Montaż i charakterystyka memrystorów biomolekularnych składających się z błon lipidowych domieszkowanych kanałami jonowymi
9 marca 2019
Miękkie, biomolekularne memrystory o niskiej mocy wykorzystują podobny skład, strukturę i mechanizmy przełączania biosynaps. Przedstawiono protokół składania i charakterystyki memrystorów biomolekularnych otrzymywanych z izolacji dwuwarstw lipidowych powstałych pomiędzy kropelkami wody w oleju. Włączenie aktywowanych napięciem peptydów alametycyny powoduje memrystywne przewodnictwo jonowe w poprzek błony.
Nasz protokół opisuje, jak złożyć i elektrycznie scharakteryzować biomembranę domieszkowaną peptydami, która ściśle naśladuje skład, strukturę i właściwości transportowe synaps biologicznych i która wykazuje przestrajalną odporność na pamięć. Technika ta umożliwia użytkownikom ocenę zależnej od aktywności, odporności pamięci i krótkotrwałej plastyczności w systemach inżynieryjnych w skalach czasowych i poziomach wzbudzenia istotnych dla synaps biologicznych i kanałów jonowych. Technika ta zapewnia ramy do charakteryzowania błon biomimetycznych zawierających kanały jonowe aktywowane napięciem, dzięki czemu ma zastosowanie do charakteryzowania różnych procesów transportu komórkowego, w tym tych w neuronach.
Nasza sugestia dla nowych badaczy jest taka, aby najpierw nabrali wprawy w przygotowywaniu roztworów liposomowych i składaniu dwuwarstwy interfejsu kropelkowego na elektrodach drutowych. Zobaczenie na własne oczy procesu dozowania kropel i pozycjonowania na elektrodach upraszcza tę technikę tworzenia dwuwarstw, czyniąc ją natychmiast dostępną dla wszystkich. Tę procedurę zademonstruje dr Joseph Najem, doktor habilitowany z mojego laboratorium.
Na początek przygotuj roztwór podstawowy almetycyny w probówce mikrowirówki, rozpuszczając proszek peptydów almetycyny w etanolu do końcowego stężenia 2,5 miligrama na mililitr. Krótko obracaj probówkę, aby dobrze wymieszać, a następnie przechowuj roztwór podstawowy w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W 1,5 mililitrowej probówce Safe-Lock dodaj jeden mikrolitr roztworu podstawowego almetycyny do 99 mikrolitrów roztworu A, aby uzyskać końcowe stężenie alametycyny 13 mikromolów w zawiesinie liposomów.
Wiruj, aby dobrze wymieszać. Powstały roztwór liposomów peptydowych to roztwór B.Wymieszaj 117 mikrolitrów roztworu A z 10 mikrolitrami roztworu B, aby uzyskać końcowe stężenie almetycyny jednego mikromolowego, a następnie wiruj, aby dobrze wymieszać. Otrzymany roztwór należy traktować jak C.Store roztworów B i C w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Umieść szklaną stronę o grubości jednego milimetra 25 razy 75 milimetrów na stoliku mikroskopu odwróconego. Dozuj kilka kropli oleju heksadekanowego na środek szkiełka podstawowego, a następnie umieść zbiornik oleju bezpośrednio na oleju na szkiełku podstawowym. Całkowicie napełnij zbiornik oleju olejem sześciokątnym.
Upewnij się, że zbiornik znajduje się nad soczewką obiektywu. Następnie podłącz uchwyt elektrody do stopnia czołowego wzmacniacza prądowego zamontowanego na mikromanipulatorze. Mikromanipulator minimalizuje długość elektrody i szum elektryczny.
Następnie zamontuj szklany uchwyt na mikropipetę wraz z drugim drutem chlorku srebra na innym mikromanipulatorze. Za pomocą mikromanipulatorów ustaw elektrody tak, aby pokryte agarozą końcówki drutów srebro-srebro-chlorek były całkowicie zanurzone w zbiorniku oleju w podobnej płaszczyźnie pionowej. Wyrównaj dwie elektrody i oddziel je o kilka milimetrów.
Aby utworzyć dwuwarstwę lipidową, przesuń elektrody pionowo do fazy olejowej. Za pomocą mikropipety nanieś 200 nanolitrów roztworu lipidowego A na każdy z przewodów. Odczekaj od trzech do pięciu minut, aby umożliwić spontaniczne złożenie się monowarstwy lipidowej na granicy faz oleju wodnego.
Kropelki mogą zwisać, jeśli otaczający olej jest wystarczająco gęsty. Następnie opuść elektrody, aby ponownie zanurzyć się, aż końce obu elektrod ledwo dotkną dna zbiornika oleju. Następnie, aby utworzyć dwuwarstwę, przesuń elektrody poziomo, aby kropelki się zetknęły.
