Name: Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę testu komórkowego do wykrywania przeciwciał anty-akwaporyny-4 w surowicy ludzkiej. Technika ta oferuje wyższą czułość i swoistość w diagnostyce zespołów nerwiczej optyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie z grantów od Narodowej Fundacji Nauki Chin (nr 31600820), Komisji Zdrowia i Planowania Rodziny prowincji Jilin (nr 2016Q036) oraz Projektu Planowania Nauki i Technologii Prowincji Jilin (nr 20180520110JH).

Ta procedura została zatwierdzona przez Komitet Etyki Pierwszego Szpitala Uniwersytetu Jilin i została przeprowadzona na około 1,500 osobach.
1. Rejestracja pacjentów i pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Zastosuj laboratoryjne wykrywanie anty-AQP4 IgG w surowicy u pacjentów klinicznych z głównymi dolegliwościami i objawami wymienionymi poniżej. Wykonaj również badania fizykalne. 
	 
	Zapalenie nerwu wzrokowego: Pacjenci cierpią na deficyty wzroku, takie jak utrata pola widzenia i zmniejszenie ostrości wzroku. 
	Ostre zapalenie rdzenia kręgowego: Pacjenci mogą wykazywać paraliż, deficyty czucia i dysfunkcję autonomiczną. 
	Zespół postrema obszaru: Pacjenci mogą mieć objawy niewyjaśnionej czkawki, nudności lub wymiotów. 
	Zespół ostrego pnia mózgu: Uszkodzenia pnia mózgu mogą powodować różne objawy i oznaki fizyczne w zależności od lokalizacji zmian. 
	Objawowa narkolepsja lub ostry zespół kliniczny międzymózgowia ze zmianami w śródmózgowiu typowymi dla NMOSD. 
	Objawowy zespół mózgowy z typowymi zmianami w mózgu NMOSD. 
	 
