Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą naśladować specyficzne dla tkanek właściwości guzów in vivo, dostarczając więcej istotnych klinicznie danych do odkrywania leków przeciwnowotworowych niż prosta hodowla komórkowa 2D. Nasza technika obrazowania, optyczna tomografia koherentna, może z łatwością zobrazować strukturę 3D pojedynczego nerwu guzowego o wielkości kilkuset mikronów i zapewnić dokładniejszą charakterystykę jego morfologii i zarażenia, często w ciągu kilku sekund. Korzystając z modelu sferycznego 3D, możemy potencjalnie skrócić czas odkrywania leków, obniżyć koszty i skuteczniej dostarczać pacjentom nowe leki.

Formowanie kulistego kształtu skupiska guza jest jednym z kluczowych kroków w naszym eksperymencie. Ważne jest, aby wybrać odpowiednią ultra-niską płytę mocującą z okrągłym dnem i odpowiednią prędkością wirowania po wysianiu komórek. Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania interesujących komórek w kolbie hodowlanej, jak opisano w manuskrypcie.

Utrzymuj komórki w inkubatorze w standardowych warunkach i codziennie monitoruj ich stan zdrowia. W razie potrzeby odśwież nośnik. Aby przeprowadzić hodowlę komórkową 3D na płytkach wielodołkowych, najpierw wyjmij pożywkę z kolby do hodowli komórkowej i umyj komórki wysterylizowanym, wstępnie podgrzanym PBS o temperaturze 33 stopni Celsjusza.

Następnie dodaj jeden mililitr Trypsyny-EDTA, aby ponownie zawiesić komórki i inkubować przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej, aby rozcieńczyć trypsynę. Przenieś tę zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj w temperaturze 500 G i temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z czterema mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Aby określić stężenie komórek, umieść jedną kroplę próbki na hemocytometrze i policz komórki. Rozcieńczyć do pożądanego stężenia wysiewu.

Wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki z wielodołkową płytką o bardzo niskim nasadce, z okrągłym dnem, o stężeniu 3 000 komórek na mililitr, aby uzyskać około 600 komórek na studzienkę. Natychmiast po wysianiu odwirować całą płytkę z najniższą dostępną prędkością, w temperaturze pokojowej, przez siedem minut. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% Co2, pamiętając o odświeżaniu podłoża co trzy dni.

Najpierw należy skonstruować ramię referencyjne i ramię próbki systemu OCT, postępując zgodnie ze schematami w tym manuskrypcie. Następnie skonstruuj spektrometr, w tym kilometr, profilację, obiektyw F-Theta i kamerę do skanowania linii. Użyj adaptera do płytek, aby utrzymać płytkę wielodołkową w ustalonej pozycji.

Przed obrazowaniem należy skorygować nachylenie i obrót płytki wielodołkowej za pomocą stolika przechylającego 2D oraz stopnia obrotowego zamontowanego na stopniu przejściowym, aby zminimalizować zmiany płaszczyzny ogniskowej z różnych dołków. Następnie dostosuj obrót, aby upewnić się, że krawędzie płyty są równoległe do kierunku ruchu sceny, tak aby studzienki pozostały w tych samych pozycjach poziomych na obrazach OCT. Następnie wyreguluj stopień przechylania, aby upewnić się, że płytka jest równoległa do stołu optycznego, tak aby dołki pozostały w tych samych pionowych miejscach obrazowania.

W dniu obrazowania sferoid guza należy wyjąć płytkę wielodołkową z inkubatora. Przenieś go pod system obrazowania OCT i umieść na adapterze płytki. Aby dostosować wysokość płyty, przesuń ją wzdłuż kierunku Z stolika translacji.

W niestandardowym oprogramowaniu do obrazowania ustaw żądany zakres skanowania OCT, aby objąć całą sferoidę guza, w zależności od jego etapów rozwoju, a następnie kliknij przycisk Zapisz parametry, aby zapisać ustawienie. Następnie pokaż zoptymalizowane podglądy XZ i YZ OCT sferoidów guza. Uzyskaj obrazy 3D OCT sferoid guza jeden po drugim dla wszystkich dołków płytki zawierającej sferoidy.

Aby wyświetlić obraz podglądu, kliknij przycisk podglądu. Aby uzyskać obraz OCT, kliknij przycisk pozyskiwania. Rejestruj cały proces przenoszenia etapu pozyskiwania danych OCT.

Aby zapewnić optymalną jakość obrazu dla wszystkich sferoid guza, adapter płytki musi być dokładnie dostrojony, a mediana objętości musi być taka sama. Użyj niestandardowego kodu przetwarzania C+ do przetwarzania zestawów danych 3D OCT sferoidów guza w celu wygenerowania obrazów strukturalnych OCT. Użyj obrazów 2D OCT w trzech płaszczyznach przekroju, XY, XZ i YZ w poprzek środka ciężkości sferoidy, aby wygenerować kolaż obrazów sferoidalnych.

Aby uzyskać renderowanie 3D sferoidy za pomocą żądanego oprogramowania, najpierw załaduj dane SD OCT do oprogramowania. Kliknij panel przewyższania, a następnie dodaj nową objętość i wybierz tryb mieszania, który ma być używany do renderowania 3D. Aby dostosować kąt widzenia, użyj wskaźnika myszy, aby przeciągnąć obraz i kontynuować kwantyfikację zgodnie z opisem w rękopisie.

Na podstawie przetworzonych danych wygenerowano kolaż niewzruszonych obrazów OCT sferoid linii komórkowej HCT116, uzyskując wyniki porównywalne z obrazami z innych wysokoprzepustowych systemów obrazowania 2D. Ponadto wygenerowano kolaż obrazów sferoidowych o przekroju poprzecznym 2D z 96 studzienek w celu monitorowania wysokości sferoidów i wizualizacji niejednorodności sferoidów w kierunku pionowym. Kolaż renderowanych w 3D obrazów sferoidowych może być generowany pod dowolnym wstępnie zdefiniowanym kątem, aby zobrazować ogólny kształt 3D i ocenić okrągłość sferoidy.

Po ogólnym przetwarzaniu końcowym OCT uzyskano obrazy strukturalne 3D OCT sferoidy guza. Na podstawie danych z OCT wygenerowano słupek powierzchniowy 3D oraz ortogonalne przekroje XZ, YZ i XY, aby zobrazować strukturę sferoidu guza w dowolnym kierunku. Przeprowadzono monitorowanie podłużne pojedynczej sferoidy guza w celu scharakteryzowania jej średnicy, wysokości i objętości opartej na wokselach, generując krzywe wzrostu pod względem wielkości i objętości podczas 21-dniowego rozwoju.

W tym przypadku sferoida została przerwana w 11 dniu i całkowicie zapadła się w 21 dniu. Śledzenie podłużne wykazało wzrost obszarów martwych komórek w sferoidalnej guzie. Renderowane w 3D obrazy sferoidy guza wykazały pojawienie się i wzrost martwych obszarów komórkowych od siódmego do czternastego dnia, na co wskazuje wzrost zaznaczonych na czerwono obszarów martwiczych.

Wraz ze wzrostem odsetka obszarów martwiczych, sferoida guza nie mogła utrzymać swojego idealnego kształtu, a tym samym zapadła się. Dzięki tej platformie obrazowania możemy dalej badać inne złożone modele sfer nowotworowych, takie jak model obrazowania 3D, model ogromnych stworzeń i modele współkultur, aby lepiej symulować guzy in vivo. Nasz wysokowydajny system obrazowania OCT może zapewnić alternatywne podejście do badań przesiewowych leków w procesie odkrywania leków przeciwnowotworowych.

Jest to coś również scharakteryzowanego, biofabrykowane próbki 3D do różnych zastosowań biomedycznych.