Aby uzyskać ściśniętą, histeretyczną zależność prąd-napięcie, należy użyć generatora funkcyjnego, aby przyłożyć trójkątny lub sinusoidalny przebieg napięcia do błony lipidowej wolnej od almetycyny połączonej z kropelkami roztworu A. Zarejestruj indukowaną odpowiedź prądową na wielu częstotliwościach. Aby zarejestrować rozmiar międzyfazowej dwuwarstwy lipidowej, zmierz średnicę błony lipidowej na komputerze lub zarejestruj amplitudę prądu między szczytami wynikającą z trójkątnej fali 10 Hz i 10 miliwoltów, aby obliczyć powierzchnię membrany. Wyjmij przewody z fazy olejowej, aby usunąć kropelki, które nie zawierają alametycyny.
Dodać nowe kropelki wody wodnej za pomocą roztworu C i utworzyć dwuwarstwę lipidową. Opierając się na amplitudzie prądu fali prostokątnej, użyj mikromanipulatorów, aby wyregulować kontakt między kropelkami, tak aby dwuwarstwa miała podobny obszar jak ten utworzony wcześniej. Następnie zastosuj przebieg fali napięcia 10 Hz i 10 miliwoltów i zapisz odpowiedź prądu indukowanego, jak poprzednio.
Aby przeprowadzić eksperymenty impulsowe przy użyciu niestandardowego oprogramowania do programowania i analogowego źródła napięcia, generuj impulsy napięciowe o określonych amplitudach wysokich i niskich w czasie włączenia i wyłączenia. Rejestruj prąd w odpowiedzi na przyłożone impulsy. Wykres prądu w funkcji napięcia pokazuje niezerową odpowiedź prądową po zastosowaniu polaryzacji napięcia do dwuwarstwy lipidowej wolnej od ametycyny.
Dodaj 0,017 herca, częstotliwość, w której impedancja jest zdominowana przez rezystancję membrany. Dla membrany o wysokiej izolacyjności pokazano niską odpowiedź prądową omową. Wykres dwuwarstwy lipidowej utworzonej między dwiema kropelkami zawierającymi peptydy almetycyny wykazuje wykładniczo rosnące prądy przy napięciach wyższych niż próg insercji wynoszący 100 miliwoltów.
Przy wysokim napięciu peptydy almetycyny znajdujące się na powierzchni dwuwarstwy lipidowej wprowadzają się do błony i agregują, tworząc pory przewodzące. Symetryczne odpowiedzi prądowe na obu biegunach wynikają z insercji i agregacji oddzielnych populacji peptydów z przeciwnych stron błony. Prąd pojemnościowy należy odjąć od prądu całkowitego, aby uzyskać tylko memrystyczną, ściśniętą histerezę odpowiedzi prądowo-napięciowej.
Reakcja memrystora biomolekularnego na kolejne impulsy napięcia ze wzrostem przewodności w czasie włączenia, pomimo okresowego przywracania stanu izolacji podczas każdego czasu wyłączenia. Zarówno obecny bodziec, jak i wcześniejsze bodźce przyczyniają się do obecnego wzrostu. Spójne monowarstwy na obu kropelkach muszą się uformować przed połączeniem ich w dwuwarstwę.
Jeśli kropelki zostaną zebrane zbyt wcześnie, łączą się i nie tworzy się dwuwarstwa. Obecnie projektujemy i wytwarzamy mikroprzepływowe sieci neuronowe składające się z neuronów półprzewodnikowych połączonych synapsami opartymi na błonie, wspieranymi przez optymalizację asymilacji sieci wysokowydajnych superkomputerów w ORNL. Te memrystory są pierwszymi, które mają skład, strukturę, mechanizm przełączania i transport jonów synaps biologicznych.
W ten sposób zapewniają biomolekularną podstawę wyposażoną w obliczenia i pamięć podobne do mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje proces montażu i charakterystykę elektryczną biomembran domieszkowanych peptydami, które naśladują synapsy biologiczne. Technika ta umożliwia ocenę rezystancji pamięciowej oraz plastyczności krótkotrwałej, istotnych w systemach biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Biomateriały
Wstęp
- Biomolekularne memrystory są inspirowane biologicznymi synapsami.
- Izolujące lipidowe dwuwarstwy są tworzone pomiędzy kropelkami wody w oleju.
- Aktywowane napięciem peptydy alametycyny zwiększają przewodnictwo jonowe.
- Zrozumienie tych systemów pomaga w badaniu procesów transportu komórkowego.
Cel badania
- Opracowanie metody tworzenia membran biomimetycznych.
- Charakterystyka rezystancji pamięciowej w systemach inżynieryjnych.
- Zapewnienie podstaw do badania zachowania kanałów jonowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów liposomów.
- Montaż dwuwarstw lipidowych na styku kropli na elektrodach.
- Charakterystyka elektryczna biomembran.
- Ocena zależnej od aktywności rezystancji pamięciowej.
Główne wyniki
- Wykazano regulowaną rezystancję pamięciową w biomembranach.
- Wykazano potencjał do badania plastyczności krótkotrwałej.
- Uzyskano wgląd w właściwości transportowe systemów inżynieryjnych.
- Podkreślono dostępność tej techniki dla nowych badaczy.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia skuteczne badanie membran biomimetycznych.
