Name: Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj technikę eksplantacji kalwarii noworodków myszy do badania przebudowy kości i mikrośrodowiska guz-kość. Metoda umożliwia testowanie terapii oraz analizę histomorfometryczną w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Mario Nomurze, doktorowi medycyny i Rodolfo Díazowi za pomoc w badaniu histologicznym, oraz Pierrickowi Fournierowi, doktorowi za cenne uwagi mające na celu poprawę jakości artykułu.

Wszystkie myszy użyte w tych testach zostały uzyskane ze szczepów myszy BALB/c, używając myszy męskich i żeńskich bezkrytycznie. Poprzednie eksperymenty hodowlane przeprowadzono również przy użyciu innych szczepów, takich jak FVB, myszy szwajcarskie, CD-1 i myszy CsA11,12,14. Wszystkie myszy były trzymane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH), Załącznik Q. Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Centrum Badań Naukowych i Szkolnictwa Wyższego w Ensenadzie (CICESE).
1. Rozwarstwienie kości kalwarycznej
<ol>
	<li>Sterylizuj narzędzia preparacyjne (np. kleszczyki do tkanek z 1 x 2 zębami, proste nożyczki chirurgiczne, nożyczki preparacyjne, pęseta z cienką końcówką, kleszcze preparacyjne z cienką zakrzywioną końcówką, kleszcze preparacyjne, skalpel). Sterylna woda destylowana może być używana do czyszczenia narzędzi chirurgicznych między każdym rozwarstwieniem, a sterylna 1x PBS może być używana do czyszczenia każdej półkuli.</li>
	<li>Umieść sterylne narzędzia do preparacji, wodę, 1x PBS i materiały wymagane do przeprowadzenia procedury (np. mikropipety, szklanki do wytrącania, sterylne szalki Petriego) w okapie z przepływem laminarnym. 
	UWAGA: Całą procedurę należy przeprowadzić w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Dodaj 12 ml sterylnego 1x PBS do dwóch 10 cm szalek Petriego.</li>
	<li>Wybierz szczenięta i umieść je w pobliżu kaptura. 
	UWAGA: Wypreparuj kalwarie od 5-7 dniowych szczeniąt.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś i przytrzymaj mysz za pomocą kleszczy preparacyjnych.</li>
	<li>Odetnij głowę myszy za pomocą nożyczek preparacyjnych i umieść głowę na szalce Petriego za pomocą PBS. 
	UWAGA: Dekapitacja nie jest odpowiednia dla starszych myszy. Jeśli doświadczenie musi być przeprowadzone na starszych myszach, metoda eutanazji powinna zostać zmodyfikowana zgodnie z zasadami eksperymentów na zwierzętach.</li>
	<li>Przytrzymaj mocno głowę za okolice nosa za pomocą kleszczy do tkanek 1 x 2 zęby i usuń skórę nad czaszką, aż kalwaria będzie widoczna.</li>
	<li>Zidentyfikuj szwy (tj. strzałkowe, czołowe i lambdoidalne) czaszki na odsłoniętej kalwarii.</li>
	<li>Wbić końcówką mikronożyczek około 2 mm za szew lambdoidalny i wykonać proste cięcie wzdłuż niego.</li>
	<li>Włóż końcówkę mikronożyczek w tylną stronę czaszki. Wykonaj proste cięcie wzdłuż dystalnej strony szwu lambdoidalnego w kierunku szwu koronalnego. Podobnie postępować z drugim szwem lambdoidalnym.</li>
	<li>Wykonaj kolejne cięcie (pod kątem 45°), aby połączyć koniec wykonanego cięcia z nacięciem ciemiączka przedniego.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.10 i 1.11 z drugim szwem lambdoidalnym. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zidentyfikować szwy, aby wykonać odpowiednie nacięcia i móc wykonać odpowiednie osadzenie i analizę danych.</li>
	<li>Użyj kleszczyków z cienką końcówką, aby usunąć kalwarię i umieść ją na szalce Petriego. Za pomocą skalpela wykonaj proste cięcie od tylnego ciemiączka wzdłuż szwu strzałkowego przez szew koronalny i kończąc na ciemiączku przednim, aby uzyskać dwie półkalwarie.</li>
	<li>Podnieś każdą z półwarii za pomocą pęsety z cienką końcówką i umieść ją na nowej szalce Petriego zawierającej PBS.</li>
</ol>
2. Kultura Kalwarii
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 1% antybiotykiem/antybiotykiem (tj. penicyliną i streptomycyną) do studzienek na płytce 24-dołkowej. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką podnieś każdą półkulwarię i umieść ją w studzience. 
	UWAGA: Połóż półkawarię wklęsłą stroną do dołu.</li>
	<li>Inkubować półkulwarie przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki i dodać 1 ml świeżej pożywki zawierającej związek do badania lub kondycjonowania pożywki z innych komórek. 
	UWAGA: Stosować co najmniej trzy półkuloryczne dla każdej grupy badanej i stosować kontrole ujemne i pozytywne.</li>
	<li>Inkubuj półkulwarie przez 7 dni, zmieniając pożywkę co 2-3 dni.</li>
</ol>
3. Hodowla z komórkami rakowymi
<ol>
	<li>Wybierz szalkę Petriego z komórkami rakowymi o zbiegu 80-90% i trypsynizuj je. Aby poddać próbie pupsynizację, przemyj komórki rakowe 1x za pomocą PBS (5 ml na 75 cm2 kolby), a następnie inkubuj w roztworze HBSS zawierającym 0,05% trypsyny i 0,53 mM EDTA (2 ml na 75 cm2 kolba).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 ml DMEM zawierającym 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku. Policz żywe komórki.</li>
	<li>Przypisz półwarie do każdej grupy badanej (tj. grupy kontroli negatywnej i kokultury do analizy RNA lub histologicznej).</li>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną z półkalwarii i dodaj 1 ml DMEM zawierającego 2% FBS i 1% antybiotyku/antybiotyku uzupełnionego lub nieuzupełnionego komórkami rakowymi. 
	UWAGA: Ilość komórek do dodania może się zmieniać w zależności od testowanej linii komórkowej. W przypadku komórek rakowych, takich jak MDA-MB-231 lub PC-3, 500 000 komórek na studnię działa prawidłowo.</li>
	<li>Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Przełóż każdą półkulę kalwaryczną do nowej studzienki, aby zatrzymać tylko komórki rakowe, które przylegały do tkanki kostnej.</li>
	<li>Inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniać pożywkę co 2-3 dni.</li>
</ol>
4. Fiksacja
<ol>
	<li>Wytnij kwadraty bibuły, aby owinąć półkulwarię. 
	UWAGA: Można również stosować podkładki piankowe do biopsji lub stalowe kapsułki do małych biopsji.</li>
	<li>Użyj prostych kleszczyków z cienką końcówką, aby podnieść każdą pół-kalwarię ze szwu strzałkowego, umieść na bibułce i zawiń.</li>
	<li>Umieść owiniętą półkalwarię w oznaczonej kasecie do zatapiania.</li>
	<li>Umieść kasetę w pojemniku z 10% formaliną buforowaną fosforanami.</li>
	<li>Utrwalać na 24 h w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Odwapnienie
<ol>
	<li>Usuń formalinę, dodaj 1x PBS i mieszaj tkanki przez 30 minut, aby spłukać półkulory.</li>
	<li>Usunąć PBS i dodać 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M). 
	UWAGA: Sprawdź, czy roztwór całkowicie pokrywa tkanki.</li>
	<li>Odwapniać tkanki przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór EDTA i dodaj 1x PBS, aby przepłukać tkankę.</li>
	<li>Przechowuj półkulwarie w 70% etanolu do czasu przetwarzania histologicznego.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Odwodnić tkanki krążkami 96% etanolu, 60 min (3x), a następnie 100% etanolem, 60 min (3x).</li>
	<li>Zastąp etanol 100% ksylenem, 60 min (3x).</li>
