Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii
March 14th, 2020
Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.
Celem tej procedury jest uzyskanie modelu ex vivo do oceny przebudowy kości i odtworzenia mikrośrodowiska guz-kość za pomocą hodowli kalwarii lub kohodowli z komórkami nowotworowymi. Większość technik kalwaryjskich to system hodowli narządów wykorzystujący kości kalwaryczne nowonarodzonych myszy do oceny przebudowy kości. Możesz przetestować potencjał terapeutyczny różnych cząsteczek, a nawet odtworzyć mikrośrodowisko kości i guza, gdy używasz kokultur z komórkami nowotworowymi.
Wszystko to w prostym i łatwym teście w krótkim czasie i przy niskich kosztach. Celem tej techniki jest uzyskanie narzędzia do oceny regeneracji kości w mikrośrodowisku nowotworowym przy użyciu modelu ex vivo hodowli mysich narządów kalwarycznych. Najpierw wybierz szczeniaka myszy i umieść go pod maską.
Używamy kalwarii od pięcio- do siedmiodniowych szczeniąt myszy. Weź głowę strzykawką, odetnij skórę i oczyść obszar skóry głowy na tyle, aby wyciąć kalwarię. Zidentyfikuj szwy czaszki, strzałkowe, czołowe i lambdoidowe.
Wykonaj proste cięcie wzdłuż szwów lambdoidowych, mniej więcej do poziomu oka. Ciąć z każdej strony, od szwów lambdoidalnych w kierunku szwu koronalnego. Pod kątem 45 wykonaj kolejne cięcie, aby połączyć koniec nacięcia wykonanego z nacięciem ciemiączka przedniego.
Niezwykle ważne jest zdefiniowanie szwów czaszki, strzałkowych, czołowych, czołowych, koronalnych, lambdoidowych, aby zagwarantować prawidłowe włączenie tkanki i analizę histologiczną. Za pomocą kleszczyków z cienkimi końcówkami usuń kalwarię i połóż ją na pokrywie szalki Petriego. Za pomocą skalpela wykonaj proste cięcie od ciemiączka tylnego wzdłuż szwu strzałkowego przez szew koronalny.
Uzyskuje się dwie hemicalvarias. Podnieś każdą kalwarię za pomocą kleszczy i umieść je na nowej szalce Petriego z PBS. W celu hodowli umieść hemicalvaria na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, zawierającej jeden mililitr pożywki, i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni.
Możemy również użyć pierwotnych kultur kalwarycznych do odtworzenia mikrośrodowiska guz-kość w celu resorpcji kości. Aby to zrobić, hodujemy kalwarie razem z komórkami rakowymi lub z kondycjonowanymi pożywkami z komórek rakowych. 24 godziny później wyjmij pożywkę i zastąp ją pożywką zawierającą lek, który chcesz przetestować.
Jeśli chcesz ocenić interakcje komórek rakowych i kości lub odtworzyć mikrośrodowisko guz-kość, przełóż kalwarię do płytki o niskim przyczepie komórkowym, aby uniknąć przyczepiania się komórek rakowych do płytki. Trypsynizuj komórki rakowe, policz je i ostrożnie umieść na szczycie hemicalvaria. Możesz również użyć pożywki warunkowej z komórek rakowych i użyć jej do inkubacji hemicalvaria.
Inkubuj przez sześć do siedmiu dni w temperaturze 37 stopni, z pięcioprocentowym CO2. Trzeciego dnia zmień podłoże i kontynuuj inkubację. Liczba komórek wykorzystywanych w kokulturze zależy od linii komórkowej nowotworu.
Po pierwsze, musisz zoptymalizować liczbę komórek potrzebnych do wywołania odpowiedzi w jednej. Po posiewie kalwaria przechodzi proces utrwalania, odwapniania i zatapiania w parafinie. Następnie tkanki są cięte w mikrotomie, barwione i przeprowadzana jest analiza histomorfometryczna.
Włączenie kalwarii może być trudne. Aby upewnić się, że chusteczka jest chroniona podczas włączenia, można umieścić ją między gąbkami lub użyć bibuły lub innego papieru chłonnego przed włożeniem jej do kasety. Do przetwarzania tkanek zawiń hemicalvaria w bibułę.
Następnie umieść go w kasecie do zatapiania i utrwal w neutralnym buforze w formalinie na 24 godziny w czterech stopniach. Aby odwapnić kalwarię, umieść kasetę w 10% EDTA na 48 godzin w czterech stopniach. Przetwarzaj kasety tkankowe za pomocą hemicalvaria w automatycznym procesorze tkanek.
Postępuj zgodnie z regularnym cyklem rotacji dnia, a następnie dodaj parafinę. Do cięcia należy wyciąć cztery skrawki mikrotyki za pomocą mikrotomu, zamontować skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych i zabarwić hematoksyliną, eozyną. Analizę histologiczną wykorzystano do przeprowadzenia analizy ilościowej powierzchni kości i obszarów przebudowy kości.
Obrazy kalwarii w ciągu siedmiu dni zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania do obrazowania. W przypadku oceny ilościowej najpierw należy zdefiniować obszar do analizy. Spójrz na sekcje na telopie, gdzie cztery X, aby zidentyfikować orientację i szwy.
Zdefiniuj szew koronalny i zidentyfikuj długą powierzchnię kości po jednej stronie, a następnie krótką powierzchnię po drugiej. Pod 40-krotnym powiększeniem zidentyfikuj szew koronalny i odsuń dwa lub trzy pola optyczne od szwu, wzdłuż długiej powierzchni. Przechwyć obraz tego obszaru do analizy.
Możesz użyć oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować integralność strukturalną kości. Można przeprowadzić ilościową analizę histomorfometryczną grubości i obszaru kości hemicalvaria. Prawidłowa analiza kalwarii zależy od dobrego osadzenia i właściwej orientacji w celu uzyskania spójnych wyników histologicznych.
Upewnij się, że używasz co najmniej trzech kalwarii na warunek eksperymentalny. Tutaj możemy zobaczyć budowę kości. W kolorze pomarańczowym obserwuje się kość.
Możemy również zauważyć obecność okostnej, ostocytów, śródmieścia i innych części kości. W naszym przypadku stosujemy insulinę w celu zwiększenia przebudowy kości. W porównaniu z grupą kontrolną możemy zaobserwować znaczny wzrost powierzchni kości.
Tutaj możemy zobaczyć wpływ linii komórkowej MDA-MB-231 na modelową kalwarię. Widzimy, w porównaniu z kontrolą, że obecność komórek nowotworowych indukuje czynniki osteolityczne, które stymulują niszczenie kości. Wykorzystaliśmy model kalwarii do pomiaru regeneracji kości i interakcji rak-kość poprzez kohodowle z komórkami rakowymi i histologię.
Weryfikujemy również nasze dane za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Ten model ex vivo ma wiele zalet, takich jak zachowanie trójwymiarowej organizacji i różnorodności komórkowej kości, a warunki eksperymentalne mogą być kontrolowane. Poza tym model jest prosty, można zobaczyć wyniki w krótkim czasie i jest tani.
Można go łączyć z innymi technikami, takimi jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, mikroskopia i mikrotomografia komputerowa.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół dotyczący hodowli ex vivo kości czołowej od noworodków myszy, mający na celu badanie fizjologii kości i ocenę wpływu leków na przebudowę tkanki kostnej. Technika ta pozwala na odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Fizjologia kości
- Przebudowa kości
- Biologia raka
Tło
- Eksplant kości można hodowlać w celu badania procesów fizjologicznych.
- Kości czołowe od noworodków myszy służą jako model do badań kości.
- Współhodowla z komórkami rakowymi może naśladować mikrośrodowisko guz-kość.
- Ta metoda jest opłacalna i prosta.
Cel badania
- Ocena przebudowy kości w modelu ex vivo.
- Ocenienie potencjału terapeutycznego różnych cząstek.
- Odtwarzanie mikrośrodowiska guz-kość.
Stosowane metody
- Izolacja kości czołowej od noworodków myszy.
- Techniki hodowli ex vivo eksplantów kostnych.
- Systemy współhodowli z komórkami rakowymi.
- Ocena regeneracji kości i wpływu leków.
Główne wyniki
- Udana hodowla kości czołowej do badania przebudowy kości.
- Możliwość testowania środków terapeutycznych w kontrolowanym środowisku.
- Pokazano odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość.
- Metoda okazała się efektywna i nisko kosztowa.
Wnioski
- Hodowla ex vivo kości czołowej jest cennym narzędziem do badań kości.
- Ułatwia badanie wpływu leków na fizjologię kości.
- Systemy współhodowli poprawiają zrozumienie interakcji raka z kością.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
