Name: Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj metodę optycznej koherentnej tomografii do monitorowania wzrostu trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Technika umożliwia precyzyjną kwantyfikację objętości i bezetykietową detekcję martwej tkanki, skracając czas odkrywania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NSF IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), granty NIH R21EY026380, R15EB019704 i R01EB025209, oraz fundusz startowy Lehigh University.

Autorzy nie ujawniają żadnych konkurencyjnych interesów.

Aktywność guza ma duże znaczenie dla jego struktury morfologicznej. Podobnie jak w przypadku monitorowania charakterystycznej krzywej wzrostu dla hodowli komórek 2D, śledzenie krzywej wzrostu dla sferoid guza 3D jest również konwencjonalnym podejściem do charakteryzowania długoterminowego zachowania wzrostu sferoidalnego dla różnych linii komórkowych. Warto zauważyć, że możemy scharakteryzować odpowiedź na lek, analizując degradację guza lub odrost guza bezpośrednio odzwierciedlony w krzywej wzrostu. Dlatego ilościowa oc...

Rak jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie1. Opracowywanie leków ukierunkowanych na nowotwory ma kluczowe znaczenie dla pacjentów. Szacuje się jednak, że ponad 90% nowych leków przeciwnowotworowych zawodzi w fazie rozwoju z powodu braku skuteczności i nieoczekiwanej toksyczności w badaniach klinicznych2. Jednym z powodów może być wykorzystanie prostych dwuwymiarowych (2D) modeli hodowli komórkowych do badań przesiewowych związków, które dostarczają wyników z ograniczonymi wartościami predykcyjnymi skuteczności i toksyczności związku dla następujących etapów odkrywania leku2,3,4. Ostatnio opracowano trójwymiarowe (3D) sferoidalne modele guzów, aby zapewnić klinicznie istotne dane fizjologiczne i farmakologiczne do odkrywania leków przeciwnowotworowych3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ponieważ te sferoidy mogą naśladować specyficzne dla tkanek właściwości nowotworów in vivo, takie jak gradient składników odżywczych i tlenu, niedotlenienie rdzenia, a także oporność na leki19, zastosowanie tych modeli może potencjalnie skrócić czas odkrywania leków, obniżyć koszty inwestycji i skuteczniej dostarczać pacjentom nowe leki. Jednym z krytycznych podejść do oceny skuteczności związku w rozwoju sferoidów guza 3D jest monitorowanie wzrostu i nawrotów sferoidów podczas leczenia9,26. Aby to zrobić, konieczna jest ilościowa charakterystyka morfologii guza, obejmująca jego średnicę i objętość, z wykorzystaniem metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości. 
Konwencjonalne metody obrazowania, takie jak jasne pole, kontrast fazowy7,9,22,24 i mikroskopia fluorescencyjna8,9,16,18,22 może zapewnić pomiar średnicy sferoidy, ale nie może określić ogólnej struktury sferoidy w przestrzeni 3D. Na te ograniczenia składa się wiele czynników, w tym przenikanie światła sondującego w sferoidę; dyfuzja barwników fluorescencyjnych do sferoidy; emitowanie sygnałów fluorescencyjnych ze wzbudzonych barwników fluorescencyjnych wewnątrz lub na przeciwległej powierzchni sferoidy w wyniku silnej absorpcji i rozpraszania; i rozdzielczość głębokości tych metod obrazowania. Często prowadzi to do niedokładnego pomiaru objętości. Rozwój martwiczego rdzenia w sferoidach naśladuje martwicę w nowotworach in vivo6,10,15,19,25. Jest mało prawdopodobne, aby ta patologiczna cecha została odtworzona w hodowlach komórkowych 2D19,25,27,28. Przy rozmiarze sferoidy większym niż 500 μm średnicy, trójwarstwową koncentryczną strukturę, w tym zewnętrzną warstwę proliferujących komórek, środkową warstwę komórek w stanie spoczynku i nekrotyczny rdzeń, można zaobserwować w sferoidzie<klasa sup='xref'>6,<klasa sup='xref'>10,<klasa sup='xref'>15,<klasa sup='xref'>19,<klasa sup='xref'>25, z powodu braku tlenu i składników odżywczych. Obrazowanie fluorescencji żywych i martwych komórek jest standardowym podejściem do oznaczania granicy rdzenia martwiczego. Jednak, ponownie, penetracja zarówno tych barwników fluorescencyjnych, jak i światła widzialnego utrudnia potencjalne badanie jądra nekrotycznego w celu monitorowania jego rozwoju w jego rzeczywistym kształcie.
Alternatywna metoda obrazowania 3D, optyczna koherentna tomografia (OCT) została wprowadzona w celu scharakteryzowania sferoid guza. OCT to technika obrazowania biomedycznego, która jest w stanie pozyskiwać bezznacznikowe, nieniszczące dane 3D z głębokości do 1-2 mm w tkankach biologicznych29,30,31,32,33,34. OCT wykorzystuje interferometrię o niskiej koherentności do wykrywania sygnałów rozpraszanych wstecznie z różnych głębokości próbki i zapewnia zrekonstruowane obrazy o rozdzielczości głębokiej w rozdzielczościach przestrzennych na poziomie mikronów zarówno w kierunku poprzecznym, jak i pionowym. OCT został szeroko przyjęty w okulistyce35,36,37 i angiografii38,39. W poprzednich badaniach wykorzystano OCT do obserwacji morfologii sferoid guza in vitro w macierzy błony podstawnej (np. Matrigel) i oceny ich odpowiedzi na terapię fotodynamiczną40,41. Niedawno nasza grupa stworzyła wysokoprzepustową platformę obrazowania OCT do systematycznego monitorowania i ilościowego określania kinetyki wzrostu sferoid guza 3D na płytkach wielodołkowych42. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza 3D przy użyciu podejścia polegającego na zliczaniu wokseli i bezznacznikowym wykrywaniu nekrotycznej tkanki w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego. W artykule opisano szczegóły dotyczące konstrukcji i wykorzystania platformy obrazowania OCT do uzyskania obrazów 3D sferoidów guza o wysokiej rozdzielczości. Opisano krok po kroku analizy ilościowe kinetyki wzrostu sferoid nowotworowych 3D, w tym dokładne pomiary średnicy i objętości sferoidy. Przedstawiono również metodę nieniszczącej detekcji martwiczych obszarów tkanek za pomocą OCT, w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

