Name: Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj ulepszony test mikroneutralizacji RSV oparty na obrazowaniu do pomiaru przeciwciał neutralizujących. Ta metoda jest wysoce powtarzalna, tania i łatwa do wdrożenia w różnych laboratoriach badawczych na całym świecie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim zaangażowanym uczestnikom. Przyjmujemy do wiadomości Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria. PVL jest stypendystą stypendium NHMRC Career Development Fellowship.

UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonane w okapie BSL2, chyba że zaznaczono inaczej. Miareczkowanie wirusa jest wymagane przed testem PRN w celu określenia optymalnego stężenia RSV stosowanego w teście PRN. Zaleca się podwielokrotnienie zapasów wirusa w małej objętości, która zostanie jednokrotnie rozmrożona i wykorzystana do każdego testu NAb. Zaleca się również stosowanie tego samego szczepu wirusa dla wszystkich testów NAb wykonanych dla wszystkich próbek z jednego badania. Upewnij się, że pożywki hodowlane i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) są podgrzane w temperaturze 37 °C przed dodaniem do płytek komórkowych.
1. Miareczkowanie wirusa RSV
UWAGA: W zależności od liczby zapasów wirusa i liczby duplikatów, płytka testowa może być ustawiona zgodnie z Rysunek 1. Każdy zapas wirusa powinien być miareczkowany trzykrotnie na płytce testowej, zaczynając od najwyższego stężenia wirusa (tj. 1:10). Miareczkowanie seryjne może wynosić zazwyczaj 1:10. Hodowla i utrzymanie komórek A549 oraz procedura hodowli RSV są wykonywane przy użyciu standardowych procedur i nie są objęte niniejszym protokołem.
<ol>
	<li>Talerze wysiewające (dzień 1) 
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki A549 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagles (DMEM) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1000 IU penicyliny/streptomycyny (pióro/paciorkowca) przy 4 x 105/ml. Wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem o pojemności 100 μl/basenik, zawierające 4 x 104 komórki A459.</li>
		<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (komórki będą w fazie logarytmicznej). 
		nuta: Użyć nowej fiolki z komórkami A549 po 23 pasażach. Zaleca się, aby nie rozpoczynać eksperymentów, gdy nowa fiolka z komórkami znajduje się jeszcze w pierwszych trzech pasażach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie wirusem (dzień 2) 
	<ol>
		<li>Przygotowanie seryjnego rozcieńczania wirusa
		<ol>
			<li>Szybko rozmrozić pojedynczą zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do prawie całkowitego rozmrożenia i natychmiast umieścić na lodzie. Przygotować 3 powtórzenia dla każdego stada wirusa RSV, które ma być oznaczone, użyć początkowego rozcieńczenia zapasu wirusa w stosunku 1:10 ze 100 μl rozcieńczonego wirusa/basenika i zarezerwować co najmniej jedną kolumnę do kontroli ujemnej. 
			UWAGA: <silna klasa="xfig">Rysunek 1 pokazuje kontrolę negatywną w trzech egzemplarzach.</li>
			<li>Dodać 100 μl każdego rozcieńczonego wirusa w stosunku 1:10 w trzech powtórzeniach rzędu A sterylnej płytki z 96-dołkowym dnem w kształcie litery U. Dodać 90 μl/basenik DMEM + 1000 j.m. długopisu/paciorkowca bez FCS do rzędów od B do H.</li>
			<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:10 w dół płytki, przenosząc 10 μl z rzędu A do rzędu B. Wymieszać roztwór, pipetując zawartość w górę i w dół 5 razy i kontynuować dziesięciokrotne rozcieńczenia aż do rzędu H. Wyrzucić ostatnie 10 μl, tak aby końcowa objętość w każdym studzience wynosiła 90 μL. 
			nuta: Ważne jest, aby używać nowych końcówek do każdego rozcieńczenia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inokulacja wirusa do komórek A549
		<ol>
			<li>Pobrać płytkę (płytki) komórkowe A549 przygotowaną poprzedniego dnia. Upewnij się, że monowarstwy komórek A549 w płytkach 96-dołkowych są w ~ 80% zlewne. Wyrzuć podłoże, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy.</li>
			<li>Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 100 μl PBS, wyrzuć nadmiar PBS, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy po każdym myciu. Nie dopuścić do wyschnięcia talerzy.</li>
			<li>Przenieś rozcieńczenia wirusa z płytki miareczkowania wirusa (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1) do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 1 godzinie inkubacji zdekantować supernatanty za pomocą pipety (aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego). Wyjmij 90 μl/studzienkę.</li>
			<li>Do każdej studzienki dodać 100 μL 1x pożywki 199 (M199, patrz tabela materiałów) + 1,5% sól sodowa karboksymetylocelulozy (CMC) o niskiej lepkości + 2% FCS zawierająca długopis/paciorkowiec. 
			UWAGA: 2x M199 + 4% FCS + 2% pen/strep i 3% CMC roztwory muszą być wcześniej przygotowane i przechowywane w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Upewnij się, że roztwór jest podgrzany w temperaturze 37 °C przed dodaniem do talerzy.
			<ol>
				<li>Przygotuj 2x roztwór M199: 1 saszetka/500 ml wody destylowanej + 20 ml FCS + 10 ml wstrzykiwacza/paciorkowca (do uzupełnienia 2x MI99). Przefiltruj roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm.</li>
				<li>W celu przygotowania 3% CMC, powoli dodawać 15 g CMC do 500 ml wody destylowanej. Rozpuścić CMC w wodzie za pomocą metalowego mieszadła o temperaturze 50 °C, co zajmuje około 1 godziny przygotowania. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać 3% CMC i autoklawuj roztwór. 
				nuta: Ciało stałe CMC musi zostać dodane do wody w celu rozpuszczenia; Dodanie wody do suchej bryły tworzy "grudkę" ciała stałego, która jest bardzo trudna do rozpuszczenia.</li>
				<li>Przygotować 1x M199 + 1,5% CMC o niskiej lepkości + 2% FCS zawierający wstrzykiwacz/paciorkowiec, mieszając 1:1 2x M199 i 3% CMC przygotowanych w kroku 1.2.2.4.2.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Inkubować płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie płytki testowej i analiza (dzień 5)
	<ol>
		<li>Utrwalanie i wywoływanie płytki testowej
		<ol>
			<li>Odrzucić M199 + CMC + 2% FCS zawierające wstrzykiwacz/paciorkowiec, delikatnie odwracając płytkę. Dodawać powoli (w celu uniknięcia naruszenia warstwy komórkowej) 200 μl buforu utrwalającego (80% acetonu, 20% PBS, przechowywanego w temperaturze -20 °C) w celu utrwalenia komórek. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 20 minut.</li>
			<li>Wyrzuć bufor utrwalający i delikatnie osusz chłonny ręcznik papierowy. Pozostaw talerz do wyschnięcia stroną zadrukowaną do dołu na 10 minut. 
			nuta: Od tego kroku test można przeprowadzić na zewnątrz okapu BSL2.</li>
			<li>Przygotować 5% roztwór blokujący rozcieńczalnik do mleka w przefiltrowanym PBS zawierającym 0,05% polisorbatu 20 (PBS-polisorbat, patrz Tabela Materiałów). Dla jednej płytki oblicz objętość potrzebną do zablokowania na podstawie 200 / studzienka i 110 dołków: 200 / studzienka x 110 dołków = 22 ml (1,1 ml skoncentrowanego rozcieńczalnika do mleka w 20,9 ml przefiltrowanego polisorbatu PBS). Na tym etapie należy również przygotować wystarczającą ilość roztworu blokującego dla przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Dla jednej płytki oblicz objętość potrzebną dla każdego roztworu przeciwciała na podstawie 50 / studzienki i 110 dołków: 50 / studzienka x 110 dołków = 5,5 ml. W związku z tym całkowita objętość roztworu blokującego rozcieńczalnik do mleka wymagana do testu na pojedynczej płytce wynosi 33 ml.</li>
			<li>Dodać 200 / studzienkę roztworu blokującego. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut. Wylej roztwór, delikatnie odwracając płytkę i osuszając chłonny ręcznik papierowy.</li>
			<li>Przygotować przeciwciało 1:500 Goat X RSV (mAb – przeciwciało pierwszorzędowe) rozcieńczone w roztworze blokującym. Dodać 50 /basenik roztworu mAb i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Umyj płytkę 3 razy przefiltrowanym polisorbatem PBS.</li>
			<li>Przygotuj 1:5 000 Alexa-Fluor anty-kozi IgG (przeciwciało drugorzędowe) rozcieńczone w roztworze blokującym. Dodać 50 baseników roztworu przeciwciał drugorzędowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Umyj płytkę 5 razy przefiltrowanym polisorbatem PBS.</li>
			<li>Odczyt płytki na automatycznym czytniku punktowym przy użyciu kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i ustawień zliczania, jak pokazano w Rysunek 2. Owinąć płytkę w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C. Skalibrować przyrząd przy użyciu nieużywanej 96-dołkowej płytki hodowlanej i wprowadzić ustawienia liczby przed testem. 
			nuta: W razie potrzeby możliwe jest ponowne skanowanie w ciągu kilku dni. Ustawienia kalibracji i zliczania można zapisać i wykorzystać do przyszłego skanowania, jeśli test wykorzystuje ten sam typ płytki, który został użyty do kalibracji.</li>
			<li>Sprawdź zdjęcia studni pod kątem płytek artefaktów lub uszkodzonych monowarstw komórkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Wyklucz studzienki z przerwanymi monowarstwami komórek. 
			nuta: W zależności od wielkości tabliczek z artefaktami, może być konieczne ręczne zliczanie tych studni lub może być konieczne odrzucenie tych studni z analizy danych. Kryteria prawidłowego wyniku obejmują brak wykrytych uszkodzonych monowarstwowych komórek lub płytek artefaktów w więcej niż jednym dołku replikacji oraz brak PFU wykrytego w dołkach ujemnych (studzienkach bez dodatku wirusa).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określanie stężeń wirusa 
		<ol>
			<li>Wybierz dwa ostatnie rozcieńczenia, w których plamy można wyraźnie policzyć. Obliczyć średnią liczbę plamek z powtórzonych studzienek przy tym samym rozcieńczeniu. Obliczyć miano wirusa (PFU na ml) próbki podstawowej, korzystając z poniższego wzoru: 
			PFU/ml = średnia liczba blaszek/(współczynnik rozcieńczenia × objętość rozcieńczonego wirusa dodanego do studzienki) 
			UWAGA: Stężenie wirusa określone dla każdego stada RSV można teraz wykorzystać w teście PRN (krok 2).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test neutralizacji RSV
<ol>
	<li>Talerze wysiewające (dzień 1)
	<ol>
		<li>Ponownie zawieś komórki A549 w DMEM + 10% FCS + 1000 IU długopis/paciorkowiec przy 4 x 105/ml. Wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem o stężeniu 100 μl/basenik zawierające 4 x 104 komórki A459 i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (komórki będą w fazie logarytmicznej wzrostu). 
		nuta: Użyć nowej fiolki z komórkami A549 po 23 pasażach. Nie zaleca się stosowania komórek A549 przed pasażem numer 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wirusa i surowicy (dzień 2) 
	nuta: W zależności od rodzaju próbki wymagane są etapy wstępnego przetwarzania próbek przed testem NAb. Zaleca się stosowanie międzynarodowych standardowych surowic RSV, które są obecnie dostępne na żądanie w Narodowym Instytucie Norm Biologicznych i Kontroli (NIBSC).
	<ol>
		<li>Przygotowanie rozcieńczenia surowicy
		<ol>
			<li>Rozmrozić ludzką referencyjną surowicę odpornościową przeciwko wirusowi RSV (surowicę referencyjną, REF) i próbki testowe surowicy w temperaturze pokojowej. Próbki surowicy i surowicę referencyjną należy inaktywować termicznie w łaźni wodnej w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed użyciem. Przygotuj rozcieńczenia zgodnie z szablonem płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
			<li>Przygotować rozcieńczenie REF w stosunku 1:100. Przygotować co najmniej 110 μl REF rozcieńczonego w DMEM + długopis/paciorkowiec bez FCS na płytkę testową (np. 1,5 μl REF w całkowitej objętości 150 μL). Dodać 110 μl rozcieńczonego REF w stosunku 1:100 do dołka A12 sterylnej płytki z 96-dołkowym dnem w kształcie litery U.</li>
			<li>Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do studzienek B12 do H12 w kolumnie 12. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 w dół płytki, przenosząc 55 μl z rzędu A do rzędu B, mieszając roztwór przez pipetowanie zawartości w górę i w dół 5 razy i kontynuując do rzędu H. Odrzucić ostatnie 55 μl pożywki, tak aby końcowa objętość w każdym dołku wynosiła 55 μl. Do każdego rozcieńczenia należy stosować nowe końcówki.</li>
			<li>Przygotować próbki do badania surowicy w rozcieńczeniu 1:100. Ponieważ wszystkie próbki surowicy są oznaczane w trzech egzemplarzach, należy przygotować minimalną objętość 110 μl/basenik x 3 = 330 μl na próbkę testową surowicy.</li>
			<li>Dodać 110 μl każdej rozcieńczonej próbki testowej surowicy (1:100; S1 = surowica 1, S2 = surowica 2 itd.) do odpowiednich dołków od A1 do A9, a także od E1 do E9 96-dołkowej sterylnej płytki zgodnie z Rysunek 4.</li>
			<li>Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do wszystkich studzienek oznaczonych X. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 zgodnie z krokiem 2.2.1.3 do rzędu D (dla próbek 1, 2 i 3). Odrzucić ostatnie 55 μl pożywki, tak aby końcowa objętość w każdym studzience wynosiła 55 μl. Podobnie przeprowadzić seryjne rozcieńczenia 1:2 dla próbek 4, 5 i 6 dla rzędów od E do H. 
			nuta: Ważne jest, aby używać nowych końcówek do każdego rozcieńczenia.</li>
			<li>Dodać 55 μl DMEM + wstrzykiwacz/paciorkowiec bez FCS do studzienek w kolumnach 10 i 11.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie wirusa
		<ol>
			<li>Szybko rozmrozić pojedynczą zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do prawie całkowitego rozmrożenia i natychmiast umieścić na lodzie. </li>
			<li>Rozcieńczyć wirusa w DMEM + długopisie/paciorkowca bez FCS w oparciu o stężenie podwielokrotności RSV określone w kroku 1.3.2. Zastosować rozcieńczenie, które daje około 200 PFU/studzienkę. Przygotuj całkowitą objętość 5,5 ml (na 100 dołków).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie mieszaniny wirusa i surowicy
		<ol>
			<li>Dodać 55 rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek w kolumnach 1-9 i studzienek w rzędach E-H w kolumnach 10 i 11 (kontrola dodatnia) zgodnie z szablonem płytki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
			<li>Dodać 55 DMEM + długopis/paciorkowiec bez FCS do wszystkich studzienek w wierszach A-D kolumn 10 i 11 (kontrola ujemna). Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inokulacja wirusa do komórek A549
		<ol>
			<li>Przed zakończeniem okresu inkubacji pobrać płytkę (płytki) komórkowe A549 przygotowane w kroku 2.1.1. Upewnij się, że monowarstwy komórek A549 w płytkach 96-dołkowych są w ~ 80% zlewne.</li>
			<li>Wyrzuć podłoże, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy. Umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 100 μl PBS, wyrzuć nadmiar PBS, delikatnie odwracając płytkę i lekko osuszając sterylny, chłonny ręcznik papierowy po każdym myciu. Nie dopuścić do wyschnięcia talerzy.</li>
			<li>Przenieść 100 / basenik mieszaniny wirus-surowica do odpowiednich studzienek na płytce komórkowej A549 zgodnie z szablonem płytki Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
			<li>Po 1 godzinie, za pomocą pipety, wyjąć 90 / studzienka i dodać 100 wstępnie podgrzanego 1x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + wstrzykiwacz/paciorkowiec. Inkubować płytkę przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
			nuta: Upewnij się, że roztwór jest podgrzany w temperaturze 37 °C przed dodaniem do talerzy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opracowanie płytki testowej i analiza (dzień 5) 
	<ol>
		<li>Sporządzić płytkę mocującą i oznaczającą, wykonując czynności od 1.3.1.1 do 1.3.1.8.</li>
		<li>Określ 50% miano neutralizacji
		<ol>
			<li>Oznaczyć 50% miano neutralizacji, obliczając proporcjonalną odległość między wzajemnymi rozcieńczeniami surowicy powyżej i poniżej 50% studzienek kontrolnych "bez surowicy" (dodatnia kontrola wirusa - kolumna 10, wiersze E-H).</li>
			<li>Policz liczbę PFU (tj. blaszek miażdżycowych) powstałych w wyniku poszczególnych infekcji wirusowych w studzienkach surowicy i bez studzienek kontrolnych surowicy. Obliczyć średnią liczbę PFU w studzienkach kontrolnych bez surowicy i określić wartość 50%.</li>
			<li>Zidentyfikować rozcieńczenia surowicy z liczbami, które są bezpośrednio powyżej i poniżej 50% wartości studzienki kontrolnej bez surowicy. Korzystając z wykresu półlogarytmicznego lub szablonu arkusza kalkulacyjnego, wykreśl liczbę PFU na osi x (skala liniowa) i odwrotne rozcieńczenie surowicy na osi y (skala logarytmu10). Narysuj linię między tymi dwoma punktami i odczytaj 50% miano neutralizacji próbek surowicy testowej z tej linii. 
			nuta: Arkusz testu RSV PRN (arkusz uzupełniający) służy do określenia 50% miana neutralizacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015%3A+a+systematic+review+and+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li>
<li>Modjarrad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine+Development+Report+from+a+World+Health+Organization+Meeting+held+on+23-24+March+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015.</a> Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).</li>
<li>Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+WHO+consultation+on+Respiratory+Syncytial+Virus+%28RSV%29+vaccine+development%2C+Geneva%2C+25-26+April+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016.</a> Vaccine. , (2017).</li>
<li>Mazur, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+syncytial+virus+vaccine+landscape%3A+lessons+from+the+graveyard+and+promising+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates.</a> Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).</li>
<li>Hosken, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+study+of+diverse+RSV+neutralization+assays+indicates+feasibility+for+harmonization+with+an+international+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard.</a> Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).</li>
<li>Zielinska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+microneutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+by+automated+plaque+counting+using+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis.</a> Virology Journal. 2, 84(2005).</li>
<li>van Remmerden, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+respiratory+syncytial+virus+neutralization+assay+based+on+the+detection+of+green+fluorescent+protein+expression+and+automated+plaque+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting.</a> Virology Journal. 9, 253(2012).</li>
<li>Varada, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutralization+assay+for+respiratory+syncytial+virus+using+a+quantitative+PCR-based+endpoint+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment.</a> Virology Journal. 10, 195(2013).</li>
<li>Tripp, R. A., Jorquera, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTripp%2C+RA+%22Human+respiratory+syncytial+virus%3A+methods+and+protocols%22">Human respiratory syncytial virus: methods and protocols</a>. , Humana Press. (2016).</li>
<li>Suara, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+neutralizing+antibody+to+respiratory+syncytial+virus+in+sera+from+mothers+and+newborns+residing+in+the+Gambia+and+in+The+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).</li>
<li>McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y">http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y</a> (2017).</li>
<li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutralizing+serum+antibodies+of+patients+vaccinated+with+human+papillomavirus+L1+or+L2-based+immunogens+using+furin-cleaved+HPV+Pseudovirions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions.</a> PLoS One. 9 (7), e101576(2014).</li>
<li>Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+resistance+to+neutralizing+antibodies%3A+Determination+of+antibody+concentrations+leading+to+escape+mutant+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution.</a> Virus Research. 218, 57-70 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy prosty i skuteczny test mikroneutralizacji RSV, który można łatwo dostosować do większości laboratoriów. Test ten jest w stanie zmierzyć zdolność infekcji wirusowej, a także zmierzyć hamowanie infekcji wirusowej przez NAb na poziomie komórkowym za pomocą skomputeryzowanego skanowania obrazu. Zastosowanie platformy obrazowania i specyficznych systemów opartych na przeciwciałach zwiększyło swoistość i czułość wykrywania plamek w porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania blaszek miażdż...

Syncytialny wirus oddechowy (RSV) jest główną przyczyną infekcji dolnych dróg oddechowych w populacji pediatrycznej na całym świecie1. Pomimo dużego obciążenia nadal nie ma dostępnej szczepionki ani leczenia. Od 2013 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała opracowanie szczepionki przeciwko RSV za główny priorytet badawczy, organizując coroczne spotkania konsultacyjne WHO2,3. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zgodziła się na wykorzystanie pomiaru przeciwciał neutralizujących RSV (NAb) do monitorowania immunogenności szczepionki, ponieważ jest ona uznawana za główny serologiczny marker ochrony4. W wielu badaniach, jak również w próbach klinicznych wykazano, że NAb chronią przed ciężkim zakażeniem RSV przeciwciałem monoklonalnym paliwizumabem, obecnie jedyną dostępną strategią profilaktyczną4.
Istnieje wiele formatów testów NAb używanych przez laboratoria na całym świecie, w tym testy komórkowe i molekularne, które utrudniły standaryzację5,6,7,8. Jednak konwencjonalny test neutralizacji z redukcją blaszki miażdżycowej (PRN), który mierzy liczbę zredukowanych jednostek tworzących płytki miażdżycowej (PFU) na podstawie obecności przeciwciała specyficznego dla RSV, nadal pozostaje złotym standardem9. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony, uproszczony i wysokoprzepustowy protokół PRN, który może być stosowany na wielu liniach komórkowych, dla różnych szczepów RSV i przy zwiększonej przepustowości testów. Protokół ten został przetestowany przy użyciu próbek klinicznych z różnych środowisk, a także na próbkach z eksperymentów na modelach zwierzęcych.

<table><tbody><tr><td>Cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>dostarczone przez dr Keitha Chappella, University of Queensland</td></tr><tr><td>Szczepy wirusowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RSV A2</td><td>ATCC</td><td>VR-1540</td><td>numer partii 60430286</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>1000142511</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor osła anty-kozioł IgG (przechowywany w temperaturze 4 & C)</td> <td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>CMC sól sodowa w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (bez surowicy, 3,7 g / L NaHC, P / S) (przechowywana w temperaturze 4 & stopni; C)</td> <td>Usługi naukowe &ndash; Posiew</td><td></td><td>tkankowy MCRI w domu</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (przechowywana w 50 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 & deg; C)</td> <td>Międzyścieżkowe</td><td>przeciwciało SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>Goat X RSV</td><td>Merck</td><td>AB1128</td><td></td></tr><tr><td>ludzka surowica poliklonalna przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV) (przechowywana w 45 &mikro; L podwielokrotności przy -20 &deg; C)</td> <td>BEI Resources</td><td>NR-4022</td><td>Bezpłatne zamówienie za pośrednictwem BEI Resources po rejestracji. Surowica ta należy do panelu ludzkiej surowicy przeciw i immunoglobuliny do RSV (NR-32832)</td></tr> <tr><td>M199 w proszku</td><td>Life Technologies</td><td>31100035</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący rozcieńczalnik do mleka (przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C)</td> <td>Australian Biosearch</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (przechowywana w 6 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 & deg; C)</td> <td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>s.d.H2O z dozownika Milli-Q</td><td>Merck</td><td></td><td>Dyspensa wewnętrzna</td></tr><tr><td>Sterylny 1x PBS do hodowli (przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C)</td> <td>Usługi naukowe &ndash; Hodowla</td><td></td><td>tkankowa MCRI w domu Tween</td></tr><tr><td>20 polisorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Ogólne materiały eksploatacyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki Falcon (50 ml)</td><td>Invitro Technologies</td><td>FAL352070</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca 0,22 &mu; m (500 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL5660020</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Eppendorf (1,5 ml)</td><td>Australia PL</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki z płaskim dnem (96-dołkowe z pokrywką)</td><td>Interpath</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki dolne w kształcie litery U (96-dołkowe z pokrywką)</td><td>Pipeta</td> serologiczna Interpath <td>650180</td><td></td></tr><tr>5<td>ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>Interpath</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta z końcówką 1-200 &micro; L Clear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowane 10 STOJAKÓW x 96 KOŃCÓWEK PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-200-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta z końcówką 5-20 i mikro; L Clear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowane 10 STOJAKÓW x 96 KOŃCÓWEK PKG960</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-20-L-R-S</td> Pipeta z końcówką <td></td></tr><tr><td>100-1,000 i mikro; LClear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowane 10RACKS x 100TIPS PKG1000</td><td>Fisher Biotec</td><td>TF-1000-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta z końcówką 1-10 i mikro; L Clear Maxymum Recovery Racked Wstępnie sterylizowany 10RACKS x 100TIPS PKG1001</td><td>Fisher Biotec</td><td>TXLF-10-L-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt i oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>System czytników ELISpot</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie AID ELISpot w wersji 5.0</td><td>AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Program Microsoft Excel 2007</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (rsv)

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Przeciwciała neutralizujące specyficzne dla syncytialnego wirusa oddechowego (NAbs RSV) są ważnym markerem ochrony przed RSV. Obecnie na całym świecie stosuje się wiele różnych formatów testów, dlatego istnieje zapotrzebowanie na dokładną i wysokowydajną metodę pomiaru NAb RSV. Opisujemy tutaj test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, który został przetestowany na podgrupie A RSV i może być również dostosowany do podgrupy B RSV i różnych typów próbek. Metoda ta jest wysoce powtarzalna, a różnice między testami dla referencyjnej surowicy odpornościowej są mniejsze niż 10%. Wierzymy, że ten test można łatwo wprowadzić do wielu laboratoriów na całym świecie przy stosunkowo niskich kosztach. Opracowanie ulepszonego, wysokoprzepustowego testu, który mierzy NAbs wirusa RSV, stanowi znaczący krok naprzód w standaryzacji tej metody na arenie międzynarodowej, a także ma kluczowe znaczenie dla oceny nowych kandydatów na szczepionki przeciwko RSV w przyszłości.

Miareczkowanie zapasu wirusa przeprowadzono w zakresie rozcieńczeń od 1:10 do 1:108 w celu określenia stężenia zapasu wirusa przed testem PRN (reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 5). Z Rysunku 5 wynika, że PFU można wiarygodnie policzyć przy rozcieńczeniach 1:104 i 1:105. Obliczono średnią liczbę PFU z trzech powtórzeń w tym samym rozcieńczeniu. Ponieważ średnia liczba plamek przy roz...

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

Istnieje zapotrzebowanie na dokładną i wysokoprzepustową metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących RSV, jako ważnego markera ochrony przed syncytialnym wirusem oddechowym. Metoda ta jest wysoce powtarzalna, a różnice między testami dla referencyjnej surowicy odpornościowej wynoszą mniej niż 10%Wierzymy, że test ten można łatwo ustalić w wielu laboratoriach na całym świecie przy stosunkowo niskich kosztach. Opisujemy tutaj test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, który został przetestowany na podgrupie A RSV i może być również dostosowany do podgrupy B RSV i różnych typów próbek.Procedurę zademonstruje Reuben Tse, członek zespołu badawczego MCRI. Aby wysiać płytki pierwszego dnia, najpierw ponownie zawieś komórki A549 w pożywce DMEM, z 10% FCS i 1,000 jednostek mieszaniny penicyliny-streptomycyny w stężeniu 400 000 komórek na mililitr. Następnie wysiewaj 96-dołkowe sterylne płytki z płaskim dnem z 40 000 komórek A459 o gęstości 100 mikrolitrów na dołek.Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez noc. Aby przygotować rozcieńczenie surowicy w drugim dniu, należy najpierw rozmrozić ludzką surowicę referencyjną RSV i próbki testowe surowicy w temperaturze pokojowej. Następnie umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 56 stopni Celsjusza na 30 minut, aby je podgrzały i aktywowały.Następnie przygotować więcej niż 110 mikrolitrów rozcieńczenia od jednego do 100 surowicy referencyjnej, mieszając 1,5 mikrolitra surowicy referencyjnej z pożywką DMEM wolną od FCS z mieszaniną penicyliny-streptomycyny do końcowej objętości 150 mikrolitrów. Odpipetować 110 mikrolitrów tego rozcieńczenia do dołka A12 z 96-dołkowej sterylnej płytki z dnem w kształcie litery U. Aby wykonać seryjne rozcieńczenia od jednego do dwóch w dół płytki, najpierw dodaj 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do studzienek od B12 do H12.Następnie za pomocą nowej końcówki przenieś 55 mikrolitrów z dołka A12 do dołka B12. Pipetować w górę i w dół pięć razy, aby wymieszać roztwór, i kontynuuj, aż osiągniesz poziom H12. Odpipetować nadmiar 55 mikrolitrów roztworu ze studzienki H12.Następnie należy przygotować rozcieńczenie od 1 do 100 próbek testowych surowicy i dodać 110 mikrolitrów każdego rozcieńczenia do odpowiednich studzienek A1 do A9 i E1 do E9 96-dołkowej sterylnej płytki. Następnie dodać 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do studzienek w kolumnach od pierwszej do dziewiątej. Wykonać seryjne rozcieńczenia od jednego do dwóch rzędów A do rzędu D i od rzędu E do rzędu H, jak opisano poprzednio.Dodać 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do studzienek w kolumnach 10 i 11. Aby przygotować zapas wirusa, najpierw umieść zamrożoną fiolkę z RSV w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby szybko ją rozmrozić, a następnie umieść fiolkę na lodzie. Następnie dodać wirusa do pożywki DMEM zawierającej mieszaninę penicyliny i streptomycyny w ilości około 200 PFU na studzienkę, aby uzyskać całkowitą objętość 55 mililitrów na 100 dołków.Aby przygotować mieszaninę surowicy wirusa, najpierw dodać 55 mikrolitrów rozcieńczonego wirusa do wszystkich studzienek w kolumnach od pierwszej do dziewiątej i studzienek w wierszach od E do H w kolumnach 10 i 11. Następnie dodać 55 mikrolitrów pożywki DMEM wolnej od FCS z mieszaniną penicyliny i streptomycyny do wszystkich studzienek rzędów od A do D kolumn 10 i 11 i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% dwutlenku węgla przez godzinę. Przed inokulacją komórek A549 wirusem RSV należy zbadać płytkę komórkową pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że monowarstwy komórek A549 są w 80% zlewne.Następnie delikatnie odwróć płytkę, aby wyrzucić nośnik, i delikatnie osusz płytkę na sterylnym, chłonnym ręczniku papierowym. Po każdym z nich przemyć przefiltrowanym sterylnym PBS. Następnie dodać 100 mikrolitrów mieszaniny surowicy wirusa na studzienkę do odpowiednich dołków na płytce komórkowej A549 zgodnie z szablonem płytki dostarczonym w manuskrypcie i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jedną godzinę.Pod koniec inkubacji za pomocą pipety usunąć 90 mikrolitrów z dołka i dodać 100 mikrolitrów pożywki zawierającej 1XM199, 1,5% CMC i 2% FCS w mieszaninie penicyliny-streptomycyny. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Aby naprawić i rozwinąć płytkę testową, najpierw delikatnie odwróć płytkę komórkową A549 zakażoną RSV, aby wyrzucić pożywkę zawierającą M199, CMC, 2% FCS i mieszaninę penicyliny-streptomycyny.Następnie powoli dodaj 200 mikrolitrów buforu utrwalającego do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie wyrzuć bufor utrwalający i delikatnie osusz chłonny ręcznik papierowy.Pozostaw talerz do wyschnięcia ekranem do dołu na 10 minut. Następnie z przefiltrowanym buforem PBS zawierającym 05 polisorbat 20 przygotować 5% roztwór blokujący mleko. Dodaj 200 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Pod koniec inkubacji delikatnie odwrócić płytkę, aby wyrzucić roztwór i osuszyć chłonny ręcznik papierowy. Aby wytworzyć przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczyć od jednego do 500 kozich przeciwciał XRSV w roztworze blokującym. Dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Umyj płytkę trzykrotnie przefiltrowanym polisorbatem PBS. Następnie wytwórz przeciwciało drugorzędowe, rozcieńczając od jednego do 5 000 immunoglobuliny przeciw kozom osła Alexa Fluor w roztworze blokującym. Dodaj 50 mikrolitrów do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Umyć płytkę pięciokrotnie przefiltrowanym polisorbatem PBS. Aby policzyć tabliczki za pomocą automatycznego czytnika plamek, najpierw użyj nieużywanej 96-dołkowej płytki hodowlanej, aby współpracować z instrumentem, wprowadzając ustawienia zliczania w kanale FITC. Następnie przeczytaj płytkę komórki, zawiń ją w folię i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie sprawdź obrazy studzienek pod kątem sztucznych blaszek lub przerwanych monowarstw komórek i wyklucz studzienki z przerwanymi monowarstwami komórek. Średnia liczba blaszek w studzienkach kontrolnych bez surowicy została obliczona i wykorzystana do wyznaczenia 50% granicy neutralizacji, która skutkowałaby 50% zahamowaniem aktywności wirusa. Wzajemne rozcieńczenie surowicy wykreślono na osi x, a liczbę blaszek na osi y wykresu półlogarytmicznego z linii narysowanej między dwoma punktami.50% miana neutralizacji w próbkach surowicy testowej były czerwone i zidentyfikowano rozcieńczenia surowicy z liczbą bezpośrednio powyżej lub poniżej 50% wartości studzienek kontrolnych bez surowicy. Testy RSVAPRN w dwóch różnych kohortach dorosłych z Gambii i zdrowych ochotnikach w Melbourne wykazały, że dorośli Gambijczycy mieli niższe średnie miano NAB w porównaniu z dorosłymi z Melbourne. Pokazana ludzka surowica referencyjna RSV wykazuje bardzo niską zmienność ze współczynnikiem zmienności 6,82%Ten ulepszony, wysokowydajny test neutralizacji redukcji blaszek miażdżycowych RSV może być łatwo wdrożony w wielu laboratoriach i wesprze międzynarodowe wysiłki WHO na rzecz harmonizacji testów przeciwciał neutralizujących RSV.Będzie to miało kluczowe znaczenie dla oceny nowych kandydatów na szczepionki przeciwko RSV w przyszłości.

an-improved-high-throughput-respiratory-syncytial-virus-rsv-micro

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje ogólną procedurę badania subunitowych szczepionek opartych na rekombinowanym domenie wiążącej receptor (RBD) przeciwko SARS. Obejmuje on metody transfekcji i ekspresji białka RBD w komórkach 293T, immunizację myszy białkiem RBD oraz wykrywanie aktywności neutralizacji w surowicach mysich przy użyciu uznanego testu neutralizacji pseudowirusa SARS. <br...

Protokół dla rekombinowanych szczepionek przeciwko SARS opartych na RBD: przygotowanie białka, szczepienie zwierząt i detekcja neutralizacji

Ten film przedstawia test do pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Wstępna inkubacja z surowicą zawierającą przeciwciała neutralizujące RSV neutralizuje cząsteczki wirusa, zmniejszając infekcję komórkową i tworzenie się blaszek miażdżycowych. Komórki zakażone wirusem są następnie poddawane utrwalaniu, blokowaniu i znakowaniu przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w celu wizualizacji płytki nazębnej. Proces ten umożliwia identyfikację...

Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Ludzki syncytialny wirus oddechowy (HRSV) może powodować ciężkie zapalenie oskrzelików u małych niemowląt. Część patogenezy ciężkiej choroby HRSV jest spowodowana odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Stymulacja pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych za pomocą HRSV zapewnia szybki i powtarzalny system modelowy do badania aktywacji szlaków zapalnych i infekcji.

Model in vitro do badania odpowiedzi immunologicznej ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na zakażenie ludzkim wirusem syncytialnym układu oddechowego

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Dla dogłębnej analizy mechanistycznej syntezy RNA syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), przedstawiamy protokół wykorzystania fosfoproteiny opiekuńczej (P) do koekspresji nukleoproteiny wolnej od RNA (N0) do późniejszego składania in vitro specyficznych dla wirusa nukleokapsydów (NC).

Wytwarzanie i składanie specyficznych dla wirusa nukleokapsydów syncytialnego wirusa oddechowego

Opisany tutaj protokół przedstawia szybką i skuteczną metodę pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko białku kolca SARS-CoV-2 poprzez ocenę zdolności próbek surowicy rekonwalescencyjnej do hamowania infekcji przez wzmocniony wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej znakowany zielonym fluorescencyjnym białkiem, pseudotypowany glikoproteiną kolca.

Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Wirusy z pseudotypami (PV) to wiriony z wadami replikacji, które są używane do badania interakcji gospodarz-wirus w bezpieczniejszych warunkach niż obsługa autentycznych wirusów. Przedstawiono szczegółowy protokół, który pokazuje, w jaki sposób PV SARS-CoV-2 mogą być wykorzystywane do testowania zdolności neutralizacyjnej surowicy pacjentów po szczepieniu przeciwko COVID-19.

Wirusy pseudotypowane jako narzędzie molekularne do monitorowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko SARS-CoV-2 za pomocą testu neutralizacji

Poznaj ulepszony test mikroneutralizacji RSV oparty na obrazowaniu do pomiaru przeciwciał neutralizujących. Ta metoda jest wysoce powtarzalna, tania i łatwa do wdrożenia w różnych laboratoriach badawczych na całym świecie.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Przeglądaj więcej filmów