Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Istnieje zapotrzebowanie na dokładną i wysokoprzepustową metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących RSV, jako ważnego markera ochrony przed syncytialnym wirusem oddechowym. Metoda ta jest wysoce powtarzalna, a różnice między testami dla referencyjnej surowicy odpornościowej wynoszą mniej niż 10%Wierzymy, że test ten można łatwo ustalić w wielu laboratoriach na całym świecie przy stosunkowo niskich kosztach. Opisujemy tutaj test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, który został przetestowany na podgrupie A RSV i może być również dostosowany do podgrupy B RSV i różnych typów próbek.

Procedurę zademonstruje Reuben Tse, członek zespołu badawczego MCRI. Aby wysiać płytki pierwszego dnia, najpierw ponownie zawieś komórki A549 w pożywce DMEM, z 10% FCS i 1,000 jednostek mieszaniny penicyliny-streptomycyny w stężeniu 400 000 komórek na mililitr. Następnie wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem z 40 000 komórek A459 o gęstości 100 mikrolitrów na dołek.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez noc. Aby przygotować rozcieńczenie surowicy w drugim dniu, należy najpierw rozmrozić ludzką surowicę referencyjną RSV i próbki testowe surowicy w temperaturze pokojowej. Następnie umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza na 30 minut, aby je podgrzały i aktywowały.

Następnie przygotować więcej niż 110 mikrolitrów rozcieńczenia od jednego do 100 surowicy referencyjnej, mieszając 1,5 mikrolitra surowicy referencyjnej z pożywką DMEM wolną od FCS z mieszaniną penicyliny-streptomycyny do końcowej objętości 150 mikrolitrów. Odpipetować 110 mikrolitrów tego rozcieńczenia do dołka A12 z 96-dołkowej sterylnej płytki z dnem w kształcie litery U. Aby wykonać seryjne rozcieńczenia od jednego do dwóch w dół płytki, najpierw dodaj 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do studzienek od B12 do H12.

Następnie za pomocą nowej końcówki przenieś 55 mikrolitrów z dołka A12 do dołka B12. Pipetować w górę i w dół pięć razy, aby wymieszać roztwór, i kontynuuj, aż osiągniesz poziom H12. Odpipetować nadmiar 55 mikrolitrów roztworu ze studzienki H12.

Następnie należy przygotować rozcieńczenie od 1 do 100 próbek testowych surowicy i dodać 110 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do odpowiednich studzienek A1 do A9 i E1 do E9 96-dołkowej sterylnej płytki. Następnie dodać 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do studzienek w kolumnach od pierwszej do dziewiątej. Wykonać seryjne rozcieńczenia od jednego do dwóch rzędów A do rzędu D i od rzędu E do rzędu H, jak opisano poprzednio.

Dodać 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do studzienek w kolumnach 10 i 11. Aby przygotować zapas wirusa, najpierw umieść zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby szybko ją rozmrozić, a następnie umieść fiolkę na lodzie. Następnie dodać wirusa do pożywki DMEM zawierającej mieszaninę penicyliny i streptomycyny w ilości około 200 PFU na studzienkę, aby uzyskać całkowitą objętość 55 mililitrów na 100 dołków.

Aby przygotować mieszaninę surowicy wirusa, najpierw dodać 55 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek w kolumnach od pierwszej do dziewiątej i studzienek w wierszach od E do H w kolumnach 10 i 11. Następnie dodać 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do wszystkich studzienek rzędów od A do D kolumn 10 i 11 i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Przed inokulacją komórek A549 wirusem RSV należy zbadać płytkę komórkową pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy komórek A549 są w 80% zlewne.

Następnie delikatnie odwróć płytkę, aby wyrzucić nośnik, i delikatnie osusz płytkę na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym. Po każdym z nich przemyć przefiltrowanym sterylnym PBS. Następnie dodać 100 mikrolitrów mieszaniny surowicy wirusa na studzienkę do odpowiednich dołków na płytce komórkowej A549 zgodnie z szablonem płytki dostarczonym w manuskrypcie i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną godzinę.

Pod koniec inkubacji za pomocą pipety usunąć 90 mikrolitrów z dołka i dodać 100 mikrolitrów pożywki zawierającej 1XM199, 1,5% CMC i 2% FCS w mieszaninie penicyliny-streptomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Aby naprawić i rozwinąć płytkę testową, najpierw delikatnie odwróć płytkę komórkową A549 zakażoną RSV, aby wyrzucić pożywkę zawierającą M199, CMC, 2% FCS i mieszaninę penicyliny-streptomycyny.

Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów buforu utrwalającego do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie wyrzuć bufor utrwalający i delikatnie osusz chłonny ręcznik papierowy.

Pozostaw talerz do wyschnięcia ekranem do dołu na 10 minut. Następnie z przefiltrowanym buforem PBS zawierającym 05 polisorbat 20 przygotować 5% roztwór blokujący mleko. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji delikatnie odwrócić płytkę, aby wyrzucić roztwór i osuszyć chłonny ręcznik papierowy. Aby wytworzyć przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczyć od jednego do 500 kozich przeciwciał XRSV w roztworze blokującym. Dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Umyj płytkę trzykrotnie przefiltrowanym polisorbatem PBS. Następnie wytwórz przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając od jednego do 5 000 immunoglobuliny przeciw kozom osła Alexa Fluor w roztworze blokującym. Dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Umyć płytkę pięciokrotnie przefiltrowanym polisorbatem PBS. Aby policzyć tabliczki za pomocą automatycznego czytnika plamek, najpierw użyj nieużywanej 96-dołkowej płytki hodowlanej, aby współpracować z instrumentem, wprowadzając ustawienia zliczania w kanale FITC. Następnie przeczytaj płytkę komórki, zawiń ją w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie sprawdź obrazy studzienek pod kątem sztucznych blaszek lub przerwanych monowarstw komórek i wyklucz studzienki z przerwanymi monowarstwami komórek. Średnia liczba blaszek w studzienkach kontrolnych bez surowicy została obliczona i wykorzystana do wyznaczenia 50% granicy neutralizacji, która skutkowałaby 50% zahamowaniem aktywności wirusa. Wzajemne rozcieńczenie surowicy wykreślono na osi x, a liczbę blaszek na osi y wykresu półlogarytmicznego z linii narysowanej między dwoma punktami.

50% miana neutralizacji w próbkach surowicy testowej były czerwone i zidentyfikowano rozcieńczenia surowicy z liczbą bezpośrednio powyżej lub poniżej 50% wartości studzienek kontrolnych bez surowicy. Testy RSVAPRN w dwóch różnych kohortach dorosłych z Gambii i zdrowych ochotnikach w Melbourne wykazały, że dorośli Gambijczycy mieli niższe średnie miano NAB w porównaniu z dorosłymi z Melbourne. Pokazana ludzka surowica referencyjna RSV wykazuje bardzo niską zmienność ze współczynnikiem zmienności 6,82%Ten ulepszony, wysokowydajny test neutralizacji redukcji blaszek miażdżycowych RSV może być łatwo wdrożony w wielu laboratoriach i wesprze międzynarodowe wysiłki WHO na rzecz harmonizacji testów przeciwciał neutralizujących RSV.

Będzie to miało kluczowe znaczenie dla oceny nowych kandydatów na szczepionki przeciwko RSV w przyszłości.