<table><tbody><tr><td><silny>Niestandardowy system obrazowania OCT w domenie spektralnej</silny></td><td></td><td></td><td>Opracowany w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Dioda superluminescencyjna (SLD) <</td><td>silna>Thorlabs</td><td><silna>SLD1325< / silna></td><td>źródło światła</td></tr><tr><td>2 razy; 2 jednomodowy łącznik światłowodów z topionem, współczynnik podziału 50:50</td><td>AC Photonics</td><td>WP13500202B201</td><td></td></tr><tr><td><mocny>ramię referencyjne< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubus obiektywu</td><td><mocny>Thorlabs</mocny></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adapter</td><td><mocny>Thorlabs</mocny></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kolimacyjny obiektyw</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-020-C</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka skupiająca</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinematic Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1D Stadium translacyjne</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciągły filtr o neutralnej gęstości</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pedestrial Post</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Widelec mocujący</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sample Arm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens tubus</td><td>Thorlabs Adapter Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soczewka kolimacyjna</td><td>Thorlabs</td><td></td> AC080-020-C <td></td></tr><tr><td>Galwanometr</td><td>Thorlabs</td> Relay Lens Thorlabs <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> AC254-100-C <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>dwie soczewki przekaźnikowe do konfiguracji teleskopu</td></tr><tr><td>Trójkątny uchwyt lustrzany</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lustro</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Mitutoyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Słupek postumentowy</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Widelec mocujący</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontroler polaryzacji</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30mm Klatka do montażu</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pręt klatkowy</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D zmotoryzowany etap translacji</td><td>Pekin Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>JTH360XY</tr><tr><td>Uchylny etap</td><td></td><td></td><td></td>uchylny 2D</tr><tr><td>Obrotowy uchwyt</td><td></td><td></td> płyty <td>Drukowany</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> w 3D <tr><td>< mocny>spektrometr< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>soczewkowy Adapter rurki</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr> Soczewka kolimacyjna <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>AC080-020-C</td><td></td></tr><tr><td>Krata</td><td>Wasatch</td><td></td><td>G = 1145 lpmm</td></tr><tr><td>Obiektyw F-theta</td><td>Thorlabs</td><td>FTH-1064-100</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik kamery InGaAs Line-scan</td><td>Unlimited</td><td>SU1024-LDH2</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td> Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Składnik hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCT 116 Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>SPL Nauki biologiczne</td><td>70025</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand</td><td></td><td>14388100</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>10340</td><td></td></tr><tr><td>Gibco GlutaMax DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenia amerykańskiego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicza (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-well Clear Okrągłodenna ultra-niska płytka z mocowaniem</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II 3110 Inkubatory CO2 z płaszczem wodnym</td><td>Rękawice Thermo Fisher Scientific</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89428-750</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Globe Scientific</td><td>138080</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5702 R</td><td>Do odwirowania probówki 15 ml</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>NUAIRE</td><td>AWEL CF 48-R</td><td>Do wirowania 96-dołkowego</td></tr><tr><td>mikroskopu</td> płytkowego <td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Histologia & IHC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy skaner slajdów</td><td>Leica</td><td>Aperio AT2</td><td>Uzyskaj obrazy histologiczne o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Serwis histologiczny</td><td>Histowiz</td><td></td><td>Zamów usługę barwienia histologicznego i immunohistologicznego guza sferoidalnego</td></tr><tr><td><silnego>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Lista komercyjnych OCT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT system</td><td>Thorlabs</td><td>Telesto Series</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT system</td><td>Wasatch Photonics</td><td>WP OCT 1300 nm</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software for Data Analyses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basic Image Analysis</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Fiji również działa.</td></tr><tr><td>Renderowanie 3D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Amira</td><td>Komercyjne oprogramowanie. Opcja 1</td></tr>: <tr><td>Renderowanie 3D</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td>Oprogramowanie komercyjne. Opcja 2. Używany w protokole</td></tr><tr><td>OCT akwizycja oprogramowania</td><td></td><td></td><td>opracowanego na zamówienie w C++.</td></tr><tr><td>Kontrola sceny</td><td>Pekin Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.</td><td>MRC_3</td><td>Włączone do niestandardowego kodu akwizycji OCT</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> do przetwarzania OCT <td>opracowane na zamówienie w języku C++. Wykorzystaj procesor graficzny. Uwzględniony w niestandardowym kodzie pozyskiwania OCT.</td></tr><tr>Analiza <td></td><td></td><td>morfologiczna i fizjologiczna</td><td>opracowana na zamówienie w MATLAB</td></tr></tbody></table>

podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Sferoidy nowotworowe zostały opracowane jako trójwymiarowy (3D) model hodowli komórkowej w badaniach nad rakiem i odkrywaniu leków przeciwnowotworowych. Jednak obecnie wysokoprzepustowe metody obrazowania wykorzystujące wykrywanie jasnego pola lub fluorescencji nie są w stanie rozwiązać ogólnej struktury 3D sferoidy guza ze względu na ograniczoną penetrację światła, dyfuzję barwników fluorescencyjnych i rozdzielczość głębokości. Niedawno nasze laboratorium zademonstrowało zastosowanie optycznej koherentnej tomografii (OCT), bezznacznikowej i nieniszczącej metody obrazowania 3D, do przeprowadzenia podłużnej charakterystyki wielokomórkowych sferoid guza na 96-dołkowej płytce. OCT był w stanie uzyskać trójwymiarowe informacje morfologiczne i fizjologiczne sferoid guza dorastających do około 600 μm wysokości. W tym artykule demonstrujemy wysokoprzepustowy system obrazowania OCT (HT-OCT), który skanuje całą płytkę wielodołkową i automatycznie uzyskuje dane 3D OCT sferoidów guza. Szczegóły systemu HT-OCT oraz wytyczne konstrukcyjne opisujemy w protokole. Na podstawie danych 3D OCT można wizualizować ogólną strukturę sferoidy za pomocą renderowanych w 3D i ortogonalnych warstw, scharakteryzować podłużną krzywą wzrostu sferoidu guza na podstawie informacji morfologicznych o wielkości i objętości oraz monitorować wzrost obszarów martwych komórek w sferoidzie guza w oparciu o optyczny kontrast tłumienia wewnętrznego. Pokazujemy, że HT-OCT może być stosowany jako wysokoprzepustowa metoda obrazowania do badań przesiewowych leków, a także do charakteryzowania próbek biofabrykowanych.