	nuta: Zgodnie z międzynarodowymi kryteriami diagnostycznymi dla NMOSD5, diagnozę NMOSD można postawić, jeśli pacjent jest anty-AQP4 IgG-dodatni w surowicy i ma co najmniej jedną z podstawowych cech klinicznych wymienionych powyżej. Nie zalecamy jednak wykonywania badań anty-AQP4 IgG wyłącznie u pacjentów z zapaleniem nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Pobieranie próbek krwi 
	UWAGA: Pacjenci nie muszą być na czczo.
	<ol>
		<li>Pobrać 2-3 ml krwi żylnej do probówki próżniowej o pojemności 4 ml.</li>
		<li>Pozostaw surowicę do krzepnięcia przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
		nuta: Przedłużone krzepnięcie może zwiększyć stężenie w surowicy z powodu wycieku z płytek krwi.</li>
		<li>Wirować przy 2100 x g przez 5 min. Ostrożnie przenieść surowicę do nowej probówki.</li>
		<li>Poddać analizie surowicę natychmiast lub podwielokrotnie i przechowywać w temperaturze -20 lub -80 °C. 
		nuta: Przechowywanie w temperaturze -20 °C służy do przechowywania przez miesiące, natomiast -80 °C służy do przechowywania przez lata.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie przeciwciał anty-AQP4
UWAGA: Próbki pacjentów i używane odczynniki powinny być uważane za materiały zakaźne. Odczynniki zawierające azydek sodu w zestawie są toksyczne. Schemat blokowy protokołu znajduje się w Rysunek 1.
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Przynieś zestaw do RT przed użyciem. 
		UWAGA: Przechowuj zestaw w temperaturze 2-8 °C.</li>
		<li>Przygotować co najmniej 200 ml PBS buforu do przemywania zawierającego 0,2% Tween 20. Wlać 100 ml buforu do przemywania do zlewki o pojemności 500 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki surowicy 10x buforem do płukania. Przygotować kontrole dodatnie i ujemne zgodnie z instrukcjami dystrybutora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja próbki
	<ol>
		<li>Dodać 30 μl wstępnie rozcieńczonych próbek, kontroli dodatniej lub kontroli ujemnej do pól reakcji tacki na odczynniki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2). 
		nuta: Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Zdejmij osłonę ochronną z prowadnic biochipowych. 
		nuta: Nie dotykaj biochipów, aby uniknąć oderwania i zanieczyszczenia utrwalonych komórek. Przytrzymaj suwak obok siebie przed zdjęciem pokrywy.</li>
		<li>Przyłóż szkiełko biochipowe do tacki na odczynnik (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Rozpocznij 30-minutową inkubację w RT. 
		nuta: Każda próbka powinna być pojedynczą kroplą podłączoną do odpowiedniego biochipa bez mieszania z innymi kropelkami.</li>
		<li>Delikatnie przepłukać szkiełko biochipowe buforem do mycia. Zanurzyć szkiełko z biochipem w zlewce o pojemności 500 ml wypełnionej 100 ml buforu do płukania na co najmniej 5 minut. Jeśli to możliwe, umieść zlewkę na shakerze.</li>
		<li>Wyjmij szkiełko biochipowe z bufora myjącego. Ostrożnie wytrzyj resztki buforu płuczącego poza pola reakcji ręcznikiem papierowym. Wystawić szkiełko biochipowe na otwarte powietrze na 1-2 minuty, aby odparować resztki buforu płuczącego na polu reakcyjnym. 
		nuta: Nie wysuszaj pól reakcyjnych. Nie dotykaj biochipów ręcznikiem papierowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych zgodnie z instrukcjami dystrybutora.</li>
		<li>Dodać 25 μl fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego do pól reakcji czystej tacki na odczynniki.</li>
		<li>Przyłóż szkiełko biochipowe do tacki na odczynnik załadowanej wtórnym przeciwciałem. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Wylać zużyty bufor do płukania i dodać 100 ml świeżego buforu do płukania do zlewki. Powtórzyć pranie zgodnie z opisem w krokach 2.2.4 i 2.2.5.</li>
		<li>Ostrożnie dodać pożywkę do zatapiania w polach reakcyjnych na szkiełku biochipowym (jedna kropla na pole reakcyjne). Uszczelnij szkiełko biochipowe jednym kawałkiem szkła nakrywkowego. Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Detekcja fluorescencji
	<ol>
		<li>Włącz świetlówkę mikroskopu i podgrzewaj przez 15 minut. Wybierz filtr o długości fali 488 nm.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do fotografowania. Rób zdjęcia zarówno z transfekowanych, jak i nietransfekowanych obszarów wszystkich pól reakcji o różnych powiększeniach. Najpierw zrób jedno zdjęcie z 4-krotnym powiększeniem, aby uzyskać przegląd, a następnie zrób więcej zdjęć z powiększeniami 10x i 20x. 
		nuta: Szczegółowy protokół przedstawiono w tabeli 1. Interpretacja wyników została omówiona w części dotyczącej wyników reprezentatywnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Diagnoza pacjentów
<ol>
	<li>Jeśli pacjent jest anty-AQP4 IgG-dodatni w surowicy i wykazuje co najmniej jedną podstawową cechę kliniczną NMOSD (patrz sekcja dyskusji), zdiagnozuj pacjenta z NMSOD5. Jeśli jednak pacjent jest anty-AQP4 IgG-ujemny, rozpoznanie NMOSD nie może być wykluczone.</li>
</ol>

