Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii
14 marca 2020
Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.
Celem tej procedury jest uzyskanie modelu ex vivo do oceny przebudowy kości i odtworzenia mikrośrodowiska guz-kość za pomocą hodowli kalwarii lub kohodowli z komórkami nowotworowymi. Większość technik kalwaryjskich to system hodowli narządów wykorzystujący kości kalwaryczne nowonarodzonych myszy do oceny przebudowy kości. Możesz przetestować potencjał terapeutyczny różnych cząsteczek, a nawet odtworzyć mikrośrodowisko kości i guza, gdy używasz kokultur z komórkami nowotworowymi.
Wszystko to w prostym i łatwym teście w krótkim czasie i przy niskich kosztach. Celem tej techniki jest uzyskanie narzędzia do oceny regeneracji kości w mikrośrodowisku nowotworowym przy użyciu modelu ex vivo hodowli mysich narządów kalwarycznych. Najpierw wybierz szczeniaka myszy i umieść go pod maską.
Używamy kalwarii od pięcio- do siedmiodniowych szczeniąt myszy. Weź głowę strzykawką, odetnij skórę i oczyść obszar skóry głowy na tyle, aby wyciąć kalwarię. Zidentyfikuj szwy czaszki, strzałkowe, czołowe i lambdoidowe.
Wykonaj proste cięcie wzdłuż szwów lambdoidowych, mniej więcej do poziomu oka. Ciąć z każdej strony, od szwów lambdoidalnych w kierunku szwu koronalnego. Pod kątem 45 wykonaj kolejne cięcie, aby połączyć koniec nacięcia wykonanego z nacięciem ciemiączka przedniego.
Niezwykle ważne jest zdefiniowanie szwów czaszki, strzałkowych, czołowych, czołowych, koronalnych, lambdoidowych, aby zagwarantować prawidłowe włączenie tkanki i analizę histologiczną. Za pomocą kleszczyków z cienkimi końcówkami usuń kalwarię i połóż ją na pokrywie szalki Petriego. Za pomocą skalpela wykonaj proste cięcie od ciemiączka tylnego wzdłuż szwu strzałkowego przez szew koronalny.
Uzyskuje się dwie hemicalvarias. Podnieś każdą kalwarię za pomocą kleszczy i umieść je na nowej szalce Petriego z PBS. W celu hodowli umieść hemicalvaria na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, zawierającej jeden mililitr pożywki, i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni.
Możemy również użyć pierwotnych kultur kalwarycznych do odtworzenia mikrośrodowiska guz-kość w celu resorpcji kości. Aby to zrobić, hodujemy kalwarie razem z komórkami rakowymi lub z kondycjonowanymi pożywkami z komórek rakowych. 24 godziny później wyjmij pożywkę i zastąp ją pożywką zawierającą lek, który chcesz przetestować.
Jeśli chcesz ocenić interakcje komórek rakowych i kości lub odtworzyć mikrośrodowisko guz-kość, przełóż kalwarię do płytki o niskim przyczepie komórkowym, aby uniknąć przyczepiania się komórek rakowych do płytki. Trypsynizuj komórki rakowe, policz je i ostrożnie umieść na szczycie hemicalvaria. Możesz również użyć pożywki warunkowej z komórek rakowych i użyć jej do inkubacji hemicalvaria.
Inkubuj przez sześć do siedmiu dni w temperaturze 37 stopni, z pięcioprocentowym CO2. Trzeciego dnia zmień podłoże i kontynuuj inkubację. Liczba komórek wykorzystywanych w kokulturze zależy od linii komórkowej nowotworu.
Po pierwsze, musisz zoptymalizować liczbę komórek potrzebnych do wywołania odpowiedzi w jednej. Po posiewie kalwaria przechodzi proces utrwalania, odwapniania i zatapiania w parafinie. Następnie tkanki są cięte w mikrotomie, barwione i przeprowadzana jest analiza histomorfometryczna.
Włączenie kalwarii może być trudne. Aby upewnić się, że chusteczka jest chroniona podczas włączenia, można umieścić ją między gąbkami lub użyć bibuły lub innego papieru chłonnego przed włożeniem jej do kasety. Do przetwarzania tkanek zawiń hemicalvaria w bibułę.
Następnie umieść go w kasecie do zatapiania i utrwal w neutralnym buforze w formalinie na 24 godziny w czterech stopniach. Aby odwapnić kalwarię, umieść kasetę w 10% EDTA na 48 godzin w czterech stopniach. Przetwarzaj kasety tkankowe za pomocą hemicalvaria w automatycznym procesorze tkanek.
Postępuj zgodnie z regularnym cyklem rotacji dnia, a następnie dodaj parafinę. Do cięcia należy wyciąć cztery skrawki mikrotyki za pomocą mikrotomu, zamontować skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych i zabarwić hematoksyliną, eozyną. Analizę histologiczną wykorzystano do przeprowadzenia analizy ilościowej powierzchni kości i obszarów przebudowy kości.
Obrazy kalwarii w ciągu siedmiu dni zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania do obrazowania. W przypadku oceny ilościowej najpierw należy zdefiniować obszar do analizy. Spójrz na sekcje na telopie, gdzie cztery X, aby zidentyfikować orientację i szwy.
Zdefiniuj szew koronalny i zidentyfikuj długą powierzchnię kości po jednej stronie, a następnie krótką powierzchnię po drugiej. Pod 40-krotnym powiększeniem zidentyfikuj szew koronalny i odsuń dwa lub trzy pola optyczne od szwu, wzdłuż długiej powierzchni. Przechwyć obraz tego obszaru do analizy.
Możesz użyć oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować integralność strukturalną kości. Można przeprowadzić ilościową analizę histomorfometryczną grubości i obszaru kości hemicalvaria. Prawidłowa analiza kalwarii zależy od dobrego osadzenia i właściwej orientacji w celu uzyskania spójnych wyników histologicznych.
Upewnij się, że używasz co najmniej trzech kalwarii na warunek eksperymentalny. Tutaj możemy zobaczyć budowę kości. W kolorze pomarańczowym obserwuje się kość.
Możemy również zauważyć obecność okostnej, ostocytów, śródmieścia i innych części kości. W naszym przypadku stosujemy insulinę w celu zwiększenia przebudowy kości. W porównaniu z grupą kontrolną możemy zaobserwować znaczny wzrost powierzchni kości.
Tutaj możemy zobaczyć wpływ linii komórkowej MDA-MB-231 na modelową kalwarię. Widzimy, w porównaniu z kontrolą, że obecność komórek nowotworowych indukuje czynniki osteolityczne, które stymulują niszczenie kości. Wykorzystaliśmy model kalwarii do pomiaru regeneracji kości i interakcji rak-kość poprzez kohodowle z komórkami rakowymi i histologię.
Weryfikujemy również nasze dane za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Ten model ex vivo ma wiele zalet, takich jak zachowanie trójwymiarowej organizacji i różnorodności komórkowej kości, a warunki eksperymentalne mogą być kontrolowane. Poza tym model jest prosty, można zobaczyć wyniki w krótkim czasie i jest tani.
Można go łączyć z innymi technikami, takimi jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, mikroskopia i mikrotomografia komputerowa.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli ex vivo kalwarii nowonarodzonych myszy, mający na celu badanie fizjologii kości oraz ocenę wpływu leków na przebudowę kostną. Technika ta pozwala na odtworzenie mikrośrodowiska guza i kości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia kości
- Przebudowa kości
- Biologia nowotworów
Wstęp
- Wyizolowane fragmenty kości mogą być hodowane w celu badania procesów fizjologicznych.
- Kopuły czaszkowe (calvaria) neonatalnych myszy służą jako model do badań nad kością.
- Współhodowla z komórkami nowotworowymi może naśladować mikrośrodowisko guza kostnego.
- Metoda ta jest kosztowo efektywna i prosta w wykonaniu.
Cel badania
- Ocena przebudowy kości w modelu ex vivo.
- Ocena potencjału terapeutycznego różnych cząsteczek.
- Rekonstrukcja mikrośrodowiska guza kostnego.
Zastosowane metody
- Izolacja kalwarii z nowonarodzonych myszy.
- Techniki hodowli ex vivo dla eksplantów kostnych.
- Systemy kokultury z komórkami nowotworowymi.
- Ocena regeneracji kości i efektów działania leków.
Główne wyniki
- Skuteczna hodowla sklepienia czaszki do badania przebudowy kości.
- Możliwość testowania środków terapeutycznych w kontrolowanym środowisku.
- Wykazanie możliwości odtworzenia mikrośrodowiska guza i kości.
- Wykazanie, że metoda jest wydajna i niskokosztowa.
Wnioski
- Kultura czaszki ex vivo jest cennym narzędziem w badaniach nad kośćmi.
- Umożliwia ona badanie wpływu leków na fizjologię kości.
- Systemy kokultury pogłębiają zrozumienie interakcji nowotworów z tkanką kostną.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model czaszki ex vivo stanowi fizjologicznie istotny system do oceny dynamiki przebudowy kości oraz interakcji między guzem a kością w kontrolowanym, powtarzalnym formacie. Umożliwia on wczesnym etapem mechanistyczną weryfikację potencjału terapeutycznego kandydatów ukierunkowanych na przerzuty do kości lub osteoporozę poprzez zachowanie natywnej architektury tkanki i różnorodności komórkowej. Analiza ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji wiodących związków poprzez ilościowe określenie anabolicznych i katabolicznych odpowiedzi kości w określonych warunkach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie hipotez terapeutycznych dotyczących szlaków formowania i resorpcji kości, wykorzystując insulinę lub kokulturę komórek nowotworowych jako modulatory.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów poprzez pomiar zmian powierzchni kości w odpowiedzi na czynniki osteolityczne lub osteoaktywne.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków w portfelu badawczym poprzez rozróżnienie substancji stymulujących a hamujących przebudowę kości w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ustandaryzowane, ilościowe wyniki histomorfometryczne powierzchni kości i obszaru przebudowy po utrwaleniu, cięciu i barwieniu.
- Powtarzalność: Wymaga minimum trzech powtórzeń biologicznych dla każdego stanu w celu zapewnienia spójnej analizy histologicznej i wiarygodności danych.
- Skalowalność: Kompatybilna z dalszymi analizami, takimi jak qPCR, mikroskopia i mikro-CT, w celu wieloparametrycznej walidacji oddziaływań między kością a guzem.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w chorobie: Modeluje indukowaną nowotworem resorpcję kości z wykorzystaniem komórek MDA-MB-231 lub medium warunkującego w celu odtworzenia mikrośrodowiska osteolitycznego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki in vitro z istotnością in vivo poprzez zachowanie trójwymiarowej organizacji tkanki i różnorodności komórkowej noworodkowej kalwarii.
- Weryfikacja mechanistyczna: Pozwala wyjaśnić, czy badane związki modulują przebudowę kości poprzez bezpośredni wpływ na osteoblasty/osteoklasty, czy poprzez sygnalizację zapośredniczoną przez nowotwór.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, w szczególności w przypadku czynników modulujących tkankę kostną oraz leków przeciwnowotworowych wywołujących efekty szkieletowe.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków Wnt, RANKL lub PTHrP poprzez ilościowe określanie tworzenia/resorpcji kości w odpowiedzi na modulatory tych szlaków.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników dotyczących powierzchni kości i integralności strukturalnej, odpowiednich dla procesu optymalizacji związku wiodącego (hit-to-lead).
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie grubości i powierzchni kości w różnych warunkach z wykorzystaniem oprogramowania do obrazowania i histomorfometrii.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie istotnych dla ludzi oddziaływań nowotwór-kość w mysim systemie ex vivo.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnie wykorzystywalna platforma do oceny różnych związków, w tym małych cząsteczek, leków biologicznych lub pożywek kondycjonowanych, w patofizjologii kości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy regulacji przebudowy kości oraz interakcje między rakiem a tkanką kostną przy wysokiej wierności fizjologicznej.
- Wartość operacyjna: Oferuje niedrogi, prosty i szybki system ex vivo, w którym wyniki można uzyskać w ciągu jednego tygodnia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich w przesiewowych badaniach związków aktywnych w tkance kostnej dzięki modelowaniu istotnemu dla przebiegu choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane efekty w zakresie formowania lub resorpcji kości w kontekście kokultury.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie sekcji tkanek myszy, obróbki histologicznej oraz analizy histomorfometrycznej.
- Przygotowanie tkanek zależy od dostępności mikrotomu, kaset do zatapiania, formaliny, EDTA oraz odczynników do barwienia.
- Niezbędne jest zastosowanie standaryzowanych protokołów orientacji i cięcia, aby zapewnić spójne wyniki histologiczne i ilościowe.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać walidacji metod utrwalania tkanek oraz żywotności komórkowej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość tkanek podczas obróbki oraz konieczność ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć artefaktów podczas kwantyfikacji powierzchni kości.