- Stanowi on cenne narzędzie do zrozumienia mechanizmów funkcjonowania synaps.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne procesy transportu komórkowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Biomolekularne memrystory oferują biomimetyczne podejście do emulacji funkcji synaptycznych w obliczeniach neuromorficznych, rozwiązując ograniczenia urządzeń opartych na krzemie, takie jak wysoki pobór mocy i słaba interkonektywność. Poprzez replikację składu, struktury i transportu jonowego synaps biologicznych, technologia ta umożliwia modelowanie predykcyjne procesów neuronalnych i wspiera ograniczanie ryzyka na wczesnym etapie walidacji celów dla neuroterapii. Platforma ta zapewnia skalowalny, powtarzalny system do oceny aktywności kanałów jonowych i rezystancji pamięciowej, odpowiadając na potrzeby etapu odkryć w zakresie wglądu w mechanizmy oraz ciągłości translacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji napięciowo zależnych kanałów jonowych w środowisku lipidowym zbliżonym do naturalnego, co wspiera walidację celu poprzez funkcjonalną ocenę tworzenia porów i dynamiki przewodnictwa.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do charakteryzacji wbudowywania i agregacji porów indukowanych przez alametycynę, co zmniejsza zmienność w mechanistycznych badaniach na wczesnym etapie.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Ułatwia opracowanie ilościowych analiz modulatorów kanałów jonowych poprzez pomiar memrystywnej histerezy prądowo-napięciowej oraz odpowiedzi plastyczności krótkotrwałej.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analiz poprzez kontrolowane tworzenie lipidowych dwuwarstw i inkorporację peptydów, co umożliwia uzyskanie spójnych wyników w kolejnych seriach doświadczalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Oferuje system istotny dla przebiegu chorób do badania mechanizmów dysfunkcji synaptycznych, szczególnie w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, w których zaangażowana jest dysregulacja kanałów jonowych.
- Wartość operacyjna: Łączy etapy odkrywania i badań przedklinicznych, dostarczając ustandaryzowaną metodę oceny wpływu związków na transport jonowy w błonach przed testami in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych (discovery workflows), umożliwiając testowanie hipotez dotyczących celów w postaci kanałów jonowych, wspiera rozwój testów do badania aktywności kanałów jonowych oraz zapewnia ilościowe odczyty elektrofizjologiczne, które pomagają w identyfikacji związków wiodących i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację funkcjonalną napięciozależnych kanałów jonowych poprzez rejestrowanie zależnych od aktywności zmian konduktancji oraz oporności pamięciowej w biomimetycznym systemie błonowym.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki powtarzalnemu tworzeniu dwuwarstw oraz domieszkowaniu peptydami, co pozwala na spójną ocenę wpływu związków na strumień jonowy.
- Analityka: Generuje pętle histerezy o kształcie „szczypty” (pinched hysteresis curves) oraz wskaźniki plastyczności na podstawie woltamperometrii cyklicznej i serii impulsów, oferując ilościowe punkty odniesienia do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od odkrywania kanałów jonowych do oceny przedklinicznej poprzez modelowanie zachowań przypominających synaptyczne w systemie redukcjonistycznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalną platformę do charakterystyki kanałów jonowych dla wielu celów, redukując redundantny rozwój testów i zwiększając przepustowość w procesach walidacji celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność predykcyjną w zakresie mechanizmu kanałów jonowych poprzez wykazanie napięciozależnego tworzenia porów oraz modulacji konduktancji analogicznej do synaps biologicznych.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu roztworów lipidowych, kontrolowanemu montażowi interfejsu kropelkowego oraz określonym stężeniom peptydów.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne przy wyborze celu poprzez dostarczenie wczesnych danych funkcjonalnych na temat zachowania kanałów jonowych, co wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac w procesie optymalizacji wiodących związków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w postaci kanałów jonowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną dynamikę konduktancji i profile plastyczności w systemie istotnym pod kątem synaptycznym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z lipidami, elektrofizjologii oraz manipulacji kroplami mikroprzepływowymi w celu niezawodnego tworzenia dwuwarstw.
- Zależny od dostępu do systemów patch-clamp lub wzmacniaczy prądu, generatorów funkcji oraz generatorów impulsów napięcia do charakterystyki elektrycznej.
- Wymaga standaryzacji składu lipidów, stężenia peptydów oraz rozmiaru kropli pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji przy rozszerzaniu metody na inne kanały jonowe poza alametycyną, w tym rozpuszczalności peptydów i kinetyki ich wstawiania.
- Ograniczony koniecznością starannego czyszczenia elektrod oraz konserwacji fazy olejowej w celu zapobiegania zanieczyszczeniom i zapewnienia stabilności dwuwarstwy.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Reconstitution of Alamethicin Peptides
2:20
Setting Up the Experiment
3:30
Formation of the Lipid Bilayer
4:15
Electrical Characterization of the Biomolecular Memristor
5:54
Results: Current-voltage Relationship, Pinched Hysteresis, and Response to Voltage Pulses
7:25
Conclusion