<ol><li>Zekeridou, A., Lennon, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoimmunity.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110(2015).</li>
<li>Ho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+aquaporin+4+at+1.8+A+and+its+mechanism+of+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuromyelitis+optica-IgG+at+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22in+vitro.Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro.</a> in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311(2016).</li>
<li>Sato, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinction+between+MOG+antibody-positive+and+AQP4+antibody-positive+NMO+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders.</a> Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).</li>
<li>Wingerchuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+consensus+diagnostic+criteria+for+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).</li>
<li>Ruiz-Gaviria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+aquaporin+4+antibody+detection+tests+in+patients+with+neuromyelitis+optica%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).</li>
<li>Waters, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicentre+comparison+of+a+diagnostic+assay%3A+aquaporin-4+antibodies+in+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).</li>
<li>Fryer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP4+autoantibody+assay+performance+in+clinical+laboratory+service%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11(2014).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+in+neuromyelitis+optica%3A+re-testing+study+in+a+large+population+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China.</a> The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).</li>
<li>Pisani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+autoantibodies+in+Neuromyelitis+Optica%3A+AQP4+isoform-dependent+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity.</a> PloS One. 8 (11), 79185(2013).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+testing%3A+direct+comparison+of+M1-AQP4-DNA-transfected+cells+with+leaky+scanning+versus+M23-AQP4-DNA-transfected+cells+as+antigenic+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate.</a> Journal of Neuroinflammation. 11, 129(2014).</li>
<li>Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+CNS+inflammatory+diseases%3A+differentiating+features+of+NMO+and+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Features+of+Patients+with+Multiple+Sclerosis+and+Neuromyelitis+Optica+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders.</a> Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).</li>
<li>Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+testing+AQP4-IgG+in+CSF%3A+Guidance+for+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 3 (3), 231(2016).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+antibodies+to+aquaporin-4+in+neuromyelitis+optica+and+related+disorders%3A+frequency%2C+origin%2C+and+diagnostic+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance.</a> Journal of Neuroinflammation. 7, 52(2010).</li>
<li>Asgari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+leptomeningeal+blood+barrier+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (4), 343(2017).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+characteristics+of+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+an+international+update%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update.</a> Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).</li>
<li>Jarius, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+encephalomyelitis%3A+international+recommendations+on+diagnosis+and+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134(2018).</li>
<li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody+disease%3A+A+review+of+MOG+antibody+seropositive+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).</li>
<li>Ogawa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOG+antibody-positive%2C+benign%2C+unilateral%2C+cerebral+cortical+encephalitis+with+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322(2017).</li>
<li>Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+antibody+titration+in+NMO+patients+treated+with+rituximab%3A+A+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology+Neuroimmunology+%26+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study.</a> Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317(2016).</li>
<li>Kessler, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aquaporin-4+titer+is+not+predictive+of+disease+course+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder%3A+A+multicenter+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study.</a> Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).</li>
<li>Mealy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+serostatus+does+not+predict+response+to+immunotherapy+in+neuromyelitis+optica+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders.</a> Multiple Sclerosis. , (2017).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+aquaporin-4+antibodies+in+Chinese+patients+with+neuromyelitis+optica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica.</a> Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).</li>
<li>Kitley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+and+disease+course+in+aquaporin-4+antibody-positive+patients+with+neuromyelitis+optica+spectrum+disorder+from+the+United+Kingdom+and+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan.</a> Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy powszechnie dostępną metodę wykrywania anty-AQP4 IgG w ludzkiej surowicy. Przeciwciało anty-AQP4 IgG jest ściśle związane z NMOSD, a ustalenie wiarygodnej metody wykrywania przeciwciał anty-AQP4 IgG ma kluczowe znaczenie dla klinicznej diagnozy NMOSD. Po pierwsze, anty-AQP4 IgG jest specyficzna dla NMOSD. Stwardnienie rozsiane jest również chorobą ośrodkowego układu nerwowego o podłożu immunologicznym i ma wiele podobieństw z NMOSD12. Jednak anty-AQP4 IgG jest dodatni tylko w NMOSD<sup ...

