mutacje i analizować interakcje molekularne z wykorzystaniem elektroforezy żelowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Uniwersytetowi Południowej Danii za przyznanie grantów w ramach polityki otwartego dostępu.

1. Wybór wektora
<ol>
	<li>Wybierz wektor, na którym chcesz przeprowadzić dalsze eksperymenty. Do tej 2- i 3-etapowej metody PCR ma zastosowanie dowolny wektor.</li>
	<li>Na podstawie wyboru wektora wybierz odpowiednie enzymy restrykcyjne do klonowania.</li>
</ol>
2. Projekt podkładu do mutagenezy kierowanej na stronę
<ol>
	<li>Zdecyduj się na 2-etapową lub 3-etapową strategię PCR (2-etapowa dotyczy tylko mutacji <200 pz z dowolnego końca DNA będącego przedmiotem zainteresowania). W przypadku 2-etapowego PCR przejdź do kroku 2.2, a w przypadku 3-etapowego PCR przejdź do kroku 2.3.</li>
	<li>Zaprojektuj startery do 2-etapowej reakcji PCR.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj starter 1 i 3 w celu amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania i z 5' zwisem, który zawiera 4 nukleotydy (np. ATAT lub AGCT), po których następuje odpowiednie miejsce rozpoznawania ograniczeń niezbędne do sklonowania do wybranego wektora.</li>
		<li>Zaprojektuj starter 2, aby wprowadzić mutację (mutacje) w pożądanym miejscu (miejscach) i oskrzydlić mutację 10-15 komplementarnymi nukleotydami po obu stronach. Odwróć starter, jeśli mutacja jest wprowadzona na końcu 5' lub do przodu, jeśli mutacja jest wprowadzona na końcu 3'.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprojektuj startery do 3-etapowej reakcji PCR.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj starter 1 i 4 do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania i z zwisem 5', który zawiera 4 nukleotydy (np. ATAT lub AGCT), po których następuje odpowiednie miejsce rozpoznawania ograniczeń niezbędne do sklonowania do wybranego wektora.</li>
		<li>Zaprojektuj starter 2 i 3, aby wprowadzić mutację (mutacje) w żądanym miejscu (miejscach) i oskrzydlić mutację przez 10-15 komplementarnych nukleotydów po obu stronach. Podkład 2 i 3 są odwrotnym uzupełnieniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Amplifikacja PCR DNA typu dzikiego do klonowania
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat PCR, zobacz6.
<ol>
	<li>Wykonaj PCR6 używając starterów 1+2 (2-etapowy PCR) lub 1+4 (3-etapowy PCR) i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR I. Użyj programu PCR w Tabeli 1.</li>
	<li>Walidacja PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór żelu agarozowego (2%), dodając 2 g agarozy na 100 ml 1x buforu kwasu tris-octanowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TAE). Rozpuść agarozę, gotując ją w kuchence mikrofalowej. Dodać barwnik barwiący DNA, bromek etydyny (do końcowego stężenia ~ 0,5 μg/ml) do roztworu żelu agarozowego w celu wizualizacji.</li>
		<li>Odlewać żel agarozowy, umieścić go w urządzeniu do elektroforezy i załadować próbki PCR (zmieszane z barwnikiem ładującym DNA) oraz drabinkę DNA o znanej wielkości. Badaj próbki z mocą 75 W przez 45 minut lub do momentu, gdy pasma zostaną odpowiednio oddzielone, a następnie wizualizuj pasma na stole ultrafioletowym (UV) lub za pomocą systemu obrazowania żelowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).</li>
	<li>Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze Tris-EDTA (TE) – przechowywanie długotrwałe) lub 4 °C (wdH2O – przechowywanie krótkotrwałe) do czasu wykorzystania w kroku 5.</li>
</ol>
4. PCR wprowadza mutacje w DNA ukierunkowane na miejsce
<ol>
	<li>PCR dla 2-etapowego PCR (patrz krok 4.2 dla 3-etapowego PCR)
	<ol>
		<li>Wykonaj PCR6 używając starterów 1+2, jeśli mutacje znajdują się na końcu 5' lub 2+3, jeśli mutacje są na końcu 3' i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR II (patrz Tabela 1 dla programu PCR).</li>
		<li>Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.</li>
		<li>Oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).</li>
		<li>Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do czasu użycia w kroku 5.</li>
		<li>Wykonaj PCR6 używając produktu PCR II jako startera razem ze starterem 3, jeśli mutacje znajdują się na końcu 5' lub starterem 1, jeśli mutacje znajdują się na końcu 3' i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do uzyskania produktu PCR III (patrz Tabela 1 dla programu PCR).</li>
		<li>Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2.</li>
		<li>Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).</li>
		<li>Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do etapu 5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR do 3-etapowej PCR
	<ol>
		<li>Wykonaj PCR6 używając starterów 1+2 i 3+4 w oddzielnych reakcjach i użyj DNA typu dzikiego jako matrycy do otrzymania produktu PCR II i III (patrz Tabela 1 dla programu PCR).</li>
		<li>Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2.</li>
		<li>Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).</li>
		<li>Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O).</li>
		<li>Wykonaj PCR6 używając starterów 1+4 i użyj 2-5 ng zarówno produktów PCR II, jak i III jako matryc (w tej samej reakcji), aby otrzymać produkt PCR IV (patrz Tabela 1 dla programu PCR).</li>
		<li>Walidację PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w kroku 3.2.1 i 3.2.2. 
