Wykorzystanie in vitro i in-cell SHAPE do badania zmian strukturalnych pre-mRNA wywołanych małymi cząsteczkami

Ten film dostarczy szczegółowych protokołów dla eksperymentów in vitro w celu określenia drugorzędowej struktury sekwencji RNA będących przedmiotem zainteresowania w obecności RNA ukierunkowanego na małą cząsteczkę. Kształt in vitro jest opłacalną metodą zrozumienia dynamiki każdego nukleotydu na aminowym elemencie RNA, który zwykle wynosi mniej niż 200 nukleotydów. Po przygotowaniu matrycy RNA zgodnie z opisem w manuskrypcie, znakuj radiowo startery odwrotnej transkrypcji, dodając gamma 32P ATP, starter odwróconej transkrypcji.

Bufor reakcyjny 10XPNK, kinaza polinukleotydowa i wolna woda RNA w 1,7 mililitrowej probówce mikrowirówkowej o łącznej objętości 20 mikrolitrów. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie aktywujesz próbki na 20 minut od 65 stopni Celsjusza, a następnie filtrujesz próbki w kolumnie odsalającej i odwirowujesz z prędkością 1000 razy G. Dodaj 25 mikrolitrów buforu do próbek mocznika 2XTBE i wymieszaj.

Obniż te oznakowane produkty do 10% żelu akrylowego i upewnij się, że nie wypuścisz radioaktywności do górnych zbiorników. Uruchom żel z mocą 20 watów przez godzinę. Po zakończeniu pracy usuń szklane płytki kasety żelowej.

Połóż żel na kawałku folii. Złóż plastik na wierzch żelu, aby zrobić hermetyczną kanapkę. Umieść kanapkę z żelem na ekranie luminoforowym z wolframianu wapnia i wolframu i naświetl za pomocą przyrządu do wyobrażania sobie.

Ponownie zobrazuj żel w zwykłym świetle, aby wiedzieć, gdzie znajdują się krawędzie żelu. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby nałożyć na siebie dwa obrazy i nałożyć na siebie jasne i ciemne obrazy. Następnie spraw, aby górny obraz był lekko nieprzezroczysty, aby widzieć oba obrazy jednocześnie.

Upewnij się, że wydrukowany obraz ma taki sam rozmiar jak rzeczywisty żel. Następnie wyrównaj żel na wydrukowanym obrazie. Na koniec użyj wysterylizowanej żyletki, aby wyciąć pożądane zagięcia z żelu i umieść każdy kawałek żelu w osobnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 mililitra.

Aby odzyskać DNA z wycinka żelu przez pasywną elucję, dodaj 0,3 mililitra mieszanki wytrącania elucji do każdej 1,7 mililitrowej probówki. Inkubować probówki w radioaktywnym pojemniku na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin. Po inkubacji przenieś ciecz do nowej probówki o pojemności 1,7 mililitra.

Dodaj 2,5 x lodowaty 200-procentowy etanol i odwróć rurki sześć razy, aby wymieszać płyn. Inkubować probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Po odwirowaniu w temperaturze 10 000 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut, należy ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.

Dodaj jeden mililitr 80% etanolu, aby umyć granulkę. Wirować przez 15 sekund i ponownie odwirować w tych samych warunkach. Po usunięciu supernatantu przez pipetowanie, wysuszyć osad DNA na powietrzu przez pięć minut.

Dodaj 50 mikrolitrów wolnej wody RNA i mieszaj, pipetując w górę iw dół 10 razy. Znormalizuj stężenie DNA do około 100 000 zliczeń na minutę na mikrolitr w liczniku scyntylacyjnym. Aby przygotować cztery próbki do modyfikacji chemicznej, dodaj osiem pikomoli RNA w 32 mikrolitrach buforu 0,5 XTE do 1,7 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Podgrzewaj w 80 stopniach Celsjusza przez dwie minuty i schładzaj na lodzie przez co najmniej minutę. Następnie dodaj osiem mikrolitrów 5-krotnej mieszanki składanej, wymieszaj i przydziel dziewięć mikrolitrów tej mieszaniny RNA do każdej z czterech probówek PCR, oznaczonych od jednej do czterech. Dodaj jeden mikrolitr 10% DMSO do probówki oznaczonej jako jeden, jeden mikrolitr stężonego roztworu drobnocząsteczkowego do probówki drugiej, jeden mikrolitr rozcieńczonego roztworu drobnocząsteczkowego do probówki trzeciej i jeden mikrolitr wody do probówki czwartej.

Inkubuj wszystkie probówki PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze przez 30 minut. Bezpośrednio przed reakcją modyfikacji dwóch głównych OH rozcieńczyć jeden mikrolitr dwumolowego roztworu podstawowego NAI w trzech mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC, aby uzyskać 0,5 molowy roztwór roboczy. Natychmiast dodaj jeden mikrolitr tego roztworu do probówek pierwszej, drugiej i trzeciej.

Dodaj jeden mikrolitr 25% DMSO do probówki czwartej i inkubuj w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Przygotuj cztery świeże mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,7 mililitra i dodaj 100 mikrolitrów mieszanki wytrącającej elucję i dwa mikrolitry glikogenu do każdej probówki. Następnie do każdej z tych probówek przenieś cały płyn z odpowiednich probówek do PCR.

Dodaj 0,34 mililitra lodowatego 200-procentowego etanolu do każdej probówki i mieszaj, wirując przez pięć sekund. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę. Następnie odwirować probówki przez 15 minut w temperaturze 14 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Nie naruszając osadu RNA, usuń supernatant z każdej probówki. Dodaj 0,5 mililitra 80% etanolu na probówkę, aby umyć osad RNA i wirować przez 15 sekund. Po ponownym odwirowaniu w tych samych warunkach, usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu osad RNA przez pięć minut.

Dodaj dziewięć mikrolitrów wolnej wody RNA i przepompuj ją 10 razy w górę iw dół, aby wymieszać. Przenieś zmodyfikowany RNA do czterech nowych probówek PCR i oznacz je od jednego do czterech, jak w poprzednim kroku. Dodaj dwie pikomole RNA w siedmiu mikrolitrach wody uzdatnionej DEPC do każdej z czterech dodatkowych probówek PCR i oznacz je numerami od pięciu do ośmiu.

Dodaj dwa mikrolitry odzyskanego znakowanego radioaktywnie startera do każdej z ośmiu probówek PCR oznaczonych od jednego do ośmiu. Po podgrzaniu do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, natychmiast schłodzić do czterech stopni Celsjusza w termocyklerze. Dodaj cztery mikrolitry buforu 5x RT, jeden mikrolitr 0,1 molowego DTT i jeden mikrolitr mieszanki DNTP do każdej z probówek.

Następnie dodaj dwa mikrolitry wody uzdatnionej DEPC do probówek od pierwszej do czterech. Dodaj cztery mikrolitry pięciomilimolowego ddATP do probówki piątej, cztery mikrolitry pięciomilimolowego ddTTP do probówki szóstej i cztery mikrolitry pięciomilimolowej ddCTP do probówki siedmiokrotnej i jeden mikrolitr pięciomilimolowej ddGTP i trzy mikrolitry wody uzdatnionej DEPC do probówki ósmej i pipetę cztery razy do wymieszania. Po podgrzaniu wszystkich probówek PCR w temperaturze 52 stopni Celsjusza przez jedną minutę w termocyklerze, dodaj jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy do każdej probówki i przepompuj ją w górę iw dół cztery razy, aby wymieszać.

Inkubuj reakcje w temperaturze 52 stopni Celsjusza przez 20 minut w termocyklerze. Aby hydrolizować RNA, dodaj jeden mikrolitr pięciu molowych wodorotlenków sodu do każdej z probówek i podgrzewaj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodać pięć mikrolitrów jednego molowego kwasu solnego, aby zneutralizować reakcję i powtórzyć wytrącanie etanolu, jak opisano wcześniej.

Po wysuszeniu na powietrzu osadu DNA przez pięć minut, dodaj 10 mikrolitrów wody i 10 mikrolitrów buforu ładującego 2xTBE do próbki mocznika 2xTBE w probówkach o pojemności 1,7 mililitra i przetrzyj go 10 razy w górę iw dół do ponownego rozpuszczenia. Podgrzewaj próbki w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie umieść probówki na lodzie przed załadowaniem do żelu. Załaduj 10 mikrolitrów próbki, która została umieszczona na lodzie, na 8% żel do sekwencjonowania poliakryloamidu.

Uruchom żel z mocą 65 watów przez dwie godziny lub do momentu, gdy dolny barwnik osiągnie 3/4 żelu. Usuń przekładkę i delikatnie włóż szpatułkę, aby usunąć górną płytkę ze szkła silikonowanego. Przykryj żel kawałkiem dużej bibuły filtracyjnej i delikatnie dociśnij, aby żel przylgnął do bibuły filtracyjnej.

Zaczynając od dolnego końca, podnieś bibułę filtracyjną i usuń żel ze szklanej płytki razem z bibułą. Po przeniesieniu żelu na papier pakowy, jak poprzednio, susz go w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez godzinę w próżni, upewniając się, że między żelem a suszarką używasz kilku bibuł filtracyjnych. Przenieś kanapkę z żelem na kasetę z fotobielonym luminoforem i wystawij radioaktywność żelu na ekran przez cztery do 16 godzin.

Na koniec umieść ekran pamięci luminoforu na urządzeniu do przetwarzania obrazu i skanuj w średniej rozdzielczości przez około 30 minut. Po wystawieniu poliakryloamidowego żelu sekwencjonującego na ekran magazynujący luminofor, udany eksperyment z kształtem wykazał pojedyncze i najbardziej intensywne zgięcie w górnej części żelu i zagięcia w całym żelu w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu bez rozmazywania. Żel wykazał również, że intensywność niektórych zagięć zmieniała się w obecności małych cząsteczek, co wskazuje na zmiany siły parowania zasad.

Częstym problemem w analizie strony jest to, że w środku żelu może pojawić się obszar rozmazu znany jako front soli, prawdopodobnie z powodu wysokiego stężenia soli, DMSO lub innej niepożądanej substancji w próbce ładującej. Można tego uniknąć, usuwając niepożądaną substancję przez wytrącanie etanolu. Jednorodna matryca RNA jest preferowana do kształtu in vitro.

Aby uzyskać takie RNA, używamy rybosomów zarówno na pięciu pierwszych, jak i trzech pierwszych końcach. Kształt wewnątrzkomórkowy można również wykonać w celu uzyskania struktury drugorzędowej RNA w kontekście komórkowym. Pamiętaj, że kształt in vitro może nie odzwierciedlać interakcji białek wiążących RNA in vivo.

Kształt in vitro to potężna metoda wykrywania zmian w strukturze RNA spowodowanych obecnością małej cząsteczki. Odbywa się to poprzez ilościowe określenie zmian w sile wzorca zatrzymania odwrotnej transkryptazy. Należy uważać, aby wszystkie eksperymenty opisane w tym filmie były wykonywane w autoryzowanym radioaktywnym miejscu pracy z odpowiednią ochroną osobistą i osłoną z pleksiglasu.