Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością
18 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.
Protokół ten pozwala naukowcom uzyskać wyraźne frakcje komórki bez użycia specjalistycznego sprzętu, drogich odczynników lub skomplikowanych technik. Podstawową zaletą tego protokołu jest prostota technik, które sprawiają, że jest on modyfikowalny i łatwy do wykonania. Procedurę zademonstrują Matt Deragon, Rob Haluska i Alexa Hodges.Troje doktorantów z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, odwiruj przygotowaną zawiesinę komórkową, aby utworzyć osad. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w PBS o temperaturze pokojowej. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 xg przez dziesięć minut. Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w lodowatym buforze. Przygotować roztwór buforu A zgodnie z protokołem tekstowym. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 xg przez dziesięć minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad w roztworze buforu A do końcowego stężenia 200 milionów komórek na ml i delikatnie odpipetować, aby rozbić wszelkie grudki. Następnie inkubować zawiesinę komórek na rotatorze na końcu nad końcem w temperaturze 4
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia wirowania przy wysokich prędkościach. Technika ta umożliwia oczyszczanie frakcji subkomórkowych do badań lokalizacji białek za pomocą immunoblotingu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biochemia
- Neuronauka
Wstęp
- Komórki U937 stanowią model do badania funkcji ludzkich monocytów.
- Izolacja komponentów subkomórkowych jest kluczowa dla zrozumienia procesów komórkowych.
- Tradycyjne metody często wykorzystują wirowanie przy wysokich prędkościach, co może być szkodliwe dla komórek.
- Niniejszy protokół ma na celu przedstawienie łagodniejszej alternatywy dla frakcjonowania subkomórkowego.
Cel badania
- Opracowanie protokołu izolacji składników komórkowych bez użycia wirowania przy wysokich prędkościach.
- Umożliwienie późniejszej analizy lokalizacji białek.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów komórkowych w komórkach U937.
Zastosowane metody
- Izolacja błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów.
- Zastosowanie specyficznych odczynników w celu ułatwienia frakcjonowania komórkowego.
- Immunoblotting w analizie lokalizacji białek.
- Porównanie wyników z metodami tradycyjnymi.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja frakcji subkomórkowych bez konieczności zastosowania wirowania przy wysokich prędkościach.
- Wyraźna wizualizacja lokalizacji białek za pomocą immunoblotingu.
- Wykazana efektywność i łagodność nowego protokołu.
- Potencjał do szerszych zastosowań w badaniach nad biologią komórki.
Wnioski
- Nowy protokół jest skuteczny w izolowaniu komponentów komórek U937.
- Stanowi on praktyczną alternatywę dla metod tradycyjnych.
- W przyszłych badaniach technika ta może zostać wykorzystana do różnych analiz komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia kosztowo efektywne frakcjonowanie subkomórkowe komórek U937 bez konieczności stosowania wirowania przy wysokich prędkościach, co wspiera walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Poprzez izolację frakcji cytoplazmy, mitochondriów i błony plazmatycznej przy użyciu dostępnych odczynników i sprzętu, metoda ta ułatwia badania lokalizacji białek, które są kluczowe dla wyjaśnienia szlaków sygnałowych i opracowania testów. Podejście to zmniejsza zależność od wyspecjalizowanej infrastruktury, zwiększając skalowalność i powtarzalność w procesach przedklinicznej oceny celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę subkomórkowej lokalizacji białek w ludzkim modelu monocytów, istotnym w badaniach nad immunologią i stanami zapalnymi.
- Wartość operacyjna: Stanowi łagodniejszą alternatywę dla ultrawirowania, zachowując integralność białek oraz tworzenie kompleksów, co jest kluczowe dla funkcjonalnej oceny celów molekularnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie zaangażowania konkretnych szlaków oraz sygnalizacji specyficznej dla poszczególnych przedziałów komórkowych w komórkach istotnych dla przebiegu choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych frakcji subkomórkowych odpowiednich do analiz opartych na immunoblottingu w celu oceny zaangażowania lub modulacji celu.
- Powtarzalność: Wykorzystuje standaryzowane warunki buforowe oraz etapy wirowania różnicowego, aby zapewnić spójne frakcjonowanie w różnych eksperymentach.
- Skalowalność: Protokół można dostosować do różnej liczby komórek, co umożliwia przygotowanie prób do przesiewania o średniej wydajności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Komórki U937 modelują funkcje ludzkich monocytów, umożliwiając translacyjne poszukiwanie biomarkerów w kontekście chorób zapalnych i zakaźnych.
- Ciągłość przedkliniczna: Wyizolowane frakcje wspierają późniejszą walidację lokalizacji celu oraz mechanizmu działania przed badaniami in vivo.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Ułatwia wczesną redukcję ryzyka związanego z celami terapeutycznymi poprzez potwierdzenie dostępności subkomórkowej i potencjału interakcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez frakcjonowanie biochemiczne przed przejściem do opracowania testów i oceny przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez poprzez frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyjaśnienia lokalizacji celu oraz zaangażowania szlaków w komórkach U937.
- Przesiewanie: Pozwala na otrzymywanie zestandaryzowanych frakcji cytoplazmatycznych, mitochondrialnych i błonowych dla wiarygodnych testów walidacji celu opartych na immunoblottingu.
- Analityka: Generuje ilościowe dane dotyczące lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu, co umożliwia porównanie rozkładu celu w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez potwierdzenie obecności celu w istotnych dla choroby przedziałach subkomórkowych w ludzkim modelu monocytów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania niskokosztowego frakcjonowania, które można zastosować dla wielu celów i projektów w badaniach nad immunologią i stanami zapalnymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki bezpośrednim dowodom na lokalizację subkomórkową.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność przeprowadzania ultrawirowania, co obniża koszty sprzętowe i zwiększa dostępność metody w ośrodkach badawczych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych, wiarygodnych danych na temat dostępności i kompartymentalizacji celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną lokalizację subkomórkową w fizjologicznie istotnym ludzkim modelu komórkowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach hodowli komórkowych, frakcjonowania subkomórkowego oraz immunoblottingu.
- Metoda zależy od dostępu do wirówek chłodzących, rotatorów oraz standardowych odczynników laboratoryjnych, takich jak digitonin i bufory hipotoniczne.
- Konieczna jest standaryzacja gęstości komórek, czasów inkubacji oraz warunków lizy w celu zapewnienia powtarzalności frakcjonowania pomiędzy użytkownikami.
- Adaptacja do innych typów komórek może wymagać optymalizacji składu buforu do lizy oraz parametrów wirowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość niepełnego oddzielenia organelli oraz zmienność wydajności w zależności od stanu zdrowia komórek i numeru pasażu.