		UWAGA: Nie jest niczym niezwykłym, że otrzymujemy kilka nieprawidłowych pasm (czasami można je zmniejszyć, używając mniejszej ilości szablonu). Jednak niewłaściwe produkty PCR można zignorować, jeśli pas o odpowiednim rozmiarze zostanie wycięty i wyekstrahowany żelem.</li>
		<li>Jeśli jest to poprawne, należy oczyścić produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i zmierzyć stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów).</li>
		<li>Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do etapu 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Rekombinacja dzikich i zmutowanych wersji DNA do wybranego wektora
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat następujących kroków, zobacz7.
<ol>
	<li>Trawić oczyszczone produkty PCR I i III (z 2-etapowego PCR) i/lub IV (z 3-etapowego PCR) przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
	<ol>
		<li>W 20 μl 1x buforu wytrawiającego z 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego, trawić 200 ng produktu PCR w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyścić strawiony produkt PCR przez ekstrakcję żelem przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów), zmierzyć stężenie DNA oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do czasu użycia w kroku 5.6.</li>
	<li>Strawić oczyszczony wektor odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i potraktować fosfatazą alkaliczną w celu zmniejszenia zdarzeń religacji wektora. Nie należy traktować produktów PCR fosfatazą alkaliczną.
	<ol>
		<li>W 30 μl 1x buforu wytrawiającego z 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego i 1 μl fosfatazy alkalicznej, trawić 1 000 ng wektora w temperaturze 37 °C przez 30-60 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielić strawiony wektor od odpadowego DNA (np. nieoszlifowanego wektora i wyciętego DNA) za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak w krokach 3.2.1 i 3.2.2.</li>
	<li>Oczyścić strawiony wektor przez ekstrakcję żelem przy użyciu zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów), zmierzyć stężenie DNA oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru (tabela materiałów) i przechowywać w temperaturze -20 °C (w buforze TE) lub 4 °C (w dH2O) do czasu użycia w kroku 5.6.</li>
	<li>Podasumować strawione produkty PCR do strawionego wektora w reakcjach określonych w tabeli 2.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
	<li>Przekształć szczep biorcy (np. E. coli K12) za pomocą reakcji ligacji.
	<ol>
		<li>Wyhoduj szczep do OD600 = 0,3-0,5 i przenieś kulturę 1 ml do tylu probówek o pojemności 1,5 ml, ile mają reakcje ligazy.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 3 500 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawieś komórki w 200 μl buforu transformacyjnego (10 ml bulionu lizogenicznego (LB) z 0,1 g/ml glikolu polietylenowego 3350, 5% siarczanu dimetylu i 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Dodaj reakcję podwiązania i umieść probówki na lodzie na 30 minut.</li>
		<li>Szok termiczny przez 2 minuty w temperaturze 42 °C.</li>
		<li>Dodać 1 ml LB do probówek o pojemności 1,5 ml i pozostawić fenotypową ekspresję oporności na antybiotyki przez co najmniej 45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 3 500 x g przez 5 minut, odrzucić 1 ml supernatantu i ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie.</li>
		<li>Umieścić komórki na płytkach z odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja transformantów zawierających wektory z udaną integracją insercji DNA (np. przez PCR przy użyciu starterów specyficznych dla wektorów i insercji).</li>
	<li>Walidacja sekwencji DNA przez sekwencjonowanie Sangera. 