IgG AQP4 w surowicy jest podstawowym biomarkerem diagnostycznym zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego (NMOSD)1. Test komórkowy (CBA) jest szeroko stosowaną metodą wykrywania anty-AQP4 IgG o wysokiej czułości i swoistości. W tym miejscu wprowadzany jest szczegółowy protokół dotyczący układu zbiorowego.
AQP4, białko kanału wodnego, ma sześć jednostek rozpiętych na błonie i dwie spiralne domeny otaczające jeden z porów wodnych2. Anty-AQP4 IgG bierze udział w patogenezie NMOSD poprzez wiązanie się z docelowym AQP4, który znajduje się głównie na końcach astrocytów3. Wykazano, że przeciwciało anty-AQP4 IgG jest dodatnie u około dwóch trzecich pacjentów z NMOSD4. W najnowszych międzynarodowych kryteriach diagnostycznych dla NMOSD, anty-AQP4 IgG jest uważany za podstawowy biomarker diagnostyczny5. W związku z tym kluczowe znaczenie ma ustanowienie wiarygodnego protokołu wykrywania anty-AQP4 IgG w surowicy ludzkiej i ułatwienie diagnostyki klinicznej NMOSD.
Obecnie dostępne są różne metody wykrywania IgG anty-AQP4, takie jak CBA, test tkankowy, test immunoenzymatyczny i cytometria przepływowa6,7. CBA wykorzystuje komórki EU90, które są transfekowane ludzkim AQP4 w celu wychwycenia anty-AQP4 IgG. Wychwycona anty-AQP4 IgG jest wykrywana przez fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe, a następnie wizualizowana za pomocą mikroskopii. Coraz więcej dowodów wykazało, że CBA jest bardziej czuły i specyficzny niż inne metody wykrywania IgG anty-AQP46,7. Zgodnie z metaanalizą wykazano, że czułość i swoistość CBA wynosiły 76% i 99%, czyli były wyższe niż testy immunoenzymatyczne oparte na tkankach i enzymach6. Ponadto przeprowadzono wieloośrodkowe porównanie testów diagnostycznych anty-AQP4 IgG7. W badaniu wzięło udział 193 uczestników z 15 europejskich ośrodków diagnostycznych7. Do wykrycia przeciwciał anty-AQP4 IgG7. Wykazano, że CBA było bardziej czułe i specyficzne niż inne metody7. Ponieważ AQP4 jest wyrażany jako dwie główne izoformy (AQP4-M1 i AQP4-M23), komórka wychwytująca anty-AQP4 IgG jest transfekowana AQP4-M1 lub AQP4-M23. Jednak to, który typ komórki przechwytującej jest lepszy, pozostaje kontrowersyjne. Jedno badanie potwierdziło CBA8 oparty na AQP4-M1, podczas gdy inne wykazały, że CBA oparty na AQP4-M23 jest lepszy7,9,10. Jednak CBA oparte na AQP4-M23 może dawać fałszywie dodatnie wyniki z powodu niespecyficznego wiązania IgG8. Jarius i wsp.11 poinformował, że nie ma znaczącej różnicy w wykrywalności anty-AQP4 IgG między CBA opartymi na AQP4-M1 i AQP4-M23.
Podsumowując, anty-AQP4 IgG w surowicy jest podstawowym biomarkerem NMOSD. CBA ma wyższą swoistość i czułość niż inne metody wykrywania anty-AQP4 IgG. Pozostaje kwestią sporną, czy układ zbiorowy oparty na AQP4-M1 czy AQP4-M23 jest lepszy. W artykule opisano szczegółowy protokół CBA opartego na AQP4-M1, który może mieć zastosowanie w diagnostyce klinicznej i badaniach NMOSD.

<table><tbody><tr><td>Anti-aquaporin-4 IIFT</td><td>Euroimmun</td><td>FA 1128-2005-50</td><td>Zawiera szkiełka biochipowe pokryte transfekowanymi i nietransfekowanymi komórkami UE 90 transfekowanymi i nietransfekowanymi AQP4-M1, znakowaną fluoresceiną anty-ludzką IgG, przeciwciałem anty-AQP4 jako kontrolą pozytywną, próbką ujemną przeciwciała, solą dla PBS pH 7,2, Tween 20 i pożywką do zatapiania.&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie fotograficzne</td> <td>CellSens Dimension</td><td>OLYMPUS</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubka z żelem i aktywatorem skrzepów</td><td>Popraw</td><td>623040202</td><td>medyczne Od lokalnej chińskiej firmy</td></tr></tbody></table>

wykrywanie immunoglobuliny g anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Immunoglobulina G (IgG) anty-akwaporyna-4 (AQP4) jest podstawowym biomarkerem diagnostycznym zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego (NMOSD). Test komórkowy (CBA) jest szeroko stosowaną metodą wykrywania anty-AQP4 IgG w ludzkiej surowicy o wysokiej czułości i swoistości. Krótko mówiąc, przeciwciało anty-AQP4 IgG w surowicy jest wychwytywane przez komórkę transfekowaną AQP4, która jest utrwalana na biochipie, a następnie wykrywana przez przeciwciało drugorzędowe znakowane fluoresceiną. Mikroskopia fluorescencyjna jest wykorzystywana do wizualizacji fluorescencji, a intensywność fluorescencji jest oceniana przez co najmniej dwóch doświadczonych klinicystów. Ostateczne rozpoznanie NMOSD można postawić na podstawie kombinacji wyników wykrywania anty-AQP4 IgG, objawów klinicznych i wyników neuroradiologicznych. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, CBA jest bardziej czułe i specyficzne niż inne metody wykrywania anty-AQP4 IgG i może być stosowane zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i badaniach NMOSD. Metoda ma ograniczenia; Na przykład nadal brakuje międzynarodowej skali do oceny miana przeciwciał IgG anty-AQP4 w surowicy. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół wykrywania anty-AQP4 IgG w surowicy ludzkiej za pomocą CBA.