	<li>Inkubować kasety w wosku parafinowym, 60 min (2x).</li>
</ol>
7. Osadzanie
<ol>
	<li>Otwórz kasety, ostrożnie wyjmij bibułę i rozwiń kalwarię.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś każdą kalwarię i ułóż wszystkie półkulwarie z tej samej grupy w tej samej orientacji.</li>
	<li>Wlej trochę parafiny do formy.</li>
	<li>Podnieś wszystkie połowicze za pomocą kleszczy i umieść je w formie szwem strzałkowym w dół w kierunku podstawy formy. 
	UWAGA: Orientacja połowiczo-kalabwarii w pleśni podczas włączania ma kluczowe znaczenie dla uzyskania spójnych przekrojów histologicznych i powtarzalnych wyników, ponieważ ta orientacja pozwoli na tylną identyfikację kości przedniej i ciemieniowej od kalwarii oraz szwu koronalnego, ułatwiając ocenę ilościową.</li>
	<li>Zwolnij kleszcze i sprawdź, czy półkawaria pozostaje na swoim miejscu.</li>
	<li>Umieść oznaczoną kasetę na wierzchu formy i napełnij ją większą ilością parafiny, aby pokryć półkulwarię.</li>
	<li>Przenieś foremki na zimną powierzchnię.</li>
</ol>
8. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Przyciąć 500-600 μm szwu strzałkowego za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Wytnij odcinki o grubości 4 μm i zbierz potrzebne sekcje.</li>
	<li>Przytnij kolejne 300 μm.</li>
	<li>Wytnij i zbierz kolejne sześć odcinków o grubości 4 μm.</li>
	<li>Przytnij blok o 300 μm dalej i zbierz więcej sekcji.</li>
	<li>Zamontuj sekcje na szklanych szkiełkach mikroskopowych.</li>
	<li>Wysuszyć szkiełka w temperaturze RT.</li>
</ol>
9. Barwienie
<ol>
	<li>Zanurz sekcje w 100% ksylenie na 3 minuty.</li>
	<li>Zanurz w 100% etanolu na 1 min.</li>
	<li>Mieszaj z 96% etanolem przez 1 minutę.</li>
	<li>Zanurz w 80% etanolu na 1 min.</li>
	<li>Zanurz w 70% etanolu na 1 min.</li>
	<li>Płukać w wodzie przez 3 min.</li>
	<li>Zanurz w hematoksylinie na 3 minuty.</li>
	<li>Spłucz w wodzie, aż sekcja będzie czysta.</li>
	<li>Zanurzyć w nasyconym roztworze węglanu litu na 10 sekund.</li>
	<li>Płukać w wodzie przez 3 min.</li>
	<li>Zanurz w 96% etanolu na 1 min.</li>
	<li>Zanurz się w eozynie na 3 minuty.</li>
	<li>Zanurz w 96% etanolu na 1 min.</li>
	<li>Zanurz w 100% etanolu na 1 min.</li>
	<li>Zanurz w 100% ksylenie na 3 minuty.</li>
	<li>Dodaj trochę na nośnik do montażu na suwaku i zabezpiecz go szkiełkiem nakrywkowym. 
	UWAGA: Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) można uzupełnić barwieniem kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP) w celu oceny osteoklastów i osteolizy.</li>
</ol>
10. Ocena ilościowa: definiowanie obszaru do analizy
<ol>
	<li>Zbadaj skrawki pod niską mocą (tj. 4x), aby określić orientację i szwy.</li>
	<li>Zdefiniuj szew koronalny i zidentyfikuj długą powierzchnię kości po jednej stronie i krótką powierzchnię po drugiej.</li>
	<li>Zidentyfikuj szew koronalny pod 40-krotnym powiększeniem i odsuń dwa lub trzy pola optyczne od szwu wzdłuż długiej powierzchni. Zrób zdjęcia tego obszaru do analizy.</li>
	<li>Zdefiniuj stary obszar kości i nowy obszar kości. Eozyna Y z pomarańczowym G barwi starą kość na ciemniej, a nową kość jaśniej</li>.
	<li>Zmierz całkowitą powierzchnię starej i nowej kości za pomocą oprogramowania Image J za pomocą narzędzia do pomiaru progu kolorów. Wyraż wyniki jako μm2.</li>
</ol>
11. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania statystycznego. Istotne różnice między grupami można określić za pomocą odpowiednich testów (np. nieparametrycznego testu U Manna-Whitneya, jak to jest wykonywane tutaj).</li>
</ol>

<ol><li>Boyce, B. Bone biology and pathology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoyce%2C+B+%22Handbook+of+Cancer-Related+Bone+Disease%22">Handbook of Cancer-Related Bone Disease</a>. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).</li>
<li>Clark, R. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClark%2C+RK+%22Anatomy+and+Physiology%3A+Understanding+the+Human+Body%22">Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body</a>. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).</li>
<li>Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFournier%2C+PGJ+%22Bone+Cancer%3A+Primary+Bone+Cancers+and+Bone+Metastases%22">Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases</a>. Heymann, D. , 13-28 (2014).</li>
<li>Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stephen+Paget+and+the+%22seed+and+soil%22+theory+of+metastatic+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination.</a> Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).</li>
<li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vicious+cycle+of+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+%26+Neuronal+Interactions%22%5BJournal%5D)">The vicious cycle of bone metastases.</a> Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).</li>
<li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of bone metastasis.</a> Cancer. 80 (8), 1546-1556 (1997).</li>
<li>Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+to+bone%3A+causes%2C+consequences+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).</li>
<li>Chong, S. K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+bone+metastasis%3A+Opportunities+for+the+study+of+cancer+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).</li>
<li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).</li>
<li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+ex+vivo+explant+cultures%3A+applications+in+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEY+Reports%22%5BJournal%5D)">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEY Reports. 5, 818(2016).</li>
<li>Nordstrand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+validation+of+an+in+vitro+coculture+model+to+study+the+interactions+between+bone+and+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).</li>
<li>Curtin, P., Youm, H., Salih, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cancer-bone+metastasis+model+using+ex+vivo+cocultures+of+live+calvaria+bones+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells.</a> Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).</li>
<li>Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarret%2C+R+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).</li>
<li>Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+new+bone+formation+in+neonatal+calvarial+organ+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym miejscu opisujemy protokół dla kalwaryjnego modelu ex vivo do oceny tworzenia lub resorpcji kości oraz do badania interakcji komórek rakowych z kością myszy kalwarycznej. Krytycznymi etapami tej techniki są sekcja, hodowla, osadzanie i analiza histomorfometryczna kalwarii. Podczas preparowania kalwarii kluczowe jest pocięcie półkalwarii na trapez, ponieważ znacznie ułatwi to orientację podczas wtrącania parafiny. Podczas badania interakcji komórek rakowych z kalwarią ważne jest, aby używać płytek wielodołk...