	UWAGA: Do sekwencjonowania nie należy używać tych samych starterów, co w kroku 5.9.</li>
</ol>
6. Używanie wektorów skonstruowanych do eksperymentów in vitro i/lub in vivo
<ol>
	<li>Eksperyment in vivo 
	UWAGA: Jest to przykład użycia wektora do ekspresji dzikiego/zmutowanego RNA w celu scharakteryzowania regulacji potranskrypcyjnej. Aby uzyskać więcej informacji na temat western blotting, zobacz8.
	<ol>
		<li>Hoduj szczepy E. coli K12 ze skonstruowanymi wektorami w odpowiednim podłożu i w razie potrzeby indukuj ekspresję. Pobieranie próbek przez odwirowanie.</li>
		<li>Przygotować próbki do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowym siarczanu sodu (SDS-PAGE) poprzez rozpuszczenie osadów komórkowych w 1x buforze do próbek SDS (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5% SDS, 0,002% błękitu bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu, 10% glicerolu) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min. 
		UWAGA: Możliwe jest odlewanie żelu lub użycie dostępnego na rynku żelu prefabrykowanego. Ten ostatni został wykorzystany w wynikach przedstawionych w Rysunek 3 (Tabela materiałów).</li>
		<li>Załadować10-7 komórek każdej próbki do oddzielnych dołków (w tym drabinki białkowej) i uruchomić żel pod napięciem 200 V, aż białka zostaną oddzielone (około 45 minut).</li>
		<li>Osuszyć białka na błonie celulozowej przez półsuche przeniesienie w temperaturze 80 mA przez 1 godzinę.</li>
		<li>Zablokuj błonę mieszaniną białek (np. 5% mleka w proszku rozpuszczonego w 1x buforowanym roztworem soli fizjologicznej Tween 20-Tris (TTBS)).</li>
		<li>Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (rozpuszczone w buforze 1x TTBS), które celuje w białko będące przedmiotem zainteresowania (np. białko znakowane GFP, FLAG lub HIS) i inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Myć membranę w 1x TTBS przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Powtórz jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozpuszczone w buforze 1x TTBS), które jest ukierunkowane na przeciwciała pierwszorzędowe i umożliwia wykrycie (np. przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP). Inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem.</li>
		<li>Umyj membranę w 1x TTBS przez 10 minut, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Powtórz jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Wizualizację błony za pomocą techniki zgodnej z przeciwciałami drugorzędowymi (np. poprzez obrazowanie po inkubacji z chemiluminescencją pochodzącą z luminolu, jeśli zastosowano przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment in vitro 
	UWAGA: Jest to przykład użycia wektora jako matrycy do transkrypcji RNA in vitro w celu scharakteryzowania interakcji RNA-białko. Aby uzyskać więcej informacji na temat EMSA, zobacz9.
	<ol>
		<li>Wykonaj transkrypty in vitro, używając zestawu do transkrypcji in vitro T7 (tabela materiałów) i wektorów z kroku 5 jako szablonów.</li>
		<li>Oddziel transkrypty RNA przez PAGE na 4,5% 7 M żelu denaturującym mocznik i wyekstrahuj RNA bezpośrednio z żelu przez elektroelucję za pomocą probówek dializacyjnych (tabela materiałów).</li>
		<li>Znakować RNA (np. znakowanie radioaktywne γ-32P-ATP przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 (tabela materiałów) i ponownie oczyścić kolumnami (tabela materiałów). 
		UWAGA: Przed przystąpieniem do pracy z materiałem radioaktywnym należy skonsultować się z lokalnym specjalistą ds. bezpieczeństwa radiologicznego.</li>
		<li>Wymieszaj znakowane RNA ze wzrostem stężenia białka w oddzielnych reakcjach w 1x buforze wiążącym (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol (DTT)). 
		UWAGA: W przedstawionych wynikach (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), 2 nM znakowanego radioaktywnie mRNA csgD zmieszano z gradientem od 0 do 2 μM białka Hfq (stężenie monomeru).</li>
		<li>Pozwól białku i RNA na hybrydyzację przed załadowaniem mieszanki hybrydyzacyjnej na niedenaturujący żel poliakrylamidowy i uruchom żel na 1,5 godziny przy napięciu 200 V.</li>
		<li>Wizualizuj żel techniką zgodną z etykietowaniem z kroku 6.1.3. (np. za pomocą fosfoobrazowania, jeśli zastosowano znakowanie radioaktywne).</li>
		<li>Określ ilościowo względną intensywność przesuniętych pasm za pomocą programu do przetwarzania obrazowania i dopasuj krzywą (sigmoidalną) do danych za pomocą wykresu i oprogramowania do analizy danych (tabela materiałów). Na podstawie dopasowanej krzywej można automatycznie wyznaczyć wartości stałej dysocjacji (Kd) za pomocą oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Mutageneza ukierunkowana ma szeroki wachlarz różnych zastosowań, a tutaj reprezentatywne wyniki eksperymentu in vivo i in vitro zostały uwzględnione jako przykłady tego, jak wyciągać wnioski biologiczne przy użyciu tej techniki. Mutageneza ukierunkowana przez długi czas była złotym standardem w badaniach interakcji RNA. Siła tej techniki polega na połączeniu wprowadzania odpowiednich mutacji z dalszymi testami i eksperymentami (np. western blot lub EMSA) w celu wyciągnięcia wniosków na temat określonych miejsc DNA i ich ...

DNA jest często określane jako wzór żywej komórki, ponieważ wszystkie struktury komórki są zakodowane w sekwencji jej DNA. Dokładne mechanizmy replikacji i naprawy DNA zapewniają, że zachodzi tylko bardzo niskie tempo mutacji, co jest niezbędne do utrzymania prawidłowych funkcji kodowanych genów. Zmiany sekwencji DNA mogą wpływać na kolejne funkcje na różnych poziomach, począwszy od DNA (rozpoznawanie przez czynniki transkrypcyjne i enzymy restrykcyjne), następnie RNA (komplementarność par zasad i zmiany struktury drugorzędowej) i/lub białka (podstawienia aminokwasów, delecje, addycje lub przesunięcia ramki). Podczas gdy wiele mutacji nie wpływa znacząco na funkcję genów, niektóre mutacje w DNA mogą mieć ogromne konsekwencje. W związku z tym mutageneza ukierunkowana jest cennym narzędziem do badania znaczenia określonych miejsc DNA na wszystkich poziomach.
Ten protokół opisuje ukierunkowane podejście mutagenezy używane do wprowadzania określonych mutacji. Protokół opiera się na dwóch różnych strategiach PCR: 2-etapowej lub 3-etapowej PCR. 2-etapowy PCR ma zastosowanie, jeśli pożądana mutacja jest bliska końcowi 5' lub końcowi 3' DNA będącego przedmiotem zainteresowania (<200 par zasad (bp) od końca), a 3-etapowy PCR ma zastosowanie we wszystkich przypadkach.
W podejściu 2-etapowym PCR projektowane są 3 startery, z których jeden zestaw starterów jest przeznaczony do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania (startery 1 i 3, odpowiednio do przodu i do tyłu), a pojedynczy starter jest przeznaczony do włączenia mutacji. Starter wprowadzający mutację (starter 2) powinien mieć orientację odwrotną, jeśli mutacja jest bliska końca 5' i orientację do przodu, jeśli mutacja jest bliska końca 3'. W pierwszym etapie PCR starter 1 + 2 lub 2 + 3 amplifikuje mały fragment w pobliżu odpowiednio końca 5' lub końca 3'. Otrzymany produkt PCR jest następnie używany jako starter w kroku drugim ze starterem 1 lub 3, w wyniku czego powstaje produkt PCR z mutacją w DNA będącym przedmiotem zainteresowania (<silna klasa = "xfig">Figura 1A).