Wysokoprzepustowe obrazowanie sferoidów w płytce 96-dołkowej za pomocą optycznej koherentnej tomografii
Rysunek 3 przedstawia wynik skanowania HT-OCT płytki 96-dołkowej z sferoidami nowotworowymi HCT 116 w dniu 3. Sekwencyjne skanowanie całej płytki rozpoczyna się od dołka w prawym dolnym rogu (H12). Rysunek 3B przedstawia schemat blokowy implementacji programowej systemu ...

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą naśladować specyficzne dla tkanek właściwości guzów in vivo, dostarczając więcej istotnych klinicznie danych do odkrywania leków przeciwnowotworowych niż prosta hodowla komórkowa 2D. Nasza technika obrazowania, optyczna tomografia koherentna, może z łatwością zobrazować strukturę 3D pojedynczego nerwu guzowego o wielkości kilkuset mikronów i zapewnić dokładniejszą charakterystykę jego morfologii i zarażenia, często w ciągu kilku sekund. Korzystając z modelu sferycznego 3D, możemy potencjalnie skrócić czas odkrywania leków, obniżyć koszty i skuteczniej dostarczać pacjentom nowe leki.Formowanie kulistego kształtu skupiska guza jest jednym z kluczowych kroków w naszym eksperymencie. Ważne jest, aby wybrać odpowiednią ultra-niską płytę mocującą z okrągłym dnem i odpowiednią prędkością wirowania po wysianiu komórek. Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania interesujących komórek w kolbie hodowlanej, jak opisano w manuskrypcie.Utrzymuj komórki w inkubatorze w standardowych warunkach i codziennie monitoruj ich stan zdrowia. W razie potrzeby odśwież nośnik. Aby przeprowadzić hodowlę komórkową 3D na płytkach wielodołkowych, najpierw wyjmij pożywkę z kolby do hodowli komórkowej i umyj komórki wysterylizowanym, wstępnie podgrzanym PBS o temperaturze 33 stopni Celsjusza.Następnie dodaj jeden mililitr Trypsyny-EDTA, aby ponownie zawiesić komórki i inkubować przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj trzy mililitry pożywki hodowlanej, aby rozcieńczyć trypsynę. Przenieś tę zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj w temperaturze 500 G i temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z czterema mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Aby określić stężenie komórek, umieść jedną kroplę próbki na hemocytometrze i policz komórki. Rozcieńczyć do pożądanego stężenia wysiewu.Wysiewaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki z wielodołkową płytką o bardzo niskim nasadce, z okrągłym dnem, o stężeniu 3 000 komórek na mililitr, aby uzyskać około 600 komórek na studzienkę. Natychmiast po wysianiu odwirować całą płytkę z najniższą dostępną prędkością, w temperaturze pokojowej, przez siedem minut. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% Co2, pamiętając o odświeżaniu podłoża co trzy dni.Najpierw należy skonstruować ramię referencyjne i ramię próbki systemu OCT, postępując zgodnie ze schematami w tym manuskrypcie. Następnie skonstruuj spektrometr, w tym kilometr, profilację, obiektyw F-Theta i kamerę do skanowania linii. Użyj adaptera do płytek, aby utrzymać płytkę wielodołkową w ustalonej pozycji.Przed obrazowaniem należy skorygować nachylenie i obrót płytki wielodołkowej za pomocą stolika przechylającego 2D oraz stopnia obrotowego zamontowanego na stopniu przejściowym, aby zminimalizować zmiany płaszczyzny ogniskowej z różnych dołków. Następnie dostosuj obrót, aby upewnić się, że krawędzie płyty są równoległe do kierunku ruchu sceny, tak aby studzienki pozostały w tych samych pozycjach poziomych na obrazach OCT. Następnie wyreguluj stopień przechylania, aby upewnić się, że płytka jest równoległa do stołu optycznego, tak aby dołki pozostały w tych samych pionowych miejscach obrazowania.W dniu obrazowania sferoid guza należy wyjąć płytkę wielodołkową z inkubatora. Przenieś go pod system obrazowania OCT i umieść na adapterze płytki. Aby dostosować wysokość płyty, przesuń ją wzdłuż kierunku Z stolika translacji.W niestandardowym oprogramowaniu do obrazowania ustaw żądany zakres skanowania OCT, aby objąć całą sferoidę guza, w zależności od jego etapów rozwoju, a następnie kliknij przycisk Zapisz parametry, aby zapisać ustawienie. Następnie pokaż zoptymalizowane podglądy XZ i YZ OCT sferoidów guza. Uzyskaj obrazy 3D OCT sferoid guza jeden po drugim dla wszystkich dołków płytki zawierającej sferoidy.Aby wyświetlić obraz podglądu, kliknij przycisk podglądu. Aby uzyskać obraz OCT, kliknij przycisk pozyskiwania. Rejestruj cały proces przenoszenia etapu pozyskiwania danych OCT.Aby zapewnić optymalną jakość obrazu dla wszystkich sferoid guza, adapter płytki musi być dokładnie dostrojony, a mediana objętości musi być taka sama. Użyj niestandardowego kodu przetwarzania C+ do przetwarzania zestawów danych 3D OCT sferoidów guza w celu wygenerowania obrazów strukturalnych OCT. Użyj obrazów 2D OCT w trzech płaszczyznach przekroju, XY, XZ i YZ w poprzek środka ciężkości sferoidy, aby wygenerować kolaż obrazów sferoidalnych.Aby uzyskać renderowanie 3D sferoidy za pomocą żądanego oprogramowania, najpierw załaduj dane SD OCT do oprogramowania. Kliknij panel przewyższania, a następnie dodaj nową objętość i wybierz tryb mieszania, który ma być używany do renderowania 3D. Aby dostosować kąt widzenia, użyj wskaźnika myszy, aby przeciągnąć obraz i kontynuować kwantyfikację zgodnie z opisem w rękopisie.Na podstawie przetworzonych danych wygenerowano kolaż niewzruszonych obrazów OCT sferoid linii komórkowej HCT116, uzyskując wyniki porównywalne z obrazami z innych wysokoprzepustowych systemów obrazowania 2D. Ponadto wygenerowano kolaż obrazów sferoidowych o przekroju poprzecznym 2D z 96 studzienek w celu monitorowania wysokości sferoidów i wizualizacji niejednorodności sferoidów w kierunku pionowym. Kolaż renderowanych w 3D obrazów sferoidowych może być generowany pod dowolnym wstępnie zdefiniowanym kątem, aby zobrazować ogólny kształt 3D i ocenić okrągłość sferoidy.Po ogólnym przetwarzaniu końcowym OCT uzyskano obrazy strukturalne 3D OCT sferoidy guza. Na podstawie danych z OCT wygenerowano słupek powierzchniowy 3D oraz ortogonalne przekroje XZ, YZ i XY, aby zobrazować strukturę sferoidu guza w dowolnym kierunku. Przeprowadzono monitorowanie podłużne pojedynczej sferoidy guza w celu scharakteryzowania jej średnicy, wysokości i objętości opartej na wokselach, generując krzywe wzrostu pod względem wielkości i objętości podczas 21-dniowego rozwoju.W tym przypadku sferoida została przerwana w 11 dniu i całkowicie zapadła się w 21 dniu. Śledzenie podłużne wykazało wzrost obszarów martwych komórek w sferoidalnej guzie. Renderowane w 3D obrazy sferoidy guza wykazały pojawienie się i wzrost martwych obszarów komórkowych od siódmego do czternastego dnia, na co wskazuje wzrost zaznaczonych na czerwono obszarów martwiczych.Wraz ze wzrostem odsetka obszarów martwiczych, sferoida guza nie mogła utrzymać swojego idealnego kształtu, a tym samym zapadła się. Dzięki tej platformie obrazowania możemy dalej badać inne złożone modele sfer nowotworowych, takie jak model obrazowania 3D, model ogromnych stworzeń i modele współkultur, aby lepiej symulować guzy in vivo. Nasz wysokowydajny system obrazowania OCT może zapewnić alternatywne podejście do badań przesiewowych leków w procesie odkrywania leków przeciwnowotworowych.Jest to coś również scharakteryzowanego, biofabrykowane próbki 3D do różnych zastosowań biomedycznych.

