Name: Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę SHAPE do badania struktury pre-mRNA in vitro i w komórkach. Protokoły umożliwiają analizę zmian strukturalnych RNA wywołanych małymi cząsteczkami w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była możliwa dzięki grantowi NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

<ol><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+%28SHAPE%29%3A+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li>
<li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li>
<li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+110%2C+E3256-E3264%22%5BJournal%5D)">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li>
<li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li>
<li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li>
<li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mn+2%2B+-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li>
<li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li>
<li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+%28TAR%29+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li>
<li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li>
<li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li>
<li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li>
<li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs%3A+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li>
<li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+small+molecule+druggable+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li>
<li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li>
<li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li>
<li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Risdiplam%2C+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+%28+SMN2+%29+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li>
<li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li>
<li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH%2C+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+%28S46.003%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li>
<li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li>
<li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li>
<li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+%2C+complex+structural+domains+%2C+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li>
<li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2+%E2%80%B2+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29+for+direct+%2C+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li>
<li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205(2014).</li>
<li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li>
<li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li>
<li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li>
<li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQi%2C+H+%22Preparation+of+pyridopyrimidine+derivatives+and+related+compounds+for+treating+spinal+muscular+atrophy%22">Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy</a>. , (2013).</li>
<li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li>
<li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959(2014).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li>
<li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li>
<li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li>
<li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure+determination+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W in vitro SHAPE kluczowe znaczenie ma użycie wysokiej jakości jednorodnej matrycy RNA. Jednak transkrypcja T7 często daje heterogeniczne sekwencje36. Zwłaszcza sekwencje z nukleotydem ±1 na końcu 3' o niepomijalnej wydajności36 są zwykle trudne do usunięcia przez oczyszczanie żelem poliakrylamidowym. Heterogeniczna matryca RNA może skutkować więcej niż jednym zestawem sygnału w profilowaniu żelu sekwencjonującego produktu przedłużającego starter, co czasami utrudnia interp...

Selektywna acylacja 2'-hydroksylowa analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) to metoda pomiaru kinetyki każdego nukleotydu w interesującej nas sekwencji RNA i wyjaśnienia struktury drugorzędowej przy rozdzielczości pojedynczego nukleotydu1. Metodologie SHAPE, zarówno w warunkach in vitro2,3,4 (oczyszczone RNA w zdefiniowanym systemie buforowym), jak i w żywych komórkach ssaków5,6, zostały opracowane w celu zbadania drugorzędowej struktury sekwencji RNA średniej długości (zazwyczaj <1000 nukleotydów dla in-cell SHAPE i <200 nukleotydów dla in vitro SHAPE). Jest to szczególnie przydatne do oceny zmian strukturalnych w RNA receptora po związaniu się z metabolitami małocząsteczkowymi oddziałującymi z RNA2,4,7,8 oraz do badania mechanistycznego działania cząsteczek ukierunkowanych na RNA podczas opracowywania leku9,10.
Odkrywanie leków ukierunkowanych na RNA przyciągnęło ostatnio uwagę laboratoriów akademickich i przemysłu farmaceutycznego11,12 poprzez różne podejścia i strategie13,14,15,16. Ostatnie przykłady małych cząsteczek ukierunkowanych na RNA do użytku klinicznego obejmują dwa strukturalnie odrębne leki eksperymentalne, LMI-07017 i RG-791618,19, dla rdzeniowego zaniku mięśni (SMA), które wykazały obiecujące wyniki w badaniach klinicznych fazy II20. Wykazano, że obie cząsteczki są ukierunkowane na przeżycie neuronu ruchowego (SMN) 2 pre-mRNA i regulują proces splicingu genu SMN26,17,21. Wcześniej wykazaliśmy zastosowanie in vitro i in-cell SHAPE w badaniu docelowych zmian strukturalnych RNA w obecności analogu RG-7916 znanego jako SMN-C26.
Zasadniczo, SHAPE mierzy szybkość acylacji 2'-OH każdego nukleotydu sekwencji RNA w obecności nadmiaru samogasnącego odczynnika acylacyjnego w bezstronny sposób. Odczynnik do acylacji nie jest stabilny w wodzie, z krótkim okresem półtrwania (np. T1/2 = 17 s dla bezwodnika 1-metylo-7-nitroizatoowego; lub 1M7, ~20 min dla imidazolidu kwasu 2-metylonikotynowego lub NAI)22 i niewrażliwością na tożsamość bases23. Powoduje to korzystniejszą acylację grup 2'-OH elastycznych zasad, które można przekształcić w dokładną ocenę dynamiki każdego nukleotydu. W szczególności nukleotyd w parze zasad jest zwykle mniej reaktywny niż nukleotyd niesparowany z odczynnikiem modyfikującym 2'-OH, takim jak NAI i 1M7.
Patrząc na źródło matrycy RNA i miejsce, w którym zachodzi acylacja 2'-OH, SHAPE można ogólnie podzielić na in vitro i in cell SHAPE. In vitro SHAPE wykorzystuje oczyszczone transkrybowane RNA T7 i brakuje mu kontekstu komórkowego w projektach eksperymentalnych. W in-cell SHAPE zarówno transkrypcja matrycy RNA, jak i acylacja 2'-OH zachodzą w żywych komórkach; w związku z tym wyniki mogą podsumować model strukturalny RNA w kontekście komórkowym. W literaturze literatura określana jako SHAPE w komórce in vivo jest określana jako SHAPE przenoszony w żywych komórkach24. Ponieważ ten eksperyment nie jest przeprowadzany na zwierzęciu, nazwaliśmy ten eksperyment jako KSZTAŁT w komórce dla dokładności.
Strategie dla etapu przedłużania startera in vitro i in-cell SHAPE są również różne. W in vitro SHAPE odwrotna transkrypcja zatrzymuje się w pozycji acylacji 2'-OH w obecności Mg2+. Rozszerzenie startera z 32warstwami P pojawia się zatem jako pasmo w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a intensywność pasma jest proporcjonalna do szybkości acylacji1. W SHAPE w komórce odwrotna transkrypcja generuje losowe mutacje w pozycji adduktu 2'-OH w obecności Mn2+. Szybkość mutacji każdego nukleotydu można uchwycić za pomocą dogłębnego sekwencjonowania nowej generacji, a następnie obliczyć reaktywność SHAPE w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu.
Potencjalnym problemem dla SHAPE w komórce jest niski stosunek sygnału do szumu (np. większość grup 2'-OH jest niezmodyfikowana, podczas gdy niezmodyfikowane sekwencje zajmują większość odczytu w sekwencjonowaniu nowej generacji). Niedawno metoda wzbogacania zmodyfikowanego 2'-OH RNA, określana jako in vivo click SHAPE (icSHAPE), została opracowana przez Chang laboratory25. Ta metoda wzbogacania może być korzystna w badaniu słabych małych cząsteczek, takich jak interakcje RNA, zwłaszcza w przesłuchaniu obejmującym cały transkryptom.

<table><tbody><tr><td>Oligonukleotyd DNA</td><td>IDT</td><td></td><td>gBlock do syntezy >200 pz DNA</td></tr><tr><td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCR Zestaw do czyszczenia</td><td>Takara</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>MegaScript T7</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1333</td><td>Zawiera 10x bufor reakcyjny, enzym T7, NTP i Turbo DNazę</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC</td><td>Thermo Fisher</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>2x bufor do próbek TBE-mocznika</td><td>Thermo Fisher</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akryloamidu/bisakryloamidu (29:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow&trade; Jednostka filtrująca</td><td>Thermo Fisher</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Safe barwnik</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-mocznik mini-żel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C005MC</td><td></td></tr><tr><td>Hyperscreen&trade; Ekran intensyfikujący</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1669</td><td>Ekran fosforowy z wolframianu wapnia</td></tr><tr><td>Ekran magazynujący luminofor</td><td>Dynamika molekularna</td><td>BAS-IP MS 3543 E</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Typhoon</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAI (2M)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-310</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Rewers Transkryptaza</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090010</td><td>Zawiera 5x bufor RT, SuperScript IV</td></tr><tr><td>dNTP mix (10 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>ddNTP zestaw (5 mM)</td><td>Sigma</td><td>GE27-2045-01</td><td></td></tr><tr><td>duża bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1001-917</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka żelowa</td><td>Hoefer</td><td>GD 2000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Zawiera również RNazę A i proteazę K</td></tr><tr><td>SMN2 minigen34</td><td>Addgene</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Thermo</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>TrpLE</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez Ca/Mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kolumna</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Zawiera również RW1, bufor RPE</td></tr><tr><td>Zestaw DNaz bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Zawiera DNazę I i bufor RDD</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>losowy nonamer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7647</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>11904-018</td><td>Zawiera 10x bufor RT, odwrotną transkryptazę SuperScript II</td></tr><tr><td>AccuPrime pfx DNA</td><td>polimer Thermo Fisher</td><td>12344024</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna NucAway</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM10070</td><td>do odsalania</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie in vitro i in-cell shape do badania zmian strukturalnych pre-mrna wywołanych małymi cząsteczkami

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

W procesie opracowywania leków dla małych cząsteczek ukierunkowanych na RNA, pożądane jest wyjaśnienie zmian strukturalnych po ich interakcjach z docelowymi sekwencjami RNA. Niniejszym przedstawiamy szczegółową in-vitro i selektywną acylację 2'-hydroksylową w komórce analizowaną za pomocą protokołu rozszerzenia startera (SHAPE) w celu zbadania zmian strukturalnych RNA w obecności eksperymentalnego leku na rdzeniowy zanik mięśni (SMA), przeżycie neuronu ruchowego (SMN)-C2 oraz w eksonie 7 pre-mRNA genu SMN2. In vitro SHAPE sekwencja RNA 140 nukleotydów zawierających ekson 7 SMN2 jest transkrybowana przez polimerazę RNA T7, fałdowana w obecności SMN-C2, a następnie modyfikowana łagodnym odczynnikiem do acylacji 2'-OH, imidazolikiem kwasu 2-metylonikotynowego (NAI). Ten addukt 2'-OH-NAI jest dalej badany przez rozszerzenie startera znakowanego 32P i rozwiązywany przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE). I odwrotnie, acylacja 2'-OH w in-cell SHAPE zachodzi in situ z komórkowym RNA związanym z SMN-C2 w żywych komórkach. Sekwencja pre-mRNA eksonu 7 w genie SMN2, wraz z indukowanymi przez SHAPE mutacjami w przedłużeniu startera, została następnie amplifikowana przez PCR i poddana sekwencjonowaniu nowej generacji. Porównując te dwie metodologie, metoda in vitro SHAPE jest bardziej opłacalna i nie wymaga mocy obliczeniowej do wizualizacji wyników. Jednak model RNA uzyskany in vitro SHAPE czasami odbiega od struktury drugorzędowej w kontekście komórkowym, prawdopodobnie z powodu utraty wszystkich interakcji z białkami wiążącymi RNA. In-cell SHAPE nie wymaga miejsca pracy z materiałem radioaktywnym i zapewnia dokładniejszą strukturę drugorzędową RNA w kontekście komórkowym. Co więcej, SHAPE w komórce ma zwykle zastosowanie do większego zakresu sekwencji RNA (~1,000 nukleotydów) poprzez wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji, w porównaniu do SHAPE in vitro (~200 nukleotydów), który zwykle opiera się na analizie PAGE. W przypadku eksonu 7 w pre-mRNA SMN2 modele RNA pochodzące z in vitro i in-cell SHAPE są do siebie podobne.

Wcześniej wykazaliśmy, że modulator splicingu RNA, SMN-C2, oddziałuje z motywem AGGAAG w eksonie 7 pre-mRNA genu SMN2, a następnie wykorzystaliśmy metodę SHAPE do oceny zmian strukturalnych RNA w obecności SMN-C26. Miejsce wiązania SMN-C2 jest odmienne od miejsca wiązania zatwierdzonego przez FDA oligonukleotydu antysensownego (ASO) stosowanego w SMA, nusinersenu, który wiąże i blokuje intronowy silencer splicingu (ISS) w intronie 727,<...

Szczegółowe protokoły zarówno in vitro, jak i selektywnej acylacji 2'-hydroksylowej w komórce, analizowane za pomocą eksperymentów z rozszerzaniem starterów (SHAPE) w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji pre-mRNA interesujących w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na RNA, są przedstawione w tym artykule.

Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Ten film dostarczy szczegółowych protokołów dla eksperymentów in vitro w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji RNA będących przedmiotem zainteresowania w obecności RNA ukierunkowanego na małą cząsteczkę. Kształt in vitro jest opłacalną metodą zrozumienia dynamiki każdego nukleotydu na aminowym elemencie RNA, który zwykle wynosi mniej niż 200 nukleotydów. Po przygotowaniu matrycy RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie, znakuj radiowo startery odwrotnej transkrypcji, dodając gamma 32P ATP, starter odwróconej transkrypcji.Bufor reakcyjny 10XPNK, kinaza polinukleotydowa i wolna woda RNA w 1,7 mililitrowej probówce mikrowirówkowej o łącznej objętości 20 mikrolitrów. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie aktywujesz próbki na 20 minut od 65 stopni Celsjusza, a następnie filtrujesz próbki w kolumnie odsalającej i odwirowujesz z prędkością 1000 razy G. Dodaj 25 mikrolitrów buforu do próbek mocznika 2XTBE i wymieszaj.Obniż te oznakowane produkty do 10% żelu akrylowego i upewnij się, że nie wypuścisz radioaktywności do górnych zbiorników. Uruchom żel z mocą 20 watów przez godzinę. Po zakończeniu pracy usuń szklane płytki kasety żelowej.Połóż żel na kawałku folii. Złóż plastik na wierzch żelu, aby zrobić hermetyczną kanapkę. Umieść kanapkę z żelem na ekranie luminoforowym z wolframianu wapnia i wolframu i naświetl za pomocą przyrządu do wyobrażania sobie.Ponownie zobrazuj żel w zwykłym świetle, aby wiedzieć, gdzie znajdują się krawędzie żelu. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby nałożyć na siebie dwa obrazy i nałożyć na siebie jasne i ciemne obrazy. Następnie spraw, aby górny obraz był lekko nieprzezroczysty, aby widzieć oba obrazy jednocześnie.Upewnij się, że wydrukowany obraz ma taki sam rozmiar jak rzeczywisty żel. Następnie wyrównaj żel na wydrukowanym obrazie. Na koniec użyj wysterylizowanej żyletki, aby wyciąć pożądane zagięcia z żelu i umieść każdy kawałek żelu w osobnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra.Aby odzyskać DNA z wycinka żelu przez pasywną elucję, dodaj 0,3 mililitra mieszanki wytrącania elucji do każdej 1,7 mililitrowej probówki. Inkubować probówki w radioaktywnym pojemniku na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin. Po inkubacji przenieś ciecz do nowej probówki o pojemności 1,7 mililitra.Dodaj 2,5 x lodowaty 200-procentowy etanol i odwróć rurki sześć razy, aby wymieszać płyn. Inkubować probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Po odwirowaniu w temperaturze 10 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, należy ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.Dodaj jeden mililitr 80% etanolu, aby umyć granulkę. Wirować przez 15 sekund i ponownie odwirować w tych samych warunkach. Po usunięciu supernatantu przez pipetowanie, wysuszyć osad DNA na powietrzu przez pięć minut.Dodaj 50 mikrolitrów wolnej wody RNA i mieszaj, pipetując w górę iw dół 10 razy. Znormalizuj stężenie DNA do około 100 000 zliczeń na minutę na mikrolitr w liczniku scyntylacyjnym. Aby przygotować cztery próbki do modyfikacji chemicznej, dodaj osiem pikomoli RNA w 32 mikrolitrach buforu 0,5 XTE do 1,7 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Podgrzewaj w 80 stopniach Celsjusza przez dwie minuty i schładzaj na lodzie przez co najmniej minutę. Następnie dodaj osiem mikrolitrów 5-krotnej mieszanki składanej, wymieszaj i przydziel dziewięć mikrolitrów tej mieszaniny RNA do każdej z czterech probówek PCR, oznaczonych od jednej do czterech. Dodaj jeden mikrolitr 10% DMSO do probówki oznaczonej jako jeden, jeden mikrolitr stężonego roztworu drobnocząsteczkowego do probówki drugiej, jeden mikrolitr rozcieńczonego roztworu drobnocząsteczkowego do probówki trzeciej i jeden mikrolitr wody do probówki czwartej.Inkubuj wszystkie probówki PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze przez 30 minut. Bezpośrednio przed reakcją modyfikacji dwóch głównych OH rozcieńczyć jeden mikrolitr dwumolowego roztworu podstawowego NAI w trzech mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC, aby uzyskać 0,5 molowy roztwór roboczy. Natychmiast dodaj jeden mikrolitr tego roztworu do probówek pierwszej, drugiej i trzeciej.Dodaj jeden mikrolitr 25% DMSO do probówki czwartej i inkubuj w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przygotuj cztery świeże mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,7 mililitra i dodaj 100 mikrolitrów mieszanki wytrącającej elucję i dwa mikrolitry glikogenu do każdej probówki. Następnie do każdej z tych probówek przenieś cały płyn z odpowiednich probówek do PCR.Dodaj 0,34 mililitra lodowatego 200-procentowego etanolu do każdej probówki i mieszaj, wirując przez pięć sekund. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę. Następnie odwirować probówki przez 15 minut w temperaturze 14 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Nie naruszając osadu RNA, usuń supernatant z każdej probówki. Dodaj 0,5 mililitra 80% etanolu na probówkę, aby umyć osad RNA i wirować przez 15 sekund. Po ponownym odwirowaniu w tych samych warunkach, usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu osad RNA przez pięć minut.Dodaj dziewięć mikrolitrów wolnej wody RNA i przepompuj ją 10 razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieś zmodyfikowany RNA do czterech nowych probówek PCR i oznacz je od jednego do czterech, jak w poprzednim kroku. Dodaj dwie pikomole RNA w siedmiu mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC do każdej z czterech dodatkowych probówek PCR i oznacz je numerami od pięciu do ośmiu.Dodaj dwa mikrolitry odzyskanego znakowanego radioaktywnie startera do każdej z ośmiu probówek PCR oznaczonych od jednego do ośmiu. Po podgrzaniu do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, natychmiast schłodzić do czterech stopni Celsjusza w termocyklerze. Dodaj cztery mikrolitry buforu 5x RT, jeden mikrolitr 0,1 molowego DTT i jeden mikrolitr mieszanki DNTP do każdej z probówek.Następnie dodaj dwa mikrolitry wody uzdatnionej DEPC do probówek od pierwszej do czterech. Dodaj cztery mikrolitry pięciomilimolowego ddATP do probówki piątej, cztery mikrolitry pięciomilimolowego ddTTP do probówki szóstej i cztery mikrolitry pięciomilimolowej ddCTP do probówki siedmiokrotnej i jeden mikrolitr pięciomilimolowej ddGTP i trzy mikrolitry wody uzdatnionej DEPC do probówki ósmej i pipetę cztery razy do wymieszania. Po podgrzaniu wszystkich probówek PCR w temperaturze 52 stopni Celsjusza przez jedną minutę w termocyklerze, dodaj jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy do każdej probówki i przepompuj ją w górę iw dół cztery razy, aby wymieszać.Inkubuj reakcje w temperaturze 52 stopni Celsjusza przez 20 minut w termocyklerze. Aby hydrolizować RNA, dodaj jeden mikrolitr pięciu molowych wodorotlenków sodu do każdej z probówek i podgrzewaj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodać pięć mikrolitrów jednego molowego kwasu solnego, aby zneutralizować reakcję i powtórzyć wytrącanie etanolu, jak opisano wcześniej.Po wysuszeniu na powietrzu osadu DNA przez pięć minut, dodaj 10 mikrolitrów wody i 10 mikrolitrów buforu ładującego 2xTBE do próbki mocznika 2xTBE w probówkach o pojemności 1,7 mililitra i przetrzyj go 10 razy w górę iw dół do ponownego rozpuszczenia. Podgrzewaj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieść probówki na lodzie przed załadowaniem do żelu. Załaduj 10 mikrolitrów próbki, która została umieszczona na lodzie, na 8% żel do sekwencjonowania poliakryloamidu.Uruchom żel z mocą 65 watów przez dwie godziny lub do momentu, gdy dolny barwnik osiągnie 3/4 żelu. Usuń przekładkę i delikatnie włóż szpatułkę, aby usunąć górną płytkę ze szkła silikonowanego. Przykryj żel kawałkiem dużej bibuły filtracyjnej i delikatnie dociśnij, aby żel przylgnął do bibuły filtracyjnej.Zaczynając od dolnego końca, podnieś bibułę filtracyjną i usuń żel ze szklanej płytki razem z bibułą. Po przeniesieniu żelu na papier pakowy, jak poprzednio, susz go w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę w próżni, upewniając się, że między żelem a suszarką używasz kilku bibuł filtracyjnych. Przenieś kanapkę z żelem na kasetę z fotobielonym luminoforem i wystawij radioaktywność żelu na ekran przez cztery do 16 godzin.Na koniec umieść ekran pamięci luminoforu na urządzeniu do przetwarzania obrazu i skanuj w średniej rozdzielczości przez około 30 minut. Po wystawieniu poliakryloamidowego żelu sekwencjonującego na ekran magazynujący luminofor, udany eksperyment z kształtem wykazał pojedyncze i najbardziej intensywne zgięcie w górnej części żelu i zagięcia w całym żelu w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu bez rozmazywania. Żel wykazał również, że intensywność niektórych zagięć zmieniała się w obecności małych cząsteczek, co wskazuje na zmiany siły parowania zasad.Częstym problemem w analizie strony jest to, że w środku żelu może pojawić się obszar rozmazu znany jako front soli, prawdopodobnie z powodu wysokiego stężenia soli, DMSO lub innej niepożądanej substancji w próbce ładującej. Można tego uniknąć, usuwając niepożądaną substancję przez wytrącanie etanolu. Jednorodna matryca RNA jest preferowana do kształtu in vitro.Aby uzyskać takie RNA, używamy rybosomów zarówno na pięciu pierwszych, jak i trzech pierwszych końcach. Kształt wewnątrzkomórkowy można również wykonać w celu uzyskania struktury drugorzędowej RNA w kontekście komórkowym. Pamiętaj, że kształt in vitro może nie odzwierciedlać interakcji białek wiążących RNA in vivo.Kształt in vitro to potężna metoda wykrywania zmian w strukturze RNA spowodowanych obecnością małej cząsteczki. Odbywa się to poprzez ilościowe określenie zmian w sile wzorca zatrzymania odwrotnej transkryptazy. Należy uważać, aby wszystkie eksperymenty opisane w tym filmie były wykonywane w autoryzowanym radioaktywnym miejscu pracy z odpowiednią ochroną osobistą i osłoną z pleksiglasu.

using-vitro-cell-shape-to-investigate-small-molecule-induced-pre-mrna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

W tym artykule wideo opisujemy syntezę in vitro zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach.

In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Ten artykuł przedstawia metody hodowli miocytów serca o różnych kształtach, które reprezentują różne patologie, oraz sortowania tych przylegających miocytów serca na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczej komórki. Proponowana platforma zapewnia nowatorskie podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań przesiewowych leków w kierunku różnych rodzajów niewydolności serca.

Podejście do badania transkryptomiki zależnej od kształtu na poziomie pojedynczej komórki

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten opisuje wizualny test z wykorzystaniem rozdzielonych reporterów RNA brokułów do wykrywania i ilościowego określania parowania zasad międzycząsteczkowych w klastrzach RNA in vitro.

Wizualizacja i ilościowa parowanie baz międzycząsteczkowych RNA w klastrach in vitro z wykorzystaniem raporterów RNA brokułów podzielonych

Poznaj metodę SHAPE do badania struktury pre-mRNA in vitro i w komórkach. Protokoły umożliwiają analizę zmian strukturalnych RNA wywołanych małymi cząsteczkami w kontrolowanych warunkach.

Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

Przeglądaj więcej filmów