W 3-etapowym PCR projektuje się 4 startery, z których jeden zestaw starterów jest przeznaczony do amplifikacji DNA będącego przedmiotem zainteresowania (startery 1 i 4, odpowiednio do przodu i do tyłu), a jeden zestaw starterów jest przeznaczony do włączania specyficznych mutacji o nakładającej się komplementarności (startery 2 i 3, odpowiednio odwrotne i przodu). W kroku pierwszym i drugim startery 1+2 i 3+4 wzmacniają koniec 5' i 3'. W kroku trzecim powstałe produkty PCR z kroku pierwszego i drugiego są używane jako matryce i amplifikowane starterami 1+4. W ten sposób otrzymany produkt PCR jest DNA będącym przedmiotem zainteresowania z pożądaną mutacją (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B).
Chociaż zmutowane DNA może być użyte do dowolnej dalszej aplikacji, ten protokół opisuje, jak ponownie połączyć DNA w wektor klonujący. Stosowanie wektorów klonujących ma kilka zalet, takich jak łatwość klonowania i specyficzne zastosowania eksperymentalne w zależności od cech wektora. Ta funkcja jest często używana do badań interakcji RNA. Inną techniką badań interakcji RNA jest strukturalne sondowanie RNA w kompleksie z innym RNA1,2 lub protein3,4. Jednak sondowanie strukturalne przeprowadza się tylko in vitro, podczas gdy mutageneza ukierunkowana i późniejsze klonowanie pozwalają na badania interakcji in vivo.
Mutageneza ukierunkowana na miejsce była szeroko stosowana w badaniach interakcji RNA, jak to tutaj pokazano. Jednak kluczowa metoda dotycząca 2- lub 3-etapowej PCR ma zastosowanie do każdego fragmentu DNA, a zatem nie ogranicza się tylko do badań interakcji RNA.
Aby zilustrować technikę i jej możliwe zastosowania, użyto charakterystyki regionów ważnych dla potranskrypcyjnej regulacji mRNA, csgD, Escherichia coli (E. coli). U E. coli csgD jest celem małego niekodującego RNA, McaS, we współpracy z białkiem Hfq, w celu stłumienia ekspresji białka CsgD2,4,5. Technika ta służy do wprowadzania mutacji do regionu parowania zasad między csgD i McaS oraz do miejsca wiązania Hfq csgD. Uzyskane DNA jest następnie klonowane do wektora nadającego się do kolejnych eksperymentów. Dalsze zastosowania tej techniki obejmują zarówno eksperymenty in vivo, jak i in vitro. Dla ilustracji przykład 1 jest charakteryzowany in vivo przy użyciu testu western blot, a przykład 2 jest charakteryzowany in vitro przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA). W obu przypadkach zilustrowano, w jaki sposób mutageneza ukierunkowana może być stosowana w połączeniu z innymi technikami w celu wyciągnięcia biologicznych wniosków na temat genu będącego przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało anty-GroEL wytwarzane u królika</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Stacja robocza do obrazowania żelu</td></tr><tr><td>Niestandardowy oligo DNA</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>Spektrofotometr do pomiarów kwasów nukleinowych</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel DNA (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny 1 %</td> <td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Rurki dializacyjne do elektroelucji</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji MEGAscript T7</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Poziomy system elektroforezy</td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało ANTI-FLAG M2 wytwarzane u myszy</td><td>Merck</td><td>F3165</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Immunoglobuliny myszy</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0447</td><td>HRP sprzężone przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>oczyszczanie RNA</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Bis-Tris do separacji białek</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>Polimeraza DNA</td></tr><tr><td>PowerPac HC Zasilacz wysokoprądowy</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Immunoglobuliny królika</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP sprzężony przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agaroza</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Narzędzie do analizy wykresów i danych</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>maszyna do PCR</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligaza</td></tr><tr><td>polinukleotydowa T4</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE (tris-acetat-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji rna w escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutageneza ukierunkowana na miejsce to technika stosowana do wprowadzania specyficznych mutacji w DNA w celu zbadania interakcji między małymi cząsteczkami niekodującego kwasu rybonukleinowego (sRNA) a docelowymi informacyjnymi RNA (mRNA). Ponadto mutageneza ukierunkowana na miejsce jest wykorzystywana do mapowania określonych miejsc wiązania białek z RNA. Opisano 2-etapowe i 3-etapowe wprowadzanie mutacji na podstawie PCR. Podejście to jest istotne dla wszystkich badań interakcji białko-RNA i RNA-RNA. Krótko mówiąc, technika ta opiera się na projektowaniu starterów z pożądaną mutacją (mutacjami) oraz na 2 lub 3 etapach PCR syntetyzujących produkt PCR z mutacją. Produkt PCR jest następnie używany do klonowania. W tym miejscu opisujemy, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce zarówno z podejściem 2-, jak i 3-etapowym w celu wprowadzenia mutacji do sRNA, McaS i mRNA, csgD, w celu zbadania interakcji RNA-RNA i RNA-białko. Stosujemy tę technikę do badania oddziaływań RNA; jednak technika ta ma zastosowanie do wszystkich badań mutagenezy (np. interakcje DNA-białko, podstawienie/delecja/addycja aminokwasów). Możliwe jest wprowadzenie dowolnego rodzaju mutacji, z wyjątkiem zasad nienaturalnych, ale technika ta ma zastosowanie tylko wtedy, gdy produkt PCR może być użyty do dalszego zastosowania (np. klonowanie i matryca do dalszego PCR).

W celu zbadania oddziaływań RNA w kontekście potranskrypcyjnej regulacji csgD, wybrano układ z dwoma wektorami: jeden do ekspresji csgD mRNA oraz inny do ekspresji małego niekodującego RNA, McaS. csgD sklonowano do pBAD33, który jest indukowalnym arabinozą plazmidem o średniej liczbie kopii z opornością na chloramfenikol, natomiast McaS sklonowano do mini R1 pNDM220, który jest indukowalnym izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydem (IPTG) plazmidem o niskiej liczbie...

Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest techniką używaną do wprowadzania specyficznych mutacji w kwasie dezoksyrybonukleinowym (DNA). Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą 2-etapowego i 3-etapowego podejścia opartego na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), które ma zastosowanie do dowolnego fragmentu DNA będącego przedmiotem zainteresowania.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Mutageneza ukierunkowana jest przydatna do badania interakcji molekularnych, takich jak interakcje RNA-RNA i białka RNA. Protokół ten opisuje, jak przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce z dwu- lub 3-etapowym podejściem PCR. Głównymi zaletami tej metody jest różnorodność różnych mutacji, które można włączyć, a także względna łatwość i koszt takiego działania.Aby rozpocząć, użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów dwóch, jeden i dwóch, trzech, specyficznych dla 2-etapu, lub par starterów trzy, jeden i trzy, cztery, specyficznych dla 3-etapowego PCR, aby uzyskać pierwszy produkt PCR. Aby zwalidować produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, należy przygotować 2% żel agarozowy, rozpuszczając dwa gramy agarozy w 100 mililitrach buforu 1X TAE za pomocą kuchenki mikrofalowej. Dodać bromek etydyny w końcowym stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr.Następnie odlej żel agarozowy. Po zestaleniu umieść go w urządzeniu do elektroforezy. Załaduj drabinę DNA o znanym rozmiarze, a próbki PCR zmieszane z DNA ładują barwnik do studzienek.Badaj próbki pod napięciem 75 V przez 45 minut. I wizualizuj opaski na transiluminatorze UV lub za pomocą żelowego systemu obrazowania. Następnie oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta i zmierz stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru.Następnie przechowuj oczyszczone DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w buforze TE. Aby rozpocząć mutagenezę ukierunkowaną z 2-etapową PCR, najpierw użyj matrycy DNA typu dzikiego, a następnie par starterów dwóch, jednego i dwóch, dwóch, dla pięciu mutacji starterów lub par starterów dwóch, dwóch i dwóch, trzech dla trzech mutacji primentowych, aby uzyskać drugi produkt PCR. Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem.Następnie użyj matrycy DNA typu dzikiego i produktu PCR dwa jako startera, wraz ze starterem drugim, trzema dla pięciu mutacji primentowych lub starterem drugim, jednym dla trzech mutacji primentowych, aby otrzymać trzeci produkt PCR. Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie przechowuj oczyszczone DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w buforze TE.Aby rozpocząć mutagenezę bezpośrednią z 3-etapowym PCR, najpierw użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów trzech, jeden i trzech, dwóch, aby uzyskać drugi produkt PCR. Użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów trzy, trzy i trzy, cztery, aby uzyskać trzeci produkt PCR. Użyj matrycy DNA typu dzikiego i par starterów trzy, trzy i trzy, cztery, aby uzyskać trzeci produkt PCR.Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem. Na koniec użyj od dwóch do pięciu nanogramów produktów PCR dwa i trzy jako matrycę wraz z parami starterów trzecim, pierwszym i trzecim, czwartym, aby uzyskać czwarty produkt PCR. Zwaliduj produkt PCR za pomocą elektroforezy żelowej, oczyść produkt PCR i zmierz jego stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem.Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w buforze TE. W tym badaniu zastosowano 2-etapową i 3-etapową mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu zbadania interakcji RNA dotyczących potranskrypcyjnej regulacji CsgD. CsgD typu dzikiego amplifikowano PCR w celu uzyskania produktu PCR IA, a mcaS typu dzikiego amplifikowano PCR w celu uzyskania produktu PCR IB. Stosując 3-etapową strategię PCR, produkty PCR IIA i IIIA zsyntetyzowano w pierwszych dwóch etapach, a IVA w trzecim etapie w celu wprowadzenia mutacji w CsgD.Podobnie, komplementarne mutacje ukierunkowane na miejsce zostały wprowadzone w mcaS, aby uzyskać produkty PCR IIB, IIIB w pierwszych dwóch etapach i IVB w trzecim etapie. Analiza Western blot wykazała, że podczas gdy ekspresja mcaS typu dzikiego zapobiega translacji CsgD typu dzikiego, mutacje w mcaS lub CsgD łagodzą obserwowaną represję. Jednak mutacje zarówno w CsgD, jak i mcaS zapobiegają translacji CsgD.Stosując 2-etapową strategię PCR, W PIERWSZYM ETAPIE ZSYNTETYZOWANO PRODUKTY PCR IIC, IID, IIE, IIF i IIG, a w drugim etapie produkty PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF i IIIG w celu wprowadzenia mutacji do całego DNA CsgD. Wyniki EMSA wiązania HFQ z transskrybowanymi in vitro dzikimi i zmutowanymi RNA CsgD, zsyntetyzowanymi przy użyciu produktów PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF i IIIG, wykazały zwiększone wartości KD zmutowanych alleli. Okazało się, że HFQ może wiązać się z mutantami mniej skutecznie.Ponadto HFQ ma kilka miejsc wiązania na CsgD, co pokazują trzy przesunięcia obserwowane dla RNA typu dzikiego. Jednak dla różnych zmutowanych RNA obserwuje się tylko dwa miejsca wiązania. W ten sposób podejście mutacyjne ukierunkowane na miejsce identyfikuje pierwszorzędowe i/lub drugorzędowe struktury mRNA CsgD, które są ważne dla całkowitego wiązania HFQ.Opisana tutaj metoda mutagenezy ukierunkowanej opiera się na PCR. Dobre praktyki PCR mają zatem kluczowe znaczenie dla metody i mogą wymagać optymalizacji, aby odnieść sukces. Mutageneza ukierunkowana na miejsce jest skuteczna tylko w przypadku wszystkich trzech metod, takich jak EMSA i Western Blotting.Inne metody, na przykład, obejmują różne testy strukturalne i niektóre testy aktywności, a także badania modyfikacji po translacji.

site-directed-mutagenesis-for-vitro-vivo-experiments-exemplified-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Niniejsza praca pokazuje, jak tworzyć hybrydy RNA/DNA na poziomie chromosomowym oraz wykazać transfer informacji genetycznej z RNA do genomowego DNA w komórkach drożdży.

Generowanie hybryd RNA/DNA w genomowym DNA poprzez transformację z wykorzystaniem oligonukleotydów zawierających RNA

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.

Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Poznaj mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w badaniach RNA-RNA i RNA-białko w Escherichia coli. Ta metoda PCR pozwala wprowadzać różne mutacje i analizować interakcje molekularne z wykorzystaniem elektroforezy żelowej.

Mutageneza ukierunkowana na miejsce w eksperymentach in vitro i in vivo na przykładzie interakcji RNA w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów