Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus

Techniki, które monitorują obciążenie bakteriami i jednoczesną reakcję neutrofili, mogą dostarczyć informacji na temat mechanizmów utrzymywania się gronkowca złocistego i skuteczności strategii leczenia. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele parametrów można mierzyć wzdłużnie w żywym żywicielu przez cały czas trwania infekcji. Bardzo ważne jest, aby pokazać, gdzie umieścić ranę na grzbiecie myszy, jak wyciąć skórę i jak zaszczepić ranę gronkowcem złocistym.

Zacznij od rozmrożenia bioluminescencji szczepu Staph aureus z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na lodzie. Przed nałożeniem kultury na 5% płytkę z agarem z krwią bydlęcą. Do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka przenieś trzy do czterech pojedynczych kolonii z płytki gronkowca złocistego do tryptycznego bulionu sojowego lub TSB. Uzupełniony 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu do całonocnej inkubacji wstrząsającej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozcieńczyć 120 mikrolitrów próbki kultury w sześciu mililitrach TSB.

Z 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu, przez dwie godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,5, przenieś trzy mililitry zawiesiny bakteryjnej do 10 mililitrów lodowatego DPBS. Po dokładnym zdekantowaniu supernatantu dodaj do granulatu dodatkowe schłodzone DPBS i dokładnie wymieszaj ponownie zawieszone bakterie.

Po drugim odwirowaniu ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1,5 mililitra PBS na lodzie. Aby sprawdzić stężenie bakterii, należy seryjnie rozcieńczyć 100 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej przez współczynnik 1 x 10 do 4 i 1 x 10 do 5 w świeżym PBS. I rozłożyć 20 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na indywidualnych płytkach agarowych.

Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza policz liczbę jednostek tworzących kolonie za pomocą badania ogólnego, aby obliczyć stężenie bakterii z poprzedniego dnia. W przypadku wycinania ran skóry u zwierząt biorców, potwierdź brak reakcji na szczypanie palca u nóg, przed ogoleniem sekcji o wymiarach jeden na dwa cale z tyłu myszy. Delikatnie wytrzyj, aby usunąć wszelkie zabłąkane włoski.

I zdezynfekuj odsłoniętą skórę za pomocą sekwencyjnych aplikacji 10% jodowidonu i 70% gazy nasączonej etanolem. Poruszanie się na zewnątrz od środka pola operacyjnego, w spiralny wzór. Po pozostawieniu skóry do wyschnięcia na około minutę, mocno dociśnij sterylną sześciomilimetrową biopsję dziurkowaną na środku przygotowanego obszaru operacyjnego.

Przekręć biopsję stempla, aby utworzyć okrągły kontur na skórze, który całkowicie przecina tkankę skórną i co najmniej jeden odcinek konturu. Uważając, aby nie przeciąć leżącej pod spodem powięzi lub tkanki. Następnie użyj sterylnych nożyczek i kleszczyków, aby przeciąć naskórek i skórę właściwą, podążając za okrągłym wzorem odciśniętym przez biopsję stempla.

W przypadku inokulacji gronkowca złocistego napełnij strzykawkę insulinową o rozmiarze 28 50 mikrolitrami przygotowanego bioluminescencyjnego inokulantu bakteryjnego. I użyj palca, aby pociągnąć skórę właściwą rannego zwierzęcia na bok. Trzymając strzykawkę prawie równolegle do tkanki, powoli wkładać strzykawkę do tkanki, aż do momentu nagłego zmniejszenia oporu.

Wskazujące na przebicie powięzi. Z igłą umieszczoną w środku rany, powoli dostarcz całą objętość inokulantu. Upewnij się, że inokulant tworzy pęcherzyk w środku rany, przy minimalnym wycieku lub dyspersji.

I powoli wyjąć strzykawkę ze zwierzęcia. Następnie zwróć zwierzę do klatki z ciepłem i monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Po zranieniu i zakażeniu, a także codziennie podczas eksperymentu, umieść znieczuloną mysz w obrazie bioluminescencyjnym i fluorescencyjnym, tak aby rana była jak najbardziej płaska.

W oprogramowaniu imagera wybierz luminescencję i fotografię jako tryby obrazowania. Czas naświetlania powinien być ustawiony na jedną minutę przy małym binningu, F/Stop 1 dla luminescencji, F/Stop 8 dla zdjęcia i otwarty dla filtra emisyjnego. Następnie kliknij przycisk pobierz, aby nagrać obraz.

W przypadku obrazowania fluorescencyjnego in vivo wybierz fluorescencję i zdjęcie jako tryby obrazowania. Czas ekspozycji powinien być ustawiony na jedną sekundę przy małym binningu, F/Stop 1 dla fluorescencji, F/Stop 8 dla zdjęcia oraz długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 465 na 30 nanometrach i 520 na 20 nanometrach, przy dużej intensywności lampy. Następnie kliknij przycisk pobierz, aby nagrać obraz.

Po uzyskaniu obu zestawów obrazów należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce, z monitorowaniem, aż do pełnego wyzdrowienia. W celu analizy obrazu otwórz obraz, który ma zostać określony ilościowo, w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu i umieść domyślny okrągły obszar zainteresowania na całym obszarze rany, w tym na otaczającej skórze. Kliknij przycisk Zmierz obszar zainteresowania i zapisz wartości średniego strumienia dla rany, aby umożliwić wykreślenie średniego strumienia każdego sygnału w funkcji czasu.

Aby zmierzyć gojenie się rany, umieść okrągły obszar zainteresowania na krawędzi rany i zmierz obszar rany w centymetrach do kwadratu, aby umożliwić wykreślenie ułamkowej zmiany w stosunku do linii podstawowej w czasie. W tym reprezentatywnym eksperymencie warunkowa ekspresja EGFP różnicowanie szpiku pierwotna odpowiedź 88 lub myszy z nokautem MyD88 wykazały większą podatność na inokulację Staph aureus niż zwierzęta z bezwarunkową ekspresją EGFP. Z 80% śmiertelnością obserwowaną w ciągu pierwszych ośmiu dni infekcji.

Oba szczepy myszy straciły około 5% masy ciała bezpośrednio po zakażeniu. Jednak myszy z warunkową ekspresją EGFP odzyskały swoją pierwotną wagę do drugiego dnia. Podczas gdy myszy MyD88 nie.

Zamykanie się ran w obecności zakażenia gronkowcem złocistym nie różniło się między tymi dwoma szczepami. Jednak sterylnie zranione myszy z nokautem MyD88 miały znaczny defekt w gojeniu się ran w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP. Obrazowanie całych zwierząt wykazało większe obciążenie bakteryjne, o czym świadczy zwiększony sygnał bioluminescencyjny w ranach zwierząt z nokautem MyD88 w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP.

Zaobserwowano również 40% spadek początkowego transportu neutrofili do niezakażonych ran u zwierząt z nokautem MyD88 w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP. Gdy natychmiast po zranieniu wprowadzono 1 x 10 do 7 jednostek tworzących kolonię Staph aureus, transport neutrofili był znacznie osłabiony u zwierząt z nokautem w porównaniu ze zwierzętami z warunkową ekspresją EGFP. Przed dozowaniem bakterii należy upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza i że igła jest prawidłowo umieszczona w środku rany.

Tkanki zwierzęce mogą być pobierane w punkcie końcowym w celu zmierzenia ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania i rozprzestrzeniania się bakterii z rany. Gronkowiec złocisty jest zakaźny dla ludzi. W związku z tym podczas obchodzenia się z bakteriami należy nosić środki ochrony osobistej i zachować ostrożność podczas obchodzenia się ze strzykawką zawierającą patogen.

Technika ta pomogła w zbadaniu możliwości zastosowania biologicznych metod leczenia zakażeń gronkowcem złocistym, które wzmacniają wrodzoną odpowiedź immunologiczną gospodarza na zakażenie.