Name: Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę frakcjonowania komórek U937 bez wirowania z dużą prędkością, umożliwiającą izolację błony komórkowej, cytoplazmy i mitochondriów. Protokół ten pozwala na analizę lokalizacji białek metodą immunoblottingu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta przez NIH-1R15HL135675-01 do Timothy'ego J. LaRocca

1. Przygotowanie i odczynników
UWAGA: Zobacz Tabelę 1.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory buforu A, buforu do lizy B, buforu próbki i digitoniny.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor A, dodając 8,77 g NaCl i 50 ml HEPES (1 M, pH 7,4) do 900 ml wody dejonizowanej, dostosować końcową objętość do 1 l wodą dejonizowaną. 
		UWAGA: Stężenia końcowe to 150 mM NaCl i 50 mM HEPES.</li>
		<li>Przygotować bufor do lizy B, dodając 20 ml kwasu HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g KCl, 0,19 g MgCl2, 2 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (0,5 M EDTA), 2 ml glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (0,5 M EGTA), 38,26 g mannitolu i 23,96 g sacharozy do 900 ml wody dejonizowanej, dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą wody dejonizowanej. 
		UWAGA: Stężenia końcowe to 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol i 70 mM sacharozy.</li>
		<li>Przygotować bufor do próbki, dodając 0,01 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 10 ml soli fizjologicznej z tris-buforem (TBS) do końcowego stężenia 0,1% SDS.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy digitoniny, dodając 25 mg digitoniny do 100 ml wody dejonizowanej (końcowe stężenie wynosi 250 μg/ml).</li>
		<li>Przechowywać wszystkie roztwory buforowe w temperaturze 4 °C, a digitoninę w temperaturze -20 °C do czasu rozpoczęcia doświadczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować świeże roztwory inhibitorów proteazy i fosfatazy, które zostaną dodane do roztworów buforowych przed dodaniem do komórek.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF), dodając 17,4 mg PMSF do 1 ml 100% etanolu (końcowe stężenie wynosi 100 mM). 
		UWAGA: Nosić odpowiedni sprzęt ochronny i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z PMSF. PMSF jest niebezpieczny w przypadku spożycia i lekko niebezpieczny w przypadku kontaktu ze skórą (działanie drażniące), kontaktu z oczami (działanie drażniące) lub wdychanie; Działa żrąco na oczy i skórę.</li>
		<li>Przygotuj dostępny w handlu koktajl inhibitorów proteazy (100×) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy ortowanadanu sodu (SOV), dodając 92 mg SOV do 1 ml wody dejonizowanej (końcowe stężenie wynosi 500 mM). 
		UWAGA: Nosić odpowiedni sprzęt ochronny i zachować ostrożność podczas obsługi. SOV jest niebezpieczny w przypadku kontaktu z oczami (działa drażniąco), po spożyciu lub wdychaniu leku. Poważne nadmierne narażenie może spowodować śmierć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mycie PBS
<ol>
	<li>Zagęścić i przemyć komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przed frakcjonowaniem.
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek z odpowiednią prędkością, aby uzyskać osad. Na przykład odwirować zawiesinę komórek U937 o stężeniu 400 × g przez 10 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad komórek w PBS o temperaturze pokojowej o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml i delikatnie odpipetować, aby rozbić grudki.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 × g przez 10 minut w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym buforze A w końcowym stężeniu 2 × 107 komórek/ml. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie, a wszystkie powinny być wstępnie schłodzone.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja białka cytozolowego
<ol>
	<li>Ekstrahować białka cytozolowe przez inkubację z detergentem digitoniną.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed ponownym zawieszeniem komórek (etap 3.1.3) dodać 10 μl podstawowego PMSF (100 mM), 10 μl inhibitora proteazy (100×), 2 μl podstawowego SOV (500 mM) i 100 μl podstawowej digitoniny (250 μg/ml) do 878 μl buforu A (końcowe stężenie wynosi 1 mM PMSF, 1× inhibitor proteazy, 1 mM SOV i 25 μg/ml digitoniny; Dostosuj końcową głośność zgodnie z liczbą używanych komórek). Utrzymuj roztwór na lodzie do momentu dodania do osadu komórkowego.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek o masie 400 × g przez 10 minut i usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w roztworze buforowym A zawierającym inhibitory i digitoninę (przygotowanym w kroku 3.1.1) o końcowym stężeniu 2 × 107 komórek/ml, delikatnie odpipetować w celu rozbicia grudek.</li>
		<li>Inkubować zawiesinę komórek na rotatorze typu end -end w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 × g przez 10 minut. Zebrać supernatant i umieścić go w czystej probówce wirówkowej.</li>
		<li>Odwirować zebrany supernatant o stężeniu 18 000 × g przez 20 minut w celu osadzenia szczątków komórkowych.</li>
		<li>Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Powtarzać kroki 3.1.5 i 3.1.6 aż do momentu, gdy po odwirowaniu nie zostanie otrzymany osad</li>.
		<li>Zebrać supernatant zawierający białka cytozolowe i przechowywać go w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub -20 °C (długotrwale).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć nadmiar digitoniny i białek cytozolowych przez odwirowanie.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad komórkowy przesycony digitoniną (od kroku 3.1.5) w buforze A o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml i delikatnie odpipetować w celu rozbicia grudek.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową przepuszczalną digitoniną o stężeniu 400 × g przez 10 minut i usunąć supernatant. 
		UWAGA: Można wykonać wielokrotne płukanie w buforze A w celu usunięcia nadmiaru zanieczyszczeń cytozolowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Homogenizacja komórek
<ol>
	<li>Inkubować komórki na lodzie w buforze do lizy B i lizować je metodami mechanicznymi.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed ponownym zawieszeniem komórek (etap 4.1.2) dodać 10 μl podstawowego PMSF (100 mM) i 2 μl podstawowego SOV (500 mM) do 988 μl buforu do lizy B (końcowe stężenia to 1 mM PMSF i 1 mM SOV; dostosować końcową objętość do liczby komórek poddawanych lizie) i utrzymywać roztwór na lodzie do czasu dodania do osadu komórkowego.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy (z kroku 3.2.2) w lodowatym roztworze B buforu do lizy zawierającym PMSF i SOV (przygotowanym w kroku 4.1.1) w końcowym stężeniu 4 ×10,6 komórek/ml.</li>
		<li>Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórkową do wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce (z ciasno dopasowanym tłuczkiem B) na lodzie i wykonaj 40 przejść tłuczkiem homogenizatora, wykonując powolne, równomierne ruchy. 
		UWAGA: Alternatywnie można zastosować inne środki mechanicznej lizy komórek, jak opisano w sekcji dyskusji.</li>
		<li>Zebrać homogenat i przenieść go do czystej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Umyć tłuczek homogenizatora i probówkę niewielką objętością (1 do 2 ml) buforu do lizy B i dodać go do homogenatu.</li>
		<li>Odwirować homogenat o masie 400 × g (lub przy minimalnej prędkości wymaganej do osadzania nieuszkodzonych komórek) przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej. 
		Uwaga: Jeśli pozostanie znaczna ilość osadu, powtórz kroki od 4.1.4 do 4.1.6, aby zwiększyć wydajność frakcji, jak opisano w sekcji dyskusji. W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a homogenat przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki okres (24 godziny).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wirowanie różnicowe
<ol>
	<li>Odwirować homogenat ze zwiększoną prędkością, aby usunąć resztki komórkowe, wyizolować mitochondria i frakcje błonowe.
	<ol>
		<li>Odwirować sklarowany nad osadem (od etapu 4.1.8) w temperaturze 500 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.</li>
		<li>Odwirować supernatant (od kroku 5.1.1) w stężeniu 1 000 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.</li>
		<li>Odwirować sklarowany nad osadem (od etapu 5.1.2) w ilości 2 000 × g przez 10 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.</li>
		<li>Odwirować sklarowany nad osadem (z kroku 5.1.3) w temperaturze 4 000 × g przez 15 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej, przechowywać osad zawierający mitochondria.</li>
		<li>Zawiesić osad mitochondriów w małej objętości (0,5\u20121 ml) buforu do lizy B.</li>
		<li>Odwirować zawieszony osad o masie 4 000 × g przez 15 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad mitochondrialny w żądanej końcowej objętości buforu próbki (np. 250 do 500 μl, w zależności od wielkości osadu i pożądanego stężenia).</li>
		<li>Odwirować sklarowany nad osadem (od etapu 5.1.4) do 4 000 × g przez 15 minut. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej. Powtarzaj ten krok, aż po odwirowaniu nie uzyskasz osadu.</li>
		<li>Wirować supernatant w temperaturze 18 000 × g przez 3 godziny.</li>
		<li>Usunąć sklarowany osad i pozostawić osad zawierający białka błonowe. Zawiesić osad membranowy w małej objętości (0,5–1 ml) buforu do lizy B.</li>
		<li>Zawiesinę osadu odwirować w ilości 18 000 × g przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad membranowy w żądanej końcowej objętości buforu próbki (250 do 500 μl, w zależności od wielkości osadu i pożądanego stężenia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonikować osady próbki przez 3 s w łaźni lodowej przy ustawieniu mocy 5 (50% maksymalnej mocy 125 W przy 20 kHz, patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub -20 °C (długotrwale).</li>
	<li>Zbadaj próbki pod kątem czystości frakcjonowania, wykonując western blot z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko markerom białkowym znajdującym się w cytoplazmie, mitochondriach i przedziałach błonowych komórki (patrz sekcja dotycząca reprezentatywnych wyników).</li>
</ol>

<ol><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Hwang, S. II, Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers%3A+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li>
<li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li>
<li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li>
<li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li>
<li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li>
<li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum%2C+Mitochondria%2C+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).</li>
<li>Sundström, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+%28U-937%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAPDH+as+a+housekeeping+gene%3A+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li>
<li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li>
<li>Therien, aG., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li>
<li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li>
<li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55(2018).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenization+of+Mammalian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Opracowanie tego protokołu wynikało z niemożności oddzielenia próbek mitochondrialnych i błonowych, przy użyciu dostępnych na rynku zestawów, do analizy lokalizacji białek podczas nekroptozy14. Podstawowymi ograniczeniami gotowych zestawów jest brak możliwości dostosowania ich do potrzeb poszczególnych badaczy, koszt w przeliczeniu na próbkę oraz ograniczona liczba próbek, które można przetworzyć. Przedstawiona tu metoda może być wykonana bez użycia drogich odczynników i bez konieczności stosowani...

Niezawodna identyfikacja lokalizacji białek jest często konieczna podczas badania szlaków molekularnych w komórkach eukariotycznych. Metody uzyskiwania frakcji subkomórkowych są wykorzystywane przez naukowców do dokładniejszego zbadania składników komórkowych będących przedmiotem zainteresowania.
Większość istniejących metod frakcjonowania komórek generalnie dzieli się na dwie szerokie kategorie, detergent-based1,2 i ultrawirówkowanie3,4,5, które można rozróżnić na podstawie szybkości, precyzji i kosztów. Protokoły oparte na detergentach polegają na użyciu o rosnącej sile detergentu w celu rozpuszczania różnych składników komórki. Jest to szybka i wygodna metoda przetwarzania próbek i może być opłacalna, jeśli liczba i rozmiar próbek są małe. Zestawy na bazie detergentów można zakupić w celu wyizolowania frakcji cytoplazmatycznych, błonowych/organelli (frakcja mieszana) i jądrowych z komórek. Jednak kilka wad związanych z tymi zestawami ogranicza ich przydatność dla badaczy. Są one zaprojektowane tak, aby łatwo wyizolować jeden lub dwa składniki komórki, ale nie są w stanie wyizolować wszystkich frakcji z próbki jednocześnie. Stosowanie detergentów oznacza, że błona plazmatyczna i organelle otoczone błoną będą jednakowo rozpuszczone, a zatem nie będzie można ich od siebie oddzielić. Dodatkową komplikacją są zastrzeżone komponenty w tych zestawach, które uniemożliwiają badaczom zmianę warunków dla określonych zastosowań. Wreszcie, są one ograniczone pod względem liczby zastosowań i mogą być zbyt drogie w przypadku eksperymentów na większą skalę. Istnieją zestawy nieoparte na detergentach do izolacji mitochondriów, jednak nie są one przeznaczone do izolowania błony plazmatycznej, a wydajność próbki jest znacznie mniejsza niż w przypadku protokołów izolacji opartych na wirowaniu gęstości6,7.
Metody, które wykorzystują ultrawirowanie do uzyskania frakcji, są bardziej czasochłonne, ale często dają czystsze frakcje niż zestawy na bazie detergentów. Wyizolowanie błon plazmatycznych z komórek bez ich uprzedniej solubilizacji (co powoduje zanieczyszczenie organellami błonowymi) wymaga ich lizy metodą bez detergentów, a następnie oddzielenia składników komórkowych poprzez wirowanie różnicowe - przy czym izolacja błony plazmatycznej wymaga prędkości 100 000 × g. W wielu przypadkach po wirowaniu różnicowym musi nastąpić wirowanie w gradientzie gęstości izopikowej w celu dalszego oddzielenia frakcji komórkowych lub usunięcia zanieczyszczeń. Chociaż metody te są dokładne i modyfikowalne, wady obejmują koszty, czasochłonność i potrzebę ultrawirówki do oddzielania frakcji i dalszego oczyszczania za pomocą wirowania w gradicynie gęstości. Większość wirówek szybkoobrotowych ma koszt, który jest zaporowy dla indywidualnych badaczy i często są współdzielonym, podstawowym wyposażeniem w instytucjach akademickich. W związku z tym dostępność ultrawirówek staje się w takich sytuacjach zaporowa.
W tym protokole frakcjonowania demonstrujemy izolację frakcji subkomórkowych bez użycia detergentów rozpuszczających i bez wirowania z dużą prędkością. Metoda ta pozwoli naukowcom wyizolować błonę plazmatyczną, mitochondria i składniki cytoplazmatyczne komórki eukariotycznej przy minimalnym zanieczyszczeniu między frakcjami.

<table><tbody><tr><td>Digitonina</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0540</td><td>Do ekstrakcji cytoplazmowej</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td>Do buforu do lizy B</td></tr><tr><td>Homogenizator odbity</td><td>VWR</td><td>22877-282</td><td>Do homogenizacji</td></tr><tr><td>rotator end-over-end</td><td>Barnstead</td><td>N/A</td><td>Do ekstrakcji cytoplazmowej</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(&beta;-aminoetylowy eter)-N,N,N' ,Kwas N'-tetraoctowy (EGTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61721</td><td>Do buforu do lizy B</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>Do buforu do lizy B</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>2118</td><td>Do wykrywania frakcji cytoplazmatycznych na Western blot, rozcieńczenie: 1:10000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848</td><td>Do do lizy A i B</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Do buforu do lizy B</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>Do buforu do lizy B</td></tr><tr><td>Na, K-ATPaza a1 (D4Y7E)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>23565</td><td>Do wykrywania frakcji błony plazmatycznej na Western blot, rozcieńczenie: 1:1000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>Do buforu do lizy A</td></tr><tr><td>fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>VWR</td><td>M145</td><td>do ekstrakcji cytoplazmy i homogenizacji Sonda buforowa</td></tr><tr><td>sonikator</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td>do próbek końcowych</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy, ogólnego zastosowania</td><td>VWR</td><td>M221-1ML</td><td>do ekstrakcji cytoplazmy</td></tr> wirówka <tr><td>z chłodzeniem</td><td>Beckman-Coulter</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>VWR</td><td>227</td><td>Do buforu próbki</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu (SOV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td>Do do lizy A i B</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Do buforu do lizy B</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)</td><td>VWR</td><td>788</td><td>Do buforu próbki</td></tr><tr><td>VDAC (D73D12)</td><td>Technologie</td> <td>sygnalizacji komórkowej4661</td><td>Do wykrywania frakcji mitochondrialnych na Western blot, rozcieńczenie: 1:1000</td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie komórek u937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

W tym protokole szczegółowo opisujemy metodę uzyskiwania subkomórkowych frakcji komórek U937 bez użycia ultrawirowania czy bezkrytycznych detergentów. Metoda ta wykorzystuje hipotoniczne, digitoninę, lizę mechaniczną i wirowanie różnicowe w celu wyizolowania cytoplazmy, mitochondriów i błony plazmatycznej. Proces ten można skalować w celu dostosowania do potrzeb badaczy, jest niedrogi i prosty. Metoda ta pozwoli naukowcom określić lokalizację białek w komórkach bez specjalistycznych wirówek i bez użycia komercyjnych zestawów, które mogą być zbyt drogie. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę do separacji białek cytozolowych, błony plazmatycznej i mitochondriów w ludzkiej linii komórkowej monocytów U937.

Pomyślne frakcjonowanie nieróżnicujących się komórek U9378 hodowanych w zawiesinie zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem opisanym powyżej i zilustrowanym na Rysunku 1. Próbki otrzymane tą metodą poddano analizie western blotting9 z wykorzystaniem metody transferu mokrego na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF). Membranę poddano następnie inkubacji z przeciwciałami przeciwko markerom białkowym zlokalizo...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Protokół ten pozwala naukowcom uzyskać wyraźne frakcje komórki bez użycia specjalistycznego sprzętu, drogich odczynników lub skomplikowanych technik. Podstawową zaletą tego protokołu jest prostota technik, które sprawiają, że jest on modyfikowalny i łatwy do wykonania. Procedurę zademonstrują Matt Deragon, Rob Haluska i Alexa Hodges.Troje doktorantów z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, odwiruj przygotowaną zawiesinę komórkową, aby utworzyć osad. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w PBS o temperaturze pokojowej. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 xg przez dziesięć minut. Następnie usuń supernatant i ponownie zawiesić osad ogniwa w lodowatym buforze. Przygotować roztwór buforu A zgodnie z protokołem tekstowym. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 400 xg przez dziesięć minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad w roztworze buforu A do końcowego stężenia 200 milionów komórek na ml i delikatnie odpipetować, aby rozbić wszelkie grudki. Następnie inkubować zawiesinę komórek na rotatorze na końcu nad końcem w temperaturze 4

cell-fractionation-u937-cells-absence-high-speed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych, co jest metodą generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych. Frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne można wykorzystać do dalszej analizy.

Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych: metoda generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych

W tym filmie pokazujemy izolację komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z tkanki okrężnicy myszy poprzez trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy E i separacji gradientowej mediów do separacji gęstości opartej na krzemionce. Wyizolowane komórki jednojądrzaste można wykorzystać do dalszej analizy.

Izolacja komórek jednojądrzastych Lamina Propria: technika wirowania w gradiencie gęstości na bazie krzemionki w celu uzyskania komórek jednojądrzastych z mysiej okrężnicy

Film pokazuje izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z mózgu myszy za pomocą mechanicznej dysocjacji i trawienia enzymatycznego. Następnie następuje wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania komórek odpornościowych do dalszej analizy.

Izolowanie komórek odpornościowych naciekających nowotwór z mysiego mózgu

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Poznaj metodę frakcjonowania komórek U937 bez wirowania z dużą prędkością, umożliwiającą izolację błony komórkowej, cytoplazmy i mitochondriów. Protokół ten pozwala na analizę lokalizacji białek metodą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Przeglądaj więcej filmów