Stosując opisaną tutaj procedurę, możliwe jest wykrycie specyficznych przeciwciał IgG przeciwko AQP4 w surowicy. Podczas procedury do pól reakcyjnych, które zawierają obszary przetransfekowane i nieprzetransfekowane, dodano uprzednio rozcieńczone próbki, kontrolę dodatnią oraz kontrolę ujemną (Rysunek 2). Fluorescencja kontroli ujemnej w obszarze przetransfekowanym wskazywała głównie na niespecyficzne wiązanie przeciwciała wtórnego z przetransfekowanymi komór...

Test komórkowy jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w surowicy. Metoda ta może być stosowana w diagnostyce klinicznej i badaniach naukowych nad zaburzeniami spektrum optycznego zapalenia nerwu i szpiku.

Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Zgodnie z najnowszymi międzynarodowymi kryteriami diagnostycznymi zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego i rdzenia wzrokowego, anty-AQP4 IgG jest uważany za podstawowy biomarker diagnostyczny. Wykrywanie anty-AQP4 IgG za pomocą testu komórkowego może ułatwić diagnostykę kliniczną. Tak więc test komórkowy jest bardziej czuły i specyficzny niż inne metody wykrywania.Można go zastosować zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w badaniach naukowych. Najpierw przynieś próbki surowicy pacjenta, szkiełko biochipowe, proszek PBS i TWEEN 20 z chłodzonego zestawu do testów komórkowych do temperatury pokojowej. Następnie przygotuj ponad 200 mililitrów buforu do płukania PBS zawierającego 0,2 procent TWEEN 20 dla każdego szkiełka biochipowego.Użyć buforu do płukania, aby wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia każdej próbki surowicy. Przygotuj kontrole dodatnie i ujemne zgodnie z instrukcjami producenta. Dodaj 30 mikrolitrów 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń próbki, kontroli pozytywnej i kontroli ujemnej do pięciu indywidualnych pól reakcyjnych na tacy z odczynnikami.Chwyć szkiełko biochipowe za szkiełka podstawowe i zdejmij jego osłonę ochronną, nie dotykając jego pól reakcyjnych. Umieść szkiełko na tacce na odczynniki i inkubuj zestaw w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Delikatnie przepłukać szkiełko biochipowe buforem do płukania.Następnie zanurz go w 500-mililitrowej zlewce wypełnionej 100 mililitrami buforu do płukania i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wyjmij szkiełko biochipowe z bufora myjącego. Użyj ręcznika papierowego, aby ostrożnie wytrzeć pozostały bufor spoza pól reakcyjnych.Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez jedną do dwóch minut. W ciemnym pomieszczeniu dodaj 25 mikrolitrów fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego do każdego pola reakcyjnego tacki na odczynniki. Umieść szkiełko na tacce na odczynniki i inkubuj zestaw w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Delikatnie przepłukać szkiełko biochipowe buforem do płukania. Następnie zanurz go w 500-mililitrowej zlewce wypełnionej 100 mililitrami świeżego buforu do mycia i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut. Wyjmij szkiełko biochipowe z bufora myjącego.Użyj ręcznika papierowego, aby ostrożnie wytrzeć pozostały bufor spoza pól reakcyjnych. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu przez jedną do dwóch minut. Ostrożnie dodaj jedną kroplę pożywki do zatapiania do każdego pola reakcyjnego na szkiełku biochipowym.Na koniec uszczelnij szkiełko biochipowe szkłem nakrywkowym, unikając pęcherzyków powietrza, i przystąp do obrazowania. Słaba intensywność fluorescencji kontroli ujemnej obserwowana w zakażonym obszarze wskazuje na niespecyficzne wiązanie przeciwciała drugorzędowego. Porównanie wykrytych intensywności fluorescencji kontroli pozytywnej w obszarach zakażonych i niezakażonych wskazuje na specyficzne wiązanie anty-AQP4 IgG z AQP4M1 w zakażonych komórkach.Surowica anty-AQP4 IgG ujemna wykazuje wzorce wiązania podobne do kontroli negatywnej zarówno w obszarach zakażonych, jak i niezakażonych. Dodatnia surowica wykazuje wzorce wiązania podobne do kontroli pozytywnej zarówno w obszarach zakażonych, jak i niezakażonych. Próbki uważa się za anty-AQP4 IgG dodatnie, gdy fluorescencja niejednorodnie wzrasta w zakażonym obszarze.Intensywność fluorescencji jest skorelowana z mianem anty-AQP4 IgG w surowicy. Próbki uważa się za prawdopodobnie dodatnie, gdy tylko niewielka liczba komórek w obszarze transfekcji wykazuje wykrywalną intensywność fluorescencji. Próbkę należy uznać za ujemną pod względem przeciwciał anty-AQP4 IgG, jeżeli jej intensywność w zakażonym obszarze jest jednorodnie silniejsza niż w obszarze niezakażonym.Unikanie pęcherzyków powietrza jest ważne i trudne. Aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, najpierw użyj pipety, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w kropelkach. Po drugie, nakładając szkiełko biochipowe na tackę na odczynniki, najpierw pozwól, aby jedna strona szkiełka dotknęła kropel, a następnie powoli wypoziomuj szkiełko.Ponadto nie należy dotykać pól reakcji przez cały czas trwania eksperymentu.