longitudinal-morphological-physiological-monitoring-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

Źródło: Huang, Y. et. al., Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej tomografii koherentnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie koherencji optycznej tomografia (OCT) do monitorowania sferoid guza w płytce wielodołkowej poprzez przechwytywanie obrazów przekroju poprzecznego o wysokiej rozdzielczości. Analizując odbicia światła od struktur komórkowych, OCT konstruuje modele 3D w celu oceny cech morfologicznych,...

Monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii 

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Prezentujemy aplikację do analizy obrazów o wysokiej przepustowości do pomiaru wielkości trójwymiarowych sferoid guza obrazowanych za pomocą mikroskopii jasnego pola. Ta aplikacja zapewnia szybki i skuteczny sposób badania wpływu leków terapeutycznych na sferoidy, co jest korzystne dla badaczy, którzy chcą używać sferoid w badaniach przesiewowych leków.

Wysokoprzepustowa analiza obrazu sferoid nowotworowych: przyjazna dla użytkownika aplikacja do automatycznego i dokładnego pomiaru wielkości sferoid

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Obecny protokół rozwija technikę opartą na obrazie do szybkiego, nieniszczącego i bezznacznikowego regionalnego pomiaru gęstości komórek i żywotności w agregatach 3D guza. Wyniki ujawniły gradient gęstości komórek, z większą gęstością komórek w regionach rdzenia niż w warstwach zewnętrznych w rozwijających się agregatach i głównie śmiercią komórek obwodowych w agregatach HER2+ leczonych trastuzumabem.

Nieniszcząca ocena regionalnej gęstości komórek w agregatach nowotworowych po leczeniu farmakologicznym

Sferoidy nowotworowe są coraz częściej wykorzystywane do oceny interakcji komórek nowotworowych z mikrośrodowiskiem i odpowiedzi na terapię. Niniejszy protokół opisuje solidną, ale prostą metodę pół-wysokoprzepustowego obrazowania sferoid guza 3D przy użyciu szybkiego usuwania optycznego.

Szybkie oczyszczanie optyczne do półwysokoprzepustowej analizy sferoidów nowotworowych

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Poznaj metodę optycznej koherentnej tomografii do monitorowania wzrostu trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Technika umożliwia precyzyjną kwantyfikację objętości i bezetykietową detekcję martwej tkanki, skracając czas odkrywania leków.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii (Wideo) | JoVE Journal

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Przeglądaj więcej filmów