Kość to dynamiczna tkanka łączna, która pełni kilka funkcji, w tym wspieranie mięśni, ochronę narządów wewnętrznych i szpiku kostnego oraz magazynowanie i uwalnianie wapnia i czynników wzrostu1,2. Aby zachować swoją integralność i prawidłowe funkcjonowanie, tkanka kostna jest stale poddawana procesowi przebudowy. Ogólnie rzecz biorąc, cykl przebudowy kości można podzielić na resorpcję kości i tworzenie kości1. Brak równowagi między tymi dwiema fazami przebudowy kości może prowadzić do rozwoju patologii kości. Ponadto choroby takie jak rak piersi często wpływają na integralność kości; Około 70% pacjentów w zaawansowanych stadiach ma lub będzie miało przerzuty do kości. Kiedy komórki raka piersi dostają się do kości, wpływają na metabolizm kostny, powodując nadmierną resorpcję (zmiany osteoklastyczne) i/lub powstawanie (zmiany osteoblastyczne)3.
Aby zrozumieć biologię chorób kości i opracować nowe metody leczenia, konieczne jest zrozumienie mechanizmów związanych z przebudową kości. W badaniach nad rakiem konieczne jest zbadanie procesu przerzutów do kości i jego związku z mikrośrodowiskiem przerzutowym. W 1889 roku Stephen Paget wysunął hipotezę, że przerzuty występują, gdy istnieje zgodność między komórkami nowotworowymi a tkanką docelową i zasugerował, że miejsce przerzutu zależy od powinowactwa guza do mikrośrodowiska4. W 1997 roku Mundy i Guise wprowadzili koncepcję "błędnego koła przerzutów do kości", aby wyjaśnić, w jaki sposób komórki nowotworowe modyfikują mikrośrodowisko kości, aby osiągnąć swoje przetrwanie i wzrost, oraz jak mikrośrodowisko kości sprzyja ich wzrostowi, dostarczając wapń i czynniki wzrostu5,6,7.
Aby scharakteryzować mechanizmy związane z przebudową kości i przerzutami do kości oraz ocenić cząsteczki o możliwym potencjale terapeutycznym, konieczne było opracowanie modeli in vitro i in vivo. Jednak modele te mają obecnie wiele ograniczeń, takich jak uproszczona reprezentacja mikrośrodowiska kości i ich koszt8,9. Hodowla eksplantatów kostnych ex vivo ma tę zaletę, że zachowuje trójwymiarową organizację, a także różnorodność komórek kostnych. Ponadto można kontrolować warunki eksperymentalne. Modele eksplantatów obejmują hodowlę kości śródstopia, głów kości udowych, kalwarii oraz rdzeni żuchwy lub beleczkowania10. Zalety modeli ex vivo zostały wykazane w różnych badaniach. W 2009 roku Nordstrand i jego współpracownicy poinformowali o stworzeniu modelu kokultury opartego na interakcjach między komórkami raka kości i prostaty11. Również w 2012 roku Curtin i współpracownicy poinformowali o opracowaniu trójwymiarowego modelu przy użyciu kokultur ex vivo12. Celem takich modeli ex vivo jest jak najdokładniejsze odtworzenie warunków mikrośrodowiska kości, aby móc scharakteryzować mechanizmy zaangażowane w normalną lub patologiczną przebudowę kości i ocenić skuteczność nowych środków terapeutycznych.
Obecny protokół opiera się na procedurach opublikowanych przez Garrett13 oraz Mohammad et al.14. Hodowle kalwarii nowonarodzonych myszy zostały wykorzystane jako model eksperymentalny, ponieważ zachowują trójwymiarową architekturę rozwijanej kości i komórki kostne, w tym komórki na wszystkich etapach różnicowania (tj. osteoblasty, osteoklasty, osteocyty, komórki zrębu), które prowadzą do dojrzałych osteoklastów i osteoblastów, a także zmineralizowaną matrix14. Model ex vivo nie reprezentuje całkowicie patologicznego procesu chorób kości. Jednak wpływ na przebudowę kości lub osteolizę kości wywołaną rakiem można dokładnie zmierzyć.
Krótko mówiąc, ten protokół składa się z następujących kroków: preparacja kalwarii od 5-7 dniowych myszy, prekultura kalwarii, zastosowania hodowli kalwaryjskiej (np. hodowla w obecności insuliny, komórek rakowych lub kondycjonowanej pożywki, a nawet środków o potencjale terapeutycznym, zgodnie z celem badania), utrwalenie kości i odwapnienie kalwarii, przetwarzanie tkanek, analiza histologiczna, i interpretacja wyników.

<table><tbody><tr><td>24-dołkowa hodowla komórkowa</td><td>Corning</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa hodowla nietkankowa</td><td>Falcon</td><td>15705-060</td><td></td></tr><tr><td>2 mL cryovial</td><td>SSI</td><td>2341-S0S</td> Antybiotyki-Przeciwgrzybicze <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biowest</td><td>P6154-100GR</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>22628188</td><td>Wirówka 5810R</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>2935-24X50</td><td></td></tr><tr><td>Żywica Cytoseal</td><td>Richard Allen</td><td>8310-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Modyfikacja Dulbecco's Eagles Medium, z 4,5 g/L glukozy i L-glutaminą, bez pirogronianu sodu</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (10X)</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do ebedingu</td><td>Sigma</td><td>Z672122-500EA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Złota</td><td>26400</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza do zatapiania</td><td>Thermo Scientific A81000001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Golden</td><td>60600</td><td></td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>JALMEK</td><td>E5325-17P</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Biowest</td><td>BIO-S1650-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtry</td><td>Corning</td><td>CLS431229</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze i nożyczki</td><td>LANCETA HG</td><td>74165</td><td></td></tr><tr><td>Formalina buforowana 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501320</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane 25 x 75 mm</td><td>Premiere</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Harris's Hematoxylin</td><td>Jalmek</td><td>SH025-13</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza wysokoprofilowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>1001259</td><td></td></tr><tr><td>Histoquinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>813150</td><td>STP 120</td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Axio Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>905200</td><td>MICROM HM 355S</td></tr><tr><td>Karma dla myszy, 18% prot, 2018S</td><td>Harlan</td><td>T.2018S.15</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Biobasic</td><td>OB0674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Paraplast</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja parafinowa Kąpiel flotacyjna</td><td>Elektrotermiczna</td><td>MH8517X1</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Floksyna B</td><td>Probiotek</td><td>166-02072</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik wosku</td><td>Elektrotermiczny</td><td>MH8523BX1</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Złoty</td><td>534056-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Kość to tkanka łączna składająca się z osteoblastów, osteocytów i osteoklastów oraz zmineralizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, co nadaje jej wytrzymałość i elastyczność oraz pozwala spełniać jej funkcje. Kość jest stale narażona na różnorodne bodźce, które w stanach patologicznych mogą deregulować przebudowę kości. Aby zbadać biologię i choroby kości oraz ocenić potencjalne środki terapeutyczne, konieczne było opracowanie modeli in vitro i in vivo.
Ten manuskrypt opisuje proces preparacji i warunki hodowli kalwarii wyizolowanych od noworodków myszy w celu zbadania procesu tworzenia kości i mikrośrodowiska guza kości. W przeciwieństwie do modeli in vitro i in vivo, ten model ex vivo pozwala na zachowanie trójwymiarowego środowiska tkanki, a także różnorodności komórkowej kości podczas hodowli w określonych warunkach w celu symulacji pożądanego mikrośrodowiska. W związku z tym możliwe jest zbadanie przebudowy kości i jej mechanizmów, a także interakcji z innymi typami komórek, takich jak interakcje między komórkami nowotworowymi a kością.
Testy opisane tutaj używają kalwarii od 5-7 dniowych myszy BALB/C. Uzyskane półkawarie są hodowane w obecności insuliny, komórek raka piersi (MDA-MB-231) lub kondycjonowanej pożywki z hodowli komórek raka piersi. Po analizie ustalono, że insulina indukuje tworzenie nowych kości, podczas gdy komórki nowotworowe i ich kondycjonowane podłoże indukują resorpcję kości. Model kalwaryczny jest z powodzeniem stosowany w badaniach podstawowych i stosowanych do badania rozwoju kości i chorób kości wywołanych rakiem. Ogólnie rzecz biorąc, jest to doskonała opcja do łatwego, pouczającego i taniego testu.