human-serum-anti-aquaporin-4-immunoglobulin-g-detection-cell-based

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje hydrofobową charakterystykę koniugatów przeciwciało-lek opartą na chromatografii cieczowej. Korzystając z kolumny chromatograficznej opartej na ligandzie butylowym, koniugaty przeciwciało-lek są charakteryzowane poprzez oddziaływania hydrofobowe z ligandem.

Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofobowych zależnych od butylu: technika charakteryzowania koniugatów przeciwciało-lek na podstawie oddziaływań hydrofobowych

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Film demonstruje test komórkowy do wykrywania anty-akwaporyny-4 immunoglobuliny G za pomocą biochipa zawierającego komórki nietransfekowane i transfekowane komórki wyrażające akwaporynę-4. Metoda ta ma zastosowanie w diagnostyce zaburzeń ze spektrum zapalenia nerwu wzrokowego, potwierdzonych silną zieloną fluorescencją na biochipie.

Test do wykrywania immunoglobuliny G antyakwaporyny-4 w surowicy

Film demonstruje test immunologiczny oparty na papierze, obejmujący funkcjonalizowane aminami krążki celulozowe usieciowane aldehydem glutarowym. Kowalencyjna immobilizacja przeciwciał wychwytujących swoistych dla IgG-Fc, a następnie wprowadzenie immunoglobuliny G i przeciwciał detekcyjnych sprzężonych z peroksydazą chrzanową, powoduje zmianę koloru potwierdzającą obecność immunoglobuliny G.

Papierowy test immunologiczny do wykrywania immunoglobuliny G

W ostatnich latach testy oparte na żywych komórkach były z powodzeniem wykorzystywane do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym i konformacyjnym. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą wysokoprzepustową cytometrię przepływową, umożliwiającą analizę dużych kohort pacjentów. Wykrycie nowych przeciwciał poprawi diagnostykę i leczenie zaburzeń o podłożu immunologicznym.

Wysokoprzepustowy test cytometrii przepływowej oparty na komórkach do wykrywania przeciwciał przeciwko receptorowi N-metylo-D-asparaginianu lub receptorowi dopaminy-2 w ludzkiej surowicy

Tutaj opisujemy dwa testy do pomiaru aktywacji dopełniacza indukowanej przez przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom. Główną przewagą nad obecnymi testami jest ich ilościowy i łatwy w interpretacji charakter.

Metody ilościowego wykrywania indukowanej przez przeciwciała aktywacji dopełniacza na krwinkach czerwonych

Ten artykuł opisuje prostą metodę mikromacierzy białkowej do profilowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej na 7-pleksowy panel wysoce oczyszczonych antygenów Clostridium difficile w surowicach ludzkich. Protokół może zostać rozszerzony w celu określenia swoistych odpowiedzi przeciwciał w preparatach poliklonalnej immunoglobuliny dożylnej.

Test mikromacierzy białkowej do serologicznego oznaczania odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu po zakażeniu Clostridium difficile

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Poznaj metodę testu komórkowego do wykrywania przeciwciał anty-akwaporyny-4 w surowicy ludzkiej. Technika ta oferuje wyższą czułość i swoistość w diagnostyce zespołów nerwiczej optyki.

Wykrywanie immunoglobuliny G anty-akwaporyny-4 w ludzkiej surowicy za pomocą testu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów