Name: Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj metodę monitorowania odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus u myszy LysM-EGFP w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia długoterminowe pomiary obciążenia bakteryjnego i aktywności neutrofili.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 AI129302 (dla S.I.S.) oraz Program Szkoleniowy w Farmakologii: od ławki do łóżka w UC Davis (NIH T32 GM099608 do L.S.A.). Obrazowanie molekularne i genomiczne (CMGI) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis zapewniło doskonałe wsparcie technologiczne.

Wszystkie badania na myszach zostały przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na UC Davis i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Ustawy o Dobrostanie Zwierząt oraz Ustawy o Rozszerzeniu Badań nad Zdrowiem. Upewnij się, że używasz sterylnych rękawiczek podczas pracy ze zwierzętami.
1. Źródło myszy i obudowa
<ol>
	<li>Wyprowadź myszy LysM-eGFP na tle genetycznym C57BL/6J, jak opisano wcześniej12. Wyprowadź myszy LysM-EGFP×MyD88-/- przez skrzyżowanie myszy LysM-EGFP z myszami MyD88-/- na tle C57BL/6J.</li>
	<li>Myszy domowe w wiwarium. W tych badaniach zwierzęta były trzymane na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis w grupach przed operacją i pojedynczo po operacji. Używaj myszy w wieku od 10 do 16 tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i kwantyfikacja bakterii
<ol>
	<li>Usunąć interesujący nas bioluminescencyjny szczep S. aureus z magazynu w temperaturze -80 °C do rozmrożenia na lodzie. Smuga na 5% płytce z agarem z krwią bydlęcą. Inkubować płytkę z prążkami w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc (16 h). 
	UWAGA: W tym protokole zastosowano szczep ALC2906 SH1000. Szczep ten zawiera plazmid wahadłowy pSK236 z promotorem białka 2 wiążącym penicylinę połączonym z kasetą reporterową luxABCDE z Photohabdus luminescens18.</li>
	<li>Przygotuj tryptyczny bulion sojowy (TSB), mieszając 0,03 g proszku TSB na ml czystej wody i autoklaw TSB w celu sterylizacji. Po schłodzeniu dodaj wszelkie niezbędne antybiotyki przy użyciu sterylnej techniki. W tym protokole dodaj 10 μg/ml chloramfenikolu18 do TSB, aby wybrać do ekspresji plazmid wahadłowy pSK236, który zawiera bioluminescencyjną kasetę luxABCDE.</li>
	<li>Wybierz 3-4 oddzielne kolonie z płytki S. aureus do TSB z 10 μg/ml chloramfenikolu, aby rozpocząć hodowlę przez noc. Inkubować bakterie na wytrząsarce inkubacyjnej w temperaturze 37 °C przez noc (16 godzin).</li>
	<li>Rozpocznij nową hodowlę bakteryjną od hodowli nocnej, rozcieńczając próbkę w stosunku 1:50 do TSB za pomocą 10 μg/ml chloramfenikolu. Hodowla w wytrząsarce inkubacyjnej przy prędkości obrotowej 200 obr./min i temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dwie godziny po rozszczepieniu S. aureus monitorować gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na spektrofotometrze. Obserwuj OD600 w funkcji czasu, aby znaleźć wzrost w środkowej fazie logarytmicznej. Dla szczepu ALC2906 SH1000 OD600 wynoszący 0,5 jest średnio logarytmiczny i odpowiada stężeniu 1 x 108 CFU/ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Gdy OD600 wynosi 0,5, umyj bakterie 1:1 lodowatym DPBS. Odwirować bakterie przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant i dodać dodatkowo schłodzony DPBS i dokładnie wymieszać. Odwirować ponownie przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować supernatant. Zawiesić osad bakteryjny w żądanym stężeniu. W tych badaniach należy pobrać 3 ml ALC2906 SH1000 i ponownie zawiesić w 1,5 ml PBS, co odpowiada stężeniu bakterii około 2 x 108 CFU/ml. Trzymaj bakterie na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Aby sprawdzić stężenie bakterii, rozcieńczyć 100 μl próbki bakteryjnej 1:10 000 i 1:100 000 w PBS. Umieścić 20 μl porcji na płytce agarowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 16 godzin. Policz jtk przez badanie ogólne i oblicz stężenie bakterii następnego dnia.</li>
</ol>
3. Wycinanie skóry i inokulacja S. aureus
<ol>
	<li>Podaj 100 μl 0,03 mg/ml chlorowodorku buprenorfiny (~0,2 mg/kg) każdej myszy we wstrzyknięciu dootrzewnowym. </li>
	<li>Dwadzieścia minut po wstrzyknięciu umieść 2-4 myszy w komorze z 2-3 l/min tlenu z 2-4% izofluranem. Gdy myszy zostaną w pełni znieczulone, przenieś myszy pojedynczo do stożka nosowego podłączonego do 2-3 l/min tlenu z 2-4% izofluranem. Sprawdź, czy myszy są w pełni znieczulone, mocno ściskając każdą tylną łapę między kciukiem a palcem wskazującym. Przejdź do następnego kroku, jeśli zwierzę nie reaguje na szczypanie.</li>
	<li>Ogol sekcję o wymiarach 1 cal na 2 cale z tyłu myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i oczyść obszar ze ścinków futra za pomocą czystej ściereczki lub gazy. Unikaj stosowania balsamu do depilacji, ponieważ może on powodować nadmierny stan zapalny.</li>
	<li>Wyczyść tył myszy najpierw 10% gazą nasączoną jodonem powidonem, a następnie gazą nasączoną 70% etanolem. Oczyść obszar spiralnie, przesuwając się na zewnątrz od środka pola operacyjnego. Przed zabiegiem odczekaj około 1 minutę, aż obszar operacyjny wyschnie.</li>
	<li>Przytrzymaj ogolony grzbiet myszy luźno między dwoma palcami i mocno dociśnij sterylną biopsję dziurkowaną 6 mm na środku przygotowanego obszaru operacyjnego. Nie naciągaj skóry.
	<ol>
		<li>Przekręć biopsję stempla, aby utworzyć okrągły kontur na skórze, który całkowicie przecina skórę w co najmniej jednej części konturu. Uważaj, aby nie przeciąć leżącej pod spodem powięzi lub tkanki.</li>
		<li>Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby przeciąć naskórek i skórę właściwą, postępując zgodnie z okrągłym wzorem odciśniętym przez biopsję stempla.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. S. Inokulacja złocista
<ol>
	<li>Napełnij strzykawkę insulinową 28 G żądanym bioluminescencyjnym inokulantem bakteryjnym. W tym badaniu należy podać stężenie 1 x 108 jtk/ml (50 μl). Nie należy podawać więcej niż 100 μl objętości.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl inokulantu między powięź a tkankę w środku rany z tyłu myszy. Upewnij się, że inokulant tworzy pęcherzyk w środku rany z minimalnym wyciekiem lub dyspersją.
	<ol>
		<li>Pociągnij skórę właściwą na bok, trzymaj strzykawkę prawie równolegle do tkanki i powoli wciskaj strzykawkę w tkankę, aż poczujesz nagły spadek oporu, co wskazuje na przekłucie powięzi. Ostrożnie wprowadzić strzykawkę do środka rany i powoli dozować inokulant. Powoli wyjąć strzykawkę ze zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć taką samą objętość sterylnego PBS w rany niezakażonych zwierząt, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce. Umieść klatkę pod lampą grzewczą lub na poduszce grzewczej i monitoruj zwierzę aż do wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
</ol>
5. In Vivo BLI i FLI
<ol>
	<li>Zainicjuj cały program do obrazowania zwierząt za pomocą oprogramowania instrumentu. Znieczulenie myszy w komorze otrzymującej 2-3 LPM tlenu z 2-4% izofluranem. Dostarczyć znieczulenie do stożków wewnątrz wywoływarki.</li>
	<li>Umieść zranioną i zainfekowaną mysz w kamerze. Ustaw mysz tak, aby rana była jak najbardziej płaska. Użyj następującej konfiguracji sekwencji, aby zobrazować myszy.
	<ol>
		<li>Wybierz Luminescencja i Fotografia jako tryb obrazowania. Czas naświetlania wynosi 1 minutę przy małym binningu i F/stop 1 (luminescencja) i F/stop 8 (zdjęcie). Filtr emisji jest otwarty. Kliknij przycisk Acquire, aby nagrać obraz.</li>
		<li>Wybierz Fluorescencja i Fotografia jako tryb obrazowania. Czas naświetlania wynosi 1 s przy małym binningu i F/stop 1 (fluorescencja) i F/stop 8 (zdjęcie) przy długości fali wzbudzenia 465/30 nm i długości fali emisji 520/20 nm przy dużym natężeniu lampy. Kliknij przycisk Acquire, aby nagrać obraz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść zwierzę z powrotem w klatce i monitoruj do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia.</li>
	<li>Obrazuj myszy codziennie, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Otwórz obrazy do określenia ilościowego.</li>
	<li>Umieść duży okrągły obszar zainteresowania (ROI) na całym obszarze rany, w tym otaczającej go skóry, dla każdej myszy na obrazie. Sygnały in vivo FLI EGFP i in vivo BLI S. aureus sygnały rozciągają się poza krawędź rany po kilku dniach i zostały włączone do tych badań (<silna klasa = "xfig">Figura 2A i 2B). Kliknij opcję Zmierz zwrot z inwestycji i zarejestruj wartości średniego strumienia dla każdej myszy. Wykreśl średni strumień każdego sygnału (p/s) w funkcji czasu.</li>
	<li>Jeśli pożądana jest bezwzględna liczba neutrofili lub S. aureus w ranie, wykonaj następujące eksperymenty.
	<ol>
		<li>Aby skorelować liczbę neutrofili z sygnałami FLI EGFP in vivo, należy zranić myszy C57BL / 6J, jak opisano powyżej, i przenieść szereg neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego (5 x 105 do 1 x 107) od dawców LysM-EGFP lub LysM-EGFPxMyD88-/- bezpośrednio na różne rany. Obraz jak opisano powyżej i skorelować sygnały in vivo FLI EGFP ze znaną ilością neutrofili.</li>
		<li>Aby skorelować S. aureus CFU z sygnałami BLI in vivo, należy zranić i zainfekować myszy, jak opisano powyżej. W pierwszym dniu po zakażeniu zarejestruj in vivo sygnały BLI od myszy i natychmiast poddaj je eutanazji i schłodzeniu. Wyciąć ranę, homogenizować tkankę i rozcieńczyć bakterie na agarze do inkubacji przez noc. Następnego dnia policz kolonie, aby określić CFU na ranę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zmierzyć gojenie się rany, narysuj okrągły wskaźnik ROI na krawędzi rany i zmierz obszar rany (cm2) i wykreśl ułamkową zmianę od linii bazowej w funkcji czasu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
7. Statystyki
UWAGA: Wszystkie dane są przedstawione jako średnia ±SEM. p < 0,05 zostały uznane za statystycznie istotne
<ol>
	<li>Określ różnice między dwiema grupami w ciągu jednego dnia za pomocą metody Holma-Sidaka z alfą = 0,05 i przeanalizuj każdy punkt czasowy indywidualnie, bez zakładania spójnego SD.</li>
	<li>Porównaj różnice między wieloma grupami tego samego dnia za pomocą jednokierunkowej ANOVA z posttestem wielokrotnych porównań Tukeya. Przeżycie między grupami eksperymentalnymi analizowano metodą Mantela-Coxa.</li>
</ol>

<ol><li>Moran, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methicillin-Resistant+S.+aureus+Infections+among+Patients+in+the+Emergency+Department%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department.</a> New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).</li>
<li>Suaya, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+cost+of+hospitalizations+associated+with+Staphylococcus+aureus+skin+and+soft+tissue+infections+in+the+United+States+from+2001+through+2009%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296(2014).</li>
<li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistance+crisis%3A+part+1%3A+causes+and+threats%5BTitle%5D)+AND+%22P+%26+T+%3A+a+Peer-Reviewed+Journal+for+Formulary+Management%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li>
<li>Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+use+and+its+consequences+for+the+normal+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome.</a> Science. 352 (6285), 544-545 (2016).</li>
<li>Hilliard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Alpha-Toxin+Monoclonal+Antibody+and+Antibiotic+Combination+Therapy+Improves+Disease+Outcome+and+Accelerates+Healing+in+a+Staphylococcus+aureus+Dermonecrosis+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).</li>
<li>Proctor, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+for+Staphylococcus+aureus+vaccines%3A+clinical+and+basic+science+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges.</a> European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).</li>
<li>Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Neutrophil+Leukocytes+in+Cutaneous+Infection+Caused+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+Marrow+to+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from Marrow to Microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Miller, L. S., Cho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+against+Staphylococcus+aureus+cutaneous+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Falahee, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Toxin+Regulates+Local+Granulocyte+Expansion+from+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Staphylococcus+aureus-Infected+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds.</a> Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).</li>
<li>Kim, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Neutrophil+Infiltration+during+Cutaneous+Wound+Healing+and+Infection+Using+Fluorescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).</li>
<li>Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+two-photon+microscopy+of+host-pathogen+interactions+in+a+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+skin+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation.</a> Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).</li>
<li>Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+through+high+endothelial+venules+of+the+lymph+nodes+via+PNAd+intercept+disseminating+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).</li>
<li>Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+TLR2-Deficient+and+MyD88-Deficient+Mice+Are+Highly+Susceptible+to+Staphylococcus+aureus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection.</a> The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).</li>
<li>Miller, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88+Mediates+Neutrophil+Recruitment+Initiated+by+IL-1R+but+Not+TLR2+Activation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus.</a> Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).</li>
<li>Macedo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+is+impaired+in+MyD88-deficient+mice%3A+a+role+for+MyD88+in+the+regulation+of+wound+healing+by+adenosine+A2A+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors.</a> The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).</li>
<li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+IL-1%CE%B2+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047(2012).</li>
<li>Granick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+recognition+by+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+via+TLR2%2FMyD88%2FPGE2+stimulates+granulopoiesis+in+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds.</a> Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).</li>
<li>Kim, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+survival+and+c-kit%2B-progenitor+proliferation+in+Staphylococcus+aureus-infected+skin+wounds+promote+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution.</a> Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).</li>
<li>Foster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+evasion+by+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Immune evasion by staphylococci.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).</li>
<li>Gordon, R. J., Lowy, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).</li>
<li>Cho, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+IL-1%CE%B2+Is+Sufficient+for+Abscess+Formation+in+Immunity+against+Staphylococcus+aureus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).</li>
<li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS ONE. 5 (9), e12580(2010).</li>
<li>Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+Luminescent+Staphylococcus+aureus+Clinical+Strains+for+Use+in+Bioluminescent+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging.</a> PLoS ONE. 8 (3), e59232(2013).</li>
<li>Dillen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+%CE%B3%CE%B4+T+cells+protect+against+Staphylococcus+aureus+skin+reinfection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).</li>
</ol>

Lloyd S. Miller otrzymał wsparcie grantowe od MedImmune, Pfizer, Regeneron i Chan Soon-Shiong Nanthealth Foundation oraz opłaty za konsultacje od Noveome Biotherapeutics i Chan Soon-Shiong Nanthealth Foundation, które nie są związane z pracami opisanymi w tym artykule. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modele infekcji S. aureus, które wykorzystują bioluminescencyjną infekcję S. aureus u fluorescencyjnej myszy reporterowej neutrofili w połączeniu z zaawansowanymi technikami obrazowania optycznego całego zwierzęcia in vivo, poszerzyły naszą wiedzę na temat wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na infekcję. Wcześniejsze badania z użyciem myszy LysM-EGFP wykazały, że do 1 x 107 neutrofili rekrutuje się do rany zakażonej S. aureus w ciągu pierwszych 24 godzin infekcji14...

Staphylococcus aureus (S. aureus) odpowiada za większość zakażeń skóry i tkanek miękkich (SSTI) w Stanach Zjednoczonych1. Częstość występowania zakażeń S. aureus opornym na metycylinę (MRSA) stale rosła w ciągu ostatnich dwóch dekad2, co motywuje do badania mechanizmów utrzymywania się i odkrywania nowych strategii leczenia. Standardem leczenia zakażeń MRSA jest antybiotykoterapia ogólnoustrojowa, ale MRSA z czasem staje się coraz bardziej oporny na antybiotyki3 i leki te mogą zmniejszać korzystny mikrobiom gospodarza, powodując negatywne skutki zdrowotne, szczególnie u dzieci4. W badaniach przedklinicznych analizowano alternatywne strategie leczenia zakażeń MRSA5, ale przełożenie tych podejść na praktykę kliniczną okazało się trudne ze względu na pojawienie się czynników wirulencji, które udaremniają odpowiedź immunologiczną gospodarza6. Aby przeanalizować dynamikę gospodarz-patogen, która napędza SSTI S. aureus, łączymy nieinwazyjne i podłużne odczyty liczby neutrofili rekrutowanych do łożyska rany z kinetycznymi pomiarami liczebności bakterii i powierzchni rany.
Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami krążącymi u ludzi i pierwszymi osobami reagującymi na infekcję bakteryjną7. Neutrofile są niezbędnym składnikiem skutecznej odpowiedzi gospodarza na infekcje S. aureus ze względu na ich mechanizmy bakteriobójcze, w tym produkcję reaktywnych form tlenu, proteazy, peptydów przeciwdrobnoustrojowych i odpowiedzi funkcjonalnych, w tym fagocytozę i produkcję pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili8,9. Pacjenci z genetycznymi wadami funkcji neutrofili, takimi jak przewlekła choroba ziarniniakowa i zespół Chediaka-Higashiego, wykazują zwiększoną podatność na zakażenie S. aureus. Ponadto pacjenci z genetycznymi (takimi jak neutropenia wrodzona) i nabytymi (takimi jak neutropenia obserwowana u pacjentów po chemioterapii) defektami liczby neutrofili są również bardzo podatni na zakażenie S. aureus10. Biorąc pod uwagę znaczenie neutrofili w usuwaniu infekcji S. aureus, wzmocnienie ich zdolności immunologicznej lub dostrojenie ich liczby w obrębie zmiany S. aureus może okazać się skuteczną strategią w leczeniu infekcji.
W ciągu ostatniej dekady, transgeniczne myszy z fluorescencyjnymi reporterami neutrofili zostały opracowane do badania ich handlu 11,12. Połączenie myszy reporterowych neutrofili z technikami obrazowania całych zwierząt pozwala na czasoprzestrzenną analizę neutrofili w tkankach i narządach. W połączeniu z bioluminescencyjnymi szczepami S. aureus możliwe jest śledzenie akumulacji neutrofili w odpowiedzi na obfitość i trwałość S. aureus w kontekście czynników wirulencji bakterii, które bezpośrednio i pośrednio zaburzają liczbę neutrofili w dotkniętej chorobą tkance13,14,15,16.
Myszy są mniej podatne na zjadliwość S. aureus i mechanizmy unikania odporności niż ludzie. W związku z tym myszy typu dzikiego mogą nie być idealnym modelem zwierzęcym do badania skuteczności danego leku w leczeniu przewlekłego zakażenia S. aureus. Myszy z niedoborem MyD88 (tj. MyD88-/- myszy), szczep myszy z obniżoną odpornością, który nie ma funkcjonalnego receptora interleukiny-1 (IL-1R) i sygnalizacji receptora Toll-podobnego (TLR), wykazują większą podatność na zakażenie S. aureus w porównaniu z myszami typu dzikiego17 i upośledzenie transportu neutrofili do miejsca zakażenia S. aureus w skórze18. Opracowanie szczepu myszy, który posiada fluorescencyjny reporter neutrofili u myszy MyD88-/- dostarczyło alternatywnego modelu do badania skuteczności terapii w leczeniu infekcji S. aureus w porównaniu z obecnymi myszami reporterowymi neutrofili.
W tym protokole opisujemy zakażenie S. aureus u myszy LysM-EGFP×MyD88-/- z obniżoną odpornością i porównujemy przebieg i rozwiązanie infekcji z myszami LysM-EGFP. Myszy LysM-EGFP×MyD88-/- rozwijają przewlekłą infekcję, która nie ustępuje, a 75% ulega infekcji po 8 dniach. Istotny defekt początkowej rekrutacji neutrofili występuje w ciągu 72 godzin od fazy zapalnej zakażenia, a w ostatnim etapie zakażenia rekrutuje się o 50% mniej neutrofili. Zwiększona podatność myszy LysM-EGFP×MyD88-/- sprawia, że ten konkretny szczep jest rygorystycznym modelem przedklinicznym do oceny skuteczności nowych technik terapeutycznych ukierunkowanych na zakażenie S. aureus w porównaniu z obecnymi modelami, które wykorzystują myszy typu dzikiego, zwłaszcza technikami mającymi na celu wzmocnienie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na infekcję.

<table><tbody><tr><td>14 ml polipropylenowa probówka z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>6 mm jednorazowy dziurkacz do biopsji</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescencyjny S. aureus</td><td>Lloyd Miller, Johns Hopkins&nbsp;</td><td>ALC 2906 SH1000</td><td></td></tr><tr><td>Agar z krwią bydlęcą, 5%, Hardy Diagnostics</td><td>VWR</td><td>10118-938</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek buprenoprhiny do wstrzykiwań</td><td>Western Medical Supply</td><td>7292</td><td>0,3 mg / ml</td></tr><tr><td>C57BL / 6J Myszy</td><td>Jackson Labratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol (krystaliczny proszek)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>329461</td><td>0,35 mm (28 G) x 12,7 mm (1/2'')</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software &ndash; Seria IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>128113</td><td></td></tr><tr><td>Myszy LysM-eGFP</td><td>Thomas Graff Albert Einstein College w Nowym Jorku&nbsp;</td>Spektrofotometr <td>mikroobjętościowy NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>MyD88 KO Myszy</td><td>Jackson Labratory</td><td>009088</td><td></td></tr><tr><td>Gąbki włókninowe</td><td>AMD- Ritmed Inc</td><td>A2101-CH</td><td>5 cm x 5 cm</td></tr><tr><td>Povidone Jod 10%</td><td>Aplicare</td><td>697731</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Licencja na oprogramowanie GraphPad</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie staphylococcus aureus

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Zakażenia Staphylococcus aureus (S. aureus), w tym barwniki oporne na metycylinę, stanowią ogromne obciążenie dla systemu opieki zdrowotnej. Wraz ze wzrostem częstości występowania infekcji S. aureus z roku na rok istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe badania nad jego patogennością. Zwierzęce modele chorób zakaźnych pogłębiają naszą wiedzę na temat odpowiedzi gospodarz-patogen i prowadzą do opracowania skutecznych metod leczenia. Neutrofile odgrywają główną rolę we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, która kontroluje infekcje S. aureus poprzez tworzenie ropnia w celu odgrodzenia infekcji i ułatwienia usuwania bakterii; liczba neutrofili, które infiltrują infekcję skóry S. aureus, często koreluje z wynikiem choroby. Myszy LysM-EGFP, które posiadają wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) wstawione do regionu promotora lizozymu M (LysM) (wyrażonego głównie przez neutrofile), w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym całych zwierząt in vivo (FLI) zapewniają sposób ilościowego określania emigracji neutrofili w sposób nieinwazyjny i podłużny do uszkodzonej skóry. W połączeniu z bioluminescencyjnym szczepem S. aureus i sekwencyjnym obrazowaniem bioluminescencyjnym in vivo całych zwierząt (BLI), możliwe jest wzdłużne monitorowanie zarówno dynamiki rekrutacji neutrofili, jak i obciążenia bakteryjnego in vivo w miejscu infekcji u znieczulonych myszy od początku infekcji do ustąpienia lub śmierci. Myszy są bardziej odporne na szereg czynników wirulencji wytwarzanych przez S. aureus, które ułatwiają skuteczną kolonizację i infekcję u ludzi. Myszy z niedoborem odporności stanowią bardziej czuły model zwierzęcy do badania uporczywych infekcji S. aureus i zdolności leków do wzmacniania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. W niniejszym artykule scharakteryzowano odpowiedzi u myszy LysM-EGFP, które zostały wyhodowane z myszami z niedoborem MyD88 (myszy LysM-EGFP×MyD88-/-) wraz z myszami LysM-EGFP typu dzikiego w celu zbadania zakażenia ran skóry S. aureus. Wielospektralna detekcja jednoczesna umożliwiła badanie dynamiki rekrutacji neutrofili za pomocą FLI in vivo, obciążenia bakteryjnego za pomocą BLI in vivo oraz gojenia się ran w czasie w sposób podłużny i nieinwazyjny.

Myszy LysM-EGFP×MyD88-/- są bardziej podatne na zakażenie S. aureus niż myszy LysM-EGFP
Szczep S. aureus użyty w niniejszym badaniu, ALC290618, został skonstruowany z plazmidem zawierającym konstrukt lux, który generuje sygnały bioluminescencyjne pochodzące od żywych i aktywnie metabolizujących bakterii. Po inokulacji u myszy można zastosować techniki obrazowani...

Opisano podejście do wykrywania w czasie rzeczywistym wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zranienia skórne i zakażenie Staphylococcus aureus u myszy. Porównując myszy LysM-EGFP (które posiadają fluorescencyjne neutrofile) z krzyżówką LysM-EGFP szczepu myszy z niedoborem odporności, pogłębiamy naszą wiedzę na temat infekcji i rozwijamy podejścia do zwalczania infekcji.

Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Techniki, które monitorują obciążenie bakteriami i jednoczesną reakcję neutrofili, mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów utrzymywania się gronkowca złocistego i skuteczności strategii leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele parametrów można mierzyć wzdłużnie w żywym żywicielu przez cały czas trwania infekcji. Bardzo ważne jest, aby pokazać, gdzie umieścić ranę na grzbiecie myszy, jak wyciąć skórę i jak zaszczepić ranę gronkowcem złocistym.Zacznij od rozmrożenia bioluminescencji szczepu Staph aureus z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na lodzie. Przed nałożeniem kultury na 5% płytkę z agarem z krwią bydlęcą. Do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego ranka przenieś trzy do czterech pojedynczych kolonii z płytki gronkowca złocistego do tryptycznego bulionu sojowego lub TSB. Uzupełniony 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu do całonocnej inkubacji wstrząsającej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozcieńczyć 120 mikrolitrów próbki kultury w sześciu mililitrach TSB.Z 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu, przez dwie godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,5, przenieś trzy mililitry zawiesiny bakteryjnej do 10 mililitrów lodowatego DPBS. Po dokładnym zdekantowaniu supernatantu dodaj do granulatu dodatkowe schłodzone DPBS i dokładnie wymieszaj ponownie zawieszone bakterie.Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1,5 mililitra PBS na lodzie. Aby sprawdzić stężenie bakterii, należy seryjnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej przez współczynnik 1 x 10 do 4 i 1 x 10 do 5 w świeżym PBS. I rozłożyć 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na indywidualnych płytkach agarowych.Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza policz liczbę jednostek tworzących kolonie za pomocą badania ogólnego, aby obliczyć stężenie bakterii z poprzedniego dnia. W przypadku wycinania ran skóry u zwierząt biorców, potwierdź brak reakcji na szczypanie palca u nóg, przed ogoleniem sekcji o wymiarach jeden na dwa cale z tyłu myszy. Delikatnie wytrzyj, aby usunąć wszelkie zabłąkane włoski.I zdezynfekuj odsłoniętą skórę za pomocą sekwencyjnych aplikacji 10% jodowidonu i 70% gazy nasączonej etanolem. Poruszanie się na zewnątrz od środka pola operacyjnego, w spiralny wzór. Po pozostawieniu skóry do wyschnięcia na około minutę, mocno dociśnij sterylną sześciomilimetrową biopsję dziurkowaną na środku przygotowanego obszaru operacyjnego.Przekręć biopsję stempla, aby utworzyć okrągły kontur na skórze, który całkowicie przecina tkankę skórną i co najmniej jeden odcinek konturu. Uważając, aby nie przeciąć leżącej pod spodem powięzi lub tkanki. Następnie użyj sterylnych nożyczek i kleszczyków, aby przeciąć naskórek i skórę właściwą, podążając za okrągłym wzorem odciśniętym przez biopsję stempla.W przypadku inokulacji gronkowca złocistego napełnij strzykawkę insulinową o rozmiarze 28 50 mikrolitrami przygotowanego bioluminescencyjnego inokulantu bakteryjnego. I użyj palca, aby pociągnąć skórę właściwą rannego zwierzęcia na bok. Trzymając strzykawkę prawie równolegle do tkanki, powoli wkładać strzykawkę do tkanki, aż do momentu nagłego zmniejszenia oporu.Wskazujące na przebicie powięzi. Z igłą umieszczoną w środku rany, powoli dostarcz całą objętość inokulantu. Upewnij się, że inokulant tworzy pęcherzyk w środku rany, przy minimalnym wycieku lub dyspersji.I powoli wyjąć strzykawkę ze zwierzęcia. Następnie zwróć zwierzę do klatki z ciepłem i monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Po zranieniu i zakażeniu, a także codziennie podczas eksperymentu, umieść znieczuloną mysz w obrazie bioluminescencyjnym i fluorescencyjnym, tak aby rana była jak najbardziej płaska.W oprogramowaniu imagera wybierz luminescencję i fotografię jako tryby obrazowania. Czas naświetlania powinien być ustawiony na jedną minutę przy małym binningu, F/Stop 1 dla luminescencji, F/Stop 8 dla zdjęcia i otwarty dla filtra emisyjnego. Następnie kliknij przycisk pobierz, aby nagrać obraz.W przypadku obrazowania fluorescencyjnego in vivo wybierz fluorescencję i zdjęcie jako tryby obrazowania. Czas ekspozycji powinien być ustawiony na jedną sekundę przy małym binningu, F/Stop 1 dla fluorescencji, F/Stop 8 dla zdjęcia oraz długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 465 na 30 nanometrach i 520 na 20 nanometrach, przy dużej intensywności lampy. Następnie kliknij przycisk pobierz, aby nagrać obraz.Po uzyskaniu obu zestawów obrazów należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce, z monitorowaniem, aż do pełnego wyzdrowienia. W celu analizy obrazu otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i umieść domyślny okrągły obszar zainteresowania na całym obszarze rany, w tym na otaczającej skórze. Kliknij przycisk Zmierz obszar zainteresowania i zapisz wartości średniego strumienia dla rany, aby umożliwić wykreślenie średniego strumienia każdego sygnału w funkcji czasu.Aby zmierzyć gojenie się rany, umieść okrągły obszar zainteresowania na krawędzi rany i zmierz obszar rany w centymetrach do kwadratu, aby umożliwić wykreślenie ułamkowej zmiany w stosunku do linii podstawowej w czasie. W tym reprezentatywnym eksperymencie warunkowa ekspresja EGFP różnicowanie szpiku pierwotna odpowiedź 88 lub myszy z nokautem MyD88 wykazały większą podatność na inokulację Staph aureus niż zwierzęta z bezwarunkową ekspresją EGFP. Z 80% śmiertelnością obserwowaną w ciągu pierwszych ośmiu dni infekcji.Oba szczepy myszy straciły około 5% masy ciała bezpośrednio po zakażeniu. Jednak myszy z warunkową ekspresją EGFP odzyskały swoją pierwotną wagę do drugiego dnia. Podczas gdy myszy MyD88 nie.Zamykanie się ran w obecności zakażenia gronkowcem złocistym nie różniło się między tymi dwoma szczepami. Jednak sterylnie zranione myszy z nokautem MyD88 miały znaczny defekt w gojeniu się ran w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP. Obrazowanie całych zwierząt wykazało większe obciążenie bakteryjne, o czym świadczy zwiększony sygnał bioluminescencyjny w ranach zwierząt z nokautem MyD88 w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP.Zaobserwowano również 40% spadek początkowego transportu neutrofili do niezakażonych ran u zwierząt z nokautem MyD88 w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP. Gdy natychmiast po zranieniu wprowadzono 1 x 10 do 7 jednostek tworzących kolonię Staph aureus, transport neutrofili był znacznie osłabiony u zwierząt z nokautem w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP. Przed dozowaniem bakterii należy upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza i że igła jest prawidłowo umieszczona w środku rany.Tkanki zwierzęce mogą być pobierane w punkcie końcowym w celu zmierzenia ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania i rozprzestrzeniania się bakterii z rany. Gronkowiec złocisty jest zakaźny dla ludzi. W związku z tym podczas obchodzenia się z bakteriami należy nosić środki ochrony osobistej i zachować ostrożność podczas obchodzenia się ze strzykawką zawierającą patogen.Technika ta pomogła w zbadaniu możliwości zastosowania biologicznych metod leczenia zakażeń gronkowcem złocistym, które wzmacniają wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza na zakażenie.

a-mouse-model-to-assess-innate-immune-response-to-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model infekcji skóry i tkanek miękkich u myszy jest wykorzystywany do oceny funkcji wirulencji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz odpowiedzi immunologicznych gospodarza. W niniejszym materiale przedstawiamy model infekcji podskórnej w przebiegu zakażenia skóry i tkanek miękkich.

Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

Ten film demonstruje obrazowanie in vivo w celu zbadania dynamiki rekrutacji neutrofili w miejscu infekcji u transgenicznej myszy z obniżoną odpornością, z neutrofilami wykazującymi ekspresję GFP. Polega na wstrzyknięciu bakterii luminescencyjnych w celu wywołania infekcji. Prowadzi to do rekrutacji neutrofili do miejsca infekcji, których śledzenie odbywa się za pomocą obrazowania.

Monitorowanie dynamiki rekrutacji neutrofili i obciążenia bakteryjnego w miejscu zakażenia w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę generowania mysiego modelu infekcji ran skóry. Po zakażeniu myszy – zmodyfikowanych do ekspresji białka fluorescencyjnego w neutrofilach – genetycznie zmodyfikowanym bioluminescencyjnym Staphylococcus aureus – bakterią chorobotwórcze. Obciążenie bakteryjne w miejscu zakażenia i dynamikę rekrutacji neutrofili można badać za pomocą obrazowania całego zwierzęcia.

Model zakażenia rany skóry myszy do badania odpowiedzi immunologicznej na patogen bakteryjny

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Staphylococcus aureus (S. aureus) ma zdolność rozprzestrzeniania się po całym ciele, powodując uporczywe i nawracające infekcje. Aby lepiej zrozumieć te procesy, w badaniu tym ustanowiono wewnątrzkomórkowy model infekcji S. aureus. Model ten będzie stanowił kluczową podstawę do badania mechanizmów stojących za infekcjami wewnątrzkomórkowymi.

Opracowanie i ocena wewnątrzkomórkowych modeli zakażeń Staphylococcus aureus

Niniejszy protokół opisuje model mysi wykorzystujący podskórną implantację grzbietową do badania zakażeń związanych z implantami, umożliwiając kompleksowe badanie mechanizmów patofizjologicznych i wspierając rozwój kryteriów diagnostycznych z ukierunkowanymi strategiami terapeutycznymi.

Zwierzęcy model zakażeń związanych z implantami u myszy

Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia u szczura wywołanego przez gronkowiec złocisty (S. aureus) oporny na metycylinę.

Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia wywołanego przez gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (Staphylococcus aureus MRSA) u szczura

Poznaj metodę monitorowania odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus u myszy LysM-EGFP w czasie rzeczywistym. Technika ta umożliwia długoterminowe pomiary obciążenia bakteryjnego i aktywności neutrofili.

Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus

Przeglądaj więcej filmów