Tani protokół analizy śladu i testu wiszącego pudełka dla myszy zastosował przewlekły stres związany z ograniczeniem

Nasz protokół wykorzystujący analizę chodu jest bardzo przydatny w określaniu, czy mysie motoryki zaburzeń ruchowych naśladują objaw pacjenta z zaburzeniami chodu. Tak więc analiza chodu w teście obciążenia stresowego może być przeprowadzona łatwo i bez drogiego sprzętu, aby wykryć pewne fenotypy motoryczne u myszy, bez spontanicznych efektów. Przed rozpoczęciem testu behawioralnego zanotuj wagę każdej myszy i użyj pisaka, aby oznaczyć każdy ogon.

Kiedy wszystkie zwierzęta zostaną zważone i oznaczone, umieść myszy w pomieszczeniu doświadczalnym na co najmniej 30 minut i połóż przezroczyste wiszące pudełko o wymiarach 25 na 25 na 40 centymetrów z obrotową pokrywą z siatki na stole laboratoryjnym. Gdy myszy się zaaklimatyzują, umieść jedną mysz na środku siatkowej pokrywy i ostrożnie odwróć pokrywę do góry nogami. Następnie zmierz opóźnienie upadku myszy z siatkowej pokrywy, zanim włożysz mysz z powrotem do klatki domowej.

Kiedy wszystkie myszy zostaną przetestowane, umieść kawałek białego papieru o wymiarach 9,9 na 42 centymetry na stole laboratoryjnym i umieść ciemne pudełko na bramkę na dystalnym końcu papieru. Umieść inne pudełka, mniej więcej tej samej długości co papier, po obu stronach pasa startowego, aby zapobiec ucieczce. I dodaj i czerwony atrament, aby oddzielić 35-mililitrowe szalki Petriego.

Aby wyszkolić myszy do analizy, umieść mysz na bliższym końcu papieru, przodem do pola bramki i pozwól myszy przejść od bliższego końca papieru do pola bramki. Gdy mysz dotrze do pudełka, delikatnie potrząśnij zwierzęciem, wsuwając grzbiet i ogon między kłębek kciuka a pozostałe palce, aby ograniczyć ruch tylnych kończyn. I zanurz spody kończyn przednich w czerwonym atramencie, a spód kończyn tylnych w czarnym tuszu.

Następnie natychmiast umieść mysz z powrotem na bliższym końcu papieru, przodem do pola bramki i pozwól myszy przejść od bliższego końca do pola bramki. Po wysuszeniu na powietrzu papieru z nadrukiem na stopie, użyj linijki, aby uzyskać trzy pomiary długości kroku, mierząc odległości między tymi samymi częściami odcisków łap. szerokości podstawy z przodu, poprzez narysowanie linii między kolejnymi, po tej samej stronie, śladami frontu i zmierzenie długości linii pionowej od pola podrysu czołowego do linii narysowanej między śladami stóp.

Oraz szerokości podstawy tylnej, rysując linię między kolejnymi śladami stóp po prawej stronie i mierząc długość linii pionowej od opuszki lewego odcisku stopy tylnej do linii narysowanej między pozostałymi śladami stóp po prawej stronie. W przypadku nakładania się zmierz odległość między opuszkami przednich i tylnych śladów. Aby przygotować rurkę unieruchamiającą, użyj kwadratowego wiertła, aby wykonać 16 dwumilimetrowych otworów w 50-mililitrowej rurce wzdłuż oznaczeń skali i tylnej strony każdego znacznika skali.

Odetnij końcówkę rurki, aby zrobić pięciomilimetrowy otwór do oddychania i zrób czteromilimetrowy otwór w nasadce rurki na ogon. W teście obciążenia stresem należy poszarpać mysz i umieścić zwierzę w rurze krępującej głową do przodu, z delikatnie związanymi kończynami przednimi. Przełóż ogon przez otwór w nasadce przed zamknięciem rurki.

I umieść mysz na blacie stołu na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu obciążenia stresem wyjmij mysz z rurki i wróć do klatki domowej. Jak zaobserwowano na tych reprezentatywnych rycinach, heterozygotyczne myszy modelowe z dystonią o szybkim początku Parkinsonism wykazują znacznie krótsze kroki kończyn przednich i tylnych niż ich rodzeństwo z miotu typu dzikiego w wieku czterech tygodni.

Myszy z heterozygotyczną dystonią o szybkim początku i modelem parkinsonizmu wykazują również znacznie krótsze długości kroku obu kończyn niż u zestresowanych rodaków z miotu typu dzikiego w wieku ośmiu tygodni. Asymetrie długości kroku obu kończyn nie różnią się znacząco w żadnej grupie myszy, w każdym wieku. Przednia podstawa i zakładki obu kończyn są również podobne, we wszystkich grupach, w każdym wieku.

Tylna podstawa jest znacznie szersza u tych zestresowanych, heterozygotycznych myszy modelowych z dystonią i szybkim początkiem Parkinsonizmu niż obserwowana u zwierząt typu dzikiego w wieku 10 tygodni, co wskazuje, że stres powoduje deficyty motoryczne u heterozygotycznych myszy z dystonią o szybkim początku Parkinsonism. Nie obserwuje się znaczących różnic w czasie zawieszenia między typem dzikim a zmutowanym u zwierząt w wieku od czterech do 10 tygodni. Jednak w wieku 12 tygodni czas zawieszenia myszy typu dzikiego stresu jest znacznie dłuższy niż u innych zwierząt, co sugeruje, że deficyt motoryczny u heterozygotycznych myszy z szybką dystonią i parkinsonizmem można odróżnić od myszy typu dzikiego za pomocą testu ograniczenia u starszych zwierząt.

Umieść mysz na papierze natychmiast po tym, jak mysz zawiesi spody kończyn w atramencie, aby uniknąć wyschnięcia atramentu przed testem chodzenia. Można wykonać dodatkowe testy cech emocjonalnych, takie jak otwarte pole, podwyższony labirynt plus i test całego pływania, aby odpowiedzieć na pytanie, czy nieprawidłowości chodu wynikają tylko z deficytu motorycznego. Nasz protokół może być wykorzystany do zbadania podatności na stres, poprzez zmianę liczby i czasu trwania obciążenia stresem oraz poprzez porównanie fenotypów motorycznych między różnymi warunkami obciążenia.

Nasz protokół może być wykorzystany do zbadania podatności na stres poprzez zmianę liczby i czasu trwania obciążeń stresowych oraz poprzez porównanie fenotypów motorycznych między różnymi warunkami obciążenia.