Aby ocenić tworzenie kości w modelu sklepienia czaszki, hodowano pół-sklepienia czaszki w pożywce z dodatkiem lub bez dodatku 50 µg/mL insuliny. Przygotowano przekroje tkanek i zabarwiono je H&amp;E. W tych warunkach badanie histologiczne wykazało, że zachowana została integralność strukturalna kości sklepienia czaszki, co pozwoliło na identyfikację jej poszczególnych elementów (Rycina 1). Sklepienia czaszki traktowane insuliną wykazały zwiększoną ilość tkank...

Hodowla ex vivo eksplantatów kostnych może być cennym narzędziem do badania fizjologii kości i potencjalnej oceny leków w przebudowie kości i chorobach kości. Prezentowany protokół opisuje przygotowanie i hodowlę kalwarii wyizolowanych z czaszek nowonarodzonych myszy, a także jej zastosowania.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Celem tej procedury jest uzyskanie modelu ex vivo do oceny przebudowy kości i odtworzenia mikrośrodowiska guz-kość za pomocą hodowli kalwarii lub kohodowli z komórkami nowotworowymi. Większość technik kalwaryjskich to system hodowli narządów wykorzystujący kości kalwaryczne nowonarodzonych myszy do oceny przebudowy kości. Możesz przetestować potencjał terapeutyczny różnych cząsteczek, a nawet odtworzyć mikrośrodowisko kości i guza, gdy używasz kokultur z komórkami nowotworowymi.Wszystko to w prostym i łatwym teście w krótkim czasie i przy niskich kosztach. Celem tej techniki jest uzyskanie narzędzia do oceny regeneracji kości w mikrośrodowisku nowotworowym przy użyciu modelu ex vivo hodowli mysich narządów kalwarycznych. Najpierw wybierz szczeniaka myszy i umieść go pod maską.Używamy kalwarii od pięcio- do siedmiodniowych szczeniąt myszy. Weź głowę strzykawką, odetnij skórę i oczyść obszar skóry głowy na tyle, aby wyciąć kalwarię. Zidentyfikuj szwy czaszki, strzałkowe, czołowe i lambdoidowe.Wykonaj proste cięcie wzdłuż szwów lambdoidowych, mniej więcej do poziomu oka. Ciąć z każdej strony, od szwów lambdoidalnych w kierunku szwu koronalnego. Pod kątem 45 wykonaj kolejne cięcie, aby połączyć koniec nacięcia wykonanego z nacięciem ciemiączka przedniego.Niezwykle ważne jest zdefiniowanie szwów czaszki, strzałkowych, czołowych, czołowych, koronalnych, lambdoidowych, aby zagwarantować prawidłowe włączenie tkanki i analizę histologiczną. Za pomocą kleszczyków z cienkimi końcówkami usuń kalwarię i połóż ją na pokrywie szalki Petriego. Za pomocą skalpela wykonaj proste cięcie od ciemiączka tylnego wzdłuż szwu strzałkowego przez szew koronalny.Uzyskuje się dwie hemicalvarias. Podnieś każdą kalwarię za pomocą kleszczy i umieść je na nowej szalce Petriego z PBS. W celu hodowli umieść hemicalvaria na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, zawierającej jeden mililitr pożywki, i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni.Możemy również użyć pierwotnych kultur kalwarycznych do odtworzenia mikrośrodowiska guz-kość w celu resorpcji kości. Aby to zrobić, hodujemy kalwarie razem z komórkami rakowymi lub z kondycjonowanymi pożywkami z komórek rakowych. 24 godziny później wyjmij pożywkę i zastąp ją pożywką zawierającą lek, który chcesz przetestować.Jeśli chcesz ocenić interakcje komórek rakowych i kości lub odtworzyć mikrośrodowisko guz-kość, przełóż kalwarię do płytki o niskim przyczepie komórkowym, aby uniknąć przyczepiania się komórek rakowych do płytki. Trypsynizuj komórki rakowe, policz je i ostrożnie umieść na szczycie hemicalvaria. Możesz również użyć pożywki warunkowej z komórek rakowych i użyć jej do inkubacji hemicalvaria.Inkubuj przez sześć do siedmiu dni w temperaturze 37 stopni, z pięcioprocentowym CO2. Trzeciego dnia zmień podłoże i kontynuuj inkubację. Liczba komórek wykorzystywanych w kokulturze zależy od linii komórkowej nowotworu.Po pierwsze, musisz zoptymalizować liczbę komórek potrzebnych do wywołania odpowiedzi w jednej. Po posiewie kalwaria przechodzi proces utrwalania, odwapniania i zatapiania w parafinie. Następnie tkanki są cięte w mikrotomie, barwione i przeprowadzana jest analiza histomorfometryczna.Włączenie kalwarii może być trudne. Aby upewnić się, że chusteczka jest chroniona podczas włączenia, można umieścić ją między gąbkami lub użyć bibuły lub innego papieru chłonnego przed włożeniem jej do kasety. Do przetwarzania tkanek zawiń hemicalvaria w bibułę.Następnie umieść go w kasecie do zatapiania i utrwal w neutralnym buforze w formalinie na 24 godziny w czterech stopniach. Aby odwapnić kalwarię, umieść kasetę w 10% EDTA na 48 godzin w czterech stopniach. Przetwarzaj kasety tkankowe za pomocą hemicalvaria w automatycznym procesorze tkanek.Postępuj zgodnie z regularnym cyklem rotacji dnia, a następnie dodaj parafinę. Do cięcia należy wyciąć cztery skrawki mikrotyki za pomocą mikrotomu, zamontować skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych i zabarwić hematoksyliną, eozyną. Analizę histologiczną wykorzystano do przeprowadzenia analizy ilościowej powierzchni kości i obszarów przebudowy kości.Obrazy kalwarii w ciągu siedmiu dni zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania do obrazowania. W przypadku oceny ilościowej najpierw należy zdefiniować obszar do analizy. Spójrz na sekcje na telopie, gdzie cztery X, aby zidentyfikować orientację i szwy.Zdefiniuj szew koronalny i zidentyfikuj długą powierzchnię kości po jednej stronie, a następnie krótką powierzchnię po drugiej. Pod 40-krotnym powiększeniem zidentyfikuj szew koronalny i odsuń dwa lub trzy pola optyczne od szwu, wzdłuż długiej powierzchni. Przechwyć obraz tego obszaru do analizy.Możesz użyć oprogramowania do obrazowania, aby przeanalizować integralność strukturalną kości. Można przeprowadzić ilościową analizę histomorfometryczną grubości i obszaru kości hemicalvaria. Prawidłowa analiza kalwarii zależy od dobrego osadzenia i właściwej orientacji w celu uzyskania spójnych wyników histologicznych.Upewnij się, że używasz co najmniej trzech kalwarii na warunek eksperymentalny. Tutaj możemy zobaczyć budowę kości. W kolorze pomarańczowym obserwuje się kość.Możemy również zauważyć obecność okostnej, ostocytów, śródmieścia i innych części kości. W naszym przypadku stosujemy insulinę w celu zwiększenia przebudowy kości. W porównaniu z grupą kontrolną możemy zaobserwować znaczny wzrost powierzchni kości.Tutaj możemy zobaczyć wpływ linii komórkowej MDA-MB-231 na modelową kalwarię. Widzimy, w porównaniu z kontrolą, że obecność komórek nowotworowych indukuje czynniki osteolityczne, które stymulują niszczenie kości. Wykorzystaliśmy model kalwarii do pomiaru regeneracji kości i interakcji rak-kość poprzez kohodowle z komórkami rakowymi i histologię.Weryfikujemy również nasze dane za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Ten model ex vivo ma wiele zalet, takich jak zachowanie trójwymiarowej organizacji i różnorodności komórkowej kości, a warunki eksperymentalne mogą być kontrolowane. Poza tym model jest prosty, można zobaczyć wyniki w krótkim czasie i jest tani.Można go łączyć z innymi technikami, takimi jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, mikroskopia i mikrotomografia komputerowa.

measuring-bone-remodeling-recreating-tumor-bone-microenvironment

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Komórki zrębu pochodzące z tkanki tłuszczowej mogą być przydatne do inżynierii nowej tkanki z własnych komórek pacjenta. Przedstawiamy protokół izolacji subpopulacji ludzkich komórek zrębu pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) o zwiększonym potencjale osteogennym, a następnie zastosowania komórek w teście gojenia kalwaryjnego in vivo.

Szybka izolacja komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej BMPR-IB+ do zastosowania w modelu gojenia ubytków nazębnych

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Ten manuskrypt opisuje model osteolizy kalwarii mysiej poprzez ekspozycję na cząsteczki CoCrMo, który stanowi idealny model zwierzęcy do oceny interakcji między cząstkami zużycia a różnymi komórkami w aseptycznym rozluźnieniu.

Budowa i ocena mysiego modelu osteolizy kalwarycznej poprzez ekspozycję na cząstki CoCrMo w aseptycznym rozluźnianiu

Tutaj prezentujemy metodę hodowli ex vivo długich kości mysich zarówno na etapie płodowym, jak i noworodkowym, odpowiednią do analizy rozwoju i homeostazy kości i chrząstki w kontrolowanych warunkach, podczas rekapitulacji procesu in vivo.

Hodowla i pomiar kości długich myszy płodu i noworodka

Tutaj prezentujemy protokół chirurgiczny u królików, którego celem jest ocena materiałów zastępczych kości pod kątem zdolności do regeneracji kości. Za pomocą cylindrów PEEK przymocowanych do czaszek królików, osteokondukcja, osteoindukcja, osteogeneza i waskulogeneza wywołane przez materiały mogą być oceniane zarówno na żywych, jak i uśpionych zwierzętach.

Kalwaryjny model augmentacji kości u królika do oceny wzrostu kości i neowaskularyzacji w materiałach kościozastępczych

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Poznaj technikę eksplantacji kalwarii noworodków myszy do badania przebudowy kości i mikrośrodowiska guz-kość. Metoda umożliwia testowanie terapii oraz analizę histomorfometryczną w kontrolowanych warunkach.

Pomiar przebudowy kości i odtworzenie mikrośrodowiska guz-kość przy użyciu kokultury kalwarii i histomorfometrii

Przeglądaj